RNA提取试剂灭菌

Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。

静置过夜，然后高压灭菌。

0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。

(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。

2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。

离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。

RNA 只存在于水相中。

水相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。

离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。

注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。

哺乳动物组织样品RNA的抽提哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。

以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

关键词：抽提样品哺乳动物组织样品RNA哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。

以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

一、实验材料：Trizol试剂（Invitrogen公司）研钵，匀浆器，镊子，铝箔都高温灭菌即可；二、具体过程：1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。

组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。

可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。

从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。

一次研磨的组织块重量不要超过300mg。

3、研磨到组织样品成粉末状后（一般需要8-10min的研磨过程），在液氮基本挥发完时，在每个研钵中加2-3ml Trizol试剂。

由于此时研钵很冷，Trizol加入后会冻结成固体状。

可以继续研磨此固体成粉末，随着研钵温度回升到室温，固体状的 Trizol逐步回复到液体状态，此时，若发现液体很粘，研杵能牵起丝状物，说明Trizol 的量太少，需在此步继续补加Trizol。

若 Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。

由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此组织样品和Trizol充分研磨混匀后就不用担心RNA的降解了。

4、把此Trizol试剂转移到玻璃匀浆器中，再进一步匀浆3-5min。

RNA提取（试剂盒法）1、取适量的植物组织（0.5g）多次加液氮研磨至粉末状，将粉末状样品（50-100mg）加入到含有450uL Buffer RL（使用前加入50×DTT Solution，1mL Buffer RL中加入20uL50×DTT，现用现配）的1.5mL灭菌管中，移液器反复吸打至无明显沉淀2、12,000rpm，5min，4℃3、上清转移到新的1.5mL管4、加入1∕2倍体积的无水乙醇（可能出现沉淀）吸打混匀5、立即将混合液（含沉淀）转入RNA Spin Column（含2mLCollection Tube）中。

（若混合液体积大于600uL，分批加入，每次加入体积不大于600uL）6、12,000rpm，1min，弃滤液，将RNA Spin Column放回2mLCollection Tube7、将500uL Buffer RW A加入RNA Spin Column，12,000rpm，30s，弃滤液8、将600uL Buffer RWB加入RNA Spin Column，12,000rpm，30s，弃滤液（RWB使用前加70mL100％乙醇）（沿RNA Spin Column管壁四周加入Buffer RWB有助于完全冲洗粘附于管壁上的盐分）9、DNase I消化⑴DNase I反应液：5uL 10 × DNase I Buffer，4uL Recombinant DNase I（RNase free，5U∕uL），41uL RNase free dH2O到新的1.5ml RNase free Tube 混匀⑵向RNA Spin Column膜中央加入50uLDNase I 室温静置15min⑶向RNA Spin Column膜中央加入350uL Buffer RWB，12,000rpm，30s，弃滤液10、重复步骤811、将RNA Spin Column重新置于2mLCollection Tube，12,000rpm，2min12、将RNA Spin Column置于1.5mL RNase free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央加入50-200uL RNase free dH2O或0.1％DEPC水，室温静置5min13、12,000rpm，2min 洗脱RNA14、若想提高RNA收量可再向膜中央加入50-200uL RNase free dH2O或0.1％DEPC水；若想提高RNA浓度可将第一次的洗脱液重新加回至RNA Spin Column室温静置5min，12,000rpm，2min 洗脱RNA。

提取RNA前的准备工作1、提取RNA操作全程及配制RNA提取试剂必须穿实验服，戴口罩和一次性手套，触摸皮肤（例如面部）、门把手及实验室其他未处理过RNase的普通物体表面后立即更换手套。

2、器具干烤：需要干烤的器具包括金属和玻璃制品，如研钵、钥匙、镊子、剪刀、试剂瓶（200mL、500mL、1L）、量筒（50mL、100mL）、烧杯，即所有在配制RNA提取试剂过程中需要用到的玻璃器皿均需要干烤处理。

所有干烤的器具均用锡箔纸包住，如研钵、钥匙、镊子、剪刀和匀浆器，容器用锡箔纸封口，如试剂瓶、量筒和烧杯。

180℃干烤6h后放入RNA专用柜中备用。

3、DEPC水的处理：用于处理枪头、试剂瓶盖和离心管等塑料制品的0.1%的DEPC水可以在烧杯中配制，磁力搅拌器上搅拌过夜，搅拌过程中用锡箔纸封口。

用于配制RNA提取试剂的DEPC水需要在干烤过的试剂瓶中配制，盖上瓶盖搅拌过夜后121℃灭菌20min。

4、枪头、离心管和试剂瓶盖用0.1%DEPC水过夜处理后用报纸包好高温灭菌，移液器必须是专用的，用之前用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭整个移液器，特别是枪杆。

超净台的处理：用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭干净后，用氯仿快速擦拭，再用75%酒精擦拭，将提取所需的物品放入超净台，并用75%酒精擦拭，另放置一个废物缸，表面喷酒精，上述完成后，超净工作台紫外灯照射15-20min。

试剂配制过程中所用的枪头也必须是DEPC水处理过并高温灭菌的。

5、提取过程中用新开封的氯仿和异丙醇，用DEPC水处理过的15mL离心管分装，每管分装10mL并于4℃保存，最后溶解RNA沉淀的DEPC处理过的水用处理过的1.5mL离心管分装并于-20℃保存。

6、用专用的电泳槽电泳RNA，用DEPC处理的水配制50×TAE缓冲液，每次电泳前用DEPC处理的水配制1×TAE缓冲液进行电泳，电泳前用去污剂将电泳槽、制胶板和梳子清洗干净，DEPC水配制的75%乙醇擦拭，最后用DEPC处理的水冲洗干净。

DEPC焦碳酸二乙酯（DEPC）：DEPC即diethypyrocarbonate，DEPC结构式中文名为。

分子式为C6H10O5，分子量为162.14。

是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。

它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

DEPC 可以抑制植物细胞上的NSCC，即nonselective cation channel （非选择性阳离子通道）。

是常用的NSCC抑制剂.DEPC毒性1．DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 是一种高效烷化剂。

配置：加0.1% DEPC 到去离子水中，混匀过夜，然后高温高压121℃，20min，DEPC即降解成二氧化碳和水无毒。

2．DEPC有刺激性，对眼睛气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。

3．DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。

DEPC水泡过一次枪头后还能再用吗?是否每次都要重配？答：不能再用。

每次处理耗材时都要用新配的。

DEPC水用于配制电泳缓冲液和溶解RNA.DEPC在水中的半衰期25℃、磷酸缓冲液中其半衰期为4 min（pH 6）、9 min（pH 7）。

Tris缓冲液中DEPC的降解会加快，25℃时，半衰期为1.25 min（pH 7.5）、0.37 min（pH 8.2）。

DEPC加入到水中之后并不会立即溶解，而是形成小的球状液滴（类似于油滴），需要彻底搅拌直至液滴消失才算混合均匀。

此时的溶液才可以拿去高温除菌除DEPC。

一般灭菌15min即可将DEPC彻底除去。

（试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性）配制泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。

实验目的：提取动物组织RNA，备后续实验使用。

实验试剂：研钵、镊子、刮勺、冰盒、试管架、微量移液器、RNA无酶管、低温离心机、酒精、液氮、Takara RNA提取试剂盒、去除DNA试剂盒冰袋实验步骤：1、实验准备:研钵中加入少量酒精，点燃，灭菌后，超净台灭菌30min（包括研钵、镊子、刮勺、试管架、微量移液器、RNA无酶管）。

2、取液氮、冰袋备、冰盒备用3、将研钵预冷，其中大研钵的可以放在冰袋上，然后再倒入液氮，小研钵直接倒入少量液氮预冷。

4、将超低温冻结的RNA 提取样品，剪取绿豆到黄豆大小组织(不能太大,不要大于黄豆大小），迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA 的收率和质量)。

可用刮勺将其刮到一团。

5、可以向4的研钵中加入适量的含有裂解液的Buffer RL,(大约700ul)，确保研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置（研钵倾斜放置），直至样品完全融化后用枪头吹打混匀,只至液体中无明显沉淀。

这期间可以研磨下一组织.6、将步骤5中的匀浆液转移至1。

5mlRNA无酶管中，12,000 rpm，4℃离心5 分钟。

期间配置70％乙醇(7份无水乙醇+3份水（为试剂盒中的RNA无酶水)）7、小心吸取6步骤上清液（吸取400ul即可），移入1。

5ml的RNase Free collection（切勿吸取沉淀，否则会阻塞后面的膜）。

然后向其中加入等体积的70％乙醇，此时可见沉淀，立即摇匀。

8、将7中的混合液，取600ul（要小于600ul)到RNA spin column （含2ml collection Tube）中，12，000 rpm，4℃离心 1 分钟,弃滤液。

将RNA spin column 放到2ml collection Tube 管中。

9、将500ul buffer RWA加入至RNA spin column 12，000 rpm，4℃离心30s，弃滤液。

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。

DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA 进入水相。

但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。

不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA 的亲水基团，与水相接触。

所以不要剧烈震荡。

异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。

氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。

通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧。

异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。

只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。

在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。

不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。

Trizol法提RNA，加氯仿就是要剧烈手摇才行，这样才能彻底地两相混匀。

而且DNA 在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的，不会跑水相里头去。

醇沉淀是很经常用的方法，因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀。

l楼主问的问题，我的个人理解是：前面提取的RNA经异丙醇沉淀后，总会含有一些未除去的蛋白和其它杂质分子，这些蛋白和杂质分子如果不除尽的话，就会直接影响所提取的RNA的纯度和稳定性。

用异硫氰酸胍法提取RNA一、试剂配制1.变性液buffer（灭菌100ml DEPC水）1.1 柠檬酸钠：0.75Mbuffer 22.06g将柠檬酸钠加入超纯水中，待完全溶解，用HCI调节pH值至7.0。

加ddH2O定容到100 mL1.2 十二烷基肌氨酸钠buffer：10% 10g0.1%DEPC水配制以后，高温高压灭菌。

2.变性液（500ml 现配）0.75mol/L柠檬酸钠buffer 17.6ml10 %十二烷基肌氨酸钠26.4ml异硫氰酸胍250gPVP（2%m/v）10gBeta-巯基乙醇1ml3. 0.1%的DEPC水（v/v）搅拌（4h以上）混匀，高温灭菌4. DEPC水处理的（配制）的75%乙醇（瓶子需要处理，灭菌）500ml 0.1%DEPC灭菌水：无水乙醇 = 100ml:300ml5 氯仿：异戊醇（24:1）（瓶子需要处理，灭菌）500ml 氯仿：异戊醇 = 480ml：20ml将氯仿和异戊醇混匀，入瓶封装。

-20℃保存6 2M醋酸钠（pH4.5）70ml醋酸钠·3H20： 19g DEPC H2O： 40ml 冰醋酸将醋酸钠完全溶解于ddH2O中，用冰醋酸调pH值至4.5，加ddH2O至70ml，搅拌过夜，高温高压灭菌所用的氯仿、乙醇、异丙醇都应该是未开封的。

准备枪头：1ml 100ul离心管：2ml 1.5ml 0.5ml瓶子：二、植物RNA提取操作规程1．取1-2g左右新鲜植物样品置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。

2. 将粉末（0.15-0.10g）移入预冷的离心管中，加入裂解液1 ml 混匀，涡旋5min（1）3. 加入100 ul2M 醋酸钠（PH4.5），混匀，4℃条件下，12000r，离心15 min，取上清液900 ul。

（2）4．加入900μL氯仿：异戊醇，涡旋10-15min，冰浴15-30 min，4℃条件下，12000 r，离心10 min。

RNA的提取1.试验所用试剂的配制(1)含0.1%DEPC(二乙基焦磷酸酰胺)的灭菌水<实验过程中用>0.1mlDEPC+99.9mlddH2O<瓶子事先用0.01%DEPC水浸泡2-3d灭菌后可用>。

配好后灭菌，高压灭菌的目的是使DEPC分解，未分解的DEPC会影响后面的实验。

所以需要放在通风厨中挥发至少3小时，一般都要放置过夜。

用1.5ml的进口去RNA酶的doff管分装该DEPC水，置-20度储存，需要实验的人可以领取一支，使用后放置自己的-20度中下次可以继续使用，只需要注意使用的时候都用去RNA酶的枪头及相关的注意操作即可。

(2)0.01%DEPC的灭菌水。

<用于浸泡瓶子器材等除去Rnase用>(3)琼脂糖凝胶电泳所用试剂配制与准备①0.5mol/L PH=8.0的EDTA溶液将37.2g EDTA-Na加入160ml的蒸馏水中，于搅拌器上剧烈搅拌。

再用NaOH调其PH值至8.0(约需4g NaOH)。

之后用蒸馏水定容至200ml，后送至高压灭菌，室温保存。

②50×TAE溶液在400ml蒸馏水中溶解121g Tris,加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5mol/L PH=8.0的EDTA 溶液，加水定容至500ml，室温保存。

③溴化乙锭(EB) (10mg/ml)在20ml水中加入0.2g EB,磁力搅拌，然后用铝箔包裹容器或将溶液移至棕色瓶中，室温保存。

④RNA电泳 loading buf. (一般为6×)2.实验过程(1)细胞种板：按相应细胞密度种板及处理，可以参考WB中的相关方法。

(2)mRNA提取：（所有试剂和耗材都需要RNA-free，一般认为氯仿等试剂新开瓶的都是RNA-free的，所以可以作为专属RNA用做好标记）①去细胞培养液用预冷的PBS洗1次，一般常用六孔板，每孔加入Trizol 300ul-500 ul,用RNA-free的枪头,吹打细胞数次,并转移到1.5mlEP管中室温孵育5min（此时的EP 管不一定需要RNA-free，可以是普通的EP管，但用于吸取液体的枪头一定要是RNA-free 的）。

Trizol 法提取RNA实验步骤一、需要的试剂：1.氯仿2.异丙醇3.75%乙醇（in DEPC-treated water)4.RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。

静置过夜，然后高压灭菌。

0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。

(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。

(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。

2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000×g，15 minutes ，2 - 8°C。

离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。

RNA只存在于水相中。

水相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 ×g ，10 minutes，2 - 8°C。

离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 ×g ，5 minutes，2 -8°C。

5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。

注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。