环境微生物学6-(补充)核糖体与16srRNA

炎 支 原 体 的 统一 标 准 。 参 考 文 献
［ ］ 雷正瑜．６ ｒ Ｎ １ １ＳＤ Ａ序列分析技术在微生物分 类鉴定 中的应用 ［ ］ 湖北 Ｊ． 生态工程职业技术学院学报 ，０ ６４（ ） ３— ． ２ ０ ， １ ： ７ ［ ］ Ｍｉ ｅ ｗ Ｉ ＯｓｎＫ，ｏａｏＪｅ ａ． ａｎ ｓｃ ｔｉ ｎ ｌ ｉａ ｓｎｆ ２ ｃ ｌ Ｃ， ｌ Ｌ ｚｎ ，ｔ Ｄｉ ｏｔ ｉｔ ａｄｃｉｃｌｉ ｉ ｈｏ ｅ １ ｇ ｉｕ ｌ ｙ ｎ ｇ － 从（ 上表中可以看出） 采用 １ Ｓ Ｎ ， ６ ｒ Ａ基 因检查诊 断支原体肺炎 较采用 Ｒ 血清学检查诊 断支原体肺炎在假 阳性率 、 敏度、 灵 耗时方面有明显的优势 ， Ｐ ＜ ．５ 比较差 异有统计学意义 。 Ｏ０ ，
标准。
【 关键词 】６ ｒ Ｎ １ＳＲ Ａ基 因； 医学微生物检 定； 效果评价 ｄ ｉ１ ．９ ９ｊｉ ｎ １０ ０：０ ３ ６ ／．ｓ ．０ ６—１５ ．０ １０ ．７ ｓ ９ ９２ １ ．８０ ９ 文章编号 ：０ ６—１５ （ ０ １ ０ ３ ９ １０ ９９ ２ １ ）一 ８— ５ ４—０ ２ １Ｓ Ｎ ６ ｒ Ａ基因序列检测技术的原理是 ： Ｒ 细菌染 色体上编码 ｒ Ｎ Ｒ Ａ的相 对 应 的 Ｄ Ａ序列存在于所有细 菌及衣 原体 、 克次体 、 Ｎ 立 支原体 、 旋体 、 线 螺 放 菌等原核生物的染色体基 因中 ， 不存在 于病毒 、 真菌等非 原核生 物体 内， 而 目前 ， 几乎所有病原 菌的 １ Ｓ Ｎ ６ ｒ Ａ基因测序均 已完成 ， Ｒ 这样 ， 使得采用基 因 序列图谱进行对比分 析测试 病原菌 的种 类成为 了可能 ， 过该技术 可 以准 通 确快速的鉴定细菌的种类 … 。 养、 免疫学和生化反应等方法 ， 这些检测方 法的检 测结果受 多种因索影响 ， 均存在特异性差、 耗时长 、 敏感 度低等问题 ， 以满 足临床 医学 检验的发展 难 要求 Ｌ． 。近年来 ， ２ ｊ Ｊ 随着聚合酶链式反应 （ Ｃ 技术的出现及核酸研究技术 Ｐ Ｒ） 的不断完善以及其它分子生 物学技术 的迅 速发展 ， 生了很多新 的细菌分 产 类鉴定 方法 ， 常见 的如 限制 性片段 长度多态 性分 析、 质粒 图谱 、 Ｎ ｒ Ａ基 因 Ｒ （ ｒ Ｎ ） 即 Ｄ— Ａ 指纹 图 、 Ｃ Ｐ Ｒ指纹 图、 ６ １ Ｓ核糖 体核 糖核 酸 （ｉ ｓ ａ Ｒ Ａ ｒｏ ｍ ｌ Ｎ 。 ｂｏ １资 料 与 方 法 ． ｒＮ 序列分析等＿ 。这些 技术均 基于对细 菌染色 体或染 色体外 的 Ｄ Ａ Ｒ Ａ） ４ Ｊ Ｎ １ １ 一般资料 ： ． 本组 ５ ４例患者 中 ， 男性 ２ ３例 ， 女性 ３ １例 ， 年龄 ２一ｌ 片段进行分析 ， １ 从分子遗传的角度对细菌进行分类鉴定 ， 从而使细菌分类更 岁， 平均年龄 ６ ２ ．３岁 。所有患者均进行血清学检查诊 断和 １ＳＲ Ａ基 因序 精确 、 ６ｒＮ 更科学。特别今年来出现的 １ＳＲ Ａ基因序列分 析技术 ， 以做到用 ６ｒＮ 可 列检测肺炎支原体。以上患者的临床表现主要有 ： 头痛、 发热伴有无力 和干 实验 研 究 来 研 究 证实 细 菌 进 化 与 否 ， 是 细 菌 分 类 史 上 的一 次 革 命 【ｊ 目 这 ５。 咳等。 前， 大多 数致病 菌 的 １ ＳＲ Ａ基 因序 列 已经被测 定 完成 ， 于 Ｐ Ｒ扩增 ６ ｒＮ 关 Ｃ １２ 检查方法 ： ． 分别对 ５ ４例患 者进行血清 血检查 诊断 和 １ＳＲ Ａ基 １ＳＲＮ ６ｒＮ ６ ｒ Ａ基因用 于细菌分类和鉴定 的研究越来越多ｔ］ ６。 因序列检查诊 断， 统计两种检查方法的假阳性率 、 灵敏 度、 检测耗时等指标 ， 肺炎支原体是一类能在无生命人 工培养基 中生 长、 繁殖 的最小 的原核 分析两种检测 方法在诊断肺炎支原体感 染时的优劣 。 型微生物 ， 曾被称 为胸膜炎微 生物（ ｌ ｒｐ ｅｍ ｎａ ｉｅｏｇｎｓ Ｐ Ｌ 。 ｐｅ ｏ ｎｕ ｏｉ —ｌ ｒａｉ ｕ ｋ ｍ， Ｐ ０） １２ １ 血清学检查诊断 ： 体感染肺 炎支原 体后 ， ．． 人 血清 中除了出现 特 临床 的上呼吸道感染 、 气管支气 管炎及非典 型肺炎经 常是 由肺炎支原 体感 异性抗体外还存在冷凝素 ， 患者的稀释血清 与 Ｏ型红细胞在 ４Ｃ ＂ 下可发生凝 染引起 。由于肺炎支原体感染 所致 的肺 炎患者临床表现 症状不典型， 需 集， 此为 Ｉ 型抗体 。以 Ｅ Ｉ ｇ Ｍ ＬＳ Ａ方法检 测患者 血清 中 Ｍ Ｐ—Ｉ ｇ Ｍ。以 Ｍ 要经过 １ Ｐ— ０～２ ｄ的潜伏期才 能表现 出来 ， ０ 临床 症状主要 为非特异性 的头痛 Ｉ ｇ Ｍ≥ｌ８ 和 （ ） 凝集 试验 ≥１３ ： ０ 或 冷 ： ２判断为有支原体感 染， 结合临床有发 和发热 ， 患者常常伴有无力和干 咳 ， 根据这些 临床 症状较难判断为肺炎支原 热、 头疼、 无力 、 干咳等症状判定为感染肺炎支原体 。 体感染 ， 因此临床 常被忽视而导致 严重 的并 发症 ， 因此 ， 利用实验 检查 就成 １２ ２ ６ ｒＮ ． ． １ Ｓ Ａ基因序列 检查 ： Ｒ 从鼻咽和 口腔采用拭子采 样进行 Ｐ Ｒ 为 了诊断肺炎支原体感染的主要依 据【 。近年来 ， Ｃ ８ Ｊ 对于肺 炎支原体感 染的 扩增 ， 引物取 自 肺炎支原体的 １ＳＲ Ａ， 照肺 炎支原体 的基 因序列进行对 流 行 病 学 特 征 、 病 机 制 、 子 生 物 学 检 测 方 法 的 研 究 报 道 较 多 。 目前 ， ６ ｒＮ 按 致 分 用 比分析 ， 符合肺炎支原体基因序列并 伴有发热 、 头疼 、 无力 、 咳等症状判定 于诊断支原体肺炎 的方法是取上呼吸道标本做 Ｐ Ｒ和急性期血 Ｉ 千 Ｃ ｓ Ｍ的复合 为感染肺炎支原体 。 测定 。但人们对于上呼吸道 ＭＰ携带者与急性 期肺炎上 呼吸道标本的 Ｐ Ｒ Ｃ １３ 统计学方法 ： ． 计量资料采用 ｔ 检验 ， 数资料采用 ｘ 检 验 ， 计 且以 Ｐ 阳性者较难区分， 且对于儿童诊 断 ＭＰ肺炎取材 的理想位置和方法还未明 而 ＜ ． ５为有统计学意义 。 ００ 确建立 。因此 ， 找到一种有效、 快速 、 期的支 原体肺 炎鉴定方法 就显 得尤 早

16S多样性测序，到底该选啥引物？！“微生物组”（Microbiome）是指由多种微生物聚居在一起形成的生态群落，从人和动物的肠道，到植物、土壤、海洋，它们无处不在，推动着地球物质循环，影响着人体乃至整个地球生物圈的健康。

小到一个工厂的污水处理，大到温室气体排放造成气候变暖，人类面临的能源短缺、环境污染、粮食安全、疾病流行等几乎所有问题的背后，都有微生物的身影。

近年来，得益于低成本高通量基因测序技术的发展、计算和成像技术的改进，以及用于数据分析的生物信息学工具的革新等进展，高通量测序走下神坛，变得平易近人，使得更多的学科领域开始投入到微生物组学的研究中来。

对于微生物组学的研究，最常见的就是对微生物群落结构多样性的研究。

也就是通过第二代高通量测序技术（Roche454高通量测序、Illumina MiSeq高通量测序等）对16SrDNA/18S rDNA/ITS等序列进行测序，获得样品中的微生物群落组成以及相对丰度。

探讨微生物多样性对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。

在高通量测序的时代，“16S测序”在各大杂志期刊、学术报告及重大会议中频繁出现，那么你真正了解16S测序吗？为什么选择16S测序？16S测序区域又该如何选择？今天，小圆要跟大家聊一下16S测序中的引物选择。

1、16S 是个啥？16S rRNA 即16Sribosomal RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。

16S中的'S'是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。

16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有原核微生物的基因组中。

16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。

随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。

1. 什么是16S rRNA16S rRNA是原核细胞核糖体构成的基本原件。

原核细胞的核糖体沉降系数约为70S，相对分子质量为2.5x103 kDa,由50S和30S两个亚基组成; 典型的原核生物核糖体是由50S大亚基和30S小亚基组成的。

在完整的核糖体中，rRNA约占2/3, 蛋白质约为1/3。

50S大亚基含有两种RNA分子，相对分子质量大的rRNA的沉降系数为23S，相对分子质量小的rRNA 为5S。

30S小亚基含有一个16S的rRNA分子。

2. 16S rRNA的华丽外衣每套华丽外衣的下面都有一些辛勤纺织的织者，16S rRNA也不例外。

如果说在上世纪七十年代之前16S rRNA还是默默无闻的灰姑娘的话，那么Carl Woese就是让灰姑娘熠熠生辉的那个王子。

1977年，他根据16S rRNA的系统进化关系图，提出了著名的三域学说，提出了古菌这一说法。

16S rRNA系统进化分析也成为现今最为经典的微生物分类方法之一。

微生物分子生态的研究者也应该牢记Carl Woese这个名字，我们现今最为流行的文库构建、DGGE、FISH等技术无不是以16S rRNA为基础的。

Carl Woese也在2003年的时候获得了生态学中的诺贝尔奖—Crafoord Prize。

3.为什么是16S rRNArRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何细胞型生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的分子钟。

在16S rRNA 分子中，不但含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。

16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1540bp，含有足够多的信息以便于亲缘关系研究，5S太短，而23S 的序列相对于当时的测序技术显得有点过长。

4. 为什么你的16S rDNA测序测不出来16S rDNA在微生物的基因组中有多少个拷贝，每个拷贝都相同么，拷贝在基因组中的分散度有多大，大家想过这样的问题没有。

1、分类与鉴定：16Sr在细菌分类学中具有举足轻重的地位。它可以帮助科 学家们确定细菌的种属和科，甚至可以用来研究整个生态系统的微生物多样性。 通过比较不同细菌16Sr序列的差异，我们可以将它们归入不同的类别。
2、进化研究：16Sr的另一个重要作用是帮助研究细菌的进化历程。通过比 较不同物种或不同地理位置的细菌16Sr序列，我们可以追踪细菌的演化过程，揭 示其自然历史和关系。
四、实验方法与技术路线
在进行16Sr研究时，我们需要采取一系列实验方法和步骤。首先，从环境中 采集样品并提取其总DNA；接着，利用PCR技术对16Sr基因进行扩增，得到特定长 度的DNA片段；随后，对这些片段进行测序，得到16Sr序列信息；最后，通过生 物信息学分析，对这些序列进行分类和比较。
在实验过程中，需要注意以下几点：首先是DNA提取的效率，必须确保能够 提取到足够纯度的DNA以供后续分析；其次是PCR扩增的特异性，要确保得到的序 列准确无误；最后是数据处理的过程，需要对测序结果进行深入分析和比对，才 能得出准确可靠的结论。
一株野生细菌的16Sr
目录
01 一、16Sr：揭开野生 细菌的神秘面纱
02
二、深入研究：16Sr 的关键角色
03 三、案例分析：16Sr 在研究中的应用
04
四、实验方法与技术 路线
05 五、总结
06 参考内容
在生物学的广袤领域中，微观世界的研究往往揭示出令人惊奇的发现。今天， 我们将聚焦于一个非常特别的主题——一株野生细菌的16Sr。这个看似微不足道 的生物实体，其实隐藏着巨大的奥秘。在本次演示中，我们将探讨16Sr的背景、 研究方法及其在野生细菌研究中的应用和意义。
2、避免过度清洗：过度清洗可能会破坏阴道菌群的平衡，引发BV。

一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。

16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。

5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。

而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：PCR实验原理即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0）三、操作方法1. 细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。

第33卷第3期广东海洋大学学报V ol.33No.3 2013年6月Journal of Guangdong Ocean University Jun. 2013环境16S rDNA和16S rcDNA序列分析湖光岩玛珥湖的浮游细菌组成秦青英1，曾永辉1，郭倩茹1，简纪常1，鲁义善1，吴灶和1,2（1. 广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524088；2. 仲恺农业工程学院，广东广州 510000）摘要：通过提取环境总16S rDNA和总16S rRNA分别构建DNA克隆文库和反转录cDNA文库，并进行克隆测序和序列分析，探讨湖光岩玛珥湖浮游细菌和浮游活性细菌的遗传多样性。

结果表明：构建两个水层的4个克隆文库，即1 m和10 m水层总菌的16S rDNA文库和总活性菌的16S rcDNA文库，共获得413条序列，分属15门、32目、52科；1 m水层的rDNA文库与rcDNA文库中Verrucomicrobia类群所占比例最大（36.8%和32.1%），其次为Alphaproteobacteria（15.1%和16%）和Betaproteobacteria（17.9%和16%）；在10 m水层的2个文库中，Alphaproteobacteria 类群均占绝对优势，分别为63.5%（rDNA）和43.8%（rcDNA），其次为Verrucomicrobia（11.5%和14.3%），其他细菌类群包括Acidobacteria、Chloroflexi、Firmicutes、待定门OD1、Planctomycetes、Spirochetes和Deltaproteobacteria，比例在0.8% ~ 3.8%之间；在科的水平上，SAR11为湖光岩玛珥湖最为丰富的类群，占总克隆数的26.9%，其中在10 m水层的比例高达51.5%。

序列同源性分析表明，绝大多数序列（89.8%）来源于新种，其中19.6%的序列可能来自于新属，69%的序列可能来自于全新的科。

一、16s rRNA基因的概述16s rRNA基因是一种真核生物和原核生物细胞中普遍存在的一种小分子RNA，其分子量约为1.5千克以上。

16s rRNA基因在细胞中广泛存在，通常以一定的拷贝数和特定序列存在于细胞的染色体或质体中。

该基因编码的16s rRNA是细菌和古菌核糖体的一个组成部分,在真核细胞中存在于线粒体和叶绿体的核糖体中。

16s rRNA基因的序列具有高度保守性和较为丰富的变异性，因此被广泛应用于系统发育关系的研究以及微生物的分类和鉴定。

二、16s rRNA基因的结构16s rRNA基因通常包含了两个高度可变的区域（V1和V2）和九个保守的区域（3’端的V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9和5’端的V1、V2）。

这些可变的区域和保守的区域交替排列在16s rRNA基因序列上。

保守的区域用于设计引物，进行PCR扩增，而可变的区域则用于分析微生物的系统发育和分类。

三、16s rRNA基因在微生物分类中的应用16s rRNA基因作为一种广泛存在于生物体中的遗传物质，在微生物分类学领域有着重要的应用价值。

通过对不同微生物16s rRNA基因序列的比对和分析，可以研究微生物之间的亲缘关系，揭示微生物的系统进化关系。

通过对16s rRNA基因进行PCR扩增和测序分析，还可以对微生物进行分类和鉴定，进而应用于环境微生物的监测和生物技术领域。

四、16s rRNA基因的序列分析技术1. 提取DNA样本：从微生物样本中提取全基因组DNA，通过裂解和酶解等步骤获得纯净的DNA。

2. PCR扩增：设计合适的引物，对16s rRNA基因的特定区域进行PCR扩增，获取所需的基因片段。

3. 序列测定：对PCR产物进行测序，获取16s rRNA基因片段的DNA序列。

4. 比对和分析：利用生物信息学软件对得到的16s rRNA序列进行比对和分析，确定微生物的系统发育关系和进行分类鉴定。

五、16s rRNA基因序列分析在环境微生物研究中的应用1. 环境微生物多样性研究：通过对不同环境样品中微生物的16s rRNA 基因进行测序和分析，可以揭示该环境中微生物的多样性和裙落结构特点。

关于细菌的16srRNA和16srDNA分子生物学技术的应用使肠道微生态学的研究取得了突破性的发展。

目前研究最多的是16S rRNA。

近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的16SrRNA进行研究，得到了广泛的细菌16SrRNA序列库。

使用该方法可以检测肠道中常规方法不能培养或生长缓慢的细菌。

rRNA分子在生物体中普遍存在，生物细胞rRNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列。

在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,在结构上可分为保守区(conserveddomain)和可变区(variabledomain), 保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。

研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生(phylogenesis)关系。

细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。

其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16SrRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。

16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成[62]。

因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。

Woese(1980)在比较200多种原核生物和真核生物的16S(或18S)rRNA/rDNA的核苷酸序列谱后,定义建立了古细菌界(包括产甲烷菌、极端嗜盐菌和极端嗜热菌),将生物界重新划分为3主干6界系统,即古细菌、真细菌和真核生物3个主干,真核生物又包括原生动物、真菌、植物和动物4界。

·综　述·收稿日期:2003-04-10作者简介:乐毅全(1962-),男,浙江宁波人,现就读于同济大学环境工程专业博士研究生,讲师。

16S rRNA 基因技术在环境科学领域中的应用乐毅全,顾国维(同济大学污染控制与资源化国家重点实验室,上海　200092) 摘要:随着分子生物学的发展,16S r RNA 基因技术被逐渐应用到环境科学领域中。

目前在环境保护和治理中,该技术主要被用于鉴定污染物的生物降解菌和分析环境样品中的微生物群落多样性,由于它不必将微生物培养分离出来,也就避免了在培养过程中可能出现的微生物丢失的情况。

本文对16S r RN A 基因技术及其在环境科学领域中的应用现状和发展作了一简要介绍,并对16S r RNA 基因技术存在的不足进行了讨论。

关　键　词:16S r RNA 基因序列;DNA 扩增;多样性分析中图分类号:Q 938 文献标识码:A 文章编号:1001-3644(2003)06-0001-04The Application of 16S rRNA Gene Technology on Environmental SciencesLE Yi -quan ,GU Guo -w ei(National K ey L aboratory of Pollution Control and Resources Reuse ,Tongji University ,S hanghai 200092,China )A bstract :With the development of mo lecular biology ,the 16S rRNA gene technique has been gradually used in environmental sci -ences .N ow ,this technique has been mainly applied to identify the pollutant -biodegradation bacteria and to analyse the diversity of mi -croorganism community in enviro nmental samples .Because it is unnecessary to culture the microorg anisms by traditional metho ds ,it can avoid the situation of losing the microorg anisms during the culture .I n this paper ,it briefly introduces that the development and the use of 16S rRN A gene technique on enviro nmental sciences .T he disadvantage of 16S rRNA gene technique is also discussed .Key words :16S rRNA g ene sequence ;DNA amplifica tio n ;diversity analysis 1　微生物体内的16S rRNA 基因及其应用核糖体存在于每个合成蛋白质的细胞中,在原核微生物中,核糖体是分散在细胞质中的亚微颗粒,细菌的核糖体由三种相对分子量不同的rRNA 组成,分别为5S rRNA 、16S rRNA 和23S rRNA 。

第35卷第9期2015年5月生态学报ACTA ECOLOGICA SINICA Vol.35,No.9May,2015基金项目:国家重点基础研究发展规划资助项目(2013CB733502);国家自然科学基金资助项目(41371268,31300447)收稿日期:2013⁃06⁃18; 网络出版日期:2014⁃05⁃22*通讯作者Corresponding author.E⁃mail:lixz@DOI :10.5846/stxb201306181726刘驰,李家宝,芮俊鹏,安家兴,李香真.16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用.生态学报,2015,35(9):2769⁃2788.Liu C,Li J B,Rui J P,An J X,Li X Z.The applications of the 16S rRNA gene in microbial ecology:current situation and problems.Acta Ecologica Sinica,2015,35(9):2769⁃2788.16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用刘　驰1,2,3,李家宝1,2,芮俊鹏1,2,安家兴1,2,李香真1,2,*1中国科学院环境与应用微生物重点实验室,成都　6100412环境微生物四川省重点实验室,中国科学院成都生物研究所,成都　6100413中国科学院大学,北京　100049摘要:16S rRNA (Small subunit ribosomal RNA)基因是对原核微生物进行系统进化分类研究时最常用的分子标志物(Biomarker),广泛应用于微生物生态学研究中㊂近些年来随着高通量测序技术及数据分析方法等的不断进步,大量基于16S rRNA 基因的研究使得微生物生态学得到了快速发展,然而使用16S rRNA 基因作为分子标志物时也存在诸多问题,比如水平基因转移㊁多拷贝的异质性㊁基因扩增效率的差异㊁数据分析方法的选择等,这些问题影响了微生物群落组成和多样性分析时的准确性㊂对当前使用16S rRNA 基因分析微生物群落组成和多样性的进展情况做一总结,重点讨论当前存在的主要问题以及各种分析方法的发展,尤其是与高通量测序技术有关的实验和数据处理问题㊂关键词:16S rRNA 基因;微生物群落;多样性;高通量测序;生物信息数据处理The applications of the 16S rRNA gene in microbial ecology :current situation and problemsLIU Chi 1,2,3,LI Jiabao 1,2,RUI Junpeng 1,2,AN Jiaxing 1,2,LI Xiangzhen 1,2,*1Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology ,Chinese Academy of Sciences ,Chengdu 610041,China2Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province ,Chengdu Institute of Biology ,Chinese Academy of Sciences ,Chengdu 610041,China 3University of Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100049,China Abstract :The 16S rRNA (small subunit ribosomal RNA)gene is a universal marker for phylogenetic reconstructions to approximate the tree of life owing to its presence in all prokaryotes and its high conservation.Sequencing of 16S rRNA genes amplified directly from environmental samples is commonly used to study microbial community composition and diversity.Great advances in pyrosequencing technology and bioinformatics in recent years enable us to obtain sequence data from large⁃scale environmental samples efficiently and cost⁃effectively.However,some critical problems need to be addressed when the 16S rRNA gene is used for microbial diversity studies,such as horizontal gene transfer (HGT),intragenomic heterogeneity,PCR amplification efficiency,and sequencing data analysis.In this review,we summarize the state⁃of⁃the⁃art applications of 16S rRNA gene as a biomarker for microbial ecology studies,and introduce current pyrosequencing techniques and bioinformatics for large⁃scale data analysis.This review focuses on four aspects.(i)We introduce the structure and properties of the 16S rRNA gene,e.g.the primary and secondary structure,HGT and heterogeneities of 16S rRNA genes.Based on current available microbial genomes,multi⁃copy and intragenomic heterogeneities of 16S rRNA genes are recognized.These phenomena may seriously bias the estimations of microbial diversity in environmental samples.Some online tools and databases used for analysis of the 16S rRNA gene sequencing data are also introduced.These tools are used0772　生　态　学　报 35卷　to predict horizontal gene transfer,secondary structure,and to align and classify16S rRNA gene sequences.(ii)We introduce some16S rRNA⁃based techniques commonly used in microbial ecology studies,such as fingerprinting profiling, hybridization,microarray,and high throughput pyrosequencing methods.We compare the advantages and limitations of various methods and recommend how to use them properly based on a specific target.Different methods have different resolutions and detection limitations.Low⁃resolution profiling methods potentially miss some important information and make it difficult to detail the phylogenetic composition of an environmental sample.Pyrosequencing technique is highly recommended in the future for microbial ecology study.Several sequencing platforms,e.g.Roche454,Ion Torrent and MiSeq,are compared.(iii)We evaluate the biases that may be introduced during sample preparation and PCR procedures, e.g.DNA extraction,primer selection,PCR optimization,PCR product purification,and data analysis.Amplicon sequencing method suffers from a high level of sequencing and amplification artifacts.It is important to select OTU (operational taxonomic units)classification and chimera removing algorithms.In this case,the Uchime and Uparse are recommended for microbial amplicon pyrosequencing reads.(iv)We introduce some bioinformatics tools for pyrosequencing data analysis,such as chimera check and diversity index calculation.The most popular pipelines for pyrosequencing data analysis include RDP,QIIME and Mothur.In order to link ecological questions with microbial composition data,the methods of ecological statistics must be employed to build the relationships of microbial datasets with environmental variables.Here,we introduce some multiple statistical methods,e.g.PCA and UniFrac analysis.Based on these analyses, microbial data based on16S rRNA sequencing are linked to the environmental variables,and fundamental ecological questions are addressed.Finally,we recommend researchers to consider these problems systematically when using16S rRNA⁃based techniques in microbial ecology study.Key Words:16S rRNA gene;microbial community;microbial diversity;pyrosequencing;bioinformatics微生物是地球上数量最多和多样性最高的生物,1g土壤中仅细菌就可能有109个㊂由于大多数微生物尚不能纯培养,传统的微生物研究方法,如显微镜微形态观察㊁选择性培养基计数㊁纯菌种分离和生理生化鉴定等,在微生物多样性研究中都存在很大的局限性㊂基于非培养基础上的分子生物学方法可以使人们快速㊁系统地分析环境样品中微生物组成㊁结构和多样性,极大地促进了微生物生态学的发展㊂Zuckerkandl等首次提出使用基因序列作为分子钟来分析生物间的亲缘关系[1]Woese Fox16S rRNA的系统进化关系进行了分析,提出了著名的 三域学说”[2]㊂物,㊁基于16S rRNA信息的系统分类结果与基于全基因组信息的分类结果很相似[3]㊂随着测序技术的发展,人们可以更加快捷地获得环境样品中的16S rRNA基因序列,这些序列信息可以和数据库中的已知信息进行比对,以研究环境样品中微生物群落的特点㊂本文主要针对当前使用16S rRNA基因分析微生物群落结构和多样性的现状进行总结,重点讨论当前技术的发展状况和存在的主要问题㊂1　16S rRNA基因的特点微生物rRNA在漫长的进化过程中,由于其在碱基组成㊁核苷酸序列㊁高级结构及生物功能等方面表现出高度保守性而有微生物 化石”之称㊂保守性能够反映微生物之间的亲缘关系,为系统发育重建提供线索㊂然而rRNA的序列组成也不是完全保持恒定的,其具有一定的可变性,这种可变性能够反应出不同微生物的特征核酸序列,可以作为微生物多样性分析的分子基础㊂原核微生物的rRNA按沉降系数可以分为5S㊁16S 和23S rRNA,大小分别约为120bp㊁1540bp和2904bp左右(以Escherichia coli为例5S rRNA ,,,;相反,23S rRNA含有的核苷酸序列较长,分析较困难㊂16S rRNA占细菌总RNA量的80%以上,基因序列长短适中,其结构中既有保守区域又有变异区域,是较好的生物标志物16S rRNA 基因不同区域序列的可变性将其分为9个可变区和9个保守区(图1)㊂图1　16S rRNA 基因保守区和可变区的分布Fig.1　Conserved and variable regions in the 16S rRNA gene虽然16S rRNA 基因被广泛应用于微生物多样性分析中,然而对于某些属的菌群分辨效果较差,如Vibrio ㊁Pseudomonas 等[5]㊂人们一般设定16S rRNA 基因序列相似性³97%的原核生物为同一个种,但很多不同种的微生物其16S rRNA 基因序列相似性却高于97%㊂另外,许多细菌的16S rRNA 基因是多拷贝的,而且各拷贝的序列组成存在一些差异;16S rRNA 基因也存在着水平转移问题,这些都直接影响着对原核微生物群落结构和多样性的分析㊂1.1　基因水平转移(HGT)人们以前曾普遍认为16S rRNA 基因不存在水平转移现象,然而一些研究发现,在许多细菌中16S rRNA 基因都出现了水平转移[6⁃7]㊂在对Pseudomonas 属的研究中发现,有些种的V1区和V3区中的48.3%和41.6%的16S rRNA 基因序列可能是从另一个距离较远的种通过基因水平转移得到的,因此,应该避免使用这些可变区对Pseudomonas 进行种间分类[7]㊂Choi 等在对Pfam 数据库蛋白结构域分析时发现已有的微生物可能发生过基因水平转移的占1.1% 9.7%,其中多于一个蛋白结构域基因发生水平转移的古菌占一半以上,而细菌占30% 50%,真核生物不到10%,这说明原核微生物发生基因水平转移的频率远远大于高等生物,他们也通过对比发现HGT 对于群落SSU (small subunit)rRNA 基因整体的系统发育分析影响不大[8]㊂Garcia⁃Valle 等建立了基因水平转移数据库(HGT⁃DB),收录了多种微生物发生基因水平转移的数据和相关证据[9]㊂1.2　16S rRNA 基因的多拷贝及异质性很多原核微生物基因组中rRNA 基因是多拷贝的,同一菌种中不同拷贝的基因序列也可能存在差异(异质性)[10]㊂Větrovsky ′等研究了1690种已知的细菌基因组,发现只有15%的基因组中16S rRNA 基因是单拷贝的,21%的基因组含有3 7个拷贝,最大的拷贝数是15(Brevibacillus brevis NBRC 100599和Photobacteriumprofundum SS9),2.4%的基因组中16S rRNA 基因具有1%以上的序列差异[11]㊂在此之前,Pei 等[12]通过对数据库中的rRNA 序列进行分析时也发现,425个种都具有2 15个不等的rRNA 基因拷贝数(2.22±0.81),如古菌一般含2 4个,氨氧化细菌含1 2个,固氮菌一般含1 3个;235个基因组中16S rRNA 基因序列异质性变化在0.06% 20.38%之间,例如古菌Haloarcula marismortui 基因组含有的两种16S rRNA 基因序列差异性达到了5%㊂多拷贝的存在给微生物群落的定量分析带来诸多问题,使群落的多样性估计和结构分析存在较大的偏差[13]㊂Větrovsky ′等使用高通量测序法分析土壤细菌时发现具有低拷贝16S rRNA 基因的类群如Acidobacteria 的丰度会被低估,而具有高拷贝16S rRNA 基因的类群如Gammaproteobacteria 的丰度会被高估㊂在某些特定情况下,对于拷贝数多或异质性大的菌群可以用其它替代性的单拷贝基因来分析其多样性或进化关系,如GroEL 伴侣蛋白,RNA 聚合酶β亚基(rpoB ),DNA 回旋酶β亚基(gyrB )和热休克蛋白(dnaK )等[14⁃15]㊂也有人使用hsp 60进行Enterobacter 的系统进化和分类研究[16]㊂异质性问题对16S rRNA 基因高通量测序研究的影响还需要进一步系统性评估㊂1772　9期 刘驰　等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用　2772　生　态　学　报 35卷　1.3　16S rRNA序列的二级结构不论种间的16S rRNA基因序列差异有多大,在进化过程中16S rRNA都保留了相似的二级结构,与Escherichia coli的二级结构相似性很高[17]㊂Thermoanaerobacter tengcongensis含有4个16S rRNA基因,这些基因的一级结构差别达到了6.7%,但二级结构却是很保守的[12]㊂研究者通过元基因组学方法发现其它细菌rRNA序列与Escherichia coli的16S rRNA序列相似性为80.9% 99.0%时,它们的rRNA操纵子可以通用,只不过代时将会增加,这个研究表明保持二级结构是维持rRNA功能的重要前提㊂虽然HGT对微生物群落多样性的分析结果影响较小,但如果进行研究的某些微生物类群中16S rRNA基因发生HGT可能性较大,要精确构建进化树则需根据已有的实验经验综合进行分析㊂RNA分子具有降解速度快且难以结晶的特点使得难于通过X射线晶体衍射和NMR(Nuclear Magnetic Resonance)等方法提高对RNA分子空间结构的认识,因此利用各种计算方法从理论上分析rRNA的空间结构是目前主要的方法㊂原核微生物16S rRNA的二级结构相对于一级结构更加保守,因而研究二级结构对于系统进化分类很有意义[18],尤其是对于种属的鉴定[19]㊂很多序列比对分析软件都考虑了二级结构,如RDP aligner㊁ARB(http://www.arb⁃home.de/)㊁SSU⁃ALIGN(/software/ssu⁃align/)等[20⁃21],使系统进化分类结果更加快速准确㊂rRNA二级结构分析编辑可使用ARB[22]和jphydit(http://plaza.snu.ac. kr/ jchun/jphydit/index.php)等㊂RNA二级结构的预测主要包括2种方法:最小自由能算法和序列比较分析方法㊂当前核酸数据库日益庞大,数据量呈指数性地增长,在16S rRNA一级结构的基础上进行二级结构分析对序列比对㊁OTU(operational taxonomic units)分类就变得更加重要[23⁃24],因此应该加强二级结构分析预测算法及软件的研究㊂1.4　16S rRNA基因序列分析数据库研究者们已经建立了一些专门针对于16S rRNA的数据库,储存16S rRNA基因序列,通过互联网对新测定的序列进行比对分析,比较著名的数据库有SILVA(http://www.arb⁃silva.de)[25]㊁RDP(http://rdp.cme.msu. edu/)[21]和Greengenes(/)[26],人们可以从这些数据库中获取高质量的16S rRNA基因序列信息㊂rrnDB(/rrndb)数据库专门用于记录细菌和古菌基因组中rRNA和tRNA基因的拷贝数[27]㊂在NCBI㊁DDBJ和EMBL数据库中也有许多16S rRNA基因全长和短序列,如NCBI Genbank中有几十万条大于1000bp的人体微生物群落的16S rRNA序列㊂某些领域也建立了一些专业的数据库,如病原微生物16SpathDB(http://147.8.74.24/16SpathDB)数据库,可用于鉴定对临床重要的细菌16S rRNA序列[28];CORE[29]是人体口腔微生物方面的专业数据库㊂Comparative RNA Web Site(http://www.rna. /)是分析rRNA二级结构的数据库㊂EzTaxon⁃e收集了已培养或未培养微生物的16S rRNA序列信息,常用于鉴定新分离的菌株[30]㊂probeBase可用来检索与16S rRNA有关的探针[31]㊂2　16S rRNA基因在研究微生物群落中的应用常规的微生物分子生物学研究方法如分子杂交㊁SSCP㊁DGGE㊁RFLP㊁ERIC⁃PCR㊁FISH及克隆文库法等相对简单,易于实验操作,但得到的信息量有限,分辨率普遍较低㊂近些年来发展起来的高通量测序[32⁃33]和基因芯片技术[34⁃35]强有力地推进了微生物生态学的研究㊂尽管每种方法都有各自的局限性,但这些技术的应用使人们对环境中的微生物群落有了更深入的认识[35⁃36]㊂图2勾画出了常用的利用16S rRNA基因分析微生物群落结构和多样性的基本流程㊂2.1　指纹图谱技术基于16S rRNA基因的指纹图谱技术如DGGE㊁TGGE㊁SSCP㊁ARDRA和T⁃RFLP等被广泛用于微生物群落的研究中[37]㊂由于指纹图谱技术的操作相对较简单,在环境微生物动态监测和分析等方面得到了广泛应用[38⁃39]㊂表1列出了常见的指纹图谱分析方法的原理和优缺点,并与多基因序列分析(MLSA)进行比较㊂图2　基于16S rRNA 基因的微生物群落多样性分析的主要流程Fig.2　Pipelines for microbial diversity analysis based on the 16S rRNA gene表1　各种rRNA 分析技术的原理和比较Table 1　Comparisons of fingerprinting profiling techniques方法Method原理Principle 特点Characteristic 参考文献References 核糖体分型(Ribotyping)利用限制性内切酶对整个基因组进行酶切,用标记的16S rRNA 基因探针与之杂交,检测相应的RNA 操纵子的位置只与限制性酶切位点的变化相关,需进行杂交试验,较费时[40]扩增性rDNA 限制性酶切片段分析(ARDRA)对16S rRNA 基因扩增或克隆产物进行限制性酶切片段长度多态性分析分辨率高,与限制性位点有关,费时[41]末端限制性片段长度多态性分析(T⁃RFLP)通过PCR 技术㊁DNA 限制性酶切技术和荧光标记技术得到末端带有荧光标记的限制性多态性片段方便快捷,灵敏度高,并只与末端限制性片段的大小有关[39]16S 23S 内部转录间隔区(ITS)分型ITS 片段在进化过程中产生更多的变异,即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS 序列上表现出差异比16S rRNA 基因序列具有更大的变异,对亲缘性更近的种属分型更有用[42]核糖体ITS 区自动分型(ARISA)利用荧光标记微生物核糖体基因间隔区(ITS)对差异进行分析分辨率较高[43]限制性片段长度多态性分析(RFLP)整个rRNA 基因的限制性片段长度多态性分析灵敏度高,操作要求高,分析较复杂[44]变性梯度凝胶电泳(DGGE)DNA 在不同浓度的变性剂中解链行为不同,导致电泳迁移率发生变化,从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA 片段分开检测片段在500bp 以内为宜,中等分辨率,只能检测优势菌群[45]温度梯度凝胶电泳(TGGE)DNA 在不同温度梯度环境中解链行为的不同会导致电泳迁移率发生变化大片段DNA 由于Tm 值较高,检测难度较大[46]单链构象多态性(SSCP)单链DNA 的构象差异导致其在凝胶电泳中的迁移率变化分辨率中等,检测片段小于400bp 最为理想[47]多基因序列分析(MLSA)通常对几个长度为500bp 左右的目的基因进行测序,用于进化分析能有效地在种水平上鉴定菌株,还可用于生态型的划分[48] ARDRA:amplified ribosomal DNA restriction analysis;T⁃RFLP:terminal restriction fragment length polymorphism;ITS:internally transcribedspacer;ARISA:Automated ribosomal intergenic spacer analysis;RFLP:Restriction fragment length polymorphism;DGGE:Denaturing gradient gel electrophoresis;TGGE:Temperature gradient gel electrophoresis;SSCP:Single⁃strand conformation polymorphism;MLSA:Multilocus sequence analysis 3772　9期 刘驰　等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用　4772　生　态　学　报 35卷　整体来看,指纹图谱技术通量和分辨率比较低,可以用来对样品进行初步的筛选或评估,例如有时为了减少测序量,可以先进行ARDRA或其它方法分型,然后根据分型结果对有代表性的样品再进一步研究㊂某些情况下如果仅使用16S rRNA的信息,分辨效果可能不是太好,可使用其它一些分子分析方法作为补充㊂相比16S rRNA和23S rRNA来说,ITS序列在进化过程中由于面临着较小的选择压力故存在较大的变异,因此ITS 的长度和序列的多态性能用来区分不同种的原核生物[42]㊂在种的水平上,MLSA也是鉴定菌株非常好的方法[48],可利用16S rRNA基因序列和各种指纹技术将未知菌株聚类到一个科或属里,然后根据这一组菌株的特点选择某些代表性的标记基因进行MLSA分析,从而进行种㊁亚种以及生态型的划分㊂有时也可参考数据库MLST()或PubMLST()进行一些病原微生物的多位点序列分型方面的信息查询㊂某些微生物之间的16S rRNA基因序列几乎相同,但是DNA杂交值却明显低于70%,因此它们代表着不同的种㊂16S rRNA基因同源性低于97%的菌株间其基因组DNA的相似性均低于60%㊂DNA⁃DNA杂交(DDH,whole genomic DNA⁃DNA hybridization)实验操作复杂,不适合进行较大范围的系统分类研究,因此16S rRNA序列分析的结果可以说明是否有必要进行DDH实验㊂随着高质量序列数据的快速增长,ANI(average nucleotide identity)作为一种很精确且方便使用的分类方法,应用越来越广泛[49]㊂2.2　荧光原位杂交技术(FISH)FISH技术是一种不依赖PCR的分子技术,它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性,可原位监测和鉴定样品中不同的微生物个体,已经广泛应用于微生物定量分析和群落结构分析[50⁃51]㊂FISH的原理是根据待测微生物的16S rRNA基因中的保守序列,设计相应的特异性寡核苷酸探针,并进行荧光标记,通过探针与环境基因组中的DNA分子进行杂交,检测该特异微生物种群的存在和丰度㊂利用分子遗传上保守性不同的特异序列,可以在不同的分类水平(如属㊁种等)上进行检测㊂当前的荧光探针安全且具有很好的分辨力,如果使用具有不同激发和散射波长的荧光染料标记探针,可同时检测多个靶序列[52⁃53]㊂FISH技术与其它方法结合能够更好地发挥优势,这些技术包括microcolony⁃FISH㊁DVC⁃FISH㊁in situ PCR⁃FISH㊁CPRINS⁃FISH㊁CARD⁃FISH㊁MAR⁃FISH等[53⁃54],其中CARD⁃FISH技术很好地解决了目标微生物数量较少时信号检测灵敏度低的问题[55]㊂Behrens等利用EL⁃FISH与NanoSIMS技术进行了微生物群落中单细胞进化分类和代谢活性的研究[56]㊂FISH技术成功应用的关键在于设计和获得具有高灵敏性和专一性的寡核苷酸探针以减少干扰,可使用ARB软件包结合probeBase数据库等多种方法进行探针分析和设计㊂综合来看,应用FISH技术不仅能研究微生物群落的结构特征和空间分布,还可以跟踪微生物种群的动态变化,此外利用mRNA等作为目标分子还可以进行群落代谢方面的研究㊂2.3　实时定量PCR(qRT⁃PCR)qRT⁃PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量的分析,具有特异性强㊁重复性好㊁准确快速等优点㊂通常使用的荧光化学方法有TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法等㊂许多因素都会影响qRT⁃PCR反应在定量上的准确性,如细胞裂解效率㊁抑制剂的去除程度㊁SYBR GreenⅠ的浓度㊁同源和异源DNA背景㊁操作流程设计㊁目标基因的选择以及PCR产物的长度等,因此在操作时需要优化条件,最大化地减小误差[57⁃60]㊂各种qRT⁃PCR方法都有其自身的优缺点,操作时需要根据实验设计特点选择㊂对于特定类群微生物也可使用一些功能基因代替16S rRNA基因进行定量,如利用mcr基因定量产甲烷菌[58]㊂在绝对定量时,要用到标准样品,可以用带有特定基因的质粒,或者利用直接从环境样品中扩增的PCR产物做标准样品㊂各种实验操作因素(不同反应批次的差异㊁加液误差等)对qRT⁃PCR结果影响很大,因此在定量多个环境样品时,最好能用96或384孔的反应板一次完成㊂qRT⁃PCR既可以对微生物群落的总体进行定量分析,也可以对具体的种属进行定量研究㊂某些种属的16S rRNA基因分辨率较低,可使用一些功能基因进行定量,如使用特异的invA基因研究Salmonella属㊂Liu 等设计了一种新的qRT⁃PCR方法用于定量分析群落16S rRNA基因的丰度,并分析了rRNA基因拷贝数等对定量的影响[13]㊂qRT⁃PCR与其它技术相结合使用可更好地研究群落的结构和多样性,如指纹图谱技术㊁测序技术等[61]㊂2.4　基因芯片技术基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性㊁多样化㊁微型化和自动化㊂基因芯片的测定结果与高通量测序[62]㊁qRT⁃PCR[63]的结果有很好的一致性㊂根据已知的基因序列信息,研究者们设计出了许多基因芯片进行微生物群落结构和功能的研究,包括基因组芯片㊁功能基因芯片和系统进化芯片等,主要用于评估多样性和鉴定病原菌等㊂其中系统进化芯片(PhyloChip)是含有与SSU RNA基因序列互补的寡核苷酸探针的阵列,适合于微生物群落结构组成和动态变化分析㊂PhyloChip已应用于研究人的肠道㊁口腔以及水体㊁土壤和植物根系等微生物群落[64⁃66]㊂利用微生物的功能基因作为探针开发出的功能基因芯片 GeoChip[67],已广泛应用于检测各种环境样品中微生物群落的功能基因[68⁃69]㊂基因芯片的信号扫描及数据处理有许多商业软件可供使用,一些开源工具如Bioconductor平台(/)[70]和R语言(http://www.r⁃/)也常用于基因芯片的数据分析中㊂在定性分析方面,基因芯片是根据已知的基因序列信息制作的,因此无法检测到未知的基因信息,也可能检测不到那些丰度较低的基因㊂检测范围较广的基因芯片由于探针数目太多易产生假阳性,设计特异性探针能够克服这类问题,比如近些年来开发出专门用于检测人体微生物相关菌群的HITChip[71]及用于检测口腔微生物的OC Chip[72]等㊂在定量分析方面,由于某些菌rRNA基因操纵子是多拷贝的,而使测定的信号总量代表的是16S rRNA基因的总拷贝数,只有使用改进的算法才能更精确地进行定量分析[73]㊂与高通量测序相比,基因芯片方法实验费用低,数据分析过程相对简单,有时在研究特定的菌群和功能基因时,基因芯片技术是一个较好的选择㊂而高通量测序是一个 开放系统”,可以探测到环境中新的基因信息,信息更加系统㊁丰富,但需要利用生物信息学方法和生物化学知识对序列数据进行深入挖掘㊂2.5　高通量测序技术要全面系统地分析微生物的多样性,首先要获取16S rRNA基因序列,如何快速准确地获取大量的序列信息就显得很重要㊂传统的Sanger测序方法操作复杂㊁通量低,难于解决这个问题㊂2005年,美国454Life Science公司首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的高通量测序系统,将第二代测序技术推向了市场㊂此后,Illumina公司和ABI公司相继推出了Hiseq和SOLiD等测序平台㊂现在利用高通量测序技术研究环境微生物多样性的报道越来越多,这些系统的主要优点在于通量高,而且利用Barcoded PCR技术使得在一次运行中能同时进行多样本的大规模测序,使测序成本大大降低㊂基于单分子测序原理的第三代测序技术也在迅速发展,Helicos Biosciences公司推出了单分子DNA测序仪tSMS Performance,PacBio与ZSGenetics公司也在大力研发新一代测序仪[74],第三代测序技术的进步将使测序更加快速准确,且能大大增加读长,而且可以直接对RNA测序㊂表2总结了几种最常用的高通量测序仪的主要技术参数㊂表2　目前常用的高通量测序平台的主要技术参数Table2　Main technical specifications of several pyrosequencing platform测序仪类型Platform运行时间Run time读长(bp)Length(bp)运行通量Throughput错误类型Error typeRoche454GS FLX Titanium XL+ 454GS FLX Titanium XLR7023h10h<1000<600≤700Mb≤450MbIndelIndelIllumina GAIIx HiSeq2000 MiSeq 14d11d65h2×2×2×300≤95Gb≤600Gb13.2 15GbSubstitutionSubstitutionSubstitutionLifeSOLiD5500xl8h75×35PE<300Gb(nanobeads)A⁃T bias Ion TorrentPGM316chip v2 4.9h400≤1Gb Indel 5772　9期 刘驰　等:16S rRNA基因在微生物生态学中的应用　6772　生　态　学　报 35卷 基于测序技术进行微生物多样性研究的方法主要有两种:一种是基于16S rRNA基因的扩增子测序,另一种是基于环境基因组DNA的宏基因组测序,两种方法各有优缺点[75⁃76]㊂相比之下,基于16S rRNA基因的高通量测序技术更加常用,并且消除了克隆问题,可以综合研究各个可变区,分析方法也相对成熟,不过在具体的实验分析中也存在着一些问题需要解决,例如PCR扩增的偏差㊁扩增错误㊁测序错误等都可能影响群落α⁃多样性的准确估计[77⁃79]㊂在16S rRNA基因扩增子测序中,Roche GS FLX+测序平台理论读长最高可以达到1000bp,一块PTP板可获得超过80万条序列,而Illumina测序平台具有通量高的优点[80],使得Miseq和Hiseq系列测序仪广泛用于微生物生态学研究中㊂宏基因组测序无需PCR扩增,既可以研究微生物的群落组成和多样性,也可以反映群落的很多代谢特征,但数据分析相对复杂㊂3　16S rRNA基因实验操作过程中的问题3.1　核酸提取环境基因组总DNA的提取效率影响着对微生物群落组成的准确鉴定和定量分析㊂核酸提取主要分为细胞破碎㊁核酸沉淀以及后续纯化三个环节㊂环境样品DNA提取过程中,不完全的细胞裂解㊁基质对DNA的吸附㊁酶抑制剂的共提取以及提取过程中DNA或RNA的降解是主要的一些问题[81],尤其是土壤样品,提取DNA或RNA过程中往往浸提出腐殖酸物质,抑制PCR或反转录反应㊂商业化的试剂盒(比如MP公司的FastDNA Kit for Soil㊁Mo Bio公司的PowerSoil DNA Isolation Kit等)能够部分解决此问题,不过价格较贵㊂其它成本较低的方法包括SDS裂解法㊁酶解法㊁玻璃珠破碎法及超声波破碎法等,这些方法提取的DNA往往需要后续再纯化以满足实验需要㊂对于抑制物含量较高的土壤DNA,可以用水稀释或利用CTAB方法进一步纯化后再扩增㊂研究表明,初步提取的DNA利用CTAB或/和PVPP可以有效去除大部分抑制剂或杂质[82]㊂针对不同的环境样品,应该根据文献报道的相关结果对DNA提取方法进行优化㊂Canto等在研究污泥微生物时使用不同的细胞直接裂解方法,获得了一种实用有效的DNA提取方法[83];Kuczynski等建议在研究复杂微生物群落时应使用多种方法进行细胞裂解[84];Flores等研究了一种新的直接PCR法以简化DNA提取步骤[85]㊂对于粘性土壤,可以加入skim milk以提高DNA的提取效率[86]㊂用试剂盒提取的DNA,进行qRT⁃PCR实验时的平行性往往优于自配试剂的提取方法㊂在进行样品总RNA提取过程中,要特别注意污染和降解问题[87],一些RNA酶抑制剂可以用于样品运输过程中的保存,以防止RNA降解,如RNA later和Methanol/ HEPES溶液[88]等㊂必须注意的是,要使结果分析重复性和精确性较高,在提取以及后面的操作过程中都要严格控制污染问题,因为相比在测序和分析过程中引入的偏差,实验污染等问题可能对结果影响更大㊂3.2　引物的选择16S rRNA基因不同区域的保守度是不一样的,因此扩增区域的选择会影响多样性的分析结果[89]㊂研究者们从各个方面对引物的选择问题进行了分析,主要有引物长度㊁扩增长度选择㊁引物覆盖度等㊂Cai等发现污泥微生物多样性分析与扩增区域有很大的关系,测序深度会影响低丰度细菌的鉴定[90]㊂利用27F/338R (V1 V2)引物,人们发现Verrucomicrobia类群在研究的土壤中数量相对较少,但改用515F/806R(V4)引物后,发现土壤中该类群的丰度变大[91]㊂理想的引物是能够尽量多地将环境样品中的基因扩增出来,同时又要能够区分出不同的种属㊂为了提高对环境样品DNA扩增的覆盖度,可以设计简并性通用引物,即使这样,也不能覆盖所有的菌群[92],而且,增加位点的非特异性可能会增大扩增偏差的概率㊂表3[93⁃101]列出了一些常用的16S rRNA基因的引物,不同的引物对不同种属的覆盖度不一样,某些引物对细菌有很高的覆盖率,某些专门针对古菌,还有些是细菌和古菌通用的引物㊂有的学者建议细菌与古菌群落应该分别用专用引物进行分析[102],而其他一些学者则直接使用细菌与古菌通用引物[95⁃96]㊂因此,在实验设计时需要考虑到实验目的而有针对性地进行选择,对不同的通用引物的覆盖能力要有个大致的了解㊂利用454GS FLX平台,测序长度可以达到800bp,然而PCR产物短时,得到的序列数量多㊁质量好,400bp左右的扩增子进行测序目前看来引物的选择很大程度上还是要根。

细菌或真菌菌种鉴定中的16SrRNA，18SrRNA等核糖体RNA的沉降系数：“S”（沉降速度）这个单位是不能直接简单相加的，因为它代表沉降速度的度量⽽不是质量。

每个亚基的沉降速度既受到其形状的影响，⼜受到其质量的影响。

原核细胞及真核细胞内共⽣体的70S核糖体中包含3种沉降系数不同的rRNA，其中30S核糖体亚基中包含16S rRNA，50S核糖体亚基中包含5S rRNA和23S rRNA。

这3种rRNA在结构上有明显的不同。

即原核⽣物中则含23S、16S和5S 三种rRNA。

由于不同种的真细菌与古细菌间的16S rRNA基因（16S rDNA）是⾼度保守的，16S rRNA作为研究分类学和系统进化的分⼦受到很⼤重视，16S rRNA序列分析是当前对细菌进⾏分类学研究中较精确的⼀种技术。

随着分⼦⽣物学的快速发展以及该技术在医学微⽣物研究中的应⽤，对16S rRNA作为微⽣物分类依据的研究也逐渐发展起来并已得到⼴泛认同。

真核⽣物80S核糖体中包含4种沉降系数不同的rRNA，其中，40S核糖体亚基（⼩亚基）中包含18S rRNA，⽽60S核糖体亚基（⼤亚基）中包含5S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA。

即真核细胞核糖体中通常含28S、18S、5.8S和5S 四种rRNA；真核细胞中的18S rRNA是16S rRNA的同源RNA，其相对分⼦质量约为0.7 MDa，长度约为1900 nt。

18S rRNA除了⽐16S rRNA稍长且多⼀些臂和环结构外，两者空间结构⼗分相似，在核糖体中起到的作⽤也基本相同。

所以就酵母⽽⾔，鉴定酵母菌株本⾝是需要进⾏18s鉴定，之所以酵母中同时出现了真核和原核的rRNA沉降系数，可能是因为该株酵母中含有共⽣体（线粒体，质体）。

利用16SrRNA基因序列鉴定奶牛乳腺炎致病菌的技术方法-奶牛养殖奶牛乳腺炎是困扰奶牛业发展的四大疾病之首，是最常见、治疗花费最高的疾病之一，主要是由病原微生物在奶牛乳腺内感染引起的炎症反应。

据统计，我国每年因乳房炎造成的经济损失达135亿元。

可以引起奶牛乳房炎的微生物种类有很多，如细菌、病毒、真菌、支原体等，目前从患有乳房炎的奶牛乳汁中分离到了160多种微生物，以细菌感染比较多见，引发该疾病的致病菌主要有葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，这三种细菌引起的乳腺炎占总发病率的90%以上。

本研究中，通过对乳腺炎患牛乳汁的病原菌培养、分离及药敏试验后，得到乳腺炎致病菌株，通过对其16S rRNA基因的序列进行分析，为该株致病菌的研究提供参考。

1、材料与方法乳腺炎致病菌分离将乳腺炎患牛乳汁稀释后，分别接种到血琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，恒温培养，观察记录菌落形态、大小及溶血情况，接种到肉羊培养基中增菌培养。

分离菌株药敏试验将上述分离的致病菌分别接种到肉汤培养基培养，周围黏贴药敏片，培养24 h，观察抑菌直径。

细菌学鉴定及致病性确定采用生化与革兰氏染色镜检，确定耐药菌形态，并进行细菌学分类。

抽取分离培养后的菌液500 μL，腹腔注射健康小鼠，24 h后观察小鼠发病情况，如小鼠死亡则认定该菌株具有致病性。

细菌16S rRNA基因克隆与测序使用细菌基因组DNA提取试剂盒对菌液进行基因组DNA的提取，后利用细菌16S rRNA基因通用引物（F：5 7- AGAGTTTGATCMTG-GCTCAG - 3&amp;acute;; R:5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）进行细菌16S rRNA基因PCR扩增（扩增体积为50lJL;条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；最后72℃终延伸10 min，4℃结束反应），电泳以及胶回收后，连接pMD - 18T载体连接克隆，经过筛选后将有16S rRNA基因序列插入的质粒提取测序。

16s rrna 名词解释
16S rRNA是ribosomal RNA（核糖体RNA）的一种，它是原核生物（如细菌和古菌）核糖体30S小亚基的组成部分。

在核糖体中，rRNA与蛋白质结合，形成核糖体的结构，用于蛋白质合成过程中mRNA和tRNA的结合。

16S rRNA的“16S”表示沉降系数，是描述分子在离心过程中沉降速度的一个指标。

rRNA的“r”代表riboso mal（核糖体的），而“NA”表示nucleic acid（核酸）。

因此，16S rRNA可以理解为具有特定沉降系数的核糖体R NA分子。

16S rRNA基因是编码16S rRNA的DNA序列，存在于细菌和古菌的基因组中。

这些基因通常是高度保守的，因为它们在进化过程中对于生物体的生存至关重要。

16S r RNA基因的序列包含了特定的功能域，如与mRNA结合的SD序列（起始位点序列），以及与23S rRNA相互作用的区域。

在分子生物学中，16S rRNA基因经常被用于细菌和古菌的鉴定和分类，通过比较不同菌株的16S rRNA基因序列，可以构建系统发育树，从而了解它们之间的亲缘关系。

16S rRNA基因的测序和分析是微生物生态学、环境监测和临床诊断等领域的重要工具。

16s rdna序列16s rrna基因序列-回复什么是16S rDNA序列和16S rRNA基因序列？16S rDNA序列和16S rRNA基因序列是用于研究微生物多样性和分类的重要工具。

它们可以提供关于微生物环境中存在的细菌和古菌的信息。

尤其是16S rDNA序列因其在不同微生物中的高度保守性和可变性而被广泛应用。

16S rDNA序列是16S ribosomal DNA序列的简称，它是细菌和古菌基因组中编码16S rRNA基因的一部分。

16S rRNA是小核糖体亚单位的组成部分之一，它在细胞质内形成核糖体的重要组成部分。

16S rDNA序列包含一段由保守和可变的核苷酸序列组成的区域，这些序列在不同微生物中具有一定的差异。

16S rRNA基因序列是16S rRNA基因的完整基因序列。

细菌和古菌的16S rRNA基因是相对保守的，这意味着在细菌和古菌之间具有一定的相似性，但在不同的物种之间仍存在一定的差异。

通过比较不同细菌和古菌的16S rRNA基因序列，可以确定它们之间的分类关系，进而研究微生物的多样性和演化。

为什么16S rDNA序列和16S rRNA基因序列重要？16S rDNA序列和16S rRNA基因序列的重要性在于它们可以用于鉴定和分类微生物，研究微生物的多样性和演化关系。

首先，通过从环境样品中分离出微生物的DNA或RNA，可以通过测序得到16S rDNA序列或16S rRNA基因序列。

通过将这些序列与已知的数据库进行比对，可以确定这些微生物的分类信息。

这种方法被广泛应用于环境微生物学和微生物生态学研究中，例如确定土壤、水体和肠道中存在的微生物群落的组成和结构。

其次，通过研究不同细菌和古菌的16S rRNA基因序列间的相似度，可以揭示它们之间的亲缘关系和进化历史。

由于16S rRNA基因具有保守性和可变性的特点，通过比对不同微生物的16S rRNA基因序列，可以构建系统发育树，揭示不同微生物之间的分类关系。

细菌16srRNA和16srDNA的关系来源：互联网分子生物学技术的应用使肠道微生态学的研究取得了突破性的发展。

目前研究最多的是16S rRNA。

近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的16SrRNA进行研究，得到了广泛的细菌16SrRNA序列库。

使用该方法可以检测肠道中常规方法不能培养或生长缓慢的细菌。

rRNA分子在生物体中普遍存在，生物细胞rRNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列。

在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,在结构上可分为保守区(conserveddomain)和可变区(variabledomain), 保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。

研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生(phylogenesis)关系。

细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。

其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16SrRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。

16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成[62]。

因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。

Woese(1980)在比较200多种原核生物和真核生物的16S(或18S)rRNA/rDNA的核苷酸序列谱后,定义建立了古细菌界(包括产甲烷菌、极端嗜盐菌和极端嗜热菌),将生物界重新划分为3主干6界系统,即古细菌、真细菌和真核生物3个主干,真核生物又包括原生动物、真菌、植物和动物4界。

结课论文题目名称：16S rRNA 在细菌鉴定与分类中的应用学生姓名：刘*学号：*************专业：生物化学及分子生物学结业课程：系统细菌学中国·武汉2016 年12 月16S rRNA在细菌鉴定与分类中的应用刘* 2016304110***华中农业大学生命科学学院，武汉[摘要]：由于细菌种属间生理生化特征的相似，单凭传统的表型和化学鉴定方法已无法准确对其进行分类鉴定。

随着包括PCR技术、测序技术等分子技术的不断进步，细菌的分类鉴定也由在最初的表型和化学鉴定演变到分子水平，使人们可以通过对细菌的DNA鉴定来达到区分种属的目的。

细菌的16S 核糖体RNA(rRNA)以其在进化上的特征性序列，基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。

本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。

关键词：16S rRNA；细菌分类鉴定；DNA测序；高级结构传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。

大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。

20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。

在PCR技术的产生发展基础上，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(rDNA)指纹图、16S核糖体核糖核酸(rRNA)序列分析等。

这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。

说明16srna的意义
16S rRNA是一种小亚基核糖体RNA，存在于细菌和古菌中，它具有以下意义：
1. 它是分析和分类微生物的靶标。

分析微生物的16S rRNA序列可以帮助我们了解微生物的系统发育、进化、遗传变异和种类。

2. 它是研究生态学和环境微生物学的重要工具。

16S rRNA序列可以被用来研究微生物的分布、生态功能和群体结构，从而推断环境因素对微生物群落的影响，或者发现一些可能对环境有害的微生物。

3. 它可以用于检测和鉴定微生物。

通过将16S rRNA序列与已知的数据库进行比较，可以快速确定未知微生物的种属和亚种水平的分类归属。

4. 它是开发抗生素和治疗微生物感染的重要工具。

通过研究微生物16S rRNA 序列，可以了解微生物的生长及代谢过程等生物学特性，从而开发出抗生素和抗微生物感染药物。

总之，16S rRNA在微生物分类学、生态学、环境学、医学等众多领域中都有着广泛的应用和意义。