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HBcrAg在慢性乙型肝炎临床诊疗中的研究进展王施刚;杨春【摘要】慢性乙型肝炎的发病率高,严重威胁人类健康.目前主要以血清乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原和乙型肝炎病毒(HBV)DNA等的水平作为病情监测的指标.但因肝内共价闭合环状DNA(cccDNA)的存在,导致慢性乙型肝炎患者在治疗中断后存在复发率高的问题.cccDNA可较好反映肝内病毒复制活性,但受侵入性方法限制,临床应用较为困难.乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)作为HBV感染的一种血清学标志物,其水平可较好反映肝内cccDNA的情况.HBcrAg检测方便,且无创伤性,具有重要的临床应用价值.血清HBcrAg在确定慢性HBV感染阶段、监测抗病毒疗效、识别疾病复发和耐药高风险人群、预测HBV再激活等方面具有重要价值.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2019(025)009【总页数】6页(P1805-1810)【关键词】慢性乙型肝炎;乙型肝炎核心相关抗原;共价闭合环状DNA;乙型肝炎病毒DNA;乙型肝炎e抗原【作者】王施刚;杨春【作者单位】重庆医科大学附属第一医院感染科,重庆400016;重庆医科大学附属第一医院感染科,重庆400016【正文语种】中文【中图分类】R512.62乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个全球性问题，全世界约有2.4亿慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者[1]。
有8%～20%的CHB患者在5年内发展为肝硬化，10%～17%的肝硬化患者在5年内发展为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1-2]。
被HBV感染的肝细胞的细胞核中存在共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)，其导致了治疗中断后高复发率的问题[3]。
目前，通常以乙型肝炎e抗原(hepatitis B eantigen,HBeAg)的血清学转换以及血清HBV DNA水平检测不出来作为抗病毒治疗的终点[3]。
血清HBV RNA定量在指导慢性乙型肝炎抗病毒治疗过程中的作用1 HBV RNA的形成在HBV感染过程中，HBV病毒粒子通过与肝细胞受体牛磺胆酸钠协同转运多肽结合，将含有病毒松弛环状DNA（rcDNA）的核衣壳释放到肝细胞，HBV核心颗粒包含的rcDNA通过一系列机制被运输到细胞核，在细胞核中依赖HBV编码的DNA 聚合酶补齐两条链上的缺口，最后形成HBV cccDNA。
cccDNA 作为病毒转录的模板，可利用宿主细胞的RNA聚合酶进行转录，产生4种不同的RNA（3.5、2.4、2.1、0.7 kb），其中3.5 kb的mRNA有两种：前核心区RNA（PreC RNA）和前基因组RNA（pgRNA），PreC RNA用于编码HBeAg，pgRNA 是新病毒逆转录及翻译HBV聚合酶和核心蛋白的模板。
在衣壳内，聚合酶通过反转录将pgRNA转化为rcDNA，然后与病毒蛋白装配成新的完整HBV释放到细胞外，或再进入细胞核补充cccDNA池。
有研究证实，HBV感染者血清中的HBV RNA为pgRNA，其来源可能为核衣壳包裹的pgRNA在未启动逆转录的情况下，直接获得包膜并从感染的肝细胞中释放出来，被称为“HBV RNA病毒样颗粒”。
2 血清HBV RNA与肝脏组织内cccDNA状态的关系由于肝组织内HBV cccDNA的检测需要做肝组织活检，多数患者不愿意接受，在临床应用中存在较大的困难。
HBV pgRNA 作为HBV cccDNA的直接转录产物，理论上HBV RNA水平能够反映肝细胞内cccDNA的水平及转录活性。
多项临床及基础研究显示，外周血清中的HBV RNA水平与肝组织内HBV cccDNA密切相关。
Wang等对62例HBeAg阳性和22例HBeAg阴性初治患者研究发现，HBeAg阳性患者的血清HBV RNA定量与肝内cccDNA水平相关性良好，而HBeAg阴性患者的血清HBV RNA与肝内cccDNA无相关性。
恩替卡韦对乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA的影响当今全球的乙型肝炎病毒（HBV）感染者约为三亿，其感染率超过HIV100倍，其强大的传染能力导致世界上每年都有大量的人群被感染。
由于该病毒具有共价闭合环状DNA（cccDNA）这一独特的复制形式[1]，导致一般抗病毒药物很难将其从患者体内完全清除，使得感染者肝炎经常复发，成为慢性乙型肝炎（CHB），并逐渐演变为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。
每年世界上死于慢性乙型肝炎以及其进展而来的肝硬化、肝细胞癌的患者高达100多万。
因此，寻找新的有效的抗HBV藥物并在监测下把感染者体内的病毒量控制在极低范围内甚至完全清除，是世界范围内众多医生以及科研工作者的共同目标与任务。
在这样的背景下，第三代抗HBV药物恩替卡韦（Entecavir）诞生了，在乙型肝炎的临床治疗中显示了极大的优点和特点。
1.HBV cccDNA的分子结构及检测方法1.1HBV cccDNA的形成特点入侵肝细胞内的HBV在胞质中形成松弛环状DNA（rcDNA），其特点为能通过共价键与蛋白质结合，而且不论正链和负链都存在缺口，形成的是部分环状结构[2]。
胞质中的rcDNA进入细胞核中，在核内酶的作用下，两条链上的缺口都被补齐，并经过一系列空间折叠，最终形成了具有超螺旋结构的共价闭合环状DNA（cccDNA）。
形成的cccDNA作为模板合成mRNA，再以mRNA为模板合成负链DNA，同样以负链DNA为模板合成正链DNA，并与之前的负链DNA 结合，形成新的rcDNA，补充到rcDNA库中。
而此时rcDNA有两种去向：第一种是与蛋白质结合形成完整的HBV，逸出肝细胞并继续感染其他健康肝细胞：第二种是再次形成cccDNA，补充到cccDNA库中[3]。
1.2HBV cccDNA检测的临床意义从HBV cccDNA的形成特点可以看出，它是HBV复制的特殊中间体，可与核内蛋白质形成微染色体，因具有不对称复制的特点从而避免被清除，从而成为HBV持续感染的关键因素，因此检测HBV cccDNA具有重要的临床意义。
HBV DNA荧光定量PCR检测及临床意义血清HBV-DNA浓度与乙型肝炎病毒感染的严重程度和传染性有关，可用于判断病情和预后，以及观察抗病毒药物的治疗效果。
通常血清 HBV-DNA持续阳性超过6个月会转为慢性肝炎。
抗-HBc阳性患者血清HBV-DNA持续阳性常提示肝受损严重,50%以上抗-HBc阳性慢性活动性肝炎患者，经平均4.5年发展为肝硬化，常与HBV-DNA持续阳性有关。
因此，采用荧光定量PCR检测方法，对乙肝早期诊断、准确判断乙肝患者的带毒状态及药物治疗观察就显得及其重要。
1 资料与方法1.1 一般资料选取 2008年10月～2009年10月，就诊患者检查200例HBVm全阴者血清样本。
1.2 血清标本的采集采用灭菌的一次性带盖塑料管，清晨空腹抽取静脉血5ml，离心分离血清，-20℃冻存备用，集中检测。
1.3 方法荧光定量PCR法检测HBV-DNA，检测仪器为Roche LightˉCycle荧光PCR检测仪，按照试剂盒说明书操作程序对上述血清标本进行检测。
HBV-DNA提取: 血清100μl加DNA提取液1100μl,13000r/min离心10min→弃上清→再加提取液Ⅱ 25 μl,振摇10 s→100 ℃10min→13000 r/min离心10min，上清液备用。
扩增取上清液2 μl，加入盛有扩增反应液38μl(含引物，dNTPs，Taq酶及PCR缓冲液)的PCR反应管中，扩增40个循环，循环参数为37 ℃5min；95 ℃ 1min；60 ℃ 30s。
定量结果采用计算对数平均值的方法来计算HBV-DNA平均拷贝数，遇有阴性结果，不参加平均值的统计。
2 结果200例乙肝标本中有91例HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性的标本中，FQ-PCR检测HBV-DNA全部阳性，阳性率100％，平均HBV-DNA拷贝数为2.8×106/ml。
3 讨论乙肝病毒血清标志物检测是目前诊断乙型肝炎最常用的指标，主要反映人体对乙肝病毒的免疫反应状态，不同血清标志模式反映不同的临床意义。
