第三章细胞生物学研究方法

细胞生物学研究方法细胞生物学是研究细胞结构、功能和过程的科学学科，主要研究对象是细胞的组成、分裂、分化、代谢、运动、增殖和死亡等。

为了深入研究细胞相关问题，细胞生物学采用了多种研究方法。

第一，显微镜观察法。

显微镜是细胞生物学中最常用的工具之一。

通过显微镜观察，可以观察到细胞的形态、结构和各种细胞器的分布情况。

常用的显微镜有光学显微镜和电子显微镜。

光学显微镜适用于观察活细胞，电子显微镜适用于观察细胞内部细节，如细胞核、线粒体和内质网等。

第二，细胞培养法。

细胞培养是指将细胞在无菌条件下培养于含有营养物质的培养基中，使其持续生长和繁殖。

通过细胞培养，可以研究细胞的生长特性、分裂过程以及对外界刺激的反应。

常用的细胞培养方法有原代培养、细胞株培养和三维培养等。

第三，细胞分离和纯化法。

细胞分离和纯化是将不同类型的细胞从混合细胞群中分离出来，以便对某种细胞进行独立的研究。

常用的方法有细胞悬浮液经过离心分离、细胞表面标记技术以及细胞排序等。

第四，分子生物学技术。

分子生物学技术可以用于研究细胞的基因表达、代谢等分子机制。

其中，PCR技术可以复制DNA序列，用于检测细胞内特定基因的存在和表达水平。

原位杂交技术可以检测细胞内特定mRNA的定位和表达情况。

第五，蛋白质分析技术。

蛋白质分析技术主要用于研究细胞内蛋白质的分布、结构和功能。

常用的方法有蛋白质电泳、质谱分析、免疫印迹等。

第六，遗传学方法。

遗传学方法可以用于研究细胞的遗传特征和突变。

如基因敲除和基因敲入技术可以研究基因在细胞中的作用；细胞杂交技术可以研究细胞核酸的互补性和杂交情况。

细胞生物学研究方法的不断更新和发展，使我们对细胞的理解越来越深入。

这些方法的应用使得我们能够更好地揭示细胞的机制和功能，为解决许多重大疾病和生物学问题提供了有力的工具。

第三章细胞生物学研究方法和技术一、名词解释荧光漂白恢复技术：即fluorescence photobleaching recovery，FPR或fluorescence recovery after photobleaching，FRAP。

首先利用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，然后利用高能量的激光束照射被被标记的特定区域，使该区域标记分子的荧光发生不可逆淬灭而被漂白。

因非照射区域荧光标记分子的移动，使得漂白区域逐渐恢复荧光。

该技术可用于研究蛋白质的运动。

酵母双杂交技术：该技术用于研究蛋白质之间的相互作用。

放射自显影技术：利用放射性同位素（如3H、14C等）的电离辐射对乳胶（含AgBr 活AgCl）的感光作用，研究样本中放射性化合物在机体、组织和器官、细胞中的分布、定位、运动等生物学活动。

二、选择题1. 正常细胞培养的培养基中常需要加入血清，主要是因为血清中含有（）。

A 氨基酸；B 核酸；C 生长因子；D 维生素。

【答案及解析】C。

加入血清主要是为培养基增加生长因子。

2. 冰冻蚀刻技术主要用于（）。

A 电子显微镜；B 光学显微镜；C 原子力显微镜；D 激光共聚焦显微镜。

【答案及解析】A。

冰冻蚀刻技术属于电镜制样技术之一，另外还有超薄切片技术、负染色技术、电镜三维重构与低温电镜技术、扫描电镜技术等。

3. 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪种技术构建的？（）A 细胞融合；B 核移植；C 病毒转化；D 基因转移。

【答案及解析】A。

4. 关于光镜的使用下列哪项有误？（）A 观察标本时，应双眼同时睁开，双手并用；B 按照从低倍镜到高倍镜到油镜的顺序进行操作；C 使用油镜时，需要在标本上滴香柏油，将聚光器降至最低，光圈关至最小；D 使用油镜时，不可一边在目镜中观察，一边下降镜筒或上升载物台。

【答案及解析】C。

三、填空题1. 体外培养的细胞，不论原代还是传代细胞一般不保持体内原有的细胞形态。

第三章细胞生物学研究方法一．名词解释1.福尔根反应：特异显示DNA分布的反应。

酸水解可除去RNA，仅保留DNA，冰出去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键上的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。

所暴露的自由醛基与西夫试剂反应呈紫红色。

2.负染色：用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。

染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的，反衬出样品中的生物大分子及其复合物的形态。

3.原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特意核苷酸序列在染色体上火细胞中的位置的方法。

4.原代培养：直接从动物体内获取细胞进行首次培养，称原代培养。

5.传代培养：原代培养的细胞在一个容器中增殖到一定的密度后，将细胞分散到多个容器中继续培养的方式称传代培养。

6.细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，一般可顺利地传40-50代次，它保持染色体二倍体的数量及接触抑制行为。

7．细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，使其获得“不死性”特征，从而无限增殖，从正常组织或胚胎组织也可以建立细胞系，这是一个含有多个细胞谱系的混杂细胞群体。

8.探针：带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段，用于核酸分子杂交技术以检出标本中待测核酸分子。

9.超薄切片：是一种主要的透射电子显微镜制样技术，利用超薄切片机将样品切成40-50nm 左右，穿透很弱的电子束才能透过。

其主要步骤为：固定、脱水、包埋、切片、染色。

二．填空1、细胞生物学常用的光镜有相差显微镜、微分干涉显微镜、和荧光显微镜。

2、利用超速离心机对细胞组分进行分级分离的常用方法有差速离心和密度梯度离心。

3、单克隆抗体技术是将B淋巴细胞与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。

4、对电镜观察的生物样品有_要求样品很薄和保持样品的精细结构5、贴壁生长的细胞具有三个特点：单侧生长、形态多变、接触抑制。

第三章细胞生物学研究方法一、是非判断1．提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。

2．光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结构。

3．亚显微结构就是超微结构。

4．电子显微镜的镜筒中是真空的，其目镜与光学显微镜的目镜也有很大区别。

5．在电子显微镜下观察细胞核时用碱性品红染色，染色质被染成红色。

6．为了使光学显微镜或电子显微镜标本的反差增大，可用化学染料对标本进行染色。

7．生物样品的电子显微镜分辨率通常是超薄切片厚度的十分之一，因而切得越薄，照片中的反差越强，分辨率也越高。

8．透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。

9．CsCl密度梯度离心法分离纯化样品时，样品要和CsCl混匀后分装，离心时，样品中不同组分的重力不同，停留在不同区带中。

10．用免疫荧光技术可显示与酶解过程有关的酶是否结合在微管上。

11．用带有标记的特定核酸分子作探针，测定与之互补的染色体DNA区段的位置，称为原位杂交。

12．Western blotting是体外分析RNA的技术。

13．进行流式细胞术时，所用的细胞需染色，而且还需对组织块中的细胞进行分散处理。

二、选择1．要观察肝组织中的细胞类型及排列，应先制备该组织的( )。

A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片2．小鼠骨髓细胞染色体标本一般制备成细胞的( )。

A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片3．观察血细胞的种类和形态一般制备成血液( )。

A．滴片D．切片 C．涂片 D．印片4．提高一般光学显微镜的分辨能力，常用的方法有( )。

A．利用高折射率的介质(如甘油) B．调节聚光镜，加红色滤光片C．用荧光抗体示踪D．将标本染色5．下列( )与显微镜能达到的分辨率无关。

A．光波波长B．物镜的放大倍数C．标本和透镜之间的物质的折射率D．透镜的数值孔径6．适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是( )。

A．扫描电镜B．荧光显微镜C．相差显微镜D．倒置显微镜7．用于观察活细胞的显微镜是( )。

第三章细胞生物学的研究方法一、填空题1．透射电子显微镜由、、、三部分所组成。

2.在酵母人工染色体制备过程中，要用酶脱去酵母的细胞壁，使之成为、并且用进行观察和计数。

4.观察贴壁生长的培养动物细胞可用，而观察脱去细胞壁的植物细胞，则要用。

5. 物质在紫外光照射下发出的荧光可分为和两种，其中需要将被照射的物质进行染色。

6．用紫外光为光源照射物体比用可见光的分辨率要高，这是因为。

7．通过或形成的细胞叫细胞株。

9.灭活的仙台病毒之所以能够诱导细胞融合，是因为。

10. 相差显微镜与普通显微镜的不同是用替代可变光阑，用代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。

11．倒置显微镜与普通显微镜的不同在于其。

12．若用紫外光为光源，光学显微镜的最大分辨率为，透射电子显微镜的最大分辨率为，扫描电镜的分辨率为。

13. 显微镜的分辨本领是指能够能力，用来表示。

14．高压电镜的电压在120kV以上，优点是：、。

16. 细胞培养的突出特点是：可在。

18.贴壁生长的细胞有三个特点：①；②；③。

19. 用细胞培养法来研究生命活动规律的局限性是。

20．超薄切片染色常采用、染色。

21．免疫细胞化学技术是用来定位细胞中的物质。

22．电子显微镜使用的是透镜，而光学显微镜使用的是透镜。

23.电子染色是用来增强电子的散射能力。

24．在光学显微镜下见到的结构称为，在电子显微镜下见到的结构称为。

25．细菌质膜的多功能性主要表现在：具有的呼吸作用，具有的分泌作用，具有的信号传导作用。

27.在同位素追踪技术中，用于研究DNA的同位素标记的前体物是。

28．单克隆抗体技术是将与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。

29. 可用技术来研究质膜结构的不对称性。

31.动物细胞培养所用的合成培养基中除含多种、和外，一般还需加入。

32．用荧光显微镜观察细胞时，经吖啶橙染色的细胞中的DNA发荧光，而RNA发荧光。

33．适于观察活细胞的光学显微有、和等。

34．分辨率是指人的肉眼或显微镜在25cm处能够分辨到的相邻两个物体间最近距离的能力。

第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法肉眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.2μm电子显微镜分辨率：0.2nm一、光学显微镜技术（一）普通复式光学显微镜光学显微镜的组成：①光学放大系统（目镜和物镜）；②照明系统（光源、折光镜、聚光镜）；③机械和支架系统（保证光学系统的准确配置和灵活调控）缺图分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。

分辨率的高低取决于光源的波长λ，物镜镜口角α和介质折射率N。

公式缺图在油镜下可提高介质折射率，从而最大分辨率达到0.2μm。

光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物体或体外培养细胞。

如果要观察生物组织样品，则需要对材料进行固定，包埋，切片，染色。

苏木精可以特性使DNA着色，伊红可以染蛋白质，从而能显示出细胞核细胞质的位置。

（二）相差和微分干涉显微镜光线通过样品的每一个点到达成像系统时所出现的图像是一个个模糊的圆盘，因此两个相邻的像点所显示的图像可能会发生重叠，重叠到一定程度时，就无法分辨两个点了，造成了光学显微镜的分辨极限。

1、相差显微镜缺图原理：相差显微镜可以将光通过不同密度物质时产生的光程差转换成振幅差，而且相差显微镜在物镜后有一块相差板，相差板上的吸光物质增大了两组光线间的相位差，最后经透镜汇聚时便会产生相互叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼可见的明暗区别。

研究对象：由于反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故相差显微镜不需染色，可观察或细胞，甚至研究细胞器的动态。

2、微分干涉显微镜原理：以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜汇合，从而样品中厚度上微笑的区别就会转化为明暗区别，增加反差，且具有很强的立体感。

研究对象：适合于研究或细胞中较大的细胞器，还可接上录像装置观察动态。

（三）荧光显微镜原理：主要用于检测细胞上的特异荧光染料，为此增加了两套滤光片，第一套为激发光滤片，装载光源和样品之间，只有那些能激发荧光染料发光的特定波长的光才能通过；第二套为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让染料所发出的荧光通过。

第三章 细胞生物学研究方法四、判断题错1、亚显微结构就是超微结构。

（）错 2、多莉的培育成功说明动物的体细胞都是全能的。

（）对 3、荧光显微镜技术是在光镜水平，对特异性蛋白质等大分子定性定位的最有力的工具。

广泛用于测定细胞和细胞器中的核酸、氨基酸、蛋白质等。

（）错 4、生物样品的电子显微镜分辨率通常是超薄切片厚度的十分之一，因而切得越薄，照片中的反差越强，分辨率也越高。

（）错 5、光镜和电镜的切片均可用载玻片支持。

（）对 6、透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。

（）错 7、光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结构。

（）错 8、体外培养的细胞，一般仍保持机体内原有的细胞形态。

（）错 9、细胞株是指在体外培养的条件下，细胞发生遗传突变且带有癌细胞特点，有可能无限制地传下去的传代细胞。

（）第四章 细胞质膜四、判断题对 1、脂质体是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人工膜。

（）错 2、外在(外周)膜蛋白为水不溶性蛋白，形成跨膜螺旋，与膜结合紧密，需用去垢剂使膜崩解后才可分离。

（）对 3、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和内膜体系，所以红细胞的质膜是最简单最易操作的生物膜。

（）对4、血影是红细胞经低渗处理后，质膜破裂，释放出血红蛋白和其他胞内可溶性蛋白后剩下的结构，是研究质膜的结构及其与膜骨架的关系的理想材料。

对 5、所有生物膜中的蛋白质和脂的相对含量都相同。

（）第五章 物质的跨膜运输四、判断题错 1、协助扩散是一种不需要消耗能量、不需要载体参与的被动运输方式。

（）错 2、胞吞作用和胞吞作用都是通过膜泡运输的方式进行的，不需要消耗能量。

（）对 3、胞吞作用与胞吐作用是大分子物质与颗粒性物质的跨膜运输方式，也是一种主动运输，需要消耗能量。

（）错 4、Na+—K+泵既存在于动物细胞质膜上，也存在于植物细胞质膜上。