杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析_陈喜

亚麻木质素合成关键酶CAD基因的克隆与分析的开题报告1. 研究背景亚麻是一种经济作物，其纤维可以用于生产纺织品，种子可以提取出亚麻油。

亚麻木中含有大量木质素，木质素是一种复杂的天然高分子化合物，具有很强的稳定性和抗生物降解性，在工业、医药、环保等领域有重要的应用价值。

木质素的合成主要是由亚麻木细胞壁中存在的木质素合成关键酶催化完成的。

CAD是木质素合成的一个关键酶，为木质素单体的预芳香化的限速酶，其合成量和合成活性直接影响亚麻木质素的含量与质量。

因此研究CAD基因的克隆与分析对于了解亚麻木质素生物合成机制，提高亚麻木质素的含量和质量具有重要意义。

2. 研究目的本研究的主要目的是克隆亚麻木质素合成关键酶CAD基因，分析其结构和功能特点，进一步了解亚麻木质素生物合成的机制。

3. 研究内容和方法3.1 克隆CAD基因从亚麻木材中提取总RNA，通过RT-PCR方法克隆CAD基因，利用PCR扩增方法连接载体并进行重组，将重组载体转化到大肠杆菌中进行扩增。

3.2 分析CAD基因结构和功能特点通过生物信息学方法对CAD基因进行序列分析，包括ORF长度、氨基酸序列、保守区域等。

同时进一步分析CAD的保守结构域、亲水性、疏水性等结构特征。

对CAD基因进行功能现象研究，如酶活检测等实验。

4. 研究意义通过本研究，能够更深入地了解亚麻木质素合成的生物合成机制，探究CAD基因的结构和功能特点，为亚麻木质素的生产和发展提供理论根据，同时在木质素生物制造方面具有积极的应用价值。

5. 研究进展和计划目前已完成了从亚麻木材中提取总RNA和克隆CAD基因的实验工作。

接下来的工作将会进行CAD基因序列分析及其功能实验，进一步深入了解CAD基因的结构和功能特点。

最后，将进一步研究亚麻木质素合成的生物合成机制。

预计本研究将在2年内完成。

一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建魏晓骁;王士亚;陈潇潇;汪凤林;曹光球;曹世江【摘要】In order to explore the molecular mechanism of Chinese fir wood formation, total RNA was extracted from Chinese fir new leaves and cDNA was synthesized. A new ClCesA was cloned using RT-PCR. The length of open reading frame of ClCesA is 2955 bp, with 984 amino acids. Based on TMHMM Server v. 2.0 and MEGA5.1 software, ClCesA proteins consist of 8 across-membrane structures, with average 18 amino acid residues and zinc finger in N end. Also, a conservative DDDQXXLRW structure domain was found in ClCesA protein. Phylogenetic tree analysis showed that ClCesA may be associated with secondary cell wall formation. The flu-orescent quantitative PCR analysis showed that ClCesA can be expressed in organsof root, stem and leaf in Chinese fir, with the highest expression in the root and the least in leaf. Lastly, a plant overexpression vector pGWB506-35s-ClCesA-GFP was successful-ly constructed from pGWB506 vector which contains GFP tag and hygromycin resistance gene by Gateway technology.%为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的cDNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA 5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,ClCseA基因在杉木的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,但在杉木根中的表达含量最高,茎中次之,叶中最低.随后,为后续该基因功能验证提供基础,将ClCesA 克隆到含有GFP标签和潮霉素抗性的pGWB506载体,构建植物过表达载体pGWB506-35S-ClCesA-GFP.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(046)001【总页数】7页(P66-72)【关键词】杉木;纤维素合酶;基因克隆;表达分析;载体构建【作者】魏晓骁;王士亚;陈潇潇;汪凤林;曹光球;曹世江【作者单位】福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q785;S791.27纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，是木材次生木质部细胞壁的主要组成成分之一，约占木材干重的40%，是决定木材品质的重要因子之一.为此揭示植物纤维素生物合成机制对木材材质改良、木材定向培育都具有十分重要的意义.纤维素合酶(CesA)是纤维素生物合成的关键酶之一[1,2].研究表明，CesA基因通过在转录水平上对纤维素合成进行调控，对植物细胞壁发育起到重要作用[3-5].美国密西根大学在2000年初次从欧洲颤杨(Populus tremuloides)中克隆得到林木的纤维素合酶基因PtrCesA1[6]，并且研究发现该基因主要在植物茎中表达，表达高峰期主要出现在次生壁形成期间.此后，在毛果杨(Populus trichocarpa)[7]、大青杨(Populus ussuriensis)[8]、松树(Pinus radiata)[9]、苎麻(Boehmeria nivea)[10]、桉树(Eucalyptus)[11]、马尾松(Pinus massoniana)[12]、杉木(Cunninghamia lanceolata)[13]、毛竹(Phyllostachys edulis)[14]等木本植物中都陆续克隆分离出CesA基因，其中毛果杨中鉴定出18个CesA基因[7]，杂交杨(Populus tremula (L)×P.tremuloides)中鉴定出10个CesA基因，绿竹(Bambusa bambusaoldhami)中鉴定出8个CesA基因[14].这些基因共同构成了林木的纤维素合酶基因家族.对ClCesA基因功能的研究结果表明，PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3这3个基因可能组成同一个纤维素合成酶复合体，共同完成杨树次生壁的合成[15]；而PtrCesA4、PtrCesA5、PtrCesA7这3个基因可能与初生壁的形成有关[16].在毛果杨中，PtCesA4、PtCesA5、PtCesA7、PtCesA8、PtCesA17和PtCesA18在木质部特异高表达[17].Song et al[18]通过研究杨树的纤维素合酶发现，杨树的木质部细胞膜上至少具有2种纤维素合酶复合体，复合体Ⅰ由CesA4、CesA7、CesA8、CesA17和CesA18组成，参与细胞次生壁的合成；复合体Ⅱ由CesA3、CesA10、CesA11、CesA13、CesA15和CesA16组成，参与细胞初生壁和次生壁的合成.杉木作为中国南方重要的速生用材树种之一，用途非常广泛.近几年，与杉木材性相关的分子机制研究取得一定进展[19,20]，而有关杉木的纤维素生物合成分子机制的研究报道甚少.彭沙沙等[21]克隆了杉木纤维素合成酶类似蛋白ClCslD1；而庞景等[13]克隆了杉木纤维素合成酶基因CesA，通过将本研究克隆出的基因ClCseA与庞景等克隆的CesA基因的DNA和蛋白序列进行比较，发现2个基因在核苷酸的编码区有11处位点存在差异，分别为773、821、1 249、1 537、1 545、1 554、2 166、2 436、2 580、2 823、2 856位点；在氨基酸的编码区序列也发现3处位点存在差异，分别为258、274、513位点.由于杉木基因组测序未完成，关于杉木纤维素合成酶基因家族的数量、各个基因的确切功能，以及各基因间的相互作用关系均不清楚.虽然克隆出的2个基因存在相似性，但也存在差异，有可能为2个不同的基因.关于基因的功能尚需进一步验证.探索杉木中纤维素合酶基因家族的功能，特别是相关次生细胞壁形成的纤维素合酶基因，对于利用现代分子生物学手段改良杉木木材品质具有重要意义.本研究以杉木三代种子园种子发育植株为材料，利用RT-PCR技术分离克隆出1个新的杉木ClCesA基因，长度为2 955 bp，编码984个氨基酸；同时进行了生物信息学分析以及不同器官表达情况的研究；采用Invitrogen公司的gateway特异性位点重组技术将ClCesA基因构建到植物表达载体中，以期为进一步的功能解析提供依据，同时也为杉木材性的改良提供重要的基因资源.1.1 材料收集与RNA提取试验材料由国家林业局杉木工程技术研究中心提供，为杉木种子发育而成的杉木幼苗.取长势好的杉木幼嫩叶片组织0.2 g，按照TIANGEN公司的总RNA提取试剂盒操作说明书提取杉木总RNA，通过1%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计Nanodrop分别检测样品的RNA质量及浓度.1.2 ClCesA基因克隆与序列分析利用NCBI网上的GenBank数据库查询到已知杉木的DNA序列，采用gateway 技术设计特异引物(表1).取检测合格的杉木总RNA，利用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行第1条链cDNA的合成.合成的cDNA稀释10倍后进行PCR反应，具体反应体系见表2.反应程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火3 min，72 ℃延伸3 min，共30循环；最后72 ℃延伸10 min.扩增后的产物经1%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测后，通过BP连接到pDONR207载体上，热激转化到大肠杆菌DH-5α感受态细胞，进行Gen抗性筛选.选取单菌落做菌落PCR，将检测为阳性的菌落进行液体LB过夜培养，使用天根质粒试剂盒提取质粒，并送铂尚生物公司进行全长测序.利用实时荧光定量PCR仪研究ClCesA基因在不同组织的表达情况.qPCR扩增试剂为SYBR Premix Ex Taq，采用的荧光染料为SYBR GreenⅠ，以杉木EF1α基因作为内参基因.在进行qCR分析前，先使用普通PCR检测体系的反应条件，如退火温度、模板量等，并将PCR 产物进行测序，以保证qPCR结果的准确性.1.3 植物表达载体的构建使用Gateway BP反应试剂盒，将回收带有attB位点的ClCesA基因PCR产物与入门载体pDONR207在室温下进行BP反应1 h.反应体系为：PCR产物0.6 μL，入门载体0.4 μL，BP酶0.25 μL.随后将反应产物全部转化到E.coli Trans 5α感受态细胞，涂布于含Gen(50 mg·L-1)的LB平板；次日随机挑选阳性克隆摇菌并提取质粒，经PCR检测验证正确后进行测序，即可获得入门克隆载体pDONR207-ClCesA.参考Gateway LR反应试剂盒的操作说明书，将入门载体与目的载体pGWB506进行LR反应，室温25 ℃，反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于LB平板(含50 mg·L-1潮霉素)，37 ℃培养过夜.次日挑单菌落，摇菌后用试剂盒提取质粒，经PCR检测载体构建的正确性，并进行测序验证.1. 4 纤维素合酶基因的序列分析在DNAMAN V6软件上设计引物；通过Vecter NTI软件进行序列比对；在TMHMM Server v.2.0软件上进行蛋白质结构分析；运用MEGA 5.1软件通过邻接法构建不同植物的基因进化树；采用Microsoft Excel 2007软件对基因表达进行作图.2.1 杉木总RNA提取杉木叶片总RNA经1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，结果见图1.从图1可以看出，RNA条带完整，28 S rRNA和18 S rRNA 2条主带明显，28 S rRNA的亮度约为18 S rRNA的2倍，且无DNA污染.采用超微量分光光度计进行浓度测定和质量分析、检测，结果显示，样品总RNA浓度为231 μg·μL-1，D260 nm/D280nm=1.86，其浓度与质量均满足反转录的要求，可用于后续试验.最后，将总RNA 样品置于-80 ℃冰箱保存.2.2 扩增产物的碱基序列测定与分析取上述总RNA，采用天根公司的逆转录酶试剂盒获得cDNA，通过RT-PCR反应得到1个约3 000 bp的产物(图2)，将该产物连接到pDONR207载体且转化DH-5α，挑取阳性克隆测序.测序结果显示该序列与CesA基因的同源性很高，并含有保守结构域.其氨基酸序列及结构如图3所示.2.3 蛋白质跨膜结构的预测从图4可以看出，新的ClCesA蛋白具有8个跨膜区，分别为175～197、204～223、760～782、794～816、831～853、878～900、910～932、945～964，最大跨膜区域为22个氨基酸残基，最小跨膜区域为12氨基酸残基，平均跨膜区域为18个氨基酸残基.2.4 基因序列系统发生树本研究运用MEGA 5.1软件构建系统进化树，将克隆到的杉木ClCesA基因编码区与拟南芥(Arabidopsis thaliana, At)、颤杨(P.tremuloides, Ptr)、欧洲山杨×颤杨(Populus tremula×P.tremuloides, Ptt)、火炬松(Pinus taeda L., Pt)、银灰杨(Populus canescens (Ait.) Smith, Pca)、毛白杨(Populus tomentosa Carrière, Pto)的初生壁和次生壁形成的CesA基因进行系统进化树分析.初生壁有关基因有AtCesA1(O48946)、AtCesA2(O48947)、AtCesA5(Q8L778)、AtCesA9(Q9SJ22)、PtrCesA7(AAO25581)、PttCesA2(AAT09895)、PtrCesA4(AAO25536)、PtrCesA6(AAP40636).次生壁有关基因有PtCesA1(AAX18647)、PtCesA2(AAX18648、PtCesA3(AAX18649)、PtrCesA2(AAM26299)、PtrCesA7(AAO25581)、PtrCesA3(AAQ08987)、PcaCesA1(AAC78476)、PttCesA1(AAT09894)、PttCesA3-1(AAT09896)、PttCesA3-2(AAT09897)、AtCesA4(Q84JA6)、AtCesA8(Q8LPK5)、PtoCesA1(AAY21910).从图5可以看出ClCesA分布在次生壁较密集的分支，且与杉木ClCesA1在一个小分支，说明两者的亲缘关系较近，可能执行类似的功能，由此推测ClCesA基因可能与次生壁合成有关.2.5 ClCesA基因在不同组织的表达杉木纤维素合酶基因在不同器官表达情况的分析结果(图6)显示，杉木的根、茎、叶3个器官均有纤维素合酶基因表达，而且相对表达量在杉木根中最高，茎中次之，叶中最低.因此，可以推测ClCesA基因与杉木木材生长发育的调控有着密切关系.2.6 植物过表达载体的构建将检测正确的入门载体pDONR207-ClCesA和目的载体pGWB506进行LR反应，获得植物表达载体pGWB506-35S-ClCesA-GFP，载体构建策略如图7所示.使用特异性的载体引物和基因特异性引物做菌落PCR，扩增出1 000 bp的片段(图8)，表明LR反应成功.重组质粒的测序结果显示，ClCesA并未产生突变，并且和原序列相同，说明本试验的植物表达载体连接正确.通过序列比对与分析，Pear et al[22]首先从棉花中克隆得到与细菌CelA基因同源的纤维素合酶基因GhCesA1、2.通过基因组学分析研究，Richmond et al[23]得到了拟南芥基因组中的10个CesA基因的蛋白质序列结构特点.Suzuki et al[17]分析了杨树基因组的18个CesA基因的结构特点.目前为止，研究发现CesA基因编码的蛋白质有着相类似的结构，共有8个跨膜结构域， N端有2个， C端有6个.1个锌指结构域在N端，可能和蛋白质之间的相互作用有关.CesA蛋白都含有较典型的结构如DDDQxxRW(天冬氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸、谷氨酞胺-x-x精氨酸—色氨酸)[24].通过对CesA基因功能的研究，已陆续鉴定出与初生壁和次生壁形成相关的基因.在欧洲颤杨中，PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3可能形成一个纤维素合成酶复合体，共同完成杨树次生壁的合成[15,24]，而PtrcesA4、PtrCesA5、PtrCesA7可能与初生壁的形成有关[16].本研究克隆到一个新杉木ClCesA基因，通过系统进化树，该基因与聚类在一个进化分支并在根中表达量最高，推测该基因可能参与植物次生细胞壁的形成.而庞景等克隆到的2个CesA基因，ClcesAl与PtrCesAl的同源性最高；ClCesA2与ZmCesA2聚类在一起，两者在茎中高度表达.本研究中所用材料为培养30 d左右的杉木种子萌发而成的幼苗，而庞景所用的杉木材料为1年生杉木幼苗，且纤维素合酶CesA在植物不同发育阶段、不同器官中的表达量不同，所以这可能是造成ClCesA在杉木器官中表达量不同的原因.植物中除了CesA基因外，还有类纤维素合酶(cellulose synthase-like, CSL)基因家族参与纤维素的生物合成.拟南芥CSL蛋白有9个家族，分别为CSL(A/B/C/D/E/F/G/H/J)[25]；在基因序列上，CSL基因与CesA基因具有部分同源，主要参与各种β-聚糖链的合成[23,25].彭莎莎等[21]也从杉木中克隆到了CSL基因，并分析其序列结构特点.【相关文献】[1] KUMAR M, TURNER S. 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收稿日期:２０１８－０６－１２修回日期:２０１８－０９－０５基金项目:国家重点研发计划(２０１６ＹＦＤ０６００３００)ꎻ国家林业局杉木工程技术研究中心平台建设项目(ｐｔｊｈ１３０００２)ꎮ第一作者简介:王培(１９９３－)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ从事林木遗传育种研究ꎮＥｍａｉｌ:７９０６４６０５５＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ通信作者:陈宇(１９８３－)ꎬ男ꎬ研究实习员ꎬ从事林木遗传育种研究ꎮＥｍａｉｌ:２８８１１８５２＠ｑｑ.ｃｏｍꎮＤＯＩ:１０.１３３２４/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｆｃｆ.２０１９.０１.００１杉木涩籽形成过程的花青素还原酶基因表达王㊀培１ꎬ２ꎬ理㊀挪１ꎬ２ꎬ张家君１ꎬ２ꎬ马志慧２ꎬ３ꎬ陈㊀宇１ꎬ２ꎬ林思祖１ꎬ２(１.福建农林大学林学院ꎬ福建福州３５０００２ꎻ２.国家林业局杉木工程技术研究中心ꎬ福建福州３５０００２ꎻ３.福建农林大学生命科学学院ꎬ福建福州３５０００２)摘要:为探究杉木涩籽形成过程中ꎬ花青素还原酶(ＡＮＲ)基因在类黄酮生物合成途径中的分子调控机制ꎬ以种子为试验材料ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ结合ＲＡＣＥ的方法对杉木ＡＮＲ基因进行全长克隆ꎬ运用ｑＰＣＲ技术分析不同涩籽率的杉木家系中ＡＮＲ基因在种子不同发育时期的表达模式ꎮ结果显示ꎬ克隆到的ＡＮＲ基因全长ｃＤＮＡ序列为１３５７ｂｐꎬ具有一个１０５６ｂｐ的开放阅读框ꎬ编码３５１个氨基酸ꎮ保守域预测显示ＡＮＲ蛋白属于ＳＤＲ超家族ꎬ具有一个ＦＲ＿ＳＤＲ＿ｅ特异性结构域ꎮｑＰＣＲ结果发现ꎬ在高涩籽率杉木中ꎬ９０㊁１００ｄ的表达量一直显著高于中㊁低涩籽率杉木ꎻ而在中㊁低涩籽率杉木中ꎬＡＮＲ基因的表达模式仅仅是种子发育８０ｄ时较高ꎬ之后明显下调ꎮ表明杉木涩籽率可能与其ＡＮＲ基因表达相关ꎮ关键词:杉木ꎻＡＮＲ基因ꎻ基因克隆ꎻ序列分析ꎻ表达模式中图分类号:Ｑ９４５.７８ꎻＳ７９１.２７㊀㊀㊀文献标识码:Ａ文章编号:２０９６－００１８(２０１９)０１－０００１－０８ＡＮＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｒｉｌｅｓｅｅｄｓｏｆＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｌａｎｃｅｏｌａｔａＷＡＮＧＰｅｉ１ꎬ２ꎬＬＩＮｕｏ１ꎬ２ꎬＺＨＡＮＧＪｉａｊｕｎ１ꎬ２ꎬＭＡＺｈｉｈｕｉ１ꎬ２ꎬＣＨＥＮＹｕ１ꎬ２ꎬＬＩＮＳｉｚｕ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙꎬＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＦｕｚｈｏｕꎬＦｕｊｉａｎ３５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＣｈｉｎｅｓｅＦｉｒꎬＦｕｚｈｏｕꎬＦｕｊｉａｎ３５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＦｕｚｈｏｕꎬＦｕｊｉａｎ３５０００２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｒｅｄｕｃｔａｓｅ(ＡＮＲ)ｇｅｎｅｉｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｄｕｒｉｎｇｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｒｉｌｅｓｅｅｄｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｆｉｒꎬｔｈｅｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈＡＮＲｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＲＴ￣ＰＣＲｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＲＡＣＥꎬａｎｄｔｈｅＡＮＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆｓｅｅｄｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｑＰＣＲ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｃｌｏｎｅｄＡＮＲｇｅｎｅｗａｓ１３５７ｂｐꎬｉｔｃｏｎｔａｉｎｓａ１０５６ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅａｎｄｅｎｃｏｄｅｓ３５１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ.ＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｄｏｍａｉｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＡＮＲｐｒｏｔｅｉｎｂｅｌｏｎｇｓｔｏＳＤＲｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙａｎｄｈａｓａＦＲ＿ＳＤＲ＿ｅｓｐｅｃｉｆｉｃｄｏｍａｉｎ.ｑＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＡＮＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｈｉｇｈｓｔｅｒｉｌｅｓｅｅｄｒａｔｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒａｔ９０ａｎｄ１００ｄｏｆｓｅｅｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｔｈａｎｔｈｅｆａｍｉｌｉｅｓｗｉｔｈｍｉｄｄｌｅａｎｄｌｏｗｓｔｅｒｉｌｅｓｅｅｄｒａｔｅ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅＡＮＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｆａｍｉｌｉｅｓｗｉｔｈｍｉｄｄｌｅａｎｄｌｏｗｓｔｅｒｉｌｅｓｅｅｄｒａｔｅｗａｓｏｎｌｙｈｉｇｈｅｒａｔ８０ｄｏｆｓｅｅｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬａｎｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｔｅｒｉｌｅｓｅｅｄｒａｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅｆｉｒｍｉｇｈｔｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏＡＮＲｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｃｈｉｎｅｓｅｆｉｒ(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｌａｎｃｅｏｌａｔａ)ꎻＡＮＲｇｅｎｅꎻｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎻｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓꎻｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ杉木[Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｌａｎｃｅｏｌａｔａ(Ｌａｍｂ.)Ｈｏｏｋ.]是我国南方地区常用的经济用材树种ꎬ在全国林业生产中占有举足轻重的地位ꎮ目前ꎬ已建立了杉木第３代种子园作为杉木的良种选育基地ꎬ但同时面临着败育率居高不下的现实问题ꎮ杉木种子败育受多种因素的影响ꎬ比如自身因素包括开花习性㊁球果的形态和自交的不亲和等ꎬ外界因素包括雨量㊁光照㊁温度和病虫害等[１]ꎮ败育种子可分为瘪籽和涩籽ꎬ瘪籽是仅有外种皮和一层珠心薄膜的种子ꎻ涩籽则与健籽的外观并无太大的差别ꎬ但剥去种皮后会发现种胚内充满了褐色物质ꎬ后证实这种褐色物质为单宁类的多酚物质[２]ꎮ在涩籽与健籽的研究中发现涩籽多形成于后胚期ꎬ成熟的干涩籽中单宁的含量比健籽高４~６倍ꎬ且过氧化酶活性显著降低ꎬＭＤＡ含量升高进一步加重了涩籽的形成[３－４]ꎮ基于前人的结论ꎬ林小琴等[５]测定了杉木成熟的涩籽与健籽的多酚含量ꎬ发现涩籽中多酚高达３８３.２２ｍｇ ｇ－１ꎬ而健籽中多酚仅１８.３６ｍｇ ｇ－１ꎬ表明涩籽的形成与多酚物质具有一定的相关性ꎮ㊀㊀以涩籽和健籽为材料ꎬ本实验室对多酚物质形成途径ꎬ即类黄酮生物合成途径的相关基因进行了转录组测序ꎬ发现参与类黄酮物质合成的多个编码基因的表达量具有显著性的差异ꎮ其中ꎬ类黄酮生物合成途森林与环境学报㊀２０１９ꎬ３９(１):１－８第３９卷第１期ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｒｅｓｔａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ２０１９年１月２ 森㊀林㊀与㊀环㊀境㊀学㊀报第３９卷㊀径中与缩合单宁合成有关的关键酶ꎬ花青素还原酶(ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｒｅｄｕｃｅｔａｓｅꎬＡＮＲ)其编码基因ＢＡＮＹＵＬＳ(ＢＡＮꎬ也称ＡＮＲ)的表达量在涩粒中相对较高ꎮ研究表明拟南芥ＡＮＲ基因参与种皮颜色的形成ꎬＡＮＲ基因缺失型的拟南芥由于花青素无法转化为缩合单宁ꎬ种皮颜色加深变红ꎬ在野生型拟南芥中随着种子发育ＡＮＲ基因调控种子中缩合单宁的积累[６－７]ꎮ在桑葚发育过程中ꎬＭａＡＮＲ基因在生长初期表达量较低ꎬ中期迅速生长且ＭａＡＮＲ优势表达ꎬ但成熟后期表达急速下调ꎬ以达到花青素的积累[８]ꎬ说明ＡＮＲ基因的表达具有一定的时序性且与花青素的积累呈负相关ꎮ然而ꎬ杉木ＡＮＲ基因的相关研究尚未见报道ꎬ综合前人的研究以及本实验室前期转录组数据ꎬ推测杉木涩籽中单宁物质的积累可能是因为ＡＮＲ基因抑制机制出现异常ꎬ导致花青素不断地向缩合单宁方向衍化ꎮ为了探究杉木涩籽形成过程中ꎬ花青素还原酶基因的表达相关性ꎬ以杉木种子为试验材料ꎬ运用分子克隆的手段对ＡＮＲ基因进行克隆及生物信息学分析ꎬ采用ｑＰＣＲ技术进行表达特性分析ꎬ探究杉木涩籽形成过程中ＡＮＲ基因在类黄酮生物合成途径中的分子调控机制及其作用机理ꎬ以期为以后杉木的分子辅助育种提供相关依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料与试剂㊀㊀以福建省尤溪林场杉木３代种子园中的Ｍ家系(涩籽率５０％)种子为试验材料ꎬ采集授粉后１４０ｄ的未成熟种子ꎬ－８０ħ冰箱中保存备用ꎮ由于种子发育早期种胚发育较小ꎬ很难分离出涩籽与健籽ꎬ所以采用不同涩籽率的杉木家系为试验对象ꎬ利用Ｈ家系(涩籽率９０％)㊁Ｍ家系和Ｌ家系(涩籽率２４％)授粉后不同时期(授粉后７０㊁８０㊁９０㊁１００ｄ)的完整种子为试验材料ꎬ取大小一致无病害的球果进行剥离ꎬ每两个球果的种子混装于同一离心管ꎬ随后称取０.１ｇ种子ꎬ４个生物学重复ꎬ进行基因实时荧光定量ＰＣＲ分析ꎮ㊀㊀试验过程中所用到的试剂盒如下:天根多糖多酚ＲＮＡ提取试剂盒ꎬ全式金公司的２ˑＴｒａｎｓＴａｑ￣ＴＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ和ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔｏｎｅ￣ｓｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｓｕｐｅｒＭｉｘ试剂盒ꎬＴａｋａｒａ公司的ＳＭＡＲＴｅｒ®ＲＡＣＥ５ᶄ/３ᶄＫｉｔ㊁ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ㊁胶回收试剂盒和ｐＭＤ１８￣Ｔ载体等ꎮ引物为擎科生物公司合成ꎬ大肠杆菌ＤＨ５α菌种为本实验室保存ꎬ抗生素及其他生化试剂均购自上海生工生物工程股份有限公司ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀总ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ的合成㊀根据天根多糖多酚ＲＮＡ提取试剂盒方法ꎬ从０.１ｇ的杉木种子中提取总ＲＮＡꎮ分别采用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ合成用于基因克隆的ｃＤＮＡꎬＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔｏｎｅ￣ｓｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｓｕｐｅｒＭｉｘ合成用于ｑＰＣＲ扩增的ｃＤＮＡꎮ１.２.２㊀杉木ＡＮＲ基因的扩增㊀根据本实验室杉木转录组测序得到的ＡＮＲ基因的部分序列ꎬ在其高度保守的区域进行特异性引物设计ꎬ正反向引物分别是ＡＮＲ￣Ｆ和ＡＮＲ￣Ｒꎮ以ｃＤＮＡ原液为模板进行ＲＴ￣ＰＣＲ扩增ꎬＰＣＲ反应条件为９４ħ预变性２ｍｉｎꎻ９４ħ变性３０ｓꎬ５６ħ退火３０ｓꎬ７２ħ延伸３０ｓꎬ反应３５个循环ꎻ７２ħ延伸１０ｍｉｎꎬ４ħ保存ꎮ１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物ꎬ紫外切胶仪回收扩增条带ꎬ胶回收试剂盒进行纯化后连接ＰＣＲ产物到ｐＭＤ￣１８Ｔ载体ꎬ随后转入ＤＨ５α大肠杆菌ꎬ菌液ＰＣＲ筛选阳性克隆后送至华大基因公司测序ꎮ基于测序的保守片段ꎬ设计特异引物扩增ＡＮＲ基因的５ᶄ和３ᶄ端序列ꎬ以上试验参照了ＳＭＡＲＴｅｒ®ＲＡＣＥ５ᶄ/３ᶄＫｉｔ试剂盒说明书ꎮ利用巢式ＰＣＲ进行ＡＮＲ５ᶄＲＡＣＥ和３ᶄＲＡＣＥ实验ꎬＰＣＲ产物回收测序ꎬ将克隆到的５ᶄ㊁３ᶄ端和保守区序列用ＤＮＡＭＡＮ软件进行拼接ꎬ获得ＡＮＲ基因的全长ｃＤＮＡ序列ꎮ利用ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ工具确定ＡＮＲ基因的ＯＲＦ区域ꎬ再根据全长ｃＤＮＡ序列设计扩增ＯＲＦ序列的特异性引物ꎬＰＣＲ反应后回收产物ꎬ再次测序验证ＯＲＦ序列是否准确ꎮ以上实验所用到的引物如表１所示ꎮ表１㊀引物设计Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅＰｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ引物名称ＡＮＲ￣Ｆ５ᶄＧＧＡＴＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＧＴ３ᶄＡＮＲ￣ＧＳＰ５５ᶄＧＧＡＴＣＡＣＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧ３ᶄＡＮＲ￣Ｒ５ᶄＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＴＣＡ３ᶄＡＮＲ￣ＮＧＳＰ５５ᶄＣＴＡＧＡＧＴＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＴ３ᶄＡＮＲ￣ＧＳＰ３５ᶄＧＧＴＡＡＣＡＧＴＧＴＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧ３ᶄＡＮＲ￣ＯＲＦ￣Ｆ５ᶄＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＧ３ᶄＡＮＲ￣ＮＧＳＰ３５ᶄＣＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＡＣ３ᶄＡＮＲ￣ＯＲＦ￣Ｒ５ᶄＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＴＴＧＡＴＡＧＧＣＧＡＡ３ᶄ１.２.３㊀生物信息学分析㊀利用ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ分析ＡＮＲ基因全长序列的ＯＲＦ区域ꎬ并将其氨基酸序列在Ｂｌａｓｔｐ上进行同源性比对ꎬＮＣＢＩｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｓ在线网站进行蛋白结构域预测ꎬ利用ＭＥＧＡ５软件构建系统进化树ꎻＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ软件推测蛋白质的基本理化性质ꎬＰｒｏｔＳｃａｌｅ软件预测蛋白亲水性ꎬＴＭＨＭＭ软件进行蛋白质跨膜区预测ꎮ并用ＳｉｇｎａｌＰ４.１Ｓｅｒｖｅｒ软件预测蛋白质信号肽ꎬＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ软件预测蛋白质的二级结构ꎬＰｈｙｒｅ２软件预测蛋白质三级结构ꎬＰｒｏｔＣｏｍｐ９.０软件进行蛋白质亚细胞定位预测ꎬＭｏｔｉｆＳｃａｎ进行蛋白质的功能位点预测ꎮ１.２.４㊀ＡＮＲ基因实时荧光定量ＰＣＲ分析㊀由克隆的ｃＤＮＡ序列设计ｑＰＣＲ特异性引物ＡＮＲ￣１:５ᶄＣＧＴＧ￣ＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＡＧＣＧＧＡ３ᶄꎬＡＮＲ￣２:５ᶄＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧ３ᶄꎬ选择杉木ＥＦ１α为内参基因ꎬ设计引物ＥＦ１:５ᶄＧＣＡＣＴＧＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＴＣＣＴ３ᶄꎬＥＦ２:５ᶄＣＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＡＡＴＧＡＴ３ᶄꎮ以稀释１０倍的ｃＤＮＡ为模板进行ｑＰＣＲ扩增ꎬＰＣＲ反应条件为９４ħ预变性３０ｓꎻ９４ħ变性５ｓꎬ５４ħ退火１５ｓꎬ７２ħ延伸１０ｓꎬ反应４０个循环ꎻ７２ħ延伸１０ｓꎮ运用２－әәＣｔ计算方法进行ＡＮＲ基因的相对表达量的分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀总ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ的合成㊀㊀采用１.０％琼脂糖凝胶电泳法和酶标仪法ꎬ检测杉木种子总ＲＮＡ的完整性和纯度ꎮ凝胶电泳结果表明２８Ｓ和１８Ｓ条带清晰ꎬ说明ＲＮＡ无降解ꎬ完整性良好果均[图１(ａ)]ꎻ测定的ＯＤ２６０/２８０的值在１.８~２.０范围内ꎬ说明无ＤＮＡ污染ꎮ２.２㊀杉木ＡＮＲ基因的扩增㊀㊀合成ｃＤＮＡ第一条链ꎬ以ｃＤＮＡ为模板进行保守区中间序列扩增ꎬＰＣＲ产物电泳检测结果如图１(ｂ)所示ꎬ得到一条长度约８５０ｂｐ的条带ꎬ回收产物ꎬＴＡ克隆测序ꎮ按照ＳＭＡＲＴｅｒ®ＲＡＣＥ５ᶄ/３ᶄＫｉｔＵｓｅｒＭａｎｕａｌ的方法ꎬ分别扩增了５ᶄ端和３ᶄ端基因序列ꎬ１％琼脂糖凝胶电泳检测ＲＡＣＥ产物ꎮ㊀㊀３ᶄＲＡＣＥ和５ᶄＲＡＣＥ扩增分别得到两条长度约８２０和４５０ｂｐ的目的基因条带[图１(ｃ)]ꎬ回收产物连接到克隆载体进行测序ꎮ将克隆到的基因片段进行拼接ꎬ获得了杉木ＡＮＲ基因的全长ｃＤＮＡ序列ꎬ其长度为１３５７ｂｐꎬ具有一个１０５６ｂｐ的开放阅读框(ＯＲＦ)ꎬ编码３５１个氨基酸ꎮ㊀㊀根据全长序列ꎬ设计引物ꎬ进行ＯＲＦ序列的ＰＣＲ扩增[图１(ｄ)]ꎬ得到一条长度约１１００ｂｐ的条带ꎬ回收测序验证ＯＲＦ序列的准确性ꎮ将ＯＲＦ编码的氨基酸序列(图２)在ＮＣＢＩ上进行Ｂｌａｓｔｐ分析ꎬ结果显示:杉木ＡＮＲ蛋白与银杏的ＡＮＲ蛋白比对ꎬ同源性达到４８％ꎻ与胡杨㊁毛果杨和黑杨的同源性均达到４２％ꎻ与无油樟和蓖麻的同源性达到４３％ꎮ同时ꎬ比对结果显示ꎬＡＮＲ蛋白与银杏㊁大豆和拟南芥的ＤＦＲ蛋白具有同源性ꎬ分别是４４％㊁４０％和４１％ꎮ在ＤｅｖｉｃＭ对花青素还原酶基因的研究中ꎬ发现ＢＡＮ基因与ＤＦＲ基因具有高度的相似性ꎬ而且是种皮早期分化和发育的一种标记基因[９]ꎮＴｈｉｒｕｇ￣ｎａｎａｓａｍｂａｎｔｈａｍＫ选用ＶｖＤＦＲ的Ｆ链为模板ꎬ运用ＳＰ２ｓｅｒｖｅｒ构建ＣｓＡＮＲ模型ꎬ发现ＣｓＡＮＲ与ＶｖＤＦＲ模型叠加[１０]ꎮ表明杉木ＡＮＲ可能与ＤＦＲ蛋白的功能相似ꎮ图１㊀ＡＮＲ基因的克隆结果Ｆｉｇｕｒｅ１㊀ＣｌｏｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅＡＮＲｇｅｎｅ３ ㊀第１期王培ꎬ等:杉木涩籽形成过程的花青素还原酶基因表达图２㊀核苷酸和推导的氨基酸序列Ｆｉｇｕｒｅ２㊀Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃ２.３㊀生物信息学分析２.３.１㊀蛋白质基本性质及结构预测㊀根据推导的氨基酸序列ꎬ采用ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ软件推测ＡＮＲ蛋白的理化性质ꎬ结果显示:３５１个氨基酸编码的ＡＮＲ蛋白分子量为３８８２４.３７ｇ ｍｏｌ－１ꎬ等电点为５.７０ꎬ半衰期为３０ｈꎬ不稳定指数４４.２４ꎬ属不稳定蛋白质ꎮ其中亮氨酸含量最高ꎬ达１０.０％ꎬ其次ꎬ丙氨酸为７.７％㊁丝氨酸７.４％ꎬ带负电残基的总数为３８个ꎬ带正电残基的总数为２８个ꎬ预测亲水性平均值为－０.０６８ꎬ表示ＡＮＲ蛋白为亲水性蛋白ꎮＰｒｏｔＳｃａｌｅ预测结果显示[图３(ａ)]负值多于正值ꎬ也证明了该蛋白的亲水性质ꎮ㊀㊀运用ＳｉｇｎａｌＰ４.１Ｓｅｒｖｅｒ信号肽预测如图３(ｂ)所示ꎬ发现ＡＮＲ蛋白Ｎ末端并没有信号肽ꎬＴＭＨＭＭ跨膜区预测如图３(ｃ)所示ꎬ也未发现跨膜结构ꎬ说明ＡＮＲ蛋白不属于分泌或跨膜蛋白ꎬ有可能是以游离态形式存在ꎮ运用ＰｒｏｔＣｏｍｐ９.０亚细胞定位预测结果如表２所示ꎬ发现ＡＮＲ蛋白最有可能存在于细胞外ꎬ其次是在细胞器过氧化物酶体和叶绿体中ꎮ㊀㊀蛋白质结构预测结果显示:ＡＮＲ蛋白具有１２个蛋白质－蛋白质相互作用位点ꎬ二级结构中无规则卷曲(Ｃｃ)和α螺旋(Ｈｈ)占比较大ꎬ分别是４０.１７％和３８.１８％ꎬ其次是延伸链(Ｅｅ)占１４.８１％ꎬβ转角(Ｔｔ)占６.８４％[图３(ｄ)]ꎮ三级结构预测结果[图３(ｅ)]与二级结构预测结果基本一致ꎮ２.３.２㊀ＡＮＲ蛋白结构域及功能位点分析㊀经过ＮＣＢＩｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｓ网站搜索ꎬＡＮＲ蛋白属于ＳＤＲ超家族成员(图４)ꎬ具有一个ＦＲ＿ＳＤＲ＿ｅ特异性结构域ꎬ以及还原酶典型的ＮＡＤＰ结合位点㊁活动位点以及底物结合位点ꎮＳＤＲ是属于功能多样的氧化还原酶家族ꎬ主要有经典型㊁扩展型㊁中间型㊁复合型和扩散型[１１]ꎮＦＲ＿ＳＤＲ＿ｅ是包含了扩展型ＳＤＲ特性的ＦＲ蛋白ꎬ在类黄酮物质发生ＮＡＤＰ依赖性还原反应中发挥着重要作用ꎮ用ＭｏｔｉｆＳｃａｎ软件预测蛋白的功能位点ꎬ显示ＡＮＲ蛋白具有４个Ｎ￣肉豆蔻酰化位点(Ｎ￣ｍｙｒｉｓ￣ｔｏｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ)ꎬ５个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点(ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ)和６个酪蛋白激酶磷酸化位点(Ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ)ꎬ具体位置如表３所示ꎮ ４ 森㊀林㊀与㊀环㊀境㊀学㊀报第３９卷㊀图３㊀ＡＮＲ蛋白质基本性质及结构预测Ｆｉｇｕｒｅ３㊀ＢａｓｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＡＮＲｐｒｏｔｅｉｎ表２㊀ＡＮＲ蛋白亚细胞定位结果Ｔａｂｌｅ２㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＡＮＲｐｒｏｔｅｉｎ亚细胞定位Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ细胞外Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ过氧化物酶体Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ叶绿体Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ线粒体Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ细胞质Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ高尔基Ｇｏｌｇｉ内质网Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｒｅｔｉｃ存在概率Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ２.４８２.２７１.９２１.０６０.９７０.９６０.３４表３㊀ＡＮＲ蛋白功能位点预测Ｔａｂｌｅ３㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｓｏｆＡＮＲｐｒｏｔｅｉｎ功能位点Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｓ氨基酸位置Ａｍｉｎｏａｃｉｄｌｏｃａｔｉｏｎ氨基酸序列Ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ功能位点Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｓ氨基酸位置Ａｍｉｎｏａｃｉｄｌｏｃａｔｉｏｎ氨基酸序列ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅＮ￣ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ１３ １８ＧＧＦＩＧＳｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ３１１ ３１３ＳＹＫＮ￣ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ６８ ７３ＧＳＦＹＳＡｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ３４ ３７ＴＣＲＤＮ￣ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ２１６ ２２１ＧＮＰＥＳＬｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ７２ ７５ＳＡＩＥＮ￣ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ３２３ ３２８ＧＩＱＹＡＫｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ８５ ８８ＴＳＭＤｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ４ ６ＴＫＫｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ１６９ １７２ＴＬＡＥｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ３４ ３６ＴＣＲｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ２６７ ２７０ＳＩＡＤｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ１１７ １１９ＴＶＲｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ３４５ ３４８ＳＳＮＤｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ３０２ ３０４ＳＮＫ ５㊀第１期王培ꎬ等:杉木涩籽形成过程的花青素还原酶基因表达图４㊀ＡＮＲ蛋白保守域分析Ｆｉｇｕｒｅ４㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｏｆＡＮＲｐｒｏｔｅｉｎ２.３.３㊀ＡＮＲ蛋白系统进化树的构建㊀根据Ｂｌａｓｔｐ的蛋白序列比对结果ꎬ选取９种不同物种的蛋白序列ꎬ其中包括可可㊁木本棉㊁苦荞麦㊁毛果杨㊁黑杨㊁茶树㊁拟南芥㊁银杏㊁北美云杉等物种ꎮ运用ＭＥＧＡ５软件中的ＮＪ法进行ＡＮＲ蛋白的系统进化树构建(图５)ꎮ从进化关系上可以看出ꎬ杉木ＡＮＲ蛋白与北美云杉位于同一分支ꎬ表明两者的亲缘关系最为接近ꎬ但北美云杉的蛋白质特征还未知ꎬ仅具有花青素还原酶的ＣＤＤ区ꎬ区域特征属于ＦＲ＿ＳＤＲ＿ｅ结构域ꎮ银杏和拟南芥则各位于一支ꎮ目前裸子植物的ＡＮＲ研究报道少之又少ꎬ２００６年首次对银杏的ＡＮＲ基因进行分离与鉴定ꎬ发现其在叶子中表达最强[１２]ꎮ而拟南芥中ꎬ最早在种皮中发现ＢＡＮ基因的存在ꎬ证明了其在类黄酮合成途径中作为一种负调节剂来防止种皮色素的积累[１３]ꎮ㊀㊀其他物种聚为一个大分支ꎬ分别包括３组ꎬ一组茶树ꎬ一组毛果杨和黑杨ꎬ另一组可可㊁木本棉和苦荞麦ꎬ根据距离远近可以看出这些物种与杉木的亲缘关系相对较远ꎮ蒋春丽等[１４]的研究表明ꎬ在苦荞麦不同发育时期的种子中ꎬＡＮＲ基因的表达受不同光质的影响ꎬ蓝光和远红光可导致ＡＮＲ表达量的上调ꎮ在可可中ꎬ种子的ＡＮＲ表达量仅次于外果皮ꎬ但ＰＡ含量却最低ꎬ结果表明ＰＡ的积累与ＡＮＲ不相关ꎬ而与ＬＡＲ相关ꎻ对拟南芥ＢＡＮ突变体进行ＴｃＡＮＲ基因过表达时ꎬ发现突变体种子恢复到野生型的表型ꎬ种皮内有缩合单宁的积累ꎬ同时下胚轴花青素的含量有所降低[１５]ꎮ缩合单宁在种皮细胞内积累的主要作用则是保护胚和胚乳的正常发育[１６]ꎮ在过表达ＣｓＡＮＲ的烟草中ꎬ发现ＣｓＡＮＲ提高了烟草根对铝毒害的耐受性[１７]ꎮ结合以上研究发现ꎬＡＮＲ基因可能具有一定的物种特异性ꎬ其表达特性受多种因素干扰ꎬ但进化树亲缘关系的远近一定程度上表明了杉木ＡＮＲ可能具备的蛋白功能ꎬ亦可为后期ＡＮＲ蛋白功能的验证提供一定的理论参考ꎮ图５㊀杉木ＡＮＲ蛋白系统进化树Ｆｉｇｕｒｅ５㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＡＮＲｐｒｏｔｅｉｎｉｎＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｌａｎｃｅｏｌａｔａ２.４㊀ＡＮＲ基因相对表达量的分析㊀㊀对不同涩籽率的杉木家系不同发育时期的种子进行实时荧光定量ＰＣＲ分析ꎬ结果显示(图６)ꎬ在７０~８０ｄ之间ꎬ３个家系的ＡＮＲ基因的相对表达量都显著上升ꎬ且在７０ｄ时ꎬ各家系中ＡＮＲ基因的相 ６ 森㊀林㊀与㊀环㊀境㊀学㊀报第３９卷㊀对表达量大小依次是Ｈ>Ｍ>Ｌꎬ差异显著ꎻ８０ｄ时ꎬＭ家系的表达量最大ꎬＬ和Ｈ家系大致相同ꎮ８０~９０ｄ之间ꎬＬ和Ｍ家系的ＡＮＲ基因相对表达量迅速降低ꎬＨ家系的相对表达量变化则没有明显的差异ꎮ９０~１００ｄ之间ꎬＬ家系的ＡＮＲ基因相对表达量有所上升ꎬＭ家系的继续下降ꎬ到达１００ｄ时两个家系的ＡＮＲ基因相对表达量基本一致ꎬ但是Ｈ家系的相对表达量仍然处于高水平状态ꎬ且无降低的趋势ꎮ表明在Ｈ家系种子中ꎬＡＮＲ基因在９０㊁１００ｄ的表达量一直显著高于Ｍ和Ｌ家系ꎻ而在Ｍ和Ｌ家系中ꎬＡＮＲ基因的表达模式仅仅是种子发育８０ｄ时较高ꎬ之后明显下调ꎮ说明杉木涩籽率可能与其ＡＮＲ基因表达相关ꎮ３㊀讨论㊀㊀本试验通过ＲＴ￣ＰＣＲ结合ＲＡＣＥ的方法ꎬ克隆了杉木花青素还原酶ＡＮＲ基因的全长ｃＤＮＡ序列ꎬ㊀㊀注:大写字母表示同一家系不同发育时期差异显著ꎬ小写字母表示同一发育时期不同家系差异显著(Ｐ<０.０５)Ｎｏｔｅ:ｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｆａｍｉｌｙꎬｌｏｗｅｒｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆａｍｉｌｉｅｓａｔｔｈｅｓａｍｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅ(Ｐ<０.０５).图６㊀种子不同发育时期ＡＮＲ基因的相对表达量Ｆｉｇｕｒｅ６㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＮＲｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆｓｅｅｄｓ其长度为１３５７ｂｐꎬ具有一个１０５６ｂｐ的开放阅读框(ＯＲＦ)ꎬ编码３５１个氨基酸ꎮ蛋白质基本性质预测:ＡＮＲ蛋白分子量３８８２４.３７Ｄａꎬ理论等电点５.７０ꎬ预测的半衰期为３０ｈꎬ不稳定指数４４.２４ꎬ亲水性平均值－０.０６８ꎬ属于不稳定的亲水性蛋白质ꎬ且不具备信号肽和跨膜区结构ꎮ保守域预测ＡＮＲ蛋白为ＳＤＲ超家族ꎬ具有一个ＦＲ＿ＳＤＲ＿ｅ特异性结构域ꎮ在进行同源性分析时ꎬ发现杉木ＡＮＲ蛋白和其他物种的ＡＮＲ蛋白和ＤＦＲ蛋白都具有一定的同源性ꎮ㊀㊀本研究对不同涩籽率的杉木家系不同发育时期的种子进行ＡＮＲ基因实时荧光定量ＰＣＲ分析结果显示ꎬＬ家系㊁Ｍ家系和Ｈ家系的种子在７０~８０ｄ的过程中ꎬＡＮＲ基因均是显著上调表达ꎬＬ家系和Ｍ家系在８０ｄ之后ＡＮＲ基因表达水平显著降低ꎬ但Ｈ家系在８０ｄ以后其表达量一直保持较高水平ꎮ㊀㊀有研究表明ꎬ黄醇酮对矮牵牛和玉米的花粉萌发和花粉管发育具有至关重要的作用[１８－１９]ꎬ在烟草中沉默黄酮醇合酶(ＦＬＳ)基因ꎬ则使得烟草的黄酮醇含量降低ꎬ黄烷￣３￣醇的含量升高ꎬ且花粉萌发受阻ꎬ种子数量减少[２０]ꎮ在类黄酮生物合成途径中ꎬＦＬＳ和ＤＦＲ蛋白酶是以二氢黄酮醇作为共同底物ꎬ分别进行黄酮醇和无色花青素的合成ꎬ无色花青素又经ＡＮＳ和ＡＮＲ的催化转化为黄烷￣３￣醇ꎬ即单宁单体[２１]ꎮ由于ＡＮＲ是催化花青素向缩合单宁衍化的关键酶之一ꎬＡＮＲ基因的表达对黄烷￣３￣醇和ＰＡ的生物合成起着重要作用[２２]ꎮ在杉木涩籽形成过程中ꎬ可能因为杉木ＡＮＲ与ＤＦＲ具有一定的相似性ꎬ促使二氢黄酮醇向ＰＡ途径的方向衍化ꎬＡＮＲ基因的高度表达使得黄酮醇的合成受到抑制ꎬ进而导致花粉育性降低引发了种子败育现象ꎮ因此推测杉木Ｈ家系的高败育率可能跟ＡＮＲ基因的异常表达具有一定的关联性ꎮ但在ＢＡＵＤＲＹｅｔａｌ[２３]研究中发现ꎬＴＴ２(ＭＹＢ转录因子)㊁ＴＴ８(ｂＨＬＨ转录因子)和ＴＴＧ１(ＷＤＲ蛋白)基因是ＢＡＮ基因正确表达的必要条件ꎮ戴鹏辉等[２４]对珙桐的ＤｉＭＹＢ１进行表达分析时ꎬ发现ＤｉＭＹＢ１在败育种子中的表达量显著高于正常种子ꎬ而且ＤｉＭＹＢ１在发育中期的败育种子中表达量最高ꎮ所以在杉木涩籽中ꎬＡＮＲ基因的异常表达可能是这类基因单一或共同调控的结果ꎮ而杉木ＡＮＲ基因的调控机制到底是如何进行的ꎬ还需后期进行实验加以验证ꎮ参考文献[１]符梅忠ꎬ傅远志ꎬ蒋国洪.杉木籽粒败育的研究[Ｊ].浙江林业科技ꎬ１９８９ꎬ９(２):１５－１９.[２]管康林.杉木种子空瘪涩粒成因的综合分析[Ｊ].浙江林学院学报ꎬ１９９７ꎬ１４(１):８８－９３.[３]黄烺增ꎬ谢永强ꎬ齐清琳ꎬ等.杉木种子涩籽胚败育过程及其生理生化指标[Ｊ].福建林学院学报ꎬ１９９３ꎬ１３(４):４０１－４０６.[４]黄烺增.杉木种子涩籽胚败育与过氧化物酶同工酶活性及脂质过氧化作用的关系[Ｊ].西北植物学报ꎬ１９９６ꎬ１６(５):８３－８８. ７ ㊀第１期王培ꎬ等:杉木涩籽形成过程的花青素还原酶基因表达８ 森㊀林㊀与㊀环㊀境㊀学㊀报第３９卷㊀[５]林小琴ꎬ马志慧ꎬ何宗明ꎬ等.杉木种子多酚提取工艺优化[Ｊ].森林与环境学报ꎬ２０１７ꎬ３７(１):４７－５３. 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木质素合成酶基因F5H的克隆及其鉴定
付月;李学龙;薛永常
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2006(034)008
【摘要】通过RT-PCR从正在分化的2年生欧美杨107号茎的次生木质部提取mRNA,扩增出一基因片段,与pGM-T载体连接,重组质粒经EcoRI酶切、特异性引物扩增、测序鉴定.结果表明,该基因片段长度为867 bp,与EMBL核酸序列库中Van Doorsselaere等发表的白杨杂种F5H的cDNA序列(PAJ10324)相比,同源性高达99.19%,可以断定所扩增的DNA片段即为F5H基因片段.
【总页数】3页(P1553-1555)
【作者】付月;李学龙;薛永常
【作者单位】大连轻工业学院生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034;大连轻工业学院生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034;大连轻工业学院生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
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5.木质素合成酶基因F5H的RT-PCR引物筛选 [J], 付月;薛永常;姚奇
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木醋杆菌纤维素合成操纵子的克隆及棉花转化卢迎春;魏刚;朱玉贤【期刊名称】《植物学报（英文版）》【年(卷),期】2002(044)004【摘要】The gram-negative bacterium Acetobacter xylinum synthesizes an extracellular ribbon of cellulose microfibrils that possess unique structural and mechanical properties when compared to higher plant cellulose. All four genes in the cellulose-synthesizing operon (ayacs operon) of A. xylinum Ay201 were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using oligonucleotide primers designed according to published acs operon sequence of A. xylinum ATCC 53582. Alignment of the two operons showed that they were highly homologous (98% similarity, 97% identity). AcsA and acsB gene were cloned in pCAMBIA 1301 vector while acsC and acsD were cloned in pCOB302-3 under the control of CaM 35S promoter. The constructs were introduced into cotton by the pollen-tube-pathway method and seeds obtained from putative transgenic plants were germinated on media containing hygromycin and phosphinothricin (PPT). Five seedlings out of 934 seeds were proved to contain all four foreign genes by PCR amplification. This is the first time that a whole operon encoding four different bacterial enzymes with various biological functions is transformed into cultivated cotton plants.%革兰氏阴性菌木醋杆菌(Acetobacter xylinum (Brown) Yamada)合成一种由纤维素微纤丝组成的胞外带状物.与高等植物纤维素相比,它具有独特的结构和机械性能.根据从木醋杆菌ATCC 53582克隆的acs纤维素合成操纵子序列设计引物, 用PCR的方法从木醋杆菌Ay201中克隆了ayacs纤维素合成操纵子的全部4个基因.序列比较发现,两者高度同源.将连上CaMV 35S启动子的acsA、acsB克隆到植物表达载体pCAMBIA 1301上,acsC、acsD克隆到pCOB302-3中.然后通过花粉管通道法转化棉花(Gossypium hirsutum)胚珠,收获的种子在含有卡那霉素和除草剂的双抗培养基上进行筛选.PCR检测发现934粒种子中有5棵植株含有全部4个基因.这是首次将编码4个功能蛋白的细菌操纵子成功地转入棉花.【总页数】5页(P441-445)【作者】卢迎春;魏刚;朱玉贤【作者单位】北京大学生命科学学院,北京,100871;北京大学生命科学学院,北京,100871;北京大学生命科学学院,北京,100871【正文语种】中文【中图分类】Q943.2因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

亚麻木质素合成途径中关键酶基因片段的克隆与序列分析高原;陈信波;龙松华;邓欣;邹杰;刘爱玲【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2008(34)2【摘要】亚麻是一种重要的韧皮纤维作物,木质素对亚麻纤维的性能和品质具有较大影响.以亚麻(Linum usitatissimum L.)茎秆表皮细胞的mRNA为模板,利用木质素合成途径中关键酶基因的同源基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增.电泳获得13个特异带.分别将这些DNA片段连接到T载体后转化大肠杆菌,从重组质粒转化菌分别挑取5～8个单菌落测定插入片段序列,得到关键酶基因新的片段序列8个.生物信息学分析结果表明,这些新片段分别属于3个基因家族.其中,2个CCoAOMT基因片段(GenBank登录号为EF214740,EF214741),3个4CL基因片段(GenBank登录号为EF214737,EF214738,EF214739),3个F5H基因片段(GenBank登录号为EF214745,EF214746,EF214747),推测亚麻中这几个木质素代谢关键调控酶基因存在多基因家族.新获得的基因片段序列为进一步克隆全序列和了解调控亚麻木质素的生物合成奠定了基础.【总页数】4页(P337-340)【作者】高原;陈信波;龙松华;邓欣;邹杰;刘爱玲【作者单位】中国农业科学院麻类研究所农业部麻类遗传改良与工程微生物重点实验室,湖南长沙,410205;湖南农业大学作物基因工程重点实验室,湖南,长沙,410128;中国农业科学院麻类研究所农业部麻类遗传改良与工程微生物重点实验室,湖南长沙,410205;湖南农业大学作物基因工程重点实验室,湖南,长沙,410128;中国农业科学院麻类研究所农业部麻类遗传改良与工程微生物重点实验室,湖南长沙,410205;中国农业科学院麻类研究所农业部麻类遗传改良与工程微生物重点实验室,湖南长沙,410205;湖南农业大学作物基因工程重点实验室,湖南,长沙,410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙,410128【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.粘质沙雷氏菌中乙偶姻合成途径基因克隆、序列分析及表达 [J], 张燎原;孙建安;魏东芝;沈亚领2.互花米草中NHX基因片段的克隆与序列分析 [J], 赵祥强;汤薇;张燕;李鑫3.桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达 [J], 古英洪;汤浩茹;张义正4.柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因片段的克隆与序列分析 [J], 董乐萌;刘玉军;魏建和5.甜菊醇糖苷生物合成途径关键酶基因KA13H的克隆及序列分析 [J], 郭书巧;束红梅;郑卿;倪万潮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

木质素生物合成酶CCR基因的生物信息学分析陈刚;徐秉良;白江平【摘要】肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是催化木质素特异途径的第一个关键酶,是调节碳素流向木质素潜在的控制关节点,对木质素单体的生物合成起着重要作用.通过NCBI数据库收集来自裸子植物、单子叶植物及双子叶植物的35条CCR基因的完整信息,对35条CCR基因的cDNA及其编码的氨基酸序列的进化规律、理化性质、结构域、导肽、信号肽、跨膜结构域、亲/疏水性以及蛋白质结构等性状进行了生物信息学分析与预测,构建了CCR基因的系统发育树.分析结果表明,单子叶植物CCR基因中GC的含量明显高于双子叶植物；CCR基因编码的氨基酸序列存在9个保守区域；所编码氨基酸的理化性质基本一致,但单子叶、双子叶及裸子植物的CCR基因编码主要氨基酸的种类和含量存在着差异；CCR蛋白的N-端存在一个脱氢酶/差向异构酶/辅酶Ⅰ结合蛋白的结构域,无导肽、信号肽及跨膜结构域,属亲水性蛋白；进化树绘制以及同源建模结果表明,CCR基因的进化和植物的进化基本一致,CCR蛋白三级结构模型的空间结构稳定,建模结果可靠.分析结果对于深入研究CCR蛋白在木质素合成中的作用具有一定的理论指导意义.【期刊名称】《生物信息学》【年(卷),期】2013(011)001【总页数】8页(P50-57)【关键词】木质素;CCR基因;生物信息学;进化树;同源建模【作者】陈刚;徐秉良;白江平【作者单位】甘肃农业大学草业学院、草业生态系统教育部重点实验室、中-美草地畜牧业可持续发展研究中心、甘肃省草业工程实验室,甘肃兰州730070;甘肃省干旱生境作物学重点实验室-甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃兰州730070;甘肃农业大学草业学院、草业生态系统教育部重点实验室、中-美草地畜牧业可持续发展研究中心、甘肃省草业工程实验室,甘肃兰州730070;甘肃省干旱生境作物学重点实验室-甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃兰州730070;甘肃农业大学草业学院、草业生态系统教育部重点实验室、中-美草地畜牧业可持续发展研究中心、甘肃省草业工程实验室,甘肃兰州730070;甘肃省干旱生境作物学重点实验室-甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】Q518.2木质素是一种具有芳香族特性的三维高分子化合物。

植物木质素合成调控及基因工程研究进展植物木质素是植物细胞壁的主要成分，对植物生长发育和抗逆性起着重要作用。

随着对木质素生物合成途径和调控机制的深入研究，利用基因工程手段调控木质素合成的研究也在不断取得进展。

本文将介绍植物木质素合成的调控机制及基因工程研究进展，为进一步探讨植物木质素合成调控及利用基因工程手段改良木质素合成途径提供参考。

一、植物木质素合成调控机制植物木质素的生物合成是一个复杂的过程，涉及多个酶和调控因子的参与。

木质素合成的主要途径是通过酚氧化酶（POX）、过氧化物酶（PRX）、木质素过氧化物酶（LAC）等酶的催化，将酪醇和酚类物质氧化聚合成多聚酚合物。

这一过程受到多种转录因子、信号分子和激素的调控，包括MYB、NAC、WRKY转录因子等，以及赤霉素、脱落酸等激素的调控。

1. MYB家族转录因子对木质素合成的调控MYB家族转录因子在植物木质素合成途径中起着重要作用。

研究表明，MYB58和MYB63是木质素合成过程中的关键调控因子，它们可以激活木质素合成途径中多个酶基因的转录。

MYB46和MYB83也能够直接激活木质素合成途径中的关键基因，促进木质素的生物合成。

植物生长发育和逆境响应过程中的激素也对木质素合成具有调控作用。

赤霉素可以直接或间接影响木质素生物合成途径中多个基因的表达，促进木质素的生物合成。

脱落酸也能够通过激活MYB家族和NAC家族转录因子来影响木质素生物合成途径。

其他激素如乙烯、赤霉素、脱落酸等对木质素合成也具有一定的调控作用。

随着对木质素合成调控机制的深入研究，利用基因工程手段调控木质素合成也成为了研究的热点。

通过转基因技术和基因编辑技术，可以对木质素合成途径中的关键基因进行调控，从而影响木质素的合成和积累。

转基因技术是一种常用的调控木质素合成的方法。

通过转入木质素合成途径相关基因或调控因子的外源基因，可以影响木质素合成途径中的关键酶的表达和活性，从而改变木质素的合成和积累。