QIAquick-PCR-Purification-Kit中文版

QIAGEN Plasmid Mini,Midi,and Maxi Kits（说明书中文翻译版）Plasmid Midi Kit(cat.Nos.12143and12145)The kit can be stored at room temperature(15~25℃)for up to2years.使用前的注意事项：（1）将Rnase A solution加入Buffer P1中，混匀，2~8℃储存。

（2）可选步骤：按1:1000的比例将LyseBlue试剂加入到Buffer P1中。

（3）使用前在4℃预冷Buffer P3，检查Buffer P2是否出现SDS沉淀。

（4）需准备好异丙醇和70%酒精。

（5）标志：圆形代表小提试剂盒；三角形代表中提试剂盒；正方形代表大提取试剂盒。

表1推荐LB培养物体积试剂盒高考倍质粒低拷贝质粒小提3mL不推荐中提25mL100mL大提100mL500mL具体操作步骤：1.收取过夜培养的细菌培养物，在4℃条件下6000×g离心15min。

2.（弃去上清液）使用4mL Buffer P1重悬菌体沉淀。

3.加入4mL Buffer P2，颠倒4~6次使彻底混匀，室温（15~25℃）孵育5min。

注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液会变蓝。

4.加入4mL预冷过的Buffer P3，颠倒4~6次使彻底混匀，冰上孵育15min。

注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液混匀后直至蓝色消失。

5.在4℃条件下≥20000×g（14000×g）离心30min。

6.平衡柱子QIAGEN-tip100：加入4mL Buffer QBT，通过重力流使液体过柱。

7.将第5步的上清液转移至QIAGEN-tip中，使其依靠重力流通过柱中的树脂。

8.使用10mL Buffer QC洗涤QIAGEN-tip，使Buffer QC依靠重力流通过柱中的树脂。

洗涤2次。

病毒宏基因组学方法鉴定出小熊猫粪便中一株新型指环状病毒郭靓骅;吴孔菊;华修国;崔立;张文;齐敦武【摘要】A novel anellovirus strain named AV-Chengdu1 was identified in feces from two red pandas.Sequence analysis showed that the 2 900 nt genome with a G+C content of 49.8％ (GenBank KX611132)contained three open reading frames (ORFs) encoding peptides of 581,131 and 133 aa in length.The homology between the largest peptide and the counterpart of pine marten torque teno virus (TTV)(JN704611) was56.4％.Phylogenetic analysis indicated that AV-Chengdu1 was a close relative of pine marten TTV.%研究从2份小熊猫粪便样品中检测到了一种新型的指环状病毒,命名为AV-Chengdu1(GenBank KX611132).全基因组测序结果表明,其基因组全长约2 900 nt,GC含量为49.8％;基因组结构分析表明其含3个开放阅读框(ORF1:1 743 nt,ORE2:393 nt,ORF3:399 nt),其中ORF1编码产物的氨基酸序列与一株来自松貂的指环状病毒的氨基酸序列(JN704611)同源性为56.4％.系统进化分析表明其与来自松貂的指环状病(JN704611)紧密聚类.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2018(036)001【总页数】7页(P14-19,35)【关键词】小熊猫;病毒宏基因组学;指环状病毒;基因组结构分析;系统进化分析【作者】郭靓骅;吴孔菊;华修国;崔立;张文;齐敦武【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;四川成都大熊猫繁育研究基地,四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室,成都610081;上海交通大学农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海200240;江苏大学医学院,江苏镇江212013;四川成都大熊猫繁育研究基地,四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室,成都610081【正文语种】中文【中图分类】S852.65指环状病毒(anelloviruses)[1-2]是一种小型单股负链环状DNA病毒,并被进一步细分为细环病毒(TTV),细小环病毒(TTMV),torque teno midi virus (TTMDV)和small anellovirus (SAV)[3]。

QIAquick® PCR Purification KitThe QIAquick PCR Purification Kit (cat. nos. 28104 and 28106) can be stored at room temperature (15–25°C) for up to 12 months.For more information, please refer to the QIAquick Spin Handbook, March 2008, which can be found at: /handbooks.For technical assistance, please call toll-free 00800-22-44-6000, or find regional phone numbers at /contact.Notes before startingAdd ethanol (96–100%) to Buffer PE before use (see bottle label for volume).All centrifugation steps are carried out at 17,900 x g (13,000 rpm) in a conventional table-top microcentrifuge at room temperature.Add 1:250 volume pH indicator I to Buffer PB. The yellow color of Buffer PB with pH indicator I indicates a pH of ≤7.5. If the purified PCR product is to be used in sensitive microarray applications, it may be beneficial to use Buffer PB withoutthe addition of pH indicator I. Do not add pH indicator I to buffer aliquots.1.Add 5 volumes Buffer PB to 1 volume of the PCR reaction and mix. If the color ofthe mixture is orange or violet, add 10 μl 3 M sodium acetate, pH 5.0, and mix.The color of the mixture will turn yellow.2.Place a QIAquick column in S a provided 2 ml collection tube or intoz a vacuum manifold. For details on how to set up a vacuum manifold, refer to the QIAquick Spin Handbook.3.To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column and S centrifuge for30–60 s or z apply vacuum to the manifold until all the samples have passedthrough the column. S Discard flow-through and place the QIAquick columnback in the same tube.October 20104.To wash, add 0.75 ml Buffer PE to the QIAquick column S centrifuge for30–60 s or z apply vacuum. S Discard flow-through and place the QIAquick column back in the same tube.5.Centrifuge the QIAquick column once more in the provided 2 ml collection tubefor 1 min to remove residual wash buffer.6.Place each QIAquick column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.7.To elute DNA, add 50 μl Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) or water (pH 7.0–8.5) to the center of the QIAquick membrane and centrifuge the column for1 min. For increased DNA concentration, add 30 μl elution buffer to the centerof the QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge.8.If the purified DNA is to be analyzed on a gel, add 1 volume of Loading Dye to5 volumes of purified DNA. Mix the solution by pipetting up and down beforeloading the gel.For up-to-date licensing information and product-specific Array disclaimers, see the respective QIAGEN kit handbook or usermanual.Trademarks: QIAGEN®, QIAquick® (QIAGEN Group). 1063920 10/2010© 2010 QIAGEN, all rights reserved.。

Qiagen基因组提取试剂盒中⽂操作说明QIAamp DNA Blood Mini Kit简介：QIAGEN公司出品的QIAamp DNA Blood Mini Kit适⽤于使⽤微型离⼼机或真空处理从全⾎、⾎浆、⾎清、⾎沉、淋巴细胞以及体液样品中提取总(基因、线粒体和病毒)DNA。

该试剂盒可处理带有EDTA、柠檬酸盐和肝素等常规抗凝剂的新鲜或冷冻的全⾎样本，样品量可达200µl。

整套基因组的操作时间约为20–40分钟，⼀般可从200µl健康全⾎中获得4–12 µg DNA，洗脱体积可在50–200µl范围。

抽提原理：样品中的DNA可以特异性结合到QIAamp的硅胶膜上，通过两次洗涤可以将PCR抑制剂，如：⼆价阳离⼦和蛋⽩完全去除，最后结合在离⼼柱上的纯核酸可⽤⽔或试剂盒中的缓冲液进⾏洗脱收集。

开始前的注意事项：1. 所以的离⼼步骤需要在室温（15-25℃）进⾏2. 如果样品中含有的基因组当量少于10000，请添加载体DNA（carrier DNA）3. 200µl全⾎样品可以得到约3-12µgDNA开始前的准备⼯作：1. 将样品平衡到室温（15-25℃）2. 将⽔浴或是⾦属浴加热到56℃，以备第4步使⽤3. 将Buffer AE或蒸馏⽔平衡到室温，⽤于第11步的洗脱4. 确保Buffer AW1、AW2以及QIAGEN蛋⽩酶已经按照说明配置完毕5. 如果在Buffer AL中出现沉淀物，请在56℃孵育使其溶解操作步骤：以下为整个基因组提取操作的流程图，由于真空装置并⾮所有的实验室都配置，所以这⾥介绍的是离⼼法（流程图左侧）。

以下译介⾃QIAGEN官⽅出品的说明部分，⿊粗体为实验操作的主体部分。

1. 吸取20µl QIAGEN蛋⽩酶（或者蛋⽩酶K）⾄1.5ml离⼼管的底部。

2. 加⼊200µl待提取基因组的样品⾄离⼼管中。

QIAGEN试剂盒提取RNA说明书中⽂翻译1:细菌的溶菌酶破碎2:细菌的溶菌酶破碎和机械破碎3:细菌的机械破碎4:细菌的溶菌酶裂解和蛋⽩酶K的消化5:细菌的溶菌酶裂解、蛋⽩酶K的消化及机械破碎6:固体培养基细菌的裂解7:使⽤RNeasy Mini Kit从细菌溶解物中提纯总RNA。

8:使⽤RNeasy Midi Kit从细菌溶解物中提纯总RNA。

章节说明该⼿册含有两种不同类型⽅案。

我们提供了多种⽅案，其中⽅案1-6是针对制备细菌溶解物，⽅案7-8是针对如何从细菌溶解物中提取全RNA。

你需要在⽅案1-6中选择⼀种操作，⽽后在⽅案7-8中任选其⼀。

制备细菌溶解物的各个⽅案都介绍了破碎细菌时如何固定RNA。

如何选择不同的实验⽅案由细菌细胞壁的稳定性所决定。

细菌细胞壁的稳定性受多个因素影响，包括细菌种类、⽣长阶段和培养基的成分。

细菌必须完全破碎以确保RNA的有效提取。

制备细菌溶解物的各个⽅案都包含了不⽌⼀步。

■酶消化：细菌细胞壁可以被溶菌酶进⾏消化（例如溶菌酶、溶葡球菌酶）。

我们认为溶菌酶的作⽤对于所有的⾰兰⽒阳性、阴性细菌均是有效的。

■蛋⽩酶K消化：在复杂培养基上⽣长的细菌⼤部分蛋⽩质可以被蛋⽩酶K消化以提⾼RNA 的纯化率。

我们认为蛋⽩酶K对于可在复合培养基中⽣长的细菌均是有效的。

蛋⽩酶K常常⽤于提⾼⾰兰⽒阳性细菌RNA。

另外，若从⼤量原材料中提取RNA，蛋⽩酶K可以有效提⾼RNA产率。

■机械破碎：细菌细胞壁的机械破碎可以使⽤组织研磨机和玻璃微珠。

机械破碎法对于绝⼤多数的细菌来说都是适⽤的。

机械破碎法与酶消化法相结合可以极⼤程度的提⾼RNA产率。

尽管本⼿册中的机械破碎⽅案均为使⽤组织研磨机，但采⽤其他的破碎⽅法是完全可⾏的。

考虑到细菌种类的多样性以及培养条件的多样性，细菌溶解物的制备⽅案（⽅案1-6）必须谨慎选择。

在第10页中介绍了制备细菌溶解物的不同⽅案，第11页（表格⼀）则提供了这些⽅案概况以便于参考选择。

基金项目:国家自然科学基金面上项目(N o.30170428,N o.30370641,N o.30570849);广东省自然科学基金重点项目(N o.37788,N o.05104541);中华人民共和国教育部博士学科科研基金项目(N o.20020560002,N o.20050560003)3通讯作者文章编号:1007-4287(2006)07-0715-03酵母单杂交筛选实验中的关键问题牛永东1,许丽艳23,韩　溟1,3,方王楷1,沈忠英2,李恩民13(1.汕头大学医学院生化与分子生物学教研室,广东汕头515041;2.汕头大学医学院肿瘤病理研究室;3.汕头大学医学院第二附属医院急诊外科)摘要:目的　酵母单杂交系统是研究生物大分子DNA 和蛋白质间相互作用的有效手段之一,酵母单杂交筛库实验是获取可以和诱饵序列相互作用的反式作用因子的关键。

方法　酵母单杂交诱饵质粒pHIS i3NF 转化Y M4271;通过不同浓度32AT 实验,获得酵母单杂交用宿主细胞Y M4271pHIS i3NF4;大规模筛选人食管癌细胞cDNA 文库。

结果　经筛库后续验证实验证实得到阳性克隆。

结论　通过准确确定32AT 的工作浓度,有效地完成了酵母单杂交的大规模筛选人食管癌细胞cDNA 文库的实验。

关键词:酵母单杂交;阳性克隆;cDNA 文库中图分类号:Q93919文献标识码:ASome keys of screening cDNA library with yeast one hybrid system NIU Yong 2dong 1,XU Li 2yan 23,H AN Min 1,3,et al.(De 2partment o f Biochemistry and Molecula Boilogy ,Medical College o f Shantou Univer sity ,Shantou 515041,China )Abstract :Objective Screening the cDNA library is the key of the yeast one hybrid technique.Methods Screening the cDNA library of es ophageal carcinoma cell line SHEEC with the cell strain Y M4271pHIS i3NF4by LiAc/PEG method in large scale ,which is the product of the constructed bait plasmid pHIS i3NF4trans forms Y M4271strain ,Further study were carried on by the 32AT higher in 2hibition test and changed report gene tested test.R esults 30positive clones by 32AT higher inhibition test and restriction endo 2nucle 2ases digested tests.Conclusion The cDNA library of yeast one hybrid system had been screened success fully in large scale by con 2firming the matched concentration of 32AT.K ey w ords :yeast one hybrid ;positive clones ;cDNA library(Chin J Lab Diagn ,2006,10:715) 酵母单杂交系统是近年来发展起来的一种研究生物大分子DNA 和蛋白质间相互作用的高通量技术平台。

酵母菌落PCR方法酵母菌落PCR方法，酵母菌落PCR方法，涉及提取DNA方法、PCR方法问：很郁闷，最近在做电转毕赤酵母，但是转化完了没有合适的筛选方法，如果提基组的话费时费钱，而且由我这个电转的几率十分低，也就有1%-10%，所以想用菌落PCR 方法筛选，但酵母菌破壁很困难，如果处理不好的话基组释放不出来，就没有阳性结果了。

查了一些资料说用反复冻融法，是不是直接挑单菌落就行了呢？还有说用蜗牛酶帮助消化的，这个我倒不是很清楚，所以请各位大虾们帮帮忙，在实在是被这个伤透脑筋了！求助十万火急答：蜗牛酶提取DNA以后作PCR效果很稳定酵母DNA的提取1、x新鲜的菌中加入150ul（200ul）bufferiI25(30)ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。

2、离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul3、加入25ul，10%SDS。

65度，30min水浴。

4、加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分钟（4度冰箱放置就可以）5、12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不振荡，直接离心）6、12000rmp，15min，弃上清。

7、150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min8、将上清溶液转到干净的离心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min9、加入等积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶50ulbufferIII中10、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提11、bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA12、bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA13、bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA14、筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法酵母菌落PCR1、酵母质粒和基组DNAPCR模版的备取对数生长期酵母菌株 1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮200ulTE缓冲液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存－20度取1ul用PCR2、从板上调取长势良好的菌落少许，悬浮含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔，放置盖子受热膨胀）水浴煮沸0.2.5.10min3、利用微波炉快速备酵母治理以及菌落取直大3mm的酵母干菌落，至EP管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30ulTE振荡，13000r/min，离心2-5min，上清储存浴－20度，取1ul来作PCR真菌DNA的提取方法改良1、酵母活化后加入YEPD培养基，25-28度培养16-24小时，收集菌2、取少许新鲜的菌，加入0.6ml缓冲液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。