PCR影响因素

影响PＣR 结果得因素(１) 引物: 引物就是PCＲ特异性反应得关键,ＰＣＲ产物得特异性取决于引物与模板DＮA 互补得程度、设计引物应遵循以下原则:①引物长度: 1５-30bp,常用为20ｂp左右。

②引物扩增跨度: 以200－500ｂｐ为宜,特定条件下可扩增长至10kｂ得片段。

③引物碱基:G＋Ｃ含量以40—60％为宜,G+Ｃ太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布,避免5个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列。

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别就是3＇端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异得扩增条带。

⑤引物3'端得碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适得酶切位点, 被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其它序列无明显同源性、引物量:每条引物得浓度０、1～1ｕmｏl或1０～1００pmoｌ,以最低引物量产生所需要得结果为好,引物浓度偏高会引起错配与非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体得机会。

(2)酶及其浓度目前有两种TaｑDNＡ聚合酶供应, 一种就是从栖热水生杆菌中提纯得天然酶,另一种为大肠菌合成得基因工程酶、催化一典型得PCR反应约需酶量２。

5Ｕ(指总反应体积为10０ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

(3)dNTP得质量与浓度dNTP得质量与浓度与PCR扩增效率有密切关系,dＮTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。

ｄNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以１M NaOH 或１M Tris、HCL得缓冲液将其PH调节到7。

0～７.5,小量分装, —２0℃冰冻保存。

多次冻融会使dNTP降解。

在PCＲ反应中,dNTP应为50~２00ｕmｏl／L,尤其就是注意４种ｄNT Ｐ得浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配、浓度过低又会降低PCＲ产物得产量、dＮTP能与Mg2+结合,使游离得Ｍｇ２+浓度降低。

pcr基因表达趋势不符合的原因
PCR基因表达趋势不符合的原因可能有多种，包括：
1. 实验误差：PCR实验中可能存在技术上的误差，如反应条
件的不准确、试剂的质量差异等，这些误差可能导致基因表达趋势不符合预期。

2. 样本异质性：PCR实验通常需要使用组织或细胞样本，可
能存在样本异质性的问题。

不同细胞或组织中可能存在基因表达异质性，导致PCR的结果不符合预期。

例如，细胞中存在
亚群细胞，其中部分细胞表达某个基因，而其他细胞则不表达，这可能导致PCR结果不一致。

3. 技术局限性：PCR作为一种定性或定量分析技术，存在一
定的局限性。

例如，在低拷贝数的基因表达水平下，PCR的
灵敏度可能不足，无法检测到基因的表达。

此外，PCR对于
高度变异的基因序列可能出现特异性问题，导致结果不准确。

4. 不完全反应：PCR反应所需的温度梯度和反应时间可能无
法覆盖到所有需要扩增的片段，导致某些基因片段未被扩增，从而影响结果。

综上所述，PCR基因表达趋势不符合预期可能是由于实验误差、样本异质性、技术局限性或不完全反应等因素造成的。

为了获得可靠的结果，建议在进行PCR实验时严格控制实验条件，使用多个样本重复实验，并结合其他实验方法进行验证。

影响PCR中DNA变性的主要因素引言聚合酶链式反应（PCR）是从已有的DNA样本中扩增特定片段的一种常用技术。

PCR的成功与否往往取决于DNA的质量和完整性。

因此，在进行PCR实验时，我们需要了解影响PCR中DNA变性的主要因素，以确保PCR实验的准确性和可靠性。

本文将介绍几个主要因素，并探讨它们对PCR的影响。

温度温度是PCR过程中最重要的因素之一。

PCR通常涉及三个不同温度区间：变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）阶段。

在变性阶段，高温（通常为94-98摄氏度）将DNA的双链结构变性为单链，并使之解开。

在退火阶段，温度会降低（通常为50-65摄氏度），引发引物与目标DNA序列的结合。

在延伸阶段，温度升高（通常为72摄氏度），聚合酶会在引物的引导下从引物的3’端开始合成新的DNA链。

引物的设计引物的设计也是影响PCR反应成功的关键因素之一。

引物是用于扩增特定DNA片段的短链DNA分子。

引物的选择应满足以下要求：与目标序列高度互补，无二义性（避免结合到非特异性区域），长度适当（通常为18-25个碱基对），GC含量稍高（40-60%）等。

合适的引物设计有助于提高PCR的特异性和效率。

样本质量样本质量是PCR反应成功的另一个重要因素。

污染的或降解的DNA样本可能会导致PCR反应失败。

因此，在进行PCR实验之前，应确保使用的DNA样本质量良好。

常用的样本处理方法包括DNA提取、净化和浓缩等。

此外，应避免使用含有PCR抑制物质（如血红素、某些金属离子等）的样本。

酶的选择和质量聚合酶是PCR中不可或缺的酶。

选择高质量的聚合酶，如热稳定的Taq聚合酶，可以提高PCR的效率和成功率。

此外，聚合酶的储存和使用条件也需要注意，以避免活性的丧失。

缓冲溶液和反应体系实验中所使用的缓冲溶液和反应体系也会对PCR的结果产生影响。

常用的PCR缓冲溶液包括Tris-HCl、MgCl2、KCl、Tween 20等，其中MgCl2起到调节DNA结构和扩增效率的重要作用。

影响PCＲ得主要因素PCR技术必须有人工合成得合理引物与提取得样品DNＡ,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析、引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强得研究院、所进行,临床应用只需购买ＰＣR检测试剂盒就可开展工作,PＣR 自动热循环中影响因素很多,对不同得ＤＮA样品,ＰＣＲ反应中各种成份加入量与温度循环参数均不一致。

现将几种主要影响因素介绍如下、一、温度循环参数在PCR自动热循环中,最关键得因素就是变性与退火得温度、如操作范例所示,其变性、退火、延伸得条件就是:9４℃60ｓ, 37℃6０s, 72℃１20s,共25~30个循环,扩增片段50０bp、在这里,每一步得时间应从反应混合液达到所要求得温度后开始计算、在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度得时间需要30~60s,这一迟滞时间得长短取决于几个因素,包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间得温度差,在设置热循环时应充分给以重视与考虑,对每一仪器均应进行实测。

关于热循环时间得另一个重要考虑就是两条引物之间得距离;距离越远,合成靶序列全长所需得时间也越长,前文给出得反应时间就是按最适于合成长度5００bp得靶序列拟定得。

下面就各种温度得选择作一介绍、1、模板变性温度变性温度就是决定PＣＲ反应中双链DNA解链得温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。

变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。

一般取9０~９5℃。

样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。

DNA变性只需要几秒种,时间过久没有必要;反之,在高温时间应尽量缩短,以保持Taq DNA聚合酶得活力,加入Ｔaq DNＡ聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

２、引物退火温度退火温度决定PCＲ特异性与产量;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DＮA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。

1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。

样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。

2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。

3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。

4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。

5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。

6. 使用阴性对照检查污染的发生。

7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。

8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。

9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。

10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。

酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。

11. PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。

一、PCR反应的关键环节1. 模板核酸的制备。

2. 引物的质量与特异性。

3. 酶的质量。

4. PCR循环条件。

二、PCR常见问题及对策1. 假阴性，不出现扩增条带（1）模板原因①模板中含有杂蛋白质。

②模板中含有Taq酶抑制剂。

③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。

④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。

引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR 检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。

现将几种主要影响因素介绍如下。

一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。

如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。

在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。

在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。

关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。

下面就各种温度的选择作一介绍。

1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。

变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。

一般取90～95℃。

样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。

DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。

pcr跑胶结果出现拖尾的解决方法
PCR跑胶结果出现拖尾可能是由于以下原因导致的：
1. DNA模板浓度过高：过高的模板浓度可能导致PCR反应过度扩增，
出现拖尾现象。

可以尝试减少DNA模板的量或稀释模板，以降低浓度。

2. DNA模板质量差：低质量的DNA模板可能导致PCR反应不特异性扩增，产生拖尾。

务必使用高质量、纯净的DNA模板。

3. 引物浓度过高：过高的引物浓度可能导致引物间的非特异性结合，
导致拖尾。

可以尝试降低引物的浓度。

4. 扩增条件不合适：PCR反应的温度和时间设置不当也可能导致拖尾
现象。

建议优化PCR反应条件，包括温度梯度法优化退火温度和延长
扩增时间。

5. 酶的活性过高：过高的酶活性可能导致PCR反应过度扩增，产生拖尾。

可以尝试减少酶的用量。

6. 存储条件不当：PCR试剂的存储条件可能会影响其稳定性和效果。

确保试剂在正确的温度下存储，并避免阳光直射和湿度过高。

根据实验情况综合考虑以上因素，逐一排查和优化，可以有效解决PCR 跑胶结果出现拖尾的问题。

如果问题仍然存在，建议寻求专业技术人
员的帮助。

分子实验——影响PCR扩增因素的分析PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术，用于扩增目标DNA片段。

PCR扩增的效果受多种因素的影响，下面将对影响PCR扩增的因素进行分析。

首先是引物设计。

引物是PCR扩增的关键，它们在PCR反应中起到引导DNA合成的作用。

引物的设计需要考虑多个因素，包括引物长度、碱基互补性、引物浓度以及引物之间的相互作用等。

引物的长度应该在18-30个碱基对之间，太短会导致非特异性扩增，太长则可能会影响扩增效率。

引物的碱基互补性要求较高，避免自身结合形成二聚体或多聚体，影响PCR反应。

引物的浓度也需要优化，过高的浓度可能会导致引物的非特异性结合，而过低的浓度则可能会影响扩增效率。

此外，引物之间的相互作用也应该考虑，避免引物之间的二聚体或多聚体形成，会导致非特异性扩增。

其次是反应条件。

PCR反应需要一定的温度和时间条件。

PCR反应的温度包括变性温度、退火温度和延伸温度。

变性温度用于将目标DNA变性为单链DNA，一般设定为95℃，时间为1-5分钟。

退火温度应该合适，使引物与模板DNA特异性结合，一般设计退火温度为5℃低于引物的结合温度，时间为30-60秒。

延伸温度用于合成新的DNA链，一般推荐为72℃，时间根据目标片段长度决定，一般为每kb1-2分钟。

另外，PCR反应的循环次数也需要优化，过多会增加非特异性扩增的风险，过少则可能无法达到预期的扩增效果。

第三是DNA模板的质量和浓度。

DNA模板的质量和浓度对PCR扩增的效果有重要影响。

模板DNA的质量应该尽可能纯净，避免有附带的细菌DNA、RNA或PCR抑制物等。

有时，模板DNA的浓度也需要优化，过高或过低的浓度都可能会影响扩增效果，一般推荐的DNA浓度为10-100ng。

第四是酶的选择和浓度。

PCR扩增需要用到聚合酶，常用的酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。

Taq聚合酶具有耐高温的特性，适用于PCR反应的变性和延伸步骤，但是它的扩增精确度较低，容易引起突变。

PCR的主要影响因素及常见问题解决方法第一部分、PCR的主要影响因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。

引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。

现将几种主要影响因素介绍如下。

一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。

如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。

在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。

在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。

关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。

下面就各种温度的选择作一介绍。

1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。

变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。

一般取90～95℃。

样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。

DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。