MISEQ数据处理步骤

miseqfgx法医基因组二代测序原理一、引言法医基因组二代测序（miseqfgx）是一种重要的生物技术，广泛应用于法医鉴定、遗传学研究等领域。

本文将介绍法医基因组二代测序的原理、实验流程及其在法医学中的应用。

二、原理法医基因组二代测序的基本原理是基于高通量技术。

其基本步骤包括：DNA 提取、模板制备、测序反应、数据解析等。

首先，从样本中提取出DNA，将其打断成小片段后加入接头，再进行PCR扩增。

接下来，通过高通量测序仪对经过处理的DNA模板进行测序，得到大量的序列数据。

最后，通过生物信息学分析，将这些序列数据转化为基因组信息，从而实现对样本的鉴定。

三、实验流程1. 样本采集：收集含有DNA的样本，如血液、精液、毛发等。

2. DNA提取：对样本进行提取，得到较为纯净的DNA。

3. 模板制备：将DNA打断成小片段，并加入接头。

接头的目的是为了稳定片段并增加序列信息。

4. 测序反应：将带有接头的DNA片段加入测序仪进行测序，得到序列数据。

5. 数据解析：对测序仪得到的原始数据进行处理，包括去除噪音、拼接序列、注释基因等步骤，以获得基因组信息。

四、应用法医基因组二代测序在法医学中的应用主要体现在以下几个方面：1. 亲子鉴定：通过比较样本和疑似父亲的基因组信息，可以确定是否存在亲子关系。

2. 遗传疾病研究：通过对患病家系的基因组信息进行分析，可以研究遗传疾病的发病机制和基因变异。

3. 法医案件分析：通过比较犯罪现场的生物样本和嫌疑人的基因组信息，可以进行个体识别和种属鉴定。

4. 种群遗传学研究：通过对不同群体基因组信息的分析，可以研究种群的遗传结构和生活史。

五、结论法医基因组二代测序作为一种重要的生物技术，具有高通量、高灵敏度、高精度等优点，在法医鉴定、遗传学研究等领域发挥着越来越重要的作用。

随着技术的不断进步，法医基因组二代测序将在更多领域得到应用，为人类健康和科学发展做出更大的贡献。

六、参考文献（此处省略参考文献）七、致谢感谢各位读者对法医基因组二代测序的支持和关注，希望能为大家提供有益的信息和帮助。

二代dna测序技术数据的处理流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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基因测序分析方法的使用教程基因测序是一种重要的生物学技术，可用于解析生物体中的基因组序列。

通过基因测序，我们可以获得基因的序列信息，进而了解基因在生物体中的功能和调控机制。

基因测序分析是在基因测序数据的基础上，对其进行处理和解读的方法。

本文将介绍基因测序分析的基本步骤和常用的分析方法。

1. 数据质量控制在进行基因测序分析之前，首先需要对测序数据进行质量控制。

这是因为基因测序数据中可能存在各种噪声和误差，如测序错误、低质量的碱基等。

常用的质量控制方法包括使用质量分数图和质量值控制图来评估序列的质量，同时可以使用适当的软件工具来去除低质量的测序序列。

2. 序列比对在质量控制后，需要将测序数据与参考序列进行比对。

比对的目的是将测序数据中的序列与已知的参考序列进行匹配，从而确定每个碱基的位置和对应的序列。

常用的比对方法包括BWA、Bowtie等。

在进行序列比对时，需要考虑参考序列的选择和比对的参数设置，以获得较高的比对准确性。

3. 变异检测基因测序分析的一个重要应用是检测基因组中的变异。

变异是指基因组序列中的突变或多态性。

常见的基因组变异包括单核苷酸多态性（SNP）、插入、缺失等。

通过测序数据的比较和分析，可以发现基因组中的变异位点，并进一步分析其与遗传疾病、药物反应等的关联。

在进行变异检测时，常用的分析方法包括Samtools、GATK等。

4. 基因表达分析除了检测基因组的变异，基因测序数据还可以用于分析基因的表达水平。

基因表达分析可以揭示在不同组织、不同时间点或不同条件下基因的表达变化情况。

常用的基因表达分析方法包括计数矩阵构建、差异表达分析、聚类分析等。

这些分析方法可以帮助我们找出与特定生物过程相关的基因集，从而进一步研究其功能和调控机制。

5. 功能注释在基因测序分析的过程中，我们经常需要对测序数据进行功能注释，以了解基因的功能和相关信息。

功能注释可以提供基因的功能预测、基因本体论、通路富集等信息。

生物信息学方法在遗传数据分析中的使用攻略随着高通量测序技术的广泛应用，遗传数据量飞速增长，对数据分析提出了更高的要求。

生物信息学方法在遗传数据分析中发挥了重要的作用，能够帮助研究人员从庞大的遗传数据中获取有价值的信息。

本文将为读者提供生物信息学方法在遗传数据分析中的使用攻略。

一、遗传数据的预处理在进行遗传数据分析前，首先需要对原始数据进行预处理，以去除噪声、纠正错误，并保留有效信息。

其中，常用的预处理步骤包括质量控制、去除适配器序列、去除低质量序列、低复杂度过滤等。

这些步骤可通过使用生物信息学软件包如Trimmomatic、FastQC和Fastp等来实现。

二、序列比对序列比对是遗传数据分析的重要步骤之一，它可以将测序片段与参考基因组进行比对，从而确定测序片段在基因组上的位置。

在进行序列比对时，需要选择合适的比对工具。

常用的比对工具包括Bowtie、BWA、STAR和HISAT2等。

选择比对工具时，需要考虑数据类型、测序技术以及研究目的等因素。

三、变异检测变异检测是遗传数据分析的核心任务之一，它可以帮助研究人员发现个体间的遗传差异，并识别与疾病相关的突变。

常见的变异检测方法包括单核苷酸多态性（SNP）检测、结构变异检测和拷贝数变异检测等。

在进行变异检测时，可以使用各种软件工具来辅助。

例如，GATK 和SAMtools等软件包可以用于SNP和INDEL检测，而Delly和CNVkit等工具则可用于结构变异和拷贝数变异的分析。

四、功能注释在确定了变异之后，需要对这些变异进行功能注释，以了解其对基因功能的影响。

功能注释可以帮助研究人员理解遗传变异与疾病之间的关系，并找出可能的治疗靶点。

在功能注释过程中，可以使用一系列的数据库和工具。

例如，dbSNP、ClinVar、PolyPhen-2和SIFT等数据库提供了关于SNP和突变致病性的信息，而DAVID和Enrichr等工具则可用于富集分析和功能通路分析。

单细胞测序之基本的数据处理基本流程1.数据质控：数据质控是单细胞测序数据处理的第一步，其目的是对原始数据进行过滤和剔除质量差的细胞。

常见的数据质控指标包括读取数、基因表达数、基因覆盖度、外源RNA比例、低质量细胞比例等。

读取数和基因表达数可以用来评估测序深度和数据完整性，基因覆盖度可以用来评估测序覆盖的均匀性，外源RNA比例可以用来评估细胞捕获的纯度，低质量细胞比例可以用来评估细胞的RNA完整性。

2.数据预处理：数据预处理是单细胞测序数据处理的第二步，其目的是对原始数据进行标准化和去噪。

常见的数据预处理方法包括基因表达的归一化、批次效应的移除、PCR放大偏差的校正等。

基因表达归一化是指通过一系列数学变换将细胞之间的基因表达进行标准化，以解决测序深度的差异带来的问题。

批次效应的移除是指通过线性模型或非线性模型将不同批次的数据调整到同一水平，以消除批次效应对单细胞聚类和差异表达的影响。

PCR放大偏差的校正是指通过数学建模和统计推断将PCR放大过程中引入的偏差进行校正，以提高数据的准确性。

3.单细胞聚类：单细胞聚类是单细胞测序数据处理的第三步，其目的是将相似的细胞归为同一类别。

常见的单细胞聚类方法包括层次聚类、K 均值聚类、Gaussian 混合模型聚类等。

单细胞聚类的基本原理是通过定义相似度度量和聚类算法，将细胞之间的相似性转化为距离或相似性矩阵，然后将相似的细胞归为同一类别。

聚类的结果可以通过可视化和生物学功能注释来进一步理解细胞的类型和状态。

4.差异分析：差异分析是单细胞测序数据处理的最后一步，其目的是比较不同细胞类型或状态之间的基因表达差异。

常见的差异分析方法包括差异基因分析、差异表达矩阵构建和富集分析等。

差异基因分析是指通过统计方法比较不同细胞类型或状态之间的基因表达水平，以识别具有显著差异的基因。

差异表达矩阵的构建是指将差异基因根据其差异表达的程度和模式进行聚类和可视化，以揭示不同细胞类型或状态之间的表达特点和变化趋势。

MiSeq TM Dx使用手册MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 1 2020年12月Material # 20030132引言本文档及其内容是Illumina，Inc.及其附属公司（“Illumina”）所有，并且仅供与所述产品相关的合同约定的客户使用，无其他用途。

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MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 2 2020年12月Material # 20030132修订历史MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 3 2020年12月Material # 20030132目录引言 (2)修订历史 (3)目录 (4)第一章概述 (6)产品名称 (6)预期用途 (6)产品结构及组成 (6)第二章设备安装及环境要求 (14)运输和储存 (14)运输和安装 (14)实验室要求 (15)电气要求 (17)环境要求 (18)网络要求 (18)用户自备耗材和设备 (19)第三章工作原理 (21)工作原理 (21)需要但不提供的设备和材料 (21)第四章性能指标 (22)仪器技术指标 (22)仪器使用期限 (23)产品合规性和监管声明 (23)第五章运行操作 (26)P ART וL OCAL R UN M ANAGER（本地运行管理） (26)本地运行管理 (26)登陆信息管理 (26)操作界面概述 (27)管理设置和任务 (31)工作流程概述 (37)P ART װM I S EQ O PERATING S OFTWARE (M I S EQ操作软件) (41)启动和开机 (41)MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 42020年12月Material # 20030132测序运行 (43)结果分析 (54)质量控制 (55)文件夹管理 (55)MOS软件界面图标 (56)第六章局限性和注意事项 (58)使用局限性 (58)警告和注意事项 (58)第七章危害及标志 (60)安全考虑和标志 (60)通用标志 (62)第八章设备维护 (63)维护频率 (63)维护清洗 (63)待机清洗 (65)关机步骤 (67)重启步骤 (68)所需磁盘空间 (68)杀毒软件 (68)第九章故障排除 (69)附件 (78)MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 52020年12月Material # 20030132第一章概述产品名称中文名称：基因测序仪英文名称：MiSeq TM Dx Instrument型号：MiSeq TM Dx预期用途用于体外诊断。

一、数据读出（通过“fasta”文件生成“classification”和“txt”文件）1、下载Java：for64位。

2、cmd进入DOS界面，进入数据所在的文件夹，逐个分析并命名数据，见下行。

Java-Xmx4g-jar..\rdp_classifier_2.6\dist\classifier.jarclassify-c0.8-ffi lterbyconf-h hier_output.txt–o samplename.classification.txt input.f asta注意：刚开始时输入“cd..”（cd空格加两点）即退回上一级目录，直到回到C盘，fasta原始数据也必须放在C盘。

手打指令，适用本机。

3、用Excel打开目标文件txt文本，“筛选”，选择不同的分类单位进行数据整理和分析。

Class:纲Domain:域Family:科Genus:属Order:目Phylum:门Kingdom:界Species:种二、删除chloroplast（叶绿体）1、将原始文件（“fasta”和“classification”文件）拷贝至与程序“mothur”相同的目录下；2、找到后缀名为“H1.classification”的数据原文件（以样品H1为例），用Excel打开；3、选中“Class”对应的物种列，“筛选”，在下拉框中勾掉物种“chloroplast（叶绿体，非细菌）”，“确定”；复制第一列到粘贴板；4、新建“H1.accnos”的txt文件，将第一列（物种序列）粘贴，保存、退出；将后缀名改为“.accnos”（窗口界面“组织”、文件夹和搜索选项、查看、勾掉“隐藏已知文件类型的扩展名”）；5、打开程序“mothur”，输入：get.seqs(accnos=H1.accnos,fasta=H1.fasta)，回车，即从原始的物种序列中选出了去除chloroplast以外的新序列，系统会自动生成一个新的fasta文件“H1.pick.fasta”。

MiSeq平台相关技术MiSeq平台简介MiSeq系统是Illumina公司推出的测序平台，测序原理和HiSeq基本相同，即基于DNA 单分子簇的边合成边测序技术和可逆终止化学反应原理。

其拥有不同测序读长模式，测序质量可与HiSeq相媲美。

性能参数如下截图所示。

图 1 MiSeq测序性能参数目前可以支持500-600bp的读长，堪与罗氏454平台读长媲美，但是通量却远高于454平台，2*250读长一个run可产出7-9G左右数据量，2*300读长一个run可产出12G左右数据。

MiSeq测序平台同时拥有较长的读长和较高的数据量产出的特点，是HiSeq和454都无法比拟的优势，是应用于分子生态和基因组测序的最佳平台。

相对于HiSeq系统，具有更长读长，可使拼装结果更加准确完整。

相对于454平台，高数据量产出，加大了测序深度和覆盖度，使测序得到的变异信息更加准确。

技术特点■读长及通量优势：读长优势可得到更准确拼装结果，通量高，PE250高达9G通量，PE300高达15G的通量；■样本制备便捷，试验周期短：最低50ng DNA模板，短时间几个小时的自动化操作就可以完成全部样品制备工作。

■最精确的测序原理: 沿用GA和HiSeq平台的边合成边测序的化学原理■最完整的整合功能:独立完成簇生成、双向测序及数据分析工作。

■数据产出均一性好:对每个样品的DNA量进行严格定量，提高了数据产出的均一性。

适用项目■宏基因组16S RDNA测序：美国Earth Microbiome Project已将该方法作为16S RDNA测序与环境群落结构多样性研究的标准方法，已有多名权威学者的研究成果在ISME J、Cell、Nature 和等顶尖期刊上发表。

■转录组测序：通过该平台测序可相对于Illumina HiSeq平台，可获得更长更准确的转录本拼装信息。

■微生物基因组（重）测序：Illumina MiSeq非常适用于对微生物基因组（重）测序，可得到更准确基因拼装结果的同时可大量准确检出SNP和indel信息。

生物信息学中的基因组数据处理教程随着基因组测序技术的快速发展，生物学研究进入了一个数据驱动的时代。

基因组数据的处理和分析对于理解生物体的功能和进化具有重要意义。

生物信息学中的基因组数据处理涉及到多个步骤，包括基本的数据预处理、序列比对、变异检测和功能注释等。

本教程将向您介绍这些基本步骤以及使用常见的工具和软件进行基因组数据处理的方法。

1. 基本的数据预处理在进行任何类型的基因组数据分析之前，首先需要对原始数据进行预处理。

这包括数据质量控制和去除低质量的序列。

其中，数据质量控制涉及到过滤掉带有低质量碱基或含有接头序列的reads。

常用的工具包括FastQC和Trim Galore。

Trim Galore可以去除接头序列并进行质量控制，还可以指定过滤条件和截断参数来提高数据质量。

2. 序列比对序列比对是将测序reads与参考基因组进行比对的过程。

比对可以帮助我们确定reads的起始和终止位置，并对其进行定量分析。

常用的比对工具有Bowtie、BWA和HISAT。

这些工具提供了快速、高效的比对算法，可以根据用户的需求进行参数配置和定制化操作。

3. 变异检测变异检测是基因组数据处理中的重要步骤之一，可以帮助我们发现个体之间的遗传差异或氨基酸突变。

常用的变异检测工具有GATK、SAMtools和FreeBayes。

这些工具可以检测单核苷酸多态性、插入/缺失突变和结构变异等不同类型的变异。

4. 功能注释功能注释是对基因组变异进行生物学解释的过程。

该过程包括鉴定变异位点的功能影响、基于数据库进行注释，并推断可能的生物功能。

常用的功能注释工具有ANNOVAR、Variant Effect Predictor (VEP)和SnpEff。

这些工具提供了丰富的注释信息和分析功能，可以帮助我们理解变异的生物学意义。

5. 数据可视化与解释基因组数据处理的最后一步是将处理后的数据进行可视化和解释。

通过绘制柱状图、散点图和热图等图表，我们可以更好地理解数据结果并从中发现潜在规律。

2.1 MiSeq 测序实验流程2.1.1 基因组DNA 抽提默认用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit （D5625-01）进行样品提取。

完成基因组DNA 抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA ，用NanoDrop2000进行浓度的检测。

（具体参考多样性样品质检报告）一、 项目基本信息二、 样品检测方法● D NA 纯度检测方 NanoDrop2000 ● D N A 完整性、总量检三、 样品检测结果 N0. 美吉编号样品名称浓度（ng/μl ） OD 260/280OD 260/230项目名称 多样性 项目跟进销售 项目联系人 合同编号 收样员 收样日期 质检员 质检日期 报告撰写人 报告审核员 报告终审员报告日期胶图(取2μl样品跑胶)：2.1.2 PCR扩增按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。

为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1) 尽可能使用低循环数扩增；2) 保证每个样本扩增的循环数一致。

随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。

PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型；全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

（具体参照PCR实验报告）PCR扩增报告1.项目基本信息2. PCR预实验2.1引物设计2.2 PCR扩增条件为了保证后续数据分析的准确性及可靠性，需要两个条件，首先是尽可能使用低循环数扩增；其次保证每个样品扩增的循环数统一。

为了达到以上目的，我方首先随机选取10个样品进行预实验，以确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增出浓度合适的产物，为所有样品的正式试验做充分准备。

seqMiSeq下的测序步骤DS故胺AI肽DoEarn等测序技术是一种分析DNA或RNA序列的方法，能够帮助研究人员了解生物体的基因信息和生物过程。

其中，seqMiSeq是一种常用的高通量测序技术，被广泛应用于生物学和医学领域。

在进行seqMiSeq测序时，有几个关键的步骤需要注意，包括DS故胺AI肽和DoEarn等。

下面将对这些步骤进行详细介绍。

首先，我们来了解一下DS故胺AI肽的概念。

DS故胺AI肽（Dual-Indexed Adapter Primers）是一种测序接头引物，用于在测序前对DNA样品进行处理。

DS故胺AI肽主要有两个作用：一方面，它能够将引物与样品中的DNA分子连接起来，从而实现对DNA序列的扩增；另一方面，DS故胺AI肽还包含了用于标记和识别样品的测序索引序列。

通过引入DS故胺AI肽，我们可以同时测序多个样品，并将不同样品的测序数据进行区分和分析。

除了DS故胺AI肽，测序库的构建还需要用到AI肽（Adapter-Indexed Primers）。

AI肽是一种特殊的引物序列，能够与DS故胺AI肽中的索引序列相互匹配。

通过AI肽引物的作用，我们可以将DS故胺AI肽中连接的DNA序列进一步扩增和准备，在测序过程中提供足够的DNA模板。

在测序前的准备步骤中，DoEarn起着关键的作用。

DoEarn是一种DNA片段耦合反应，主要用来将引物和样品中的DNA序列连接起来。

通过DoEarn反应，我们可以将DS故胺AI肽和AI肽引物与DNA样品中的DNA序列连接起来，形成测序库。

在DoEarn反应中，需要注意的是反应温度、时间和酶的浓度等因素，以确保反应的效率和准确性。

完成了测序库的构建后，我们就可以进行seqMiSeq测序了。

seqMiSeq是一种高通量测序技术，通过短读长度和并行测序的方式，大幅度提高了测序的速度和效率。

在seqMiSeq测序中，测序仪会对构建好的测序库进行碱基的识别和记录。

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修订历史记录目录第1章概述1简介1更多资源1组件2 MiSeq概念4系统软件4二级分析选项5 Sequencing Analysis Viewer6所需磁盘空间6 MiSeq试剂盒概述7第2章入门9启动MiSeq9自定义系统设置9配置BaseSpace更新的通知10设置电子邮件首选项10设置默认的文件夹位置10耗材11第3章测序12简介12运行持续时间12簇生成13测序13分析13解冻试剂夹盒13检查试剂夹盒13变性和稀释文库14装入样品文库14使用MCS设置运行14清洁流动槽16装入流动槽17装入试剂18启动运行20监控运行21执行运行后清洗23第4章维护27维护频率27 VeriSeq PGS工作流程的维护频率27执行维护清洗28执行备用清洗30管理文件31MiSeq系统指南软件更新33关闭仪器33附录A故障诊断34简介34用于故障诊断的打包日志34执行系统检查35暂停或停止运行35手动提起试剂夹盒吸管36解决运行设置错误37解决RFID读取失败37执行液量测试38测量预期的清洗量38解决试剂冷却器温度错误38解决Local Run Manager分析错误39配置系统设置39附录B输出文件和文件夹40运行文件夹40 MiSeqOutput文件夹内容40 RTA文件夹和文件41索引43技术协助46第1章概述简介1更多资源1组件2 MiSeq概念4系统软件4二级分析选项5 Sequencing Analysis Viewer6所需磁盘空间6 MiSeq试剂盒概述7简介Illumina®MiSeq™系统结合了经证明的Sequencing by Synthesis(SBS)技术和创新的工作流程，让您只需八小时就能从DNA完成数据分析。

测序数据处理流程
听说测序数据挺复杂？别担心，咱一步一步来。

首先，数据质
量得把关。

就得看看这些数据准不准，有没有啥问题。

有时候数据
可能有点“脏”，得用专门的工具给它洗洗澡，让它变得干净又整洁。

然后，数据得整合。

就是把那些东一个西一个的数据片段，按
照一定规则凑到一起。

这过程得靠软件帮忙，把不同来源、不同格
式的数据整合成一个大家庭。

这样，数据就更有条理，更容易分析了。

接下来，就是数据分析啦。

这环节得用统计学和生物信息学的
大招，对数据进行深入“挖掘”。

看看这些数据背后藏着啥秘密，
比如基因的表达模式、遗传变异之类的。

最后，得解读分析结果。

这就像是猜谜语的答案揭晓，得把分
析结果跟已有的生物学知识结合起来，给大家一个明明白白的解释。

这样，测序数据就不再是一堆看不懂的数字和字母，而是变成了有
实际意义的生物学信息啦！。

DNA缓冲液Tagment DNA Buffer (TD)DNA酶1 Tagment DNA Enzyme (TDE1)目的DNA转移到冰上。

缓冲液颠倒混匀、酶不适合旋涡，易损坏酶片段。

把样本纯化磁珠从2-8度冰箱取出，至温度升到室温。

确保终止连接缓冲液（ST）没有沉淀，如有沉淀要旋涡，直到所有颗粒物悬浮起来。

多试剂处理，使用排枪，分装洗脱缓冲液，目的DNA缓冲液，和DNA酶，分装到八连排管中，保证每个孔的体积一致。

把样品纯化磁珠倾倒至多通道反应管中。

将深孔板插入到加热体模块中，预加热垂直混匀仪至58度。

取一个深孔板，用记号笔签字。

操作确保反应试剂分装时，为了最好的描述试剂盒信息，反应液分装不需要再冰上操作。

1. 按照以下步骤标准化a)检测目的DNA样本的质量，使用紫外分光光度计或者Qubit，b)每个样品用10mM的Tris-HCl（pH8.5）稀释到10ng/μL。

c)再次检测5ng/μL的目的DNA样本质量，使用紫外分光光度计或者Qubit。

d)在此基础上，每个样品用10mM的Tris-HCl（pH8.5）稀释到5ng/μL，取10μL备用。

配置方法：原DNA浓度为18 ng/μL，配置成体积为20 μL，浓度5ng/μL 的DNA，取原液的体积是20*5/18，取Tris-HCl体积为20-（20*5/18）。

2. 取一0.2mL的干净离心管，加入以下成分：10μL（5ng/μL）gDNA + 25μL Tagment DNA Buffer + 15μL Tagment DNA Enzyme涡旋振荡混匀，1800转1min，避免有气泡，58℃，10min。

注意：用普通PCR仪，先让机器预热到58℃，再放样品。

大样本可用深孔板操作。

在垂直混匀仪上操作。

3. 结束后，向管中加15μL Stop Tagment Buffer，涡旋振荡，短暂离心。

室温放置反应4min。

【此时体系共65μL】（三）纯化：因为转座酶与DNA末端紧密结合，会干扰下游反应过程准备样品重悬洗脱液RSB，样品纯化磁珠SPB，80%乙醇取出，降温至室温。

高通量基因测序系统美国illumina公司Miseq技术参数1.仪器功能：可开展快速经济高效的第一代测序应用，包括扩增产物测序和克隆检查等；也可以开展新一代基因组测序应用，如高度多重PCR扩增子测序，小基因组重测序，de novo测序，小RNA测序，文库质控和16s细菌宏基因组研究等；2.技术规格＊2.1一轮测序反应生成的有效数据量最高可达15Gb（即150亿个碱基）；＊2.2一轮测序反应生成的可读测序片段序列最高可达2500万条；＊2.3一轮测序反应（最高完成15Gb数据量）的所用的全部试剂和耗材成本不高于2000美元；一轮测序反应的过程包括样本文库克隆扩增、测序和数据分析；＊2.4单端读取序列的有效数据读长可达300个碱基；双端读取序列的有效数据读长可达2×300个碱基。

2.5测序质量标准为Q30（即每个碱基的准确度为99.9％），并且75%以上的碱基比例达到Q30；2.6 样本文库克隆扩增原理为桥式PCR法；2.7 每100碱基测序的碱基缺失率<0.001；2.8具备多重SNP分析功能，可在一轮实验中同时检测384个样品，对384×1536＝589824个SNP的DNA片段进行测序比对分析；2.9可精确读取≥12个的连续单个重复碱基（如AAAAAAAAAAAAAAAA）；2.10具备云储存功能，并具有公共交流平台，方便与业内专家共同分析与合作。

2.11测序系统主机内置服务器，主机同时具备样本文库克隆扩增、测序和数据分析功能；无需再配置额外的样本文库克隆扩增和分析服务器；2.12仪器同时具备并免费提供以下软件分析功能：全基因组重测序、定向重测序、De novo 测序、序列特异DNA结合蛋白的ChIP-Seq、组蛋白修饰和表观遗传标记的ChIP-Seq、16s宏基因组学研究、mRNA测序、基于标签的基因表达、小RNA测序、降解DNA样品的测序、末端配对mRNA测序、DNA印迹和等位基因特异的表达、CNV-Seq：用测序测定拷贝数变异研究。

MiSeq 系统（系列7—标准文库变性及稀释）本指南介绍了对Illumina®MiSeq® system 上进行测序的文库进行变性和稀释方法，同时介绍了用作测序控制PhiX 文库的制备说明。

1、耗材和设备名称 供应商HT1(Hybridization Buffer), thawed and prechilled Illumina 提供的MiSeq Reagent KitIlluminaPhiX Control, Catalog # FC-110-3001Illumina(选择) 1.0N NaOH, molecular biology-grade 一般实验室供应商Tris-Cl10 mM, pH 8.5 with 0.1% Tween 20一般实验室供应商 1.5ml 的离心管 SciGene,catalog # 1057-34-0, or equivalent2、试剂准备2.1准备新鲜稀释的NaOHa. 取800µLaboratory -grade water 至1.5ml 微量离心管中。

b. 添加200µL 的1.0NNaOH ，获得1ml 含0.2NNaOH 溶液。

c. 漩涡混匀离心备用。

注：为防止小的移液误差影响最终的NaOH 浓度，准备至少1ml 新鲜稀释的NaOH 。

始终准备新鲜稀释的NaOH 用于变性文库以便簇生成，新鲜配置的氢氧化钠必须在12小时以内使用.2.2准备HT1a. 将-25°C ~ -15°C 储存的HT1移至室温溶解。

b. 待HT1溶解后储存至2°C ~ 8°C 冰箱中备用。

2.3稀释变性PhiX 质控根据测序试剂版本稀释PhiX 质控名称 最终PhiX 浓度MiSeq Reagent Kit v 3 将变性PhiX 对照稀释至20 pM ，对于v3试剂能够产生最佳簇密度MiSeq Reagent Kit v 2 将变性PhiX对照稀释至12.5pM，对于v2试剂能够产生最佳簇密度2.3.1稀释PhiX质控至4nMa.取2µl10nM PhiX文库至1.5ml的微量离心管中。

核磁数据处理方法一、引言核磁共振（NMR）是一种重要的物理现象，广泛应用于化学、生物、医学等领域。

核磁共振技术通过对样品中的核自旋进行激发和探测，获取样品的结构和性质信息。

在核磁共振实验中，数据处理是不可或缺的一步，它能够对原始数据进行噪声滤除、谱线拟合、峰识别等操作，从而提取有用的信息。

二、数据处理方法1. 数据预处理数据预处理是核磁数据处理的第一步，旨在去除噪声、消除基线偏移等。

常用的数据预处理方法包括：- 噪声滤波：采用滑动平均、高斯滤波等方法，平滑数据曲线，降低噪声的影响。

- 基线校正：通过拟合基线曲线，将基线偏移的影响消除，使得谱线更加清晰。

2. 谱线拟合谱线拟合是核磁数据处理的关键步骤，它能够从复杂的谱线中提取出有用的信息。

常用的谱线拟合方法包括：- 高斯拟合：将谱线拟合为高斯函数，通过调整高斯函数的参数，使得拟合曲线与实际数据吻合度最高。

- 洛伦兹拟合：将谱线拟合为洛伦兹函数，通过调整洛伦兹函数的参数，使得拟合曲线与实际数据吻合度最高。

- Voigt拟合：将谱线拟合为Voigt函数，它是高斯函数和洛伦兹函数的卷积，能够更好地拟合复杂的谱线。

3. 峰识别峰识别是核磁数据处理的重要环节，它能够确定谱线中的峰位、峰面积等参数。

常用的峰识别方法包括：- 阈值法：通过设置一个阈值，将超过阈值的数据点认定为峰位，从而实现峰识别。

- 导数法：通过计算谱线的导数，找到导数为零的点，即为峰位。

- 滑动窗口法：将一个固定大小的窗口在谱线上滑动，找到窗口内的最大值，即为峰位。

4. 数据分析数据分析是核磁数据处理的最终目标，它能够从处理后的数据中提取出有用的化学或生物信息。

常用的数据分析方法包括：- 化学位移分析：通过对峰位的分析，确定样品中不同核自旋的化学位移，从而推断样品的结构和组成。

- 峰面积分析：通过对峰面积的分析，确定样品中不同核自旋的相对含量，从而推断样品的组成比例。

- 峰形分析：通过对峰形的分析，确定样品中不同核自旋的环境和相互作用情况，从而推断样品的性质和结构。

免疫组库测序技术流程免疫组库测序技术是一种用于研究免疫系统中抗体多样性的高通量测序方法。

该技术利用高通量测序平台，对免疫组库中的抗体编码区域进行测序，以获得抗体的基因序列信息。

本文将介绍免疫组库测序技术的流程和应用。

一、样品准备在进行免疫组库测序之前，需要准备包含抗体多样性信息的样品。

样品可以来源于人体、动物或其他生物体内的免疫组织或细胞。

样品可以是血液、骨髓、脾脏等，也可以是单个B细胞或其核酸提取物。

样品的获取和处理要符合伦理和规范，确保实验的可靠性和准确性。

二、抗体基因的扩增在免疫组库测序中，需要对抗体基因进行扩增，以获得抗体的编码区域序列。

一般采用PCR方法进行扩增。

PCR反应中使用特异性引物，选择性地扩增目标抗体基因。

PCR反应条件需要精确控制，以保证扩增的特异性和效率。

三、文库构建扩增得到的抗体基因片段需要进行文库构建，以便后续的测序分析。

文库构建包括DNA片段的末端修复、连接适配体、连接产物纯化和文库的扩增等步骤。

文库构建过程中需要注意避免污染和损伤，以保证文库的质量和稳定性。

四、高通量测序文库构建完成后，可以进行高通量测序。

高通量测序技术可以同时测定大量的DNA序列，具有高效、高准确性的特点。

目前常用的高通量测序平台有Illumina MiSeq、Ion Torrent等。

测序数据的质量控制和分析是保证结果可靠性的重要环节。

五、数据分析测序得到的数据需要进行分析和解读。

数据分析包括序列比对、多样性分析、克隆频度计算等。

序列比对可以将测序得到的序列与数据库中已知的抗体序列进行比对，以鉴定和注释抗体基因。

多样性分析可以评估抗体基因的多样性水平和克隆选择压力。

克隆频度计算可以估算不同克隆的相对丰度。

六、应用领域免疫组库测序技术在许多领域都有广泛的应用。

在免疫学研究中，可以利用免疫组库测序来解析免疫应答的动态变化、鉴定新的抗体分子、研究抗体多样性和亲和力等。

在疾病诊断和治疗中，免疫组库测序可以用于鉴定致病微生物、筛选特异性抗体、监测治疗效果等。