微生物原生质体技术及其研究进展
原生质体融合(Protoplast fusion)技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。同时，日本的Okada发现并证明了仙台病毒可诱发内艾氏腹水癌细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探讨。1974 年，匈牙利的Ferenczy[1]采用离心力诱导的方法报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合(如光合细菌与酵母菌的融合)。1979 年匈牙利的Pesti首先提出了融合育种提高青霉素产量的报告[2]，开创了原生质体融合技术在实际工作中的应用，使原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。Hopwood等[3]提出，原生质体融合重组可能实现隐性基因的重组暴露，使一些隐性基因表达或随机产生新的基因表型，从而使之成为链霉菌抗生素产生菌育种的新途径。利用完全脱去细胞壁的微生物细胞--原生质(protoplast)进行微生物遗传育种是一项发展迅速的育种技术，其基本实验方法已比较成熟，主要表现在原生质体的制备、再生及诱变处理和试剂的复合、交替使用等。原生质体技术的关键是去除细胞壁，形成一定数量的原生质体，并使经诱变处理的原生质体能再生出细胞壁。原生质体由于缺乏细胞壁，故可直接对其进行遗传操作或诱导其融合。形成杂种细胞，而且仍然保持了细胞的全能性，可经过培养进行繁殖。因此，原生质体是进行微生物遗传育种的极好材料。原生质体技术在理论和实践上越来越受到重视，涉及的微生物种类也越来越多。
1 原生质体的制备和再生
1.1 原生质体的制备
自1953年weibull[4]首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌获得原生质体以后。经过数十年的发展，原生质体制备方法已基本成熟，在微生物遗传育种中得到了广泛应用。在地衣状芽孢杆菌原生质体制备过程中发现，许多因素能影响原生质体的形成，主要包括菌龄、培养基成分、使用酶的种类及酶浓度、酶解时间、酶解温度、酶解液的pH值、渗透压稳定荆的性质及浓度等。在菌龄选择方面，大多数研究采用对数生长中后期的细菌进行处理。这主要是由于对数生长期细菌细胞壁中肽聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感的原因。
（1）革兰氏阳性菌中B.subtK如和B.megaterium这两种杆菌已被广泛运用于制备原生质体，它们易在简单的生理状态下生长，在单一的溶菌酶处理下即可转化成原生质体，而在Staphylococcus中，需要用溶链球菌酶代替溶菌酶来制备原生质体。与杆菌、球菌不同，链霉菌是丝状微生物，在特定的条件下，可分化出孢子丝，产生孢子。在液体培养中，菌丝中的每个细胞处在不同的菌龄和生理状态，这将影响其原生质体形成率和一致件。细菌在含有高浓度甘氨酸的培养基中生长，能引起细胞壁缺失，其机理是肽聚糖链中的D一丙氨酸残基被甘氨酸代替，由此干扰了交联所致。实验证实甘氨酸对不同菌种作用的适宜浓度不同，且在微生物培养初期加人效果理想。Duchiron F发现一种链霉菌S.pristinaespiralis 在制备原生质体时,不使用溶菌酶，单独使用甘氨酸即可形成原生质体。张增艳等单纯用甘氨酸处理制备苏云金杆菌(Bacillus thruingieasis)，原生质体形成率达96。8％。Baltz等报道了S.fradiae和S.griseofuscus原生质体制备的关键转化阶段在菌体发育的对数期和稳定生长期之间。
（2）革兰氏阴性菌的细胞壁不同于革兰氏阳性菌，其细胞壁中除了含有肽聚
糖外，还含有脂类层，使得原生质体的制备比较困难，真正的原生质体很难获得。Weiss R等用溶菌酶和EDTA处理，使大肠杆菌转化成真正的原生质体，并已成功地应用于融合。Goetzee J等用甘氮酸-溶菌酶-EDTA方法制备ProvididenceaLcalifaciens原生质体获得成功并用于融合。冯清平等通过青霉素-甘氨酸-溶菌酶方法制备地衣状芽孢杆菌原生质体，形成率达99.7％。王燕[5]对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备中，采用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶浓度比为5：3：1的混合酶液处理细胞壁，能提高原生质体的形成率。采用微生物复合酶或几种酶的混合液比单独使用一种酶的破壁效果好，在一定范围内，酶的作用时间和酶浓度与原生质体形成率成正相关。在原生质体制备过程中，螯合剂的作用效果也非常明显，如加入EDTA作为螯合剂，能够避免金属离子对酶的抑制作用从而提高其作用效果，使原生质体的形成牢进一步提高。Minghua D等[6]报道在大肠埃希菌原生质体形成过程中，用EDTA洗涤可以去除金属离子对酶解的不利影响；薛林贵等[7]也报道EDTA对原生质体形成的促进作用。在细菌破壁过程中，加入适量的青霉素可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用，有利于原生质体的形成。另外，控制酶解温度，选择合适的pH值，添加分散剂、镁离子等也有助于原生质体的形成。
1.2 原生质体的再生
Sagara等被认为是首先报道获得链雹菌原生质体较高再生率的研究者。原生质体再生是原生质体技术的关键步骤，如何提高原生质体再生率是育种工作者首先要解决的问题。原生质体再生的方法是采用夹层法或涂布法将原生质体分布在高渗培养基上，经培养再生出细胞壁。近年来原生质体的再生率逐年提高，这主要归功于一些稳定剂(如血清和明胶)的使用及高渗剂、温度的选择。除了培养基适合的成分外，物理条件的选择对原生质体的再生也非常重要，如一种严重脱水的再生培养基(失去20％水分)经夹层培养s.fradiae原生质体，再生率可显著提高。增大高渗再生培养基的渗透性(如使用高于0.3 moL／L的蔗糖溶液)有利于有些种的原生质体再生，目前常用的高渗荆是蔗糖溶液、琥珀酸钠、甘露醇等。Takashi 等采用改进方法可使枯草芽孢杆菌原生质体在某种半合成培养基t-的再生率达92％～100％。不同的菌种要求不同的再生培养方式，用固体培养法再生原生质体比液体培养法效果好。在再生培养基中添加一些营养物质有利于原生质体的再生，这些物质可能是作为细胞壁合成的前体物质，也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质。对细菌、放线菌而言，一般在再生培养基中添加水解酪蛋白、血清白蛋白、氨基酸和琥珀酸钠等。王玉华等[8]报道在高渗再生培养基中加入0.5 mol ／L的蔗糖原生质体的再生效果很好。Ca2+能够通过维持膜结构的完整性来实现原生质体的稳定与活性。王建华等[9]报道，原生质体膜外在蛋白质分子上二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强，而且ca2+维持稳定性的效果与膜表面结合分子数量的多少呈正相关。
2 微生物原生质体技术进展及其应用
2.1 原生质体融合技术
1974年，高国楠发现聚乙二醇(PEG)在钙离子存在下能促进植物细胞原生质体融合。Fodor和Schaeffer用PEG诱导需氧芽孢杆菌原生质体融合获得成功。此后，此项技术的应用有了飞跃发展，并取得大量研究成果。除了传统的融合方法及分离融合产物的方法外，微生物灭活原生质体融合技术、电融合技术、激光融合技术及诱变融合技术的发展非常引人注目。
2.1.1 微生物灭活原生质体融合技术
