细胞总RNA提取及逆转录

单细胞测序逆转录
单细胞测序（Single-cell sequencing）是一种用于研究单个细胞的基因组学、转录组学和表观基因组学的技术。

在单细胞测序中，逆转录（Reverse Transcription）是其中一个关键步骤，主要用于将细胞中的RNA转录成相应的cDNA，以便后续的测序和分析。

逆转录的步骤通常包括以下几个方面：
1.RNA提取：从单个细胞中提取总RNA。

这可以通过不同的方
法实现，如细胞裂解、酶解或使用特定的细胞捕获技术。

2.逆转录反应：使用逆转录酶（reverse transcriptase）对RNA进
行逆转录，将RNA转录成相应的cDNA。

逆转录酶能够合成cDNA链，其方向是与RNA模板相反的。

3.RNA降解：通过加入RNase（核酸酶）等酶来降解RNA模板，
使得只有cDNA链得以保留。

4.二次合成：对得到的cDNA进行二次合成，以增加cDNA的数
量。

在单细胞测序中，逆转录的效率和准确性对后续的数据分析至关重要。

由于单细胞样本的RNA量非常有限，逆转录过程的优化是确保从单个细胞获取高质量数据的关键步骤之一。

单细胞测序技术的不断发展使得研究者能够更全面地理解单个细胞的基因表达和功能，为理解生物学的复杂性提供了强大的工具。

总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。

若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。

在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。

TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。

TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。

Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。

Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱 4℃ 3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、管、200μl EP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在管中，4℃保存。

2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。

3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。

注：均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。

均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。

b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。

TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。

TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。

步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的 PBS 清洗 1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。

2.收集标本悬浮于 EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。

Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱4℃3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、1.5mlEP 管、200μl EP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液0.5ml,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在1.5mlEP 管中，4℃保存。

2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。

3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。

注：均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。

均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。

b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，3.5 厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。

TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。

TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。

步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的PBS 清洗1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。

2.收集标本悬浮于1.5ml EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。

rna提取逆转录步骤及原理以RNA提取逆转录步骤及原理为标题，本文将详细介绍RNA提取逆转录的步骤和原理。

一、RNA提取的步骤RNA提取是从细胞或组织中分离RNA分子的过程，常用于研究RNA的功能和表达水平。

RNA提取的步骤通常包括以下几个主要步骤：1. 细胞或组织的收集：首先，需要选择目标细胞或组织，并将其收集到离心管或离心管中。

收集的细胞或组织应该是新鲜的，并且要避免RNA的降解。

2. 细胞破碎：为了释放RNA，需要将细胞或组织破碎。

可以使用机械方法（如研钵研磨）或化学方法（如细胞裂解缓冲液）来破碎细胞膜。

破碎后的细胞溶液中包含了RNA分子。

3. RNA的纯化：为了纯化RNA，需要将其他的细胞组分（如蛋白质和DNA）去除。

这可以通过加入酚/氯仿混合液和异丙醇来实现。

酚/氯仿混合液可以将DNA和蛋白质从RNA中分离出来，而异丙醇可以用来沉淀RNA。

4. RNA的沉淀和洗涤：将异丙醇沉淀的RNA沉淀物用无水乙醇洗涤，以去除杂质。

然后，使用适当的缓冲液来溶解RNA，使其溶于水中。

5. RNA的定量和质量检测：使用光谱法（如比色法或荧光法）对RNA进行定量，以确定其浓度。

此外，还可以使用凝胶电泳或聚合酶链反应（PCR）等方法对RNA的质量进行检测。

二、RNA提取逆转录的原理逆转录是将RNA转录成相应的DNA分子的过程。

逆转录酶是逆转录过程中的关键酶。

其原理如下：1. 逆转录酶的作用：逆转录酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶，能够将RNA作为模板合成相应的DNA分子。

逆转录酶能够识别RNA中的反义链，并以该反义链为模板合成DNA链。

2. 逆转录酶的特点：逆转录酶具有RNA依赖性，意味着它只能在RNA分子上进行反应。

逆转录酶还具有RNA酶活性，可以在RNA 分子上剪切和连接。

3. 逆转录酶的机制：逆转录酶首先与RNA结合形成复合物，然后通过酶活性，将RNA分子上的核苷酸逐个反向转录成DNA链上的互补核苷酸。

RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。

加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。

RNA存在于水样层中。

收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。

用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。

Takara总RNA提取纯化和反转录1．总RNA的提取、纯化和反转录（Takara）1.1 总RNA的提取（1）取新鲜或者-80℃冻存的组织，添加液氮充分研磨，约每100 mg组织加入1mL RNAiso plus裂解，振荡混匀后室温静置5 min；（2）以每毫升RNAiso对应0.2 mL氯仿的比例加入氯仿，振荡15 s，室温静置3 min；（3）12000 g，4℃，离心15 min，取上清至新的Eppendorf管中（上层：无色水相为RNA，中层：白色为DNA，下层：红色为蛋白）；（4）在得到的水相中加入等体积异丙醇，混匀后-20℃放置20～30 min；（提取dsRNA时，加入等体积的异丙醇和3M NaCl混合液（异丙醇：3M NaCl=1：1））（5）12000 g，4℃，离心10 min，去除上清；（6）加入1 mL75%乙醇（DEPC水和无水乙醇配置，-20℃预冷）洗涤沉淀；（7）8000 g，4℃，离心5 min，去除上清，干燥RNA沉淀；（8）用20～30 μL DEPC水溶解RNA；（9）通过甲醛琼脂糖凝胶电泳判断RNA完整性，用Nanodrop 紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。

1.2 总RNA的纯化1) 在微量离心管中配制下列反应液。

10×DNase I Buffer 5 μLTotal RNA 20~50 μgRecombinant DNase I (RNase-free) 2 μL（10 units）RNase Inhibitor 20 units补DEPC处理的ddH2O至50 μL2) 37℃反应20～30 min。

3) 按以下方法失活Recombinant DNase I。

（1）加入2.5 μL0.5 M EDTA，混匀，80℃保持2 min。

（2）用DEPC处理的ddH2O定容至100 μL。

4) 加入10 μL 3 M醋酸钠和250 μL乙醇，混匀后-80℃放置20 min。

简述cdna的合成原理
cDNA合成是通过逆转录反应将mRNA反转录成cDNA的过程。

其合成原理如下：
1. 提取mRNA：从细胞中提取总RNA，其中包含mRNA。

2. 逆转录反应：将提取的mRNA模板与逆转录酶（通常使用逆转录酶反转录酶）一起反应，逆转录酶可以合成单链cDNA。

3. 反转录酶合成cDNA：逆转录酶利用mRNA模板的poly(A)尾部区域的poly(T)引物，以及反转录酶的反转录活性，合成单链cDNA。

4. DNA合成：使用DNA聚合酶（如DNA聚合酶I）进行第二链合成，形成双链cDNA。

该酶需要DNA聚合酶I缓冲液、三个dNTP和寡核苷酸引物。

5. 酶切：使用适当的酶对双链cDNA进行酶切，去除RNA模板或其他非cDNA 序列。

6. 连接：将链接适配体连接到cDNA的末端，以便进一步扩增和克隆。

总结：cDNA的合成原理是通过逆转录反应将mRNA转录成单链cDNA，再通过DNA聚合酶合成双链cDNA，并进行酶切和连接，最终得到cDNA。

RNA提取和RT-PCR1.准备工作：检查提RNA专用的枪头，EP管，以及PBS，Trizol，氯仿，酚氯仿，异丙醇，75%乙醇，DEPC水（0.1%）。

2.从4℃取出Trizol恢复室温，预冷离心机到4℃。

3.用室温的PBS把细胞洗一次，加入1ml Trizol裂解细胞，静置5分钟，反复吹打10次，收集到EP管内，-80℃可储存一个月（解冻时需要离心）。

4.向Trizol裂解液内加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。

5.4℃，12000g离心15分钟，此时可见细胞裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA,脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。

6.转移上层的水相到新的EP管内，150ul吸三次，共450ul。

7.补充200ul的DEPC水，总体积即为650ul，加入等体积的酚氯仿，混匀，静置3分钟后，4℃离心，12000rcf,15分钟。

8.取上清500ul到新的EP管内，167ul吸三次。

加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟。

9.小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1ml 75%乙醇, 上下颠倒，使沉淀块重悬起，加75%乙醇后4℃可储存一周， -20℃可储存一年。

10.4℃，12000g离心10分钟,小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。

晾干约15分钟，至管壁无液体。

11.加入适量体积（20-30ul）的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。

12.取出3 ul定量，测量buffer: 10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆=40µg/ml,A260/A2801.8~2.1）转录。

（1A26013.逆转录：a.根据定量结果取2μg RNA补充DEPC水至14μl；b.加入1μg oligod(T),70℃5min,取出后立刻冰上孵育5min；c.进行逆转录反应：在上一步反应管中直接加共40μl，42℃反应1h。

RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA，作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a)TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。

加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。

RNA存在于水样层中。

收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75％乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny配合Trizol A+提总RNA操作）1.匀浆处理（*打开离心机，降温）a)-80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。

用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10％（注：先加700μl Trizol A+，再加300μl，防止外溢；一般匀浆1.5~2min，可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3.将Phase lock Gel TM (PLG)置于离心机中，15000Xg离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml 氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。

1、提取RNA后，取2ul用微量核酸测定仪对RNA进行定量分析，测定其纯度和浓度，当OD260/OD280在1.8-2.0范围内，纯度较好，可用于下一步的实验。

可测得RNA的浓度，将样本稀释成1ug/ul用于之后的跑胶和逆转录。

稀释公式：需加入的试剂用DEPC水的量=（C-1）*V【C为测得的浓度，V为RNA体积】2、取2ul用跑胶，观察RNA的完整性3、取3ul用于逆转录，（根据不同的试剂盒而定，以下为我们所用的逆转录试剂盒）Total RNA 3ulOligo(dT)18 primer 1ul （混匀65°C，5min）→冰浴Water,nuclease-free 8ul将5*Reaction Buffer 4ulRNase Inhibitor 1ulDNTP Mix 2ulM-MuLV 逆转录酶1ul依次加入以上的反应液中，混合，→42°C,1h→70°C,5min→已合成的cDNA在-20°C保存4、其余RNA保存于-80°C冰箱中RNA提取步骤：取100mg组织（5ml圆底离心管）↓1mlTrizol迅速匀浆，转至1.5mlEP管中，静置10min↓加200ul氯仿在振荡器上剧烈震荡1min,静置10min←↓离心（12000rpm，4°C，15min）↓吸取上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）↓加等体积异丙醇混匀2min,静置10min↓离心（12000rpm，4°C，15min）↓可见微量沉淀，弃上清↓加75%乙醇1ml,混悬沉淀离心，（12000rpm，4°C，5min）↓弃上清，用移液器小心吸取残余液体室温干燥5-10min,沉淀溶于40ul-80ulDEPC水。

提RNA反转录的详细流程SMART 技术制备GS FLX 样品cDNA详细流程第一天一．RNA的提取1.用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)：1）在1.5 ml管中加入600ulRL T和6ul B-巯基乙醇2）取10—30mg组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎，3—5min3）12000rpm/3min,取上清移入新管4）加入1倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。

(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作)5）加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液6）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液7）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min8）将收集柱移入1.5mlRnase-free管中，加30—50ulRnase-free water,静置1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase去除DNA,需用87.5ul RNA溶液，因此用45ul Rnase-free water洗两次) 9）定量，跑胶2.用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除DNA 污染1）反应体系：共100ul87.5ul RNA 溶液10ul buffer RDD2.5ul Dnase I储存液（配制：干粉溶于550ul的Rnase-Free ddH20中，分装，-20℃保存）2）20—25℃孕育10min3.用Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化1）100ul除DNA后的RNA+350ulRL T,混匀2）加入250ul无水乙醇，轻柔混匀，不能离心，并立即移入收集柱，10000rpm/30s，弃废液3）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液4）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新的收集管，空转1min5) 换 1.5ml管，加30—50ulRnase-free water，置1min,10000rpm/1min6）定量，跑胶第二天二．反转录（SMART Kit,详见Manual）1.做逆转录之前对RNA的处理：浓缩RNA1）在所提取的RNA里（大约为10ug），加无水乙醇（2倍体积），醋酸钠（3M. PH=15.2 0.1倍体积）2）-70℃, 酝酿40min或过夜.3）取出溶液，3000g/1min; 换个方向，12000rpm/5min4）弃上清，用70%的乙醇洗两次。

一、总RNA的提取：
1. 将细胞培养液倒掉，立即加入Trizol试剂，每瓶1ml，反复吹打，室温静置5-10min；
2. 将细胞吸入1.5ml EP管中，每管加入200ul氯仿，旋窝振荡器剧烈震荡15s，冰上孵育10min；
3. 4℃、12000g离心15min，收集上层无色水相到新的1.5ml EP管中；
4. 加入等量异丙醇（约500ul），轻柔颠倒混匀，冰上孵育15min（沉淀RNA）；
5. 4℃、12000g离心15min，弃上清；
6. 加入1ml 75%乙醇并震荡（将沉淀弹起即可，乙醇要用DEPC水配制）；
7. 4℃、12000g 离心5min，弃上清；
8. 空气中（超净台内）干燥20-25min；
9. 加入20-30ul DEPC水溶解RNA； 10. 分装后，-80℃保存。

二、逆转录：
1. 按以下体系配反应液：
短暂离心后，70℃反应5min，立即放冰上冷却。

2. 以上反应液在冰上加入以下成分：
总体积为20ul，轻柔混匀后短暂离心。

3. 42℃ 60min，70℃ 5min。

三、Real-time PCR：
2. 反应条件： 95℃ 30s 95℃ 5s
55℃ 30s 40cycles 72℃ 31 or 34s。

逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。

一、总RNA的提取见总RNA的提取相关内容。

二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。

现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。

在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。

轻轻混匀，离心。

42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；5．于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。

-20℃保存备用。

三、PCR1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。

定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）一、实验原理逆转录-聚合酶链反应(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

二、实验步骤（一）总RNA提取1.Trizol裂解收集各处理组细胞于1.5ml离心管，用PBS缓冲液洗涤1次，每5～10×106个细胞加入1ml Trizol，吹打数次，使细胞充分裂解，室温静置5min。

（裂解后若不能及提取RNA，可在加入Trizol后，将其保存于-80℃）2.氯仿（三氯甲烷）萃取（1）每管加入200ul氯仿（Trizol :氯仿= 5 : 1），盖好离心管后，涡旋震荡15s后，放置室温静置2min。

（2）4℃、12000rpm条件下离心15min后，溶液分为上、中、下3层，上层为水相（无色透明，含RNA），下层为有机层（粉红色，含DNA和蛋白质等）。

3.异丙醇沉淀（1）吸取上层水相（约500μL）至RNase-free离心管中。

（不要吸到中间层）（2）加入500μL异丙醇（与上层水相等量），颠倒混匀数次。

（不要剧烈摇晃）（3）4℃、12000rpm条件下离心15min后，吸弃上清液，保留底部白色沉淀。

4.75%乙醇洗涤沉淀（1）加入1mL 75%乙醇（现配现用，DEPC水:无水乙醇= 1:3，配制后上下颠倒混匀）洗涤沉淀，涡旋震荡。

（2）4℃、12000rpm条件下离心5min后，吸弃上清液，将离心管开盖干燥10min。

5. RNA干燥溶解每管加入50μL DEPC水，盖好离心管后，敲打溶解。

（二）RNA浓度和纯度检测1.提前10min对酶联免疫分析仪进行预热。

2.用DEPC水洗涤微量比色皿。

2.5 从293T细胞中提取总RNA
2.5.1 实验材料
2.5.2 实验仪器
2.5.3 实验方法
（1）细胞收集完毕后，用1ml TRI-Reagent 重悬细胞(不超过1×107 个细胞)，并剧烈振荡以裂解细胞。

（2）将细胞裂解液冰浴5分钟。

（3）向细胞裂解液中加入0.2 ml 氯仿，剧烈振荡15秒。

（4）将细胞裂解液冰浴5分钟。

（5）将细胞裂解液在4 ℃，13000 rpm的条件下离心15分钟。

（6）将上层水相转移至新的1.5 ml无菌离心管中，加入0.5 ml异丙醇颠倒数次混匀，冰浴5分钟。

（7）将内容物在4 ℃，13000 rpm的条件下离心15分钟，RNA将形成沉淀。

（8）弃去上清液，用1 ml 75％乙醇（Ambion® RNase-free water与无水乙醇现配制）清洗RNA。

（9）在4 ℃，13000 rpm的条件下离心10分钟。

（10）弃去上清液，将RNA置于无菌环境中室温干燥10分钟。

（11）用30 μl Ambion® RNase-free water溶解RNA。

（12）测定RNA的浓度，并于1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

（13）将RNA溶液置于-80 ℃的冰箱中贮存备用。

2.6 逆转录PCR
2.6.1 实验材料
2.6.2 实验仪器
2.6.3 实验方法
按下表于0.2 ml无菌PCR管中准备50 μl的逆转录体系：
（2）按下表中的程序进行逆转录反应：
（3）反应结束后，将cDNA 置于-20 ℃贮存。