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人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达王中华;窦科峰;杜建军;陈勇【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2003(024)011【摘要】目的: 构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白. 方法: 采用反转录-聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2 cDNA中,分别扩增出Heparanase编码基因,用限制性内切酶BamHI消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定与测序证实后,连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体. 以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白. 结果: 构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实, 与GenBank登录结果完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pcDNA3.1及pRSET;SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功. 结论: 成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体,成功正确表达了6His/Heparanase融合蛋白.【总页数】4页(P968-971)【作者】王中华;窦科峰;杜建军;陈勇【作者单位】第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西,西安,710033;第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.正、反义Heparanase基因荧光真核表达载体的构建及胰腺癌SW1990细胞转染 [J], 杨彦;陈陵;崔明;段体德2.人β-防御素-3基因定点突变,原核表达载体构建和融合蛋白表达 [J], 金琳;韩跃武3.人线粒体融合蛋白-2基因真核表达载体的构建与鉴定 [J], 徐弋;曹成建;赵丽;徐华;杨晓玲;韩学波;田珏;姜怡邓4.人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达 [J], 贾丽;李晓军5.人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定 [J], 王春美;盛光耀;卢洁;郝庆飞;谢垒;白松婷;许松涛;薛乐勋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立作者：杨俊霞石华魏丽丽袁成福陈济易发平马永平宋方洲【关键词】 MCHR2；真核表达载体；转染；基因表达【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human melaninconcentrating hormone receptor 2 (MCHR2) and stably transfect HEK293 cells with it. METHODS: The fulllength MCHR2 cDNA fragment was amplified by PCR from the human fetal brain cDNA library and was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After identification of restriction digestion and PCR, the recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by lipofectamine. After screening culture by G418, a stablytransfected cell line was established, and the transcription and expression of the MCHR2 gene were identified by RTPCR, Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The eukaryotic expression vector pcDNA3.1MCHR2 was successfully constructed and the MCHR2 gene was transfected stably into HEK293 cells. A stablytransfected cell line was established and the MCHR2 gene was expressed successfully. CONCLUSION: The establishment of the stablytransfected cell line and the expression of the target gene provide a solid experimental foundation forfurther studies on the function of the MCHR2 gene.。
如何构建稳定转染的细胞系（株）？稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？A：如下♀一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：表达之类构建细胞转染pool细胞筛选单克隆筛选细胞库建立表达质粒构建A：如下♀将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不同载体上。
为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。
细胞转染A：如下♀将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。
转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。
Pool细胞筛选A：如下♀细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。
选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。
过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。
在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。
单克隆筛选A：如下♀单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。
为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。
三级细胞库的建立A：如下♀细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。
根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。
------------------------------华 美 制 作------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档华美制作------------------------------华美制作FKBP12真核表达载体的构建及稳定转染A549细胞株的建立*汤莹1方琦2史道华2△（1福建医科大学福总临床医学院福建福州350025；2南京军区福州总医院药学科福建福州350025）摘要目的：构建FK506结合蛋白12(FK506binding proteins 12,FKBP12)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。
方法：RT-PCR 扩增人平滑肌细胞FKBP12基因片断，构建pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12真核表达载体，经琼脂糖电泳、特异性内切酶切割及测序验证其正确性。
脂质体法转染真核细胞A549，Hygromycin B 筛选建立稳定转染的细胞株，免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。
结果：构建了FKBP12真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株，成功表达FKBP12蛋白。
结论：FKBP12真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立，为深入研究基于FKBP12靶点药物的机制奠定基础，进而为探索安全、高效的免疫抑制剂提供新的途径。
关键词：FK506结合蛋白12(FK506Binding proteins 12,FKBP12)基因；真核表达载体；稳定转染中图分类号：Q782，R734.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2010）04-617-03Construction of Eukaryotic Expressing Vector of FKBP12and Establishmentof Stable Transfectant A549Cell Line*TANG Ying 1,FANG Qi 2,SHI Dao-hua 2△(1Fuzhong Medical school of Fujian Medical University,Fuzhou 350025,China;2Dept.of Pharmacy,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command,Fuzhou 350025,China)ABSTRACT Objective:To construct the eukaryotic plasmid of FK506Binding proteins 12(FKBP12)and transfect A549cell so as to establish stable cell line.Methods:The whole objective gene was cloned by RT-PCR from VSMCs.Eukaryotic victor pcDNA3.1/Hy-gro(+)-FKBP12was connected and by enzyme digestion and DNA sequencing .We transfected the recombinant vector into A549cell by lipofectamine TM 2000.Stable transfected A549cell line was established after screening culture by Hygromycin B and was identified by Western blot.Results:The eukaryotic expression vector pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12was constructed,stable transfected A549cell line was established and FKBP12protein was expressed successfully.Conclusion:The construction of the eukaryotic expression vector pcD-NA3.1/Hygro (+)-FKBP12and the establishment of stable transfected A549cell line not only lay the foundation for the further research into the mechanism of drug targets based on FKBP12but also provide a safe and efficient way for myocardial new immunosuppressive agents.Key words:FK506Binding proteins 12（FKBP12）;eukaryotic expression vector;stable transfection Chinese Library Classification:Q782,R734.2Document code :A Article ID:1673-6273(2010)04-617-03*基金项目：福建省自然科学基金项目(No.2008J0103)；南京军区医学科学技术研究"十一五"计划课题（06MA154）作者简介：汤莹（1986-），女，硕士研究生，主要研究方向：分子药理及心血管药理学△通讯作者：史道华，教授，电话：*************，E-mail:**************（收稿日期：2009-12-15接受日期：2010-01-10）前言FKBPs 属于免疫亲和素(Immunophilin )的一个亚类，现已发现FKBP 家族成员20多个[1]，FKBP12是免疫抑制剂FK506结合蛋白(FK506-binding protein ，FKBP)家族的主要成员。
人Ｐ２Ｘ７真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立 魏林郁，卢娜，孟莉，李新娟，李璐，李超【基金项目】国家自然科学基金（８１２７１３７６）；河南省教育厅科学技术重点研究项目（１４Ａ３１００１９，１４Ａ３１０００９，１６Ａ３１００１１）；河南省基础与前沿技术研究计划资助项目（１１２３００４１０１６４）【收稿日期】２０１６ ０２ ２９【修回日期】２０１６ ０５ ３０△【通讯作者】Ｔｅｌ：０３７３ ３０２９１０４；Ｅ ｍａｉｌ：ｘｙｌｄｌ８＠１２６．ｃｏｍ共表达，并且不同Ｐ２Ｘ受体亚型彼此之间有着密切的拮抗或协同效应，又都以ＡＴＰ作为同一配体，因此难以在原代细胞中单独研究Ｐ２Ｘ７受体的结构、信号转导与调控机理。
因此本研究构建了ｐＥＧＦＰ Ｎ１／Ｐ２Ｘ７真核表达载体，转染人胚肾细胞（ＨＥＫ２９３），观察人Ｐ２Ｘ７的蛋白表达及在细胞内定位，建立稳定表达的ＨＥＫ２９３细胞株，旨在体外单独研究Ｐ２Ｘ７离子通道结构与功能，为进一步探讨Ｐ２Ｘ７受体相关疾病发病机理、治疗靶点及药物研发奠定基础。
１材料与方法１．１材料人脑组织Ｐ２Ｘ７全长ｃＤＮＡ（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，美国）；感受态细菌Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５ａ（北京天根生化科技有限公司）；质粒ｐＥＧＦＰ Ｎ１（上海吉凯基因化学技术有限公司）；ＨＥＫ２９３细胞由本实验室保存。
１．２仪器和试剂胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，美国）；ＤＭＥＭ高糖培养基（杭州吉诺生物医药技术有限公司）；Ｘ ｆｅｃｔ转染试剂盒（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，美国）；限制性内切酶ＤｐｎＩ（ＴａＫａＲａ，日本）；质粒提取试剂盒（ＯＭＥＧＡ，美国）；Ｇ４１８（Ｓｉｇ ｍａ，美国）；兔源Ｐ２Ｘ７多克隆抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ，以色列）；ＳＤＳ ＰＡＧＥ凝胶配制试剂盒、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ碱性磷酸酯酶显色试剂盒、Ｔｕｂｕｌｉｎ兔抗大鼠多克隆一抗、ＡＰ标记羊抗兔ＩｇＧ二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；ＰＣＲ反应引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；倒置荧光显微镜（ＺＥＩＳＳ，德国）；ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ Ｒａｄ，美国）；激光共聚焦显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ／ＦＶ１０００，日本）；流式细胞仪（ＢｅｃｋＭａｎ／ＦＣ５００，美国）。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
人Hepcidin融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达张怀;袁其朋;朱亚平;马润宇【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2005(25)3【摘要】为了在大肠杆菌中表达生产hepcidin ,根据大肠杆菌密码子偏好性 ,化学合成了人hepcidin的基因序列 ,并构建了hepcidin的融合表达载体pET -hpc。
pET- hpc在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中表达的hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在 ,其N端带有 6个组氨酸。
通过优化诱导表达条件 ,该融合蛋白表达水平显著提高 ,占总蛋白的 2 5 . 2 %。
表达的包涵体经 1 %TritonX 1 0 0洗涤后溶于8mol L 尿素 ,在变性条件下采用金属螯合层析进行纯化 ,所得融合蛋白纯度大于 95 %。
【总页数】5页(P44-48)【关键词】融合表达载体;ET;融合蛋白;大肠杆菌;包涵体;总蛋白;表达水平;诱导表达;密码子;变性【作者】张怀;袁其朋;朱亚平;马润宇【作者单位】北京化工大学生命科学与技术学院制药工程系【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q786【相关文献】1.嗜铬颗粒蛋白B-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 油红捷;毋晓涛;潘颖;王泽生2.重组人肝刺激因子非融合性蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化[J], 刘贺佳;吴媛;杨琳;安威3.融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 [J], 李莉;高秀来;宋一志;陆涛;景鹏4.pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 张晓红;夏春波;刘源劼;蒋常文;门楠K39/UreB双基因融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 [J], 张炜阳;李岩;吴同山;罗文华;胡斌;胡文锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
[文章编号] 16712587Ⅹ(2008)0120057204[收稿日期] 2007205223[基金项目] 吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20061550)[作者简介] 舒振波(1972-),男,吉林省长春市人,主治医师,在读医学博士,主要从事胃肠道肿瘤研究。
[通讯作者] 张桂珍(Tel :0431284995423,E 2mail :zhangguizhenjlu @yahoo 1com )核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在CH O 细胞中的表达舒振波1,操海萍2,王大民3,张桂珍3(11吉林大学中日联谊医院胃肠外科,吉林长春130033;21吉林大学中日联谊医院泌尿外科,吉林长春130033;31吉林大学中日联谊医院中心实验室,吉林长春130033)[摘 要] 目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN )真核表达载体,并在CHO 细胞中进行表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。
方法:以含有人DCN cDNA 的质粒pBluescript 为模板,采用聚合酶链式反应(PCR )扩增目的基因片段。
真核表达载体pcDNA3及PCR 产物经X ba Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌J M109,获得重组载体pCDNA 2DEC ,进行酶切鉴定和测序鉴定。
脂质体lipofectamine 介导重组载体转染CHO 细胞,经G418(800mg ・L -1)筛选建立稳定转染细胞株。
采用细胞免疫组织化学方法检测稳定转染CHO 细胞中DCN 表达。
结果:PCR 获得与预期大小一致约1000bp 的特异性DNA 片段;重组载体pCDNA 2DEC 经双酶切鉴定及测序证实,人DCN 基因cDNA 片段正确插入真核表达载体中;在稳定转染的CHO 细胞株中可见DCN 蛋白表达。
结论:成功构建DCN 真核表达载体pCDNA 2DEC ,并建立稳定转染CHO 细胞株。
[关键词] 核心蛋白聚糖;基因表达;转染;CHO 细胞[中图分类号] R329128 [文献标识码] AConstruction of decorin expression vector andits expression in CH O cellsSHU Zhen 2bo 1,CAO Hai 2ping 2,WAN G Da 2min 3,ZHAN G Gui 2zhen 3(11Department of Gastroenterology ,China 2J apan Union Hospital ,Jilin University ,Changchun 130033,China ;21Department of Urinary Surgery ,China 2J apan Union Hospital ,Jilin University ,Changchun 130033,China ;31Central Laboratory ,China 2J apan Union Hospital ,Jilin University ,Changchun 130033,China )Abstract :Objective To construct a eukaryotic expression vector of decorin (DCN ),and observe its expression in CHO cells ,in order to provide a basis for further study on the anti 2tumor effect of DCN.Methods DCN cDNA was amplified by PCR.The human f ull 2length DCN cDNA ligated into pBluescript was used as template.The fragment was ligated to the expression vector pCDNA3previously digested with X ba Ⅰand Eco R Ⅰ.The ligation mixture was transformed into competent E.coli J M109cells.Transformants containing inserts were confirmed by restrictive digestion and DNA sequencing.The expression vector was transfected into CHO cells using lipofectamine ,and transfected cells were cultivated in DM EM containing G 418(800mg ・L -1)for about 2months.Immunohistochemistry method was used to detect the expression of DCN protein in stably transfected cells.Results The PCR product was about 1000bp.The recombinant expression vector was identified by restrictive digestion and DNA sequencing.DCN protein was detectable in stablely transfected cells.Conclusion The recombinant eukaryotic expression vector pCDNA 2DEC is constructed successf ully and stablely transfected CHO cells are established.K ey w ords :decorin ;gene expression ;transfection ;CHO cells75第34卷 第1期2008年1月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版)Journal of Jilin University (Medicine Edition )Vol.34No.1 J an.2008 核心蛋白聚糖(decorin,DCN)是细胞外基质的重要组成成分。
