中国李组织培养过程中褐变的抑制研究

收稿日期2016-01-28近年来,随着科学技术的迅猛发展,植物组织培养已成为生物学科中的重要研究技术和手段之一,其被广泛应用于科研和生产,在农学、花卉、林业、医药业等领域中取得了巨大的经济、社会效益。

但是,植物组织培养过程中褐变问题普遍存在,褐变的发生会严重影响外植体的生长与分化,甚至导致培养材料的死亡,褐变问题已成为组织培养中的一大难题。

褐变的影响因素是复杂的,随外植体种类、基因型、取材部位及生理状况等的不同而危害程度有所区别,国内外也研究报道了一些减少或防止褐变的方法。

本文系统归纳了植物组织培养褐变的影响因素和防止措施,对深入研究褐变问题和组织培养技术都有着非常重要的意义。

1褐变的影响因素1.1外植体基因型在植物组织培养中,有些品系容易褐变,诱导困难,而有些品系褐变较少,愈伤组织化容易些,组培容易成功,其原因之一可能是酚类物质含量及多酚氧化酶活性上的差异。

1.2外植体的生理状态外植体本身的生理状态不同,接种后褐变的程度也不同。

致褐物质的含量会因生理年龄、季节、取材时间及部位的不同而不同。

1.3培养基成分和培养条件无机盐浓度、培养基pH 值、培养基状态及植物激素等不适宜,均会引起褐变的产生。

此外,培养过程中温度过高或光照过强,也会加速褐变的产生。

1.4培养时间接种后转瓶时间的早晚也是影响褐变的因素,接种后外植体培养时间过长,未及时转瓶,会使培养材料伤口积累过多酚类物质,导致褐变。

2褐变的防止措施2.1外植体的选择2.1.1基因型。

在相同培养条件下,甜菜二倍体品系外植体发生褐变的频率低于四倍体品系。

Dalal 等[1]比较2个葡萄品种“Pusa Seedless ”和“Beauty Seedless ”的褐变时,发现后者比前者严重,酚类化合物含量也是后者明显高。

因此,在组织培养中应注意不同基因型的筛选,选择褐变程度较小的材料来进行培养。

2.1.2生理年龄。

外植体年龄对褐变有较大影响,Chevre 分析表明欧洲栗幼龄材料酚类化合物含量少,而成龄材料比较多。

植物组织培养中褐变现象的研究马莉贞(青海大学农牧学院,青海西宁810003)摘要阐述了植物组织培养中褐变现象的原理及影响褐变的因素,提出了防止褐变的措施和方法。

关键词组织培养;褐变中图分类号Q943.1文献标识码 A 文章编号0517-6611(2006)15-3583-02R e se a rch on B row in g in P la n t T issu e Cu ltu reM A L i-zh e n(F acu lty o f A g ricu ltu re an d A n i m a l S c ien ce,Q in gh a i U n iv er sity,X in in g,Q i n gh a i810003)A b s tra c t T h e pr in ciple o f e xplan t b row in g w a s s ta ted inth is pape r,an d th e fa cto rs cau sin g b row in g an d th e m e th ods to ov ercom e b row in g in p lan t tissu e cu ltu re w e re pu t fo rw a rd.K e y w o rd s T issu e cu ltu re;B row in g褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面向培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步褐变而死亡的现象。

1褐变的原理褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有关。

很多植物,特别是木本植物都含有较高的酚类化合物,这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶(PPO)分隔存在,因而比较稳定。

在建立外植体时,切口附近的细胞受到伤害,其分隔效应被打破,酚类化合物外溢。

在溢出过程中与多酚类氧化酶接触,在P PO的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水,醌类又会在酪氨酸酶等的作用下,与外植体组织中的蛋白质发生聚合,进一步引起其他酶系统失活,从而导致组织代谢活动紊乱,生长停滞,最终衰老死亡[1-3]。

植物组织培养中褐变机理和防治措施摘要：褐变现象是指组织培养诱导脱分化或再分化的过程中，外植体组织从表面向培养基释放褐色物质而使得培养基逐渐变成褐色，外植体随之褐变死亡的现象，褐变现象又称酚污染，在植物组织培养过程中经常出现。

对诱导外植体的脱分化和培再分化过程的影响非常大，甚至是影响某些植物组织培养成功与否的关键。

褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。

褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

本文对褐变的影响因素和对策进行了研究。

关键词：组织培养，褐变，影响因素1. 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。

1.1褐变类型及基因型物种及其基因型对褐化的影响。

植物组织培养过程中外植体的褐化主要由多酚氧化酶作用于酚类物质而引起的。

不同植物品种、同种植物的不同类型因为外植体材料的基因型不同，在组织培养中褐化发生的频率和程度都存在着较大的差异[4]。

由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，木本植物、单宁含量或色素含量高的植物酚类物质含量也很高，木质素、单宁或色素形成多，其组织培养就容易发生褐变。

因此，组织培养过程中，木本植物一般比草本植物易发生褐变。

目前报道发生褐变的植物中多数是木本植物[5]。

在木本植物中，核桃、板栗由于单宁含量很高，进行组织培养难度很大，不仅在接种后的初代培养期容易发生褐变，而且在形成愈伤组织以后也会因为褐变而引起死亡。

红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。

豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。

在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。

5BIOTECHWORLD 生物技术世界近年来组培技术在农作物栽培、花卉生产幼苗以及脱毒苗当中的应用日趋广泛,使得植物种植日益规模化以及自动化,避免受自然条件的影响。

组织培养方面的理论研究已经较为成熟,不过在试验生产的过程当中往往出现外植体褐变的问题[1]。

褐化产物一方面导致外植体以及培养基褐变,另一方面也会抑制外植体的正常生理反应,从而影响外植体生长,甚至诱发外植体的死亡。

因此加强外植体褐变方面的研究有着重要作用。

1 植物组织培养外植体褐变的影响因素1.1 外植体材料一方面是生理状态的影响。

材料自身生理状态的不同,在接种后的褐变程度往往也有所区别,原因推测是不同生理状态材料,其中酚类物质含量以及PPO的活性各不相同,褐变则随母株的年龄以及组织的木质化程度而呈现出上升的趋势。

有学者使用桑树基部幼芽作为外植体,比桑树上部的枝条壮芽外植体褐化程度轻并且褐化率低[2]。

另一方面是取材部位以及时期的影响。

研究人员通过对葡萄进行研究,发现侧生蔓切取茎尖要比延长蔓更加容易成活,分析发现前者的酚类物质含量要比后者低。

使用苹果进行研究结果表明顶芽要比侧芽更加容易成活,并且褐变的程度也更轻。

1.2 培养条件研究人员发现卡特兰在10～20℃的时候褐变程度要比超过20℃的时候轻。

苹果等植物茎尖的外植体加以遮光处理之后,其褐变的程度显著降低,同时取自然光照条件下的植株枝条,在接种后则容易出现褐变问题。

推测其中的原因可能是酚类物质合成醌类物质时候需要光诱导酶。

1.3 培养基培养基的成分过高导致无机盐的浓度上升,可以诱发柚棕出现褐变。

同时培养基的pH值变化能够导致酚类以及酚氧化酶的结合部位发生改变。

实验显示,石井的培养基pH在3.0～4.0的时候,外植体排出较多的褐化物,而pH为5.0的时候排出的褐化物显著减少。

除此之外,培养基的状态对褐化也有相应的影响。

通常情况下,液体培养的时候外植体的毒害物质能够很快扩散,这样一来对外植体的影响就比较轻微。

褐变综述组培中如何抑制褐变的研究⽂献综述摘要：本⽂主要从如何防⽌或者减少组织培养中外植体褐变现象进⾏综述.选择适当的外植体并进⾏预处理,选择适宜的培养基,培养基中添加防褐剂,选择适宜的培养条件,外植体的连续转移等措施都能有效减少组织培养过程中褐变现象的发⽣。

关键字：组织培养褐变褐变是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，从组织表⾯向培养基释放分泌物质,这种分泌物质氧化后使培养基逐渐变成褐⾊(或⿊⾊),外植体随之进⼀步变褐⽽死亡的现象。

组织培养过程中外植体褐变是影响组织培养的重要因素。

发⽣褐变是因为植物体内含有较多的酚类化合物，在完整植物体的细胞中，酚类化合物与多酚氧化物分割存在，因此⽐较稳定。

当外植体切割后，切⼝附近的细胞的分割效应被打破，组织中的酚类物质经多酚氧化酶（PPO）氧化后产⽣棕褐⾊的醌类物质。

褐变产物不仅使外植体、培养基褐变，⽽且对许多酶有抑制作⽤，引起其他酶系统失活，导致组织代谢混乱，从⽽影响培养材料⽣长分化，严重时甚⾄导致死亡。

1外植体的选择与处理1．1选择适当的外植体外植体组织的受伤害程度直接影响褐变的发⽣。

Bonga等[1]认为，外植体越⼩，切⾯与体积的⽐率越⼤，伤害及褐化的程度越⼤，这在巨桉和卡德兰的组织培养中得到了验证。

Pruveni和Kipnis⽤椰⼦的完整胚、叶⽚作外植体进⾏培养也很少发⽣褐变。

外植体受伤害程度直接影响褐变，切割时应尽可能减⼩伤⼝⾯积，并缩短切⼝在空⽓中的暴露时间,伤⼝剪切尽可能平整。

切取外植体时还应考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切长些。

1.2对外植体进⾏预处理将外植体⽤流⽔冲洗，然后在50℃左右条终下处理12—24h，消毒后先接种在只含蒸糖的培养基上5-7d，使组织中的酚类物质部分先渗⼊培养基。

取出外植体，⽤适当⽅法清洗，再接种到适当的陪养基上，可减轻外植体的褐变。

李焕修等[2]⽤6种不同的预处理研究其对苍溪梨外植体褐交和成活的影响，结果发现，低温处理对降低褐变有⼀定作⽤；⽤氧化剂或PPO溶液进⾏预处理也可以起到减轻褐变的效果。

植物组织培养中褐变的发生机制与防治方法刘悦（西北师范大学生命科学学院甘肃·兰州730070）摘要褐变是植物组织培养中的普遍存在的现象，已经成为影响组织培养成功的重要因素，并且已成为组织培养中的一大难题。

本文揭示了褐变的发生机制及控制机理、影响褐变的因素，并于此提出了防治褐变的措施，以期为解决褐变问题提供理论依据。

关键词植物组织褐变机制防治中图分类号：Q943.1文献标识码：A褐变在植物组织培养过程中普遍存在，国内学者普遍认为褐变能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在，并且证明了褐变度与总酚含量以及PPO活性之间的关系因品种而异。

而国外学者Mayer和Harel则注意到正常果实组织中虽然存在有酚类物质和PPO，却并不发生褐变，指出果实中酚类物质和PPO在细胞中可能是区域化状态分布。

1褐变的发生机制关于褐变的发生机制，目前认为褐变分为两种：即酶促褐变和非酶促褐变。

但诸多研究认为引起褐变发生的主要是酶促褐变。

醌类化合物在酪氨酸酶的作用下与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。

当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为底物创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，再进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而才引起褐变。

2影响褐变的因素不同的材料、环境条件、因素或操作手段都会严重影响褐变发生的程度,不同的褐变程度也跟实验结果、研究目的息息相关。

在外植物体材料的基因型与生理状态确定的情况下，外植物体的种类和大小、培养条件是影响褐变的主要因素。

2.1外植体的种类和大小一般认为，木本植物比草本植物的外植体在培养中更易发生褐变。

外植体小的材料，因为切口所占比例较大而较易发生褐变。

切口越大，酚类被氧化的面积就越大，褐变现象越严重。

2.2培养条件培养室的温度控制在15℃~20℃，可有效地防止褐变的发生。

高温一方面不利于伤口的愈合，另一方面会增强多酚氧化酶的生物活性，从而加速氧化过程，使植物材料的褐变更为严重。

论植物组织培养褐变产生的因素及对策(一)论文关键词:植物组织培养褐变酚类物质多酚氧化酶醌类物质论文摘要:植物组织培养过程中，褐变问题普遍存在,与菌类污染和玻璃话现象并称为植物组织培养的三大难题。

针对褐变难题，本文结合相关资料，对影响褐变的因素作了全面分析，褐变的影响因素是复杂的，随植物种类外植体的部位几生理状况培养基及培养条件的不同而危害的程度有所不同，对这些因素是内因外界影响作用作了分析并针对这些因素提出了相应的解决措施。

在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。

褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。

褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。

1褐变原因及危害褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。

褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。

很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。

在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。

对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物侵染组织。

但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。

从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。

此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。

植物组织培养过程中外植体褐变及处理方法发布日期：2010-12-31 浏览次数：1231 褐变的原因：①植物品种研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。

由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。

因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。

②生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。

一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。

一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

③培养基成分浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

④培养条件不当如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

2 褐变的防止措施为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。

可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。

①选择合适的外植体一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

②合适的培养条件无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

③使用抗氧化剂在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。

另外使用0.1％～0.5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

④连续转移对容易褐变的材料可间隔12-24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-lOd后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

精品资料组织培养褐化原因以及防止措施........................................褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。

在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。

而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。

因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。

(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。

1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。

一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。

多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。

2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。

因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。

3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。

即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。

4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。

例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。

植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。

2003年6月韶关学院学报(自然科学版)Jun.2003第24卷第6期Journal of Shaoguan University(Natural Science)Vol.24No.6组织培养过程中污染和褐化的防治缪耀梅,李开彪,叶添谋(韶关学院英东生物工程学院,广东韶关512005)摘要:分析了植物组织培养过程中造成污染(真菌污染、细菌污染和潜伏性污染)和褐化的主要原因,同时提出了克服污染和褐化的若干具体措施.关键词:组织培养;污染;褐化;外植体中图分类号:Q136文献标识码:A文章编号:1007-5348(2003)06-0101-03污染和褐化是植物组织培养过程中最常见的现象,也是组织培养过程中的两大难题[1].这是因为微生物体积极其微小,生活力强,数量大,繁殖系数高,容易传播等特点,再加上操作者的技术不过关,以及外植体本身生理状态和环境因素的影响所造成的.本文分析了造成污染和褐化的原因,并总结作者在实践过程中的经验,提出防止措施.1污染的原因及其预防111造成污染的原因在组织培养过程中,污染的微生物分为细菌及真菌两大类[1].细菌污染的特点是,菌斑呈粘液状,而且在接种1~2天即可发现.主要是工作人员使用了未经充分消毒的工具(镊子、培养皿等)及呼吸时排出的细菌所引起的.有时也因操作人员用手接触材料或器皿边缘,这也造成了微生物落入材料或器皿的机会.因此,为了减少或去除这种污染,接种前,工作人员必须剪指甲及用肥皂洗手,以后还要用70%酒精擦拭双手,工作进行过程中,还应特别注意避免交叉污染.如,已灭菌的接种工具被消毒不够彻底的超净工作台面污染后又污染消毒过的材料和已灭菌的培养基等.又如,因工作人员呼吸所产生的污染,主要是在接种时说话或咳嗽引起的.11111真菌污染:一般多由接种室(箱)的空气污染造成.形成的原因,一是接种室的空气本身未很好消毒,二是操作时由于打开瓶盖时真菌孢子落入瓶内,或在去掉包头纸及解除捆扎包头纸的橡皮筋时,扬起了真菌孢子,致使接种室空间污染.11112细菌污染:主要是表面消毒不彻底和交叉污染造成的.11113潜伏性污染:有些培养材料内部带菌,比如维管组织带菌,在培养过程中由于本身的防御系统保护,这些微生物潜伏在其中未表现出来,当培养到一定阶段,由于各种环境因素的变化,外植体组织坏死时,就会长霉.112预防污染的措施11211经常对接种室进行空间消毒:用70%的酒精喷雾降尘消毒,用消毒水擦拭地板、墙壁、工作台等,用紫外灯照射消毒,用甲醛(2mL/m3)加少量高锰酸钾熏蒸灭菌.仔细做好实验室清洁卫生[2].11212防止菌类和灰尘进入室内:在超净工作台门口挂两层纱布,这样可有效地防止菌类和灰尘进入.收稿日期:2002-09-11作者简介:缪耀梅(1979-),女,广东阳江人,韶关学院英东生物工程学院农业工程系学生.11213 紫外灯照射:紫外灯接种前先打开超净工作台的紫外灯照射20min,利用UV 光激发空气中的O 2变成O 3进行空气消毒和UV 光的直接表面消毒.11214 防止操作过程中的污染:在每步操作过程中,都要认真按操作程序进行,防止污染的发生,具体应该注意如下几点:(1)经过灭菌的接种工具表面要盖一层无菌的报纸或纱布,以防止高压锅盖打开后落入细菌和灰尘,双手要套上经过灭菌的手套或用其它经过灭菌的物品把工具放进工作台,不能直接用手拿取工具.然后再开一次紫外灯照射20min.(2)接种前双手要用70%或75%的酒精擦洗2~3次,然后套上经过高压灭菌的袖套和手套,这样可保证伸入工作台空间的手和臂是无菌的,不会污染已经灭过菌的工作台.(3)把从室外采回来的接种材料经修剪、清洗,再用洗衣粉水泡2~3min,把装有外植体的烧杯小心地放在工作台左边,工作台要有两个人配合.用一支经灭菌的镊子把外植体取出放进一干净小烧杯里,注意镊子和外植体不能碰到烧杯壁,然后倒入酒精浸泡1~2min,目的是使外植体得到初步灭菌和浸润,减少附着在材料上的脂溶性物质的表面张力,以利于消毒液与外植体充分接触,以达彻底灭菌的目的.然后用镊子小心地夹起外植体放入另一经灭菌的烧杯,同样注意不能碰到烧杯上壁.倒入杀菌剂(升汞或氯酸钠等),注意杀菌液一定要淹过材料,加入1~2滴吐温-80,用玻棒搅拌.若是升汞,5~10min 后倒掉消毒液,再倒入无菌水,搅拌,连续冲洗8次以上.然后把消好毒的外植体分成3份,放入经过灭菌的培养皿,目的是减少交叉污染的机会.(4)接种时要用另一把干净的镊子,先用干净的剪刀把外植体(茎段)的两端剪去少许,以防带菌,用灭过菌的滤纸吸干水即可接种.一人拿培养瓶或试管,先用酒精擦一下容器外盖和盖子,再取下盖子,另一人接入外植体.每接一定数量的材料后要更换镊子.(5)培养时要注意空间的消毒.可用甲醛加高锰酸熏蒸,或用70%酒精消毒.培养室装上紫外灯定期照射.11215 首次接种污染率的估算与对策[3]:对于初学者而言,污染概率较大.因为第一次接种,材料是从田间或温室采来经表面消毒的,要获得有活力的材料,灭菌措施不可能很彻底,以致污染率很高,严重时常达100%.大多数情况下污染率约为40%~80%.那么首次接种采用什么方式污染率才最低呢?下面以兰花的茎尖(去病毒)培养为例,阐述如何有效降低污染率:(1)假定有100小块(5011~1m m)经消毒的兰花茎尖材料,接入100支试管,每管接1小块,1~2周后就会出现许多污染,其余一直没有污染的,就是得到的无菌材料(如果它们能生长、增殖并通过继代培养,那么就建立了无菌培养系),如果得到10块(10管)不污染的材料,那么得率为10%.(2)假定污染率仍为90%,每支试管接入2小块茎尖组织材料,则P 1=0190@0190=018100=81%P 2=2@0190@0110=01180=18%P 3=0110@0110=010100=1%(注:P 1)2污;P 2)1污1得和1得1污;P 3)2得)实际上P 1和P 2都是污染的,都只能弃去,只有P 3能得到1小块不污染的材料.(3)如果每支试管接入3小块材料,那么,污染率为9919%,得率仅为011%,可见要做1000支试管才能得到1支不污染材料.由此可见,首次外植体接种,每支试管接种一小块材料的污染率是最低的.#102#韶关学院学报(自然科学版)2003年2 褐化的原因与预防211 造成褐化的原因褐变是由于外植体中的多酚氧化酶被激活,使细胞的代谢发生变化[4].酚类物质被氧化后产生呈棕褐色的醌类物质,它们会逐渐扩散到培养基中,抑制其他酶的活性,毒害培养的材料.褐变的影响因素极其复杂,随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同,危害程度也有区别.21111 基因型:海垦2号橡胶树的花药褐变较少[4],因而易形成愈伤组织;而有些橡胶树品种极易褐变,其愈伤组织的诱导也很困难.故在组织培养中,有些品系难以成功,而有些则容易成功,其原因之一可能是酚类物质的含量及多酚氧化酶活性上的差异.因此对于容易褐变的植物,应考虑对其不同基因型的筛选,力争采用不褐变或褐变程度轻微的外植体进行培养.21112 外植体的生理状态:有研究表明,材料本身的生理状态不同,接种后褐变的程度也不同.如在欧洲栗的培养中,幼年型的外植体培养时含醌类物质少,而用成年型材料培养时含醌类物质多.在卡德利亚兰的培养中,较短的新生茎致褐物质含量高,而较长的新生茎致褐物质含量低.此外,致褐物质的寒冷因季节的不同而不同,冬季褐变少,夏秋季褐变最严重,接种后存活率也最低.分生部位接种后形成的醌类物质少,而分化的部位形成的醌类物质较多.21113培养基的成分:过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化,如油棕用MS 培养基容易引起外植体的褐变,而用降低了无机盐浓度的改良MS 培养基时则可减轻褐变,并可诱导出愈伤组织和胚状体.激素使用不当时,外植体也容易褐变.在芽大量增殖时,褐变也被抑制.此外,培养条件不太适宜,如过高温度或光照过强,都可使多酚氧化酶活性提高,从而加速外植体的褐变.212 防止褐变的措施21211 选择适宜的外植体和培养条件:许多研究表明,选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要手段[4].通常外植体应有较强的分生能力,在最适宜的细胞脱分化和再分化培养条件下,使外植体处于旺盛的生长状态,便可大大减轻褐变.适宜的温度和在全黑暗条件下进行培养也可显著减少外植体的褐变.据报道,如在芽初始培养的1~6周内,用黑暗培养或光强150Lx 可抑制外植体的酚类氧化.对于易褐变的材料,接种后转瓶时间长,伤口周围积累的醌类物质增多,则褐变加重;而缩短转瓶周期常常可减轻褐变.21212 加入抗氧化剂[4]:在组织培养中,加入一些氧化剂或用抗氧化剂进行材料(外植体)的预处理或预培养,可大大减轻醌类物质的毒害.这些抗氧化剂包括:Vit C 、Vit E 、聚乙烯吡咯烷酮(乙烯聚合物pyrrolidone,PVP)、血清白蛋白、柠檬酸、硫代硫酸钠(Na 2S 2O 3)等.011%~015%活性炭对吸附酚类氧化物的效果也很明显.参考文献:[1]罗士韦.植物组织培养在农业上的应用[J].植物生理学通讯,1997(1):1-6.[2]刘青林,陈青华,陈俊愉.梅花愈伤组织培养及其细胞学研究初报[J].北京林业大学学报,1999,21¦:100-105.[3]谭文澄.观赏植物组织培养技术[M].北京:中国林业出版社,1997.86-87.[4]潘瑞炽.植物组织培养[M].广州:广东高教出版社,2000.(下转第112页)#103#第6期缪耀梅,等:组织培养过程中污染和褐化的防治要求,积极研究和确立全面评价体育师范生创新意识和创造能力的内容和指标,并将其充实到学业考核评价体系中去,作为衡量学生学习成效的重要标准.参考文献:[1]冯培,贺淑曼.创新素质与人才发展[M].北京:世界图书出版公司,2000.16-20.[2]陈冀平.高师院校创新教育与课程结构改革[J].高等师范教育,1999(5):50.[3]周明星.不拘一格的创造力[M].武汉:武汉大学出版社,2000.[4]杨留锁,肖丰.试论体育院校学生创新素质的培养[J].体育科学,2003(1):17-20.A Research on the Cultivating Aproachesof the Creative Physical GraduatesXUE Liu -cheng 1,ZHE NG Wen -ling 2,HUANG Jin -ming 1(1.Department of Physical Education,Shaoguan University,Shaoguan 512005,Guangdong,China;2.Department of Physical Education,Nanyang Teaching -training College,Nanyang473061,Henan,China)Abstract:As the coming of the times of knowledge and economics,the tasks for education to cultivate the qualified graduates with creative senses and abilities for society are more and more important and ur -gent.By the analysis and reaearch on the proble ms existinhg in the cultivation of creative graduates in physics department of universities,this article probes into the cultivating approaches of creative phys-i cal graduates.Key words:physical education students for teacher -training;creative and qualified personnel;cult-i vating approaches(责任编辑:赵 鸥)(上接第103页)Study on the Prevention and Cure of the Browning and Pollu tionin the Process of the Plant Tissue CultureMIAO Yao -mei,LI Ka -i biao ,YE Tian -mou(Yingdong College of Bioengineering,Shaoguan University,Shaoguan 512005,Guangdong,China)Abstract:In this paper,the main reasons which caused the pollution and browning in the process of plant tissue culture had been discussed detaily,meanwhile,measures had been taken to overc ome these problem effitiently.Key words:tissue culture ;pollution ;browning;explant(责任编辑:颜志森)#112#韶关学院学报(自然科学版)2003年。

组培褐变怎么抑制目前，在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。

褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。

褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。

1褐变产生的影响因素影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。

1.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。

在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。

1.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。

1.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。

另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。

1.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。

不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。

2褐变产生的机理2.1非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。

徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。

当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。

但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。

2.2酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。

植物组织培养中的褐变现象与防止方法植物组织培养中出现褐变现象是一种常见的问题，褐变通常是因为植物组织培养过程中遭受到内部或外部压力所致。

褐变不仅会导致组织的死亡，也会影响到培养物的生长和发育。

因此，了解褐变的原因并采取相应的防止方法非常重要。

褐变现象发生的原因可以归纳为以下几个方面：1.感染：细菌、真菌和病毒感染是导致褐变的常见原因。

感染会导致组织坏死并产生褐色产物，从而导致组织培养失败。

解决方法：进行无菌操作，确保培养环境的无菌状态，并加强培养物的保护。

使用抗菌剂、消毒剂和抗生素等来抑制病菌的生长和传播。

2.氧化：氧化应激是导致组织褐变的常见原因之一、当细胞受到氧化应激时，产生大量的活性氧自由基，进而导致细胞内物质的氧化和组织褐变。

解决方法：在培养过程中尽量减少暴露在空气中的时间，并加入适量的抗氧化剂，如抗坏血酸、多酚等，来减少氧化损伤。

3.脱水：组织细胞在培养过程中由于脱水导致的细胞膜破裂，会释放出酶和多酚等有害物质，从而导致组织褐变。

解决方法：在组织切割后尽快进行培养，避免组织脱水。

可以使用无菌的生理盐水或培养基进行预处理，来保持组织的水分。

4.存储条件不适宜：组织在培养过程中需要适当的温度、湿度和光照等条件来维持其正常的生理活性。

如果存储条件不适宜，会导致组织的死亡和褐变的产生。

解决方法：在培养室中提供适宜的温度、湿度和光照条件，并定期检查和调节培养环境的参数，以确保组织的正常生长和发育。

总之，在植物组织培养中防止褐变现象的发生，需要保持无菌环境、抑制病菌感染、减少氧化应激、防止组织脱水和提供适宜的存储条件。

通过这些措施，可以有效减少组织的褐变现象，提高培养物的生长和发育效果。