天津科技大学海洋生物综合实验讲义

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2012级海洋生物综合实验

实 验 指 导 书

隋丽英 袁春营 邓元告 刘洪艳 张波 编 写

海洋科学与工程学院 海洋科学系

2013年10月

2 第一部分 浮游动植物培养

实验一 单细胞藻类的培养

一、实验目的

1、了解单细胞藻类培养基的主要成分及培养基的制备

2、掌握单细胞藻摇瓶培养技术

二、实验内容

单细胞藻类培养基的配制；单细胞藻类的摇瓶培养技术。

三、实验原理和方法

藻类是无胚的放氧光合生物，本实验介绍的细胞培养方法，主要基于藻类细胞进行放氧光合作用这种主要功能。藻类与微生物培养有相似之处，在固相平板上分离、纯化和保种，在液相中采用通气和振荡方法促进繁殖。

四、实验条件

1、实验仪器：分光光度仪、灭菌锅、光照培养箱或光照摇床、电子天平、显微镜等。

2、实验材料：杜氏盐藻（Dunaliella salina）

3、药品和试剂：

Walne培养基：以0.1%比例加入海水培养基中，配方如下。

成分 质量

溶液A：

FeCl3

MnCl2·4H2O

H3BO3

EDTANa2

NaH2PO4·2H2O

NaNO3

溶液B

0.8g

0.4g

33.6g

45.0g

20.0g

100.0g

1.0mL

溶于蒸馏水，加热溶解，定容至1000mL

溶液B：

ZnCl2

CoCl2·6H2O

(NH4)6Mo7O24·4H2O

CuSO4·5H2O

浓HCl

2.1g

2.0g

0.9g

2.0g

10mL

加热溶解，蒸馏水定容至100mL。

3 每组学生：250ml锥形瓶2个，皮筋，100ml量筒，1ml 移液器或刻度吸管，200ul移液器。

五、实验步骤

1、将已培养好的对数生长期的盐藻藻种接入装有100mL Walne培养基的250ml锥形瓶中，接种量约为5%。

2、将已接种的锥形瓶置于光照培养箱中静置培养（每隔一段时间摇晃一次），光照强度为60 μmol photons/m2.s，温度23-25℃。

3、藻细胞生长的测定：每隔一天测一次吸光值 OD674或进行细胞计数， 测一周左右（约2-4天进入对数期）。

4、绘制生长曲线。

实验二 轮虫的孵化、培养及生长繁殖测定

一、实验目的

了解浮游动物轮虫的孵化、培养和生长繁殖的测定方法。

二、 实验内容

1、 轮虫休眠卵的孵化和孵化率测定

2、 用单胞藻培养轮虫

3、 轮虫生长和挂卵量的测定

三、 实验原理和方法

四、实验条件

1、实验仪器：250mL锥形孵化管、恒温水浴槽、电加热棒、充氧泵和气管、解剖镜

2、实验材料：轮虫休眠卵、小球藻培养液、天然海水、卢戈氏固定液等

五、实验步骤

张波老师上课用

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第二部分 藻类DNA的提取和PCR扩增

实验三 单细胞藻总DNA的提取

一、实验目的

学习提取藻类总DNA提取的方法。

二、实验内容

藻类总DNA的提取。

三、实验原理和方法

随着植物基因工程的迅速发展，人们经常需要提取总DNA进行基因工程操作（如PCR扩增）。本实验介绍一种简便提取单胞藻总DNA的方法：先加裂解液和溶菌酶、用SDS进行细胞破碎，再经苯酚－氯仿－异戊醇抽提去除蛋白，即可得到藻类总DNA。

四、实验条件

1、实验仪器：恒温水浴锅，离心机，离心管，微量移液器等。

2、实验材料：鱼腥藻7120。

3、药品和试剂：

（1）细胞裂解液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L EDTA (pH 8.0)，50 mmol/L

NaCl，5%甘油。

（2）STE的配制：Tris-HCl (pH8.0) 10 mmol/L，EDTA (pH8.0) 1 mmol/L，NaCl 0.1 mmol/L

（3）苯酚－氯仿－异戊醇（25：24：1）

（4）TE（10mmol/L Tris-HCl pH7.4，1mmol/L EDTA）

（5）无水乙醇

每组学生：10 mL离心管或数个1.5 mL离心管合并离心，1 mL移液器，1.5 mL离心管3个。

五、实验步骤

1、收集对数期鱼腥藻7120培养物4mL，离心，用STE溶液洗涤。

2、0.5mL裂解液加入10mg/mL的溶菌酶（30微升），振荡混合完全，于37℃水浴1h。

3、加入10%SDS（10微升），蛋白酶K（20微升）至100 g/mL，于50℃水浴至少2h。

5 4、用等体积酚：氯仿、氯仿轻轻颠倒混匀，抽提2次。

5、加入预冷的2倍体积冰乙醇，轻轻混匀直到沉淀DNA。

6、离心收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀，室温下干燥，用TE重悬。

7、保存至-20℃冰箱。

六、注意事项

提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。

实验四 PCR扩增藻类16s rRNA基因片段

一、实验目的

学习PCR反应的基本原理与实验技术。

二、实验内容

用实验三提取的总DNA作模板，PCR扩增16s rRNA基因片段。

三、实验原理和方法

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

PCR技术的原理：1）变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。2）退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。3）延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。

四、实验条件

1、实验仪器：PCR仪，微量移液器等。

2、实验材料：上次实验提取的总DNA作为模板。

3、药品和试剂：

（1）吸头、0.2mL或0.5mL PCR管、PCR扩增体系（包括Taq酶、4种dNTP、10×PCR 缓冲液(含Mg2+）和引物）

（2）引物：

R149： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

6 F27： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

每组学生：100微升移液器，20微升移液器，0.2mL PCR管

五、实验步骤

1、在0.5mL RCR管内配置20uL反应体系：

20 µL反应体系中：Taq (5U/µL) 0.2µL

10× Taq Buffer 3µL

dNTP Mixture(各2.5mM) 3µL

引物1 1µL

引物2 1µL

用ddH2O补至20µL体积。

2、PCR反应程序：

94℃变性5min；94℃变性1min，52 ℃退火1min，72 ℃延伸2min，30个循环；72 ℃延伸10min。

3、PCR结束后保存于冰箱。

实验五 琼脂糖凝胶电泳PCR产物

一、实验目的

掌握琼脂塘凝胶电泳检测DNA方法。

二、实验内容

琼脂糖电泳检测实验四提取的藻类总DNA以及PCR扩增产物。

三、实验原理和方法

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium bromide，EB）染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度凝胶。琼脂糖凝胶分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

7 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：DNA的分子大小；琼脂糖浓度；DNA分子的构象；电源电压；嵌入染料存在和离子强度影响等。

四、实验条件

1、实验仪器：水平式电泳槽，电泳仪，微量移液枪，微波炉或电炉，紫外分析仪或凝胶成像扫描系统。

2、实验材料：提取的藻类总DNA和PCR扩增产物。

3、药品和试剂：

（1）5×TAE电泳缓冲液：24.2g Tris碱，57.1mL冰醋酸，37.2g Na2EDTA-2H2O，加H2O至1L。

（2）6×电泳载样缓冲液（购买taq酶时公司客提供）：0.25％ 溴粉蓝，40％（w/v） 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。

（3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。

（4）琼脂糖。

五、实验步骤

1、取5×TAE缓冲液稀释，配制成0.5×TAE缓冲液作为工作液备用。

2、1.0%浓度凝胶液的制备：称取0.5g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL 0.5×TAE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1.0％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。

3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/mL(也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5μg/mL的EB溶液浸泡染色)。琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。

4、加样：取5-10μl样品与1-2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

5、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。