基于石英晶体的牛奶加水量测量机理与应用研究_肖文丽

价值工程0引言在现代很多产品生产过程中，物料含水率对产品的生产加工过程及产品质量有着重要意义。

物料含水率测量根据测量方式主要分为直接测量法和间接测量法。

微波透射法是间接测量法的一种，具有测量精度高，反应速度快，受外界环境影响小等优点，是近年来水分测量领域重要研究方向，各类型基于微波透射原理的水分测定仪层出不穷，为各行各业水分测定提供了极大的便捷。

因此开展微波透射法水分测定仪的量值溯源具有非常重要的作用。

目前国内发布的水份测定仪量值溯源方法有：JJG 891-2019《电容法和电阻法谷物水分测定仪检定规程》[1]、JJG 658-2010《烘干法水分测定仪检定规程》[2]、JJG 845-2009《原棉水分测定仪检定规程》[3]、JJG 1154-2018《卡尔·费休容量法水分测定仪检定规程》[4]，以上方法均不适用于基于微波透射法原理设计的水分测定仪的量值溯源。

在参考了T/CIS17002-2018《胶乳水份测定微波透射法》[5]、GB/T8298-2008《浓缩天然胶乳总固体含量的测定》[6]及JJG1154-2018《卡尔·费休容量法水分测定仪检定规程》[4]等标准的基础上，结合湖南赫西仪器有限公司生产的RH2021SF-I 型微波水分测定仪校准案例，开展微波透射法水分测定仪量值溯源方法的研究，设计出合理的校准方法，提出示值误差校准结果不确定度评定模型[7]。

1微波透射法水分测定仪工作原理[8]微波通过被测物质时，会产生能量衰减，不同的介质，使微波通过时能量衰减不同。

微波透射法水分测定仪采用微波衰减法检测设计。

通过水分测定仪的微波发射装置发射特定波长的微波，特定波长微波经过被测样品后，微波会产生能量、相位等特定变化，微波透射法水分测定仪的微波接收装置探测并接受变化后的特定微波，根据微波能力的变化，经过水分测定仪数据分析系统进一步演算，可得到被测物体水分含量。

2仪器计量性能要求根据仪器的计量特性、测量对象要求，结合微波透射法水分测定仪计量性能的试验结果，提出微波透射法水分测定仪的计量特性要求，如表1所示。

近红外光谱在乳品检测中的应用研究进展摘要：近红外光谱技术作为一种新型的分析检测技术，越来越广泛地应用在物品的定性和定量检测中。

本文以奶制品质量检测为切入点，阐述了近红外光谱技术的基本原理，检测步骤，介绍了国内外近红外光谱分析技术在奶制品质量检测方面应用的最新研究进展，对目前研究存在的问题进行了分析，对今后进一步的研究进行了展望并提出了一些建议。

关键词近红外光谱技术奶制品1 引言鲜奶及奶制品作为一种与人民生活息息相关的营养品，含有蛋白质、乳糖、脂肪、维生素、矿物质等100多种人体所需的营养元素，其营养价值完善，是最接近于人奶的天然食品，已成为居民生活中不可缺少的日常食品之一。

由于鲜奶和奶制品在人们日常饮食中占据着越来越重要的地位，它的安全性直接影响到人们的身体健康。

因此，对乳制品进行有效的质量检测和控制也就至关重要。

传统的奶制品质量检测主要是使用一些化学分析方法，其结果准确，但过程耗时，费力，一般需要试剂，对样本具有破坏性。

此外，由于各种掺假现象的层出不穷，传统化学方法的应对显迟缓和繁琐。

著名的“三聚氰胺”事件，就是钻了传统的“凯氏定氮法”的空子。

对于一些成分复杂的化学添加剂，往往需要多种化学方法综合辨别。

其前处理复杂，耗时长，成本高，同时也不适用于现场及在线分析。

近红外光谱分析技术是近十多年来新兴的一种分析技术，随着近红外光谱仪器硬件技术的不断完善以及化学计量学软件的发展，近红外光谱分析的应用急剧扩展，广泛应用于农产品，饲料，饮料，药物，烟草和石油化工领域。

与传统方法相比，近红外光谱分析技术具有测量速度快，操作方便，不破坏样品，不用前处理试剂等特点，非常适合于现场分析和在线检测。

在线检测能够保证生产过程的全程质量监控，现场检测有利于及时发现质量问题，控制问题产品的扩散，对奶制品质量控制有着重大的意义。

2近红外光谱技术的基本原理及特点近红外光谱指的是波长在780~2526nm范围内的电磁波, 波数范围为3500~13000 cm- 1, 从波长上可以分为短波近红外( 780 ~1100 nm ) 和长波近红外( 1100 ~ 2526nm) 。

牛奶成份检测仪光强检测电路设计原理1 引言牛奶在人们的生活饮食中越来越普遍，实时快速准确的检测牛奶成份对提高牛奶质量和对实现乳业生产过程的自动化管理有重要意义。

检测牛奶成份的方法有多种，化学分析方法仍然是准确度最高的检验方法，但是他很难适应短时间测试的需要，物理仪器测试法主要有利用超声波原理和光谱分析检测，目前国外的技术相对比较成熟，但仪器昂贵，不可能在中国普及，特别不可能在中小企业和乳牛场使用。

本文介绍的牛奶成份测仪采用激光散透比来检测，精度比较准确、成本较低。

2 检测原理激光散透比检测即用激光的入射平内同时90°处的散射光光强Is和检测0°处的透射光光强It的比值来表征测试牛乳蛋白质含量的光学参量。

但是由于牛乳中存在两种散射大分子，所以很难准确地单独测出蛋白质和脂肪含量。

通过化学研究，找出一种快速蛋白质熔解液(乙二氨四乙酸稀溶液)能够把蛋白质溶解为小分子，使牛乳稀溶液中只有脂肪是牛乳中的不溶的大分子测出脂肪，再测脂肪和蛋白质两相共存的牛乳稀溶液，通过建立理论关联模型便可求出蛋白质含量。

在测量过程中光电流信号比较微弱，所以设计性能好的光强检测电路是很重要的。

此仪器电路设计最关键的部分就是光强采样电路的设计，光强采样电路的设计合理与否直接影响到牛奶成份检测的准确度和精度。

牛奶成份检测仪的结构框图。

从半导体激光器发出波长为635 nm的非偏振光，平行准直入射试样盒，在透射光和散射光方向用光电二极管将光信号转化为电信号。

光强检测电路由放大电路和A／D转化电路组成，放大电路将由光电二极管转化的微弱电信号放大为适合A／D转化的模拟电压。

A／D转化电路将模拟电压转化为数字量。

单片机是仪器的控制器，用于处理按键，读取采样值、计算并显示测量结果。

3 影响光电转化输出信号精度的原因在此仪器的结构图可以看出，影响光电转化输出信号精度的因素有以下几个方面：(1)半导体激光器发出的光具有不一致性，在一定的波长范围分布；半导体激光器对温度敏感，环境温度的变化和注入电流的热效应都会使激光器的阈值电流以及输出光功率发生变化。

应用电导率仪测定微生物生物量的研究谢丽;孙瑞珠;马玉龙【摘要】[Objective] The research aimed to study the determination methods of the biomass of bacteria. [ Method] Liquid bacteria culture was centrifuged and Synechocystis sp. PCC 6803 were collected. After washing by deionized water, the cells of collected Synechocystis sp. PCC 6803 were broken by ultrasonic wave. Then the conductivity of different density of the sonicated bacteria was determined using conductometer. At the same time, the dry weight and light absorption of different density of bacteria were measured. [ Result] The results showed that there is a perfect linear relationship between the cell conductivity and its dry weight, correlation coefficient r = 0.9994; the linear relationship between dry weight and optical density of Synechocystis sp. PCC 6803 is also good, correlation coefficient r = 0.998. [ Conclusion] The optical density method and conductivity method are both good methods in the determination of the biomass of Synechocystis sp. PCC 6803. Comparing with optical density method, conductivity method is also convenient and accurate.%[目的]研究微生物生物量的测定方法.[方法]离心收集蓝细菌,用去离子水清洗后,超声破碎蓝细菌,将破碎后的蓝细菌用去离子水稀释至不同浓度,测定不同浓度破碎后的蓝细菌菌液的电导率值.同时测定蓝细菌的细胞干重及吸光度值.[结果]完全破碎后的蓝细菌菌液的电导率值与细胞干重存在良好的线性关系,线性系数r =0.999 4；蓝细菌的吸光度值与细胞干重也存在良好的线性关系,线性系数r=0.998.[结论]电导率法和吸光度法均能很好地反映蓝细菌的生物量,电导率法的方便程度和可靠性均可以与吸光度法相比较.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)031【总页数】3页(P19048-19050)【关键词】生物量;蓝细菌;电导率;吸光度【作者】谢丽;孙瑞珠;马玉龙【作者单位】宁夏大学化学化工学院,宁夏银川750021;宁夏大学化学化工学院,宁夏银川750021;宁夏大学化学化工学院,宁夏银川750021【正文语种】中文【中图分类】S132微生物生物量的测定是研究微生物生命活动规律及其生产应用的最基本与最重要的内容，其中微生物生长的测定主要包括计数法(直接计数法、染色计数法、比例计数法等)、比浊法、细胞干重和湿重法、活菌计数法(平板菌落计数、MPN法、试剂纸法、膜过滤等)以及生理指标(定氮和DNA含量测定)测定法等［1］，每种方法都各有其优缺点和适用性。

牛奶含水率介电谱结合化学计量学检测方法郭文川;林碧莹【摘要】为了实现牛奶含水率的快速检测,采用网络分析仪和同轴探头测量了室温((25±0.5)℃)下20～4500MHz间105个牛奶样品的相对介电常数和介质损耗因子.发现基于单—频率下的介电参数很难预测牛奶的含水率.为此,将介电谱与化学计量学方法相结合预测牛奶的含水率.基于X-Y共生距离法进行了样本集划分,得到校正集样本75个和预测集样本30个.采用连续投影算法从全介电谱中提取出了15个用于预测牛奶含水率的特征变量;建立了基于全介电谱和连续投影算法提取的特征变量预测牛奶含水率(87.28％～91.30％)的广义神经网络、支持向量机和极限学习机模型.结果发现,基于连续投影算法提取的特征变量所建立的极限学习机模型是预测牛奶含水率的最优模型,其预测相关系数、预测均方根误差和剩余预测偏差分别为0.988、0.119％和6.723.研究表明,介电谱结合化学计量学方法可用于检测牛奶的含水率.【期刊名称】《农业机械学报》【年(卷),期】2016(047)009【总页数】7页(P249-255)【关键词】牛奶;含水率;介电特性;化学计量学;人工神经网络【作者】郭文川;林碧莹【作者单位】西北农林科技大学机械与电子工程学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学机械与电子工程学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】TS252.2牛奶中富含多种营养物质，如蛋白质、脂肪、糖类和矿物质等，被誉为“白色血液”。

牛奶的含水率是反映牛奶品质的主要指标之一，它可以反映牛奶是否掺水以及乳成分的变化。

常用的牛奶含水率检测方法有直接干燥法[1]、微波法[2]、水分测定仪法[3]、红外光谱法[4-5]和热辐气动干燥法[6]等。

国标GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》中规定的直接干燥法虽然具有检测精度高的优点，但其耗时长、仪器笨重、能耗大，不能实现在线检测，难以满足市场快速检测牛奶含水率的要求。

牛乳掺杂检验方法目录第一章牛乳的物理化学性质 (3)第一节牛乳的一般物理性状 (3)1、乳的色泽及气味 (3)2、PH值与酸度 (3)3、密度和比重 (4)4、粘度和表面张力 (4)5、乳的比热、冰点和沸点 (5)6、乳的折光指数 (5)7、乳的导电率 (5)第二节乳的化学组成 (5)1、水份 (6)2、干物质 (6)3、乳脂肪 (6)4、乳蛋白质 (7)5、乳糖 (7)6、无机盐 (7)7、维生素 (8)8、牛乳中的酶 (8)第三节异常乳 (9)1、低成份乳 (9)2、细菌感染乳 (9)3、酒精阳性乳 (10)4、乳房炎乳 (11)5、风味异常乳 (11)6、混入杂质乳 (12)7、其它病牛乳 (13)第二章鲜奶掺杂系统分析 (13)第一节掺杂物质的分类 (13)1、电解质物质 (13)2、非电解质物质 (13)3、胶体类物质 (13)4、防腐类物质 (13)第二节可掺杂物质的系统检验 (13)1、系统检验方法的应用 (13)2、牛奶系统检验指标综合制定 (13)第三章掺杂检验方法 (13)第一节常规检验中有关方法 (13)第二节非常规系统检验方法 (13)1、牛奶电导率测定 (14)2、牛奶冰点测定 (14)3、乳清比重测定 (15)4、牛乳的活性试验 (15)第三节非常规快速检验方法 (16)1、陈旧奶的检验 (16)2、食盐的检验 (16)3、蔗糖的检验 (17)4、尿素的检验 (17)5、人、畜尿的检验 (17)6、加碱的检验 (18)7、豆浆、豆饼水的检验 (19)8、米汤、淀粉类的检验 (20)9、洗衣粉（烷基磺酸钠）的检验 (20)10、白广告色及白鞋粉的检验 (20)11、胺肥检验 (20)12、硝酸盐的检验 (21)13、亚硝酸盐的检验 (21)14、硫酸盐的检验 (22)15、血与脓的检验 (22)16、白陶土的检验 (23)17、明胶的检出 (23)18、福尔马林（甲醛）的检验 (23)19、过氧化氢的检验 (23)20、敌敌畏的检验 (24)21、可溶性钡盐的检验 (25)第四节牛奶及乳粉中硝酸盐含量的定量方法一、亚硝酸盐的定量方法二、硝酸盐的定量方法附表：《温度、比重》标准对照表牛乳掺杂检验方法讲义第一章牛乳的物理化学性质第一节牛乳的一般物理性状乳的一般物理性状包括色泽、气味、比重、粘度、沸点、比热、表面张力、冰点、折射率以及乳的反应等许多内容。

畜牧兽医学报 2023,54(4):1465-1477A c t aV e t e ri n a r i a e tZ o o t e c h n i c aS i n i c a d o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.04.011开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):L R T N 4R L 1-A S 通过m i R -27a -3p 靶向PP A R γ调节奶牛乳腺细胞乳脂合成贾鸿儒,杨超群,王 萌,吴章情,昝林森,杨武才*(西北农林科技大学动物科技学院,国家肉牛改良中心,杨凌712100)摘 要:旨在探究l n c R N A -L R T N 4R L 1-A S /m i R -27a -3p /P P A R γ轴在奶牛乳脂合成中的作用及其调控机制㊂本研究以奶牛乳腺上皮细胞(b o v i n em a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l s ,B M E C s )为试验对象,对处理组与对照组进行3个生物学重复,通过实时荧光定量(r e a l t i m e q u a n t i t a t i v eP C R ,R T -q P C R )㊁W B (W e s t e r nb l o t )㊁油红O 染色和甘油三酯检测㊁双荧光素酶报告等技术检测l n c R N A -L R T N 4R L 1-A S 对B M E C s 中甘油三酯积累及脂质合成相关基因表达量的影响,验证L R T N 4R L 1-A S -m i R -27a -3p -P P A R γ存在内源竞争R N A (c o m p e t i n g e n d o g e n o u sR N A s ,c e R N A )的靶向关系㊂结果表明,L R T N 4R L 1-A S 主要在细胞质中表达,干扰L R T N 4R L 1-A S 后显著抑制了B M E C s 的脂滴形成和甘油三酯积累(P <0.05),显著下调脂质合成相关基因C E B P α(P <0.01)㊁C E B P β(P <0.01)和P P A R γ(P <0.05)表达,且显著上调脂质分解基因H S L 表达(P <0.05);双荧光素酶报告试验发现,转染m i m i c s -m i R -27a -3p ,L R T N 4R L 1-A S 突变型组荧光素酶活性显著高于L R T N 4R L 1-A S 野生型组(P <0.01),证实L R T N 4R L 1-A S 与m i R -27a -3p 之间存在靶向结合关系;共转染试验发现,i n h i b i t o r -m i R -27a -3p 逆转了干扰L R T N 4R L 1-A S 对乳脂合成的抑制作用(P <0.05),同时降低了s i -L R T N 4R L 1-A S 对P P A R γ基因的表达抑制㊂结果显示,L R T N 4R L 1-A S通过竞争性结合m i R -27a -3p 调控P P A R γ表达来调节B M E C s 乳脂合成㊂关键词:乳脂肪;l n c R N A ;P P A R γ;m i R -27a -3p中图分类号:S 823.91 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)04-1465-13收稿日期:2022-09-09基金项目:陕西省自然科学基金(2021J M -100)作者简介:贾鸿儒(1998-),女,山西洪洞人,硕士生,主要从事动物遗传育种与繁殖研究,E -m a i l :h o n g r u j i a 123@163.c o m *通信作者:杨武才,主要从事动物脂质代谢与泌乳调控研究,E -m a i l :y a n gw u c a i 111@163.c o m L R T N 4R L 1-A SM e d i a t e sM i l kF a t S y n t h e s i s i nB o v i n eM a m m a r yE p i t h e l i a l C e l l s t h r o u g hm i R -27a -3p T a r g e t i n g PP A R γJ I A H o n g r u ,Y A N GC h a o q u n ,WA N G M e n g ,WUZ h a n g q i n g ,Z A N L i n s e n ,Y A N G W u c a i *(N a t i o n a l B e e f C a t t l e I m p r o v e m e n tC e n t e r ,C o l l e g e o f An i m a lS c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,N o r t h w e s t A &F U n i v e r s i t y ,Y a n g l i n g 712100,C h i n a )A b s t r a c t :T h i s s t u d y a i m e d t o e x p l o r e t h e r o l e a n d r e g u l a t o r y m e c h a n i s mo f l n c R N A -L R T N 4R L 1-A S /m i R -27a -3p /P P A R γa x i s i nm i l k f a t s y n t h e s i s o f d a i r y c o w s .B o v i n em a m m a r y e pi t h e l i a l c e l l s (B M E C s )w e r eu s e da se x p e r i m e n t a l o b j e c t s .T h r e eb i o l o g i c a l r e pe a t sw e r ec a r r i e do u tf o r t h e t r e a t m e n tg r o u p a n d th ec o n t r o l g r o u p .R e a l ti m e q u a n t i t a t i v eP C R (R T -q P C R ),W e s t e r nb l o t (W B ),O i lR e dOs t a i n i n g ,t r i g l y c e r i d e d e t e c t i o n a n d d o u b l e l u c i f e r a s e r e p o r tw e r e u s e d t o d e t e c t t h e e f f e c to f l n c R N A -L R T N 4R L 1-A So nt h ee x p r e s s i o no ft r i g l y c e r i d ea c c u m u l a t i o na n dl i p i d s y n t h e s i s r e l a t e d g e n e s i nB M E C s .L R T N 4R L 1-A S -m i R -27a -3p -P P A R γh a dt a r g e t i n g re l a t i o n -s h i p of c o m p e t i ng e n d o ge n o u s R N A s (c e R N A )w a s v e r if i e d .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t Copyright ©博看网. All Rights Reserved.畜牧兽医学报54卷L R T N4R L1-A Sw a sm a i n l y e x p r e s s e d i n t h e c y t o p l a s m.A f t e r i n t e r f e r i n g w i t hL R T N4R L1-A S, t h e l i p i dd r o p l e t f o r m a t i o na n dt r i g l y c e r i d ea c c u m u l a t i o no fB M E C sw e r es i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d (P<0.05),a n d t h e e x p r e s s i o n o f l i p i d s y n t h e s i s r e l a t e d g e n e s C E B Pα(P<0.01),C E B Pβ(P< 0.01)a n d P P A Rγw e r e s i g n i f i c a n t l y d o w n-r e g u l a t e d(P<0.05),a n d t h e e x p r e s s i o no f l i p i dc a-t a b o l i s m g e n e H S L w a ss i g n i f i c a n t l y u p-r e g u l a t e d(P<0.05).D o u b l el u c i f e r a s er e p o r ta s s a y s h o w e d t h a t t h e l u c i f e r a s ea c t i v i t y i n m i m i c s-m i R-27a-3p i nL R T N4R L1-A S m u t a n t g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a nt h a t i nL R T N4R L1-A Sw i l dt y p e g r o u p(P<0.01).I tw a sc o n f i r m e d t h e r ew a s a t a r g e t e db i n d i n g r e l a t i o n s h i p b e t w e e nL R T N4R L1-A Sa n db t a-m i R-27a-3p.C o t r a n s-f e c t i o n e x p e r i m e n t r e s u l t s h o w e d t h a t i n h i b i t o r-m i R-27a-3p r e v e r s e d t h e i n h i b i t i o ne f f e c t o f i n t e r f e r e n c e L R T N4R L1-A S o nm i l k f a t s y n t h e s i s(P<0.05),a n d r e d u c e d t h e i n h i b i t i o n e f f e c t o f s i-L R T N4R L1-A S o n P P A Rγg e n ee x p r e s s i o n.T h er e s u l t ss h o wt h a tL R T N4R L1-A Sr e g u l a t e s m i l kf a ts y n t h e s i so f B M E C s b y c o m p e t i t i v e l y b i n d i n g m i R-27a-3p t o r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f P P A Rγ.K e y w o r d s:m i l k f a t;l n c R N A;P P A Rγ;m i R-27a-3p*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Y A N G W u c a i,E-m a i l:y a n g w u c a i111@163.c o m乳脂肪含量的高低直接决定了牛奶及其乳制品的品质与口感,同时也是评价牛奶质量的主要指标之一[1-2]㊂乳腺组织内部汇集大量具有泌乳功能的腺泡,牛乳腺上皮细胞(b o v i n em a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l s,B M E C s)以单层而紧密的方式排列在腺泡周围,乳汁是在乳腺上皮细胞内由血液中的各类营养物质经过一系列复杂生化过程而形成[3-4]㊂乳脂主要是以脂滴的形式存在,甘油三酯的含量约占97%~98%,其余部分由构成磷脂膜的磷脂㊁胆固醇脂㊁胆固醇㊁二酰甘油㊁单酰甘油等构成㊂乳脂合成调控受环境㊁遗传㊁激素㊁生理等多种因素的影响,其中遗传是影响乳脂肪合成调控的最主要因素[5-6]㊂目前已鉴定了一批与乳脂合成密切相关的基因功能:乙酰辅酶A羧化酶(a c e t y l-C o A c a r b o x y l a s e-α,A C A C A)和脂肪酸合成酶(f a t t y a c i d s y n t h a s e,F A S N)可以促进脂肪从头合成[7-9];硬脂酰辅酶A脱饱和酶1(s t e a r o y l-c o e n z y m e ad e-s a t u r a s e1,S C D1)㊁二酰甘油酰基转移酶1(d i a c y l-g l y c e r o l a c y l t r a n s f e r a s e1,D G A T1)与类脂1(l i p i n 1,L P I N1)均参与三酰甘油的加工[10-14];白细胞分化36蛋白(f a t t y a c i d t r a n s l o c a s e,C D36)与脂肪酸结合蛋白(f a t t y a c i db i n d i n gp r o t e i n,F A B P)在脂肪合成过程中执行运输功能[15-16];过氧化物酶体增殖物激活受体(p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o ra c t i v a t e d r e c e p t o r,P P A R)以及固醇调节元件结合蛋白(s t e-r o l r e g u l a t o r y e l e m e n t-b i n d i n gp r o t e i n,S R E B P)是哺乳动物脂质合成过程中的重要转录因子,在脂肪合成过程中发挥着重要的调控作用[17-18]㊂同时,非编码基因也被发现参与调节B M E C s乳脂肪合成[19],但目前关于乳脂肪合成调控机制的认识仍十分有限㊂l n c R N A是指长度大于200个核苷酸的R N A 分子,通常不具有编码蛋白质的能力,以R N A的形式参与机体生命过程的调控,在动物细胞的增殖㊁分化㊁新陈代谢以及疾病等方面均发挥重要作用[20]㊂l n c R N A在细胞中不同位置可能产生不同功能,位于细胞质中的l n c R N A可能通过竞争内源性R N A (c e R N A)机制与m i R N A结合,以减弱m i R N A对靶向m R N A表达的抑制进而发挥功能作用[21-22]㊂近年来,越来越多的证据表明l n c R N A通过c e R N A 机制在乳腺发育与泌乳调控方面发挥重要,郝志云[23]通过对不同品种的绵羊乳腺组织长链非编码R N A测序,发现l n c R N A可通过竞争性结合m i R N A s参与乳腺发育和泌乳,且证实M S T R G. 7526.1通过竞争性结合m i R-200c调控P A NK3基因表达,进而抑制乳腺上皮细胞甘油三酯的合成;刘丽华等[24]研究发现,l n c R N A M P N C R能够与m i R-31竞争性结合靶向调控基因C AMK2D表达区调节乳腺上皮细胞的增殖;l n c R N AE P B41L4A-A S通过负调控E r b B3激活P I3K-A K T和J A K-S T A T信号通路从而促进乳蛋白的合成[25]㊂但是,目前l n c R N A在奶牛乳脂合成方面的研究较少,l n c R N A 在B M E C s乳脂合成中的作用机制研究刚刚起步,其所参与的分子调控网络有待阐明㊂因此,本研究在本实验室前期全转录组测序工作基础上,探究l n c R N A-L R T N4R L1-A S对乳脂合成的作用㊂6641Copyright©博看网. All Rights Reserved.4期贾鸿儒等:L R T N4R L1-A S通过m i R-27a-3p靶向P P A Rγ调节奶牛乳腺细胞乳脂合成1材料与方法1.1试验材料本试验所使用的奶牛乳腺上皮细胞(B M E C s)由西北农林科技大学国家肉牛改良中心保存提供㊂1.2主要试剂与仪器1.2.1 主要试剂D M E M/F12培养基购于H y c l o n e;胎牛血清(F B S)购于P A N-B i o t e c h;L i p o-f e c t a m i n e3000R e a g e n t购自I n v i t r o g e n公司;牛胰岛素与氢化可的松购于S i g m a;牛催乳素购于P r o s P e c;T R I z o l与反转录试剂盒购于T a K a R a;荧光定量试剂盒购于全式金;m i R c u t e增强型m i R N A c D N A第一链合成试剂盒与m i R c u t e增强型m i R N A荧光定量检测试剂盒(S Y B R G r e e n)购于天根生化有限公司;油红O购于S o l a r b i o;甘油三酯酶法测定试剂盒购于北京普利莱;去内毒素质粒试剂盒㊁胶回收试剂盒购于O m e g a;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于百赛生物公司(货号为F6075S);核质分离试剂盒购自A m b i o n P A R I S T M K i t(货号:AM1921);P P A Rγ㊁β-a c t i n抗体以及l n c R N A-L R T N4R L1-A S的s i R N A-600和s i R N A-642与m i R-27a-3p的m i m i c s㊁N C㊁i n h i b i t o r㊁i n h i b i t o r-N C 购于生工生物工程有限公司(序列见表1)㊂表1s i R N A㊁m i m i c s㊁i n h i b i t o r与N C序列T a b l e1s i R N A,m i m i c s,i n h i b i t o r a n dN Cs e q u e n c e s名称N a m e序列S e q u e n c e正义链(5'ң3')S e n s e反义链(5'ң3')A n t i s e n s es i R N A-600C C U C U C C U C A C C A U G U A A U T T A U U A C A U G G U G A G G A G A G G T T s i R N A-642G C A A G A G C C A G C U G U G A A A T T U U U C A C A G C U G G C U C U U G C T T s i R N A-N C U U C U C C G A A C G U G U C A C G U T T A C G U G A C A C G U U C G G A G A A T T m i m i c s-m i R-27a-3p U U C A C A G U G G C U A A G U U C C G G A A C U U A G C C A C U G U G A A U U m i m i c s-N C U U G U A C U A C A C A A A A G U A C U G G U A C U U U U G U G U A G U A C A A U U i n h i b i t o r-m i R-27a-3p C G G A A C U U A G C C A C U G U G A Ai n h i b i t o r-N C C A G U A C U U U U G U G U A G U A C A A1.2.2主要仪器 P C R仪㊁核酸电泳设备㊁半干转膜仪㊁实时荧光定量P C R仪㊁核酸凝胶成像仪㊁蛋白凝胶成像仪(B i o-R a d美国);冷冻离心机(E p p e n-d o r f德国);倒置显微镜(O L YM P U S日本);高压灭菌锅(Z E A L WA Y美国);超低温冰箱(-80ħ) (S A N Y O日本)等仪器㊂1.3试验方法1.3.1牛l n c R N A-L R T N4R L1-A S的核质定位使用未进行分化的奶牛乳腺上皮细胞,按照试剂盒说明书(A m b i o n P A R I S T M K i t)进行细胞核与细胞质的R N A分离,同时验证R N A的完整性,然后将R N A反转录成c D N A进行实时定量P C R(R T-q P C R)试验,检测l n c R N A-L R T N4R L1-A S在细胞质与细胞核的含量㊂1.3.2细胞转染㊁油红O染色以及甘油三酯测定将B M E C s接种于12孔板,密度达到70%左右时进行转染㊂转染前1h更换培养基,s i R N A试剂按照L i p o f e c t a m i n e3000说明书步骤转染,每组设置3个重复孔㊂转染48h后收集细胞,P B S清洗两遍,4%多聚甲醛固定30m i n,弃去甲醛P B S清洗两遍,油红O染液(饱和油红Oʒ蒸馏水=3ʒ2)染色30m i n,P B S清洗去多余的油红O染液,显微镜下观察拍照㊂甘油三酯按照北京普利莱甘油三酯酶法测定试剂盒说明书进行测定㊂1.3.3总R N A提取㊁反转录以及实时定量P C R 按照T R I z o l说明书方法提取R N A㊂按照T a K a R a 反转录试剂盒说明书合成c D N A,稀释为30倍㊂然后以该c D N A作为模板,通过R T-q P C R检测基因表达量,泛素表达转录因子(u b i q u i t o u s l y e x p r e s s e d t r a n s c r i p t,U X T)为内参基因,对L R T N4R L1-A S㊁激素敏感性脂肪酶(h o r m o n e-s e n s i t i v el i p a s e, H S L)㊁脂肪甘油三酯脂肪酶(a d i p o s e t r i g l y c e r i d e l i p a s e,A T G L)㊁C C A A T/增强子结合蛋白α(C C A A T e n h a n c e r b i n d i n g p r o t e i n a l p h a,7641Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜 牧 兽 医 学 报54卷C E B P α)㊁C C A A T /增强子结合蛋白β(C C A A Te n -h a n c e r b i n d i n gp r o t e i nb e t a ,C E B P β)㊁过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pe r o x i s o m e p r o l if e r a t o r a c t i -v a t e d r e c e p t o rg a m m a ,P P A R γ)㊁脂肪酸结合蛋白2(f a t t y a c i db i n d i n gp r o t e i n2,F A B P 2)㊁乙酰辅酶A 羧化酶α(a c e t y l -C o Ac a r b o x y l a s e a l ph a ,A C A C α)进行定量分析㊂以U 6为内参基因对b t a -m i R -27a -3p 进行定量分析,引物序列见表2㊂反应体系为15μL :S Y B R 为7.5μL ,c D N A 为6.9μL ,上㊁下游引物各为0.3μL ㊂反应程序:95ħ预变性3m i n;95ħ变性10s ,60ħ退火20s ,72ħ延伸30s,45个循环,基因相对表达量根据2-ΔΔC t法计算㊂表2 引物信息T a b l e 2 P r i m e r s i n f o r m a t i o n 基因G e n e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e 产物长度/b pP r o d u c t l e n gt h 用途A p p l i c a t i o n L R T N 4R L 1-A S F :A C A G G A G G G A A C C G T G C T A AR :A A G A C A C T T C C A G A G G G G G A 201R T -q P C R U X T F :G C G C T A C G A G G C T T T C A T C T R :C C G A G T G G T T A G C T T C C T G G142R T -q P C R H S L F :C G G G G A G C A C T A C A A A C G A A A CR :G T C A G A G G C A T T T C A A A G G C G A 264R T -q P C R A T G L F :T G C T G A T T G C T A T G A G T G T G C C R :C C T C T T T G G A G T T G A A G T G G G T 101R T -q P C R C E B P αF :A T C T G C G A A C A C G A G A C G R :C C A G G A A C T C G T C G T T G A A73R T -q P C R C E B P βF :T T C C T C T C C G A C C T C T T C T C R :C C A G A C T C A C G T A G C C G T A C T79R T -q P C R P P A R γF :T G A A G A G C C T T C C A A C T C C C R :G T C C T C C G G A A G A A A C C C T T G117R T -q P C R F A B P 2F :T T T C A G T T C C A T C T G G G A G G C R :G C A C T T T C C A T G G C A T T T T G A C 218R T -q P C R A C A C αF :C G G C T G A C T G G A G T T G A A G A A R :C G C G T A T G G G A G G C A A A A A C 160R T -q P C R U 6F :G C T T C G G C A G C A C A T A T A C T R :T T C A C G A A T T T G C G T G T C A T 86R T -q P C R b t a -m i R -27a -3pT T C A C A G T G G C T A A G T T C C20R T -qP C R 1.3.4 W e s t e r nb l o t 吸出细胞培养板中所有培养基,并用P B S 轻柔的清洗细胞3次;6孔板每孔按R I P A (蛋白裂解液)ʒP M S F (蛋白酶抑制剂)=100ʒ1的比例加入150μL 混合液;冰上裂解30m i n ,于冰上用细胞刮刀刮细胞培养板底部,使细胞充分裂解;将裂解液转移至1.5m L 离心管中,4ħ,12000ˑg 离心10m i n ,100ħ变性10m i n;制作分离胶和浓缩胶,电泳80V30m i n ㊁120V1h ;快速封闭30m i n ;一抗(1ʒ2000)4ħ孵育14~16h ;二抗(1ʒ7500)室温2h ㊂1.3.5 双荧光素酶报告基因的构建和检测 利用预测软件B i b i s e r v 2(h t t p ://r e gr n a 2.m b c .n c -t u .e d u .t w /d e t e c t i o n .h t m l )与m i R B a s e (h t t p://w w w.m i r b a s e .o r g/s e a r c h .s h t m )预测L R T N 4R L 1-A S 与m i R N A -27a -3p 结合位点,设计P G L 3-L R T N 4R L 1-A S -野生型㊁P G L 3-L R T N 4R L 1-A S -突变型分别设计引物插入K p n I 和H i n d I I I 两个酶切位点,使用T K 作为内参,P G L 3-L R T N 4R L 1-A S -野生型㊁P G L 3-L R T N 4R L 1-A S -突变型转染的量为500n g ㊃m L -1,T K 的转染量为50n g ㊃mL -1,m i R N A -27a -3p m i m i c s ㊁N C 转染量为50n m o l ㊃m L -1转染于293A 细胞后24h 后收样,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行检测㊂1.3.6 数据统计与分析 试验均设置3个生物学重复,所有数据结果使用S P S SS t a t i s t i c s 22.0软件独立样本T 检验进行显著性分析,数据以 平均值ʃ8641Copyright ©博看网. All Rights Reserved.4期贾鸿儒等:L R T N4R L1-A S通过m i R-27a-3p靶向P P A Rγ调节奶牛乳腺细胞乳脂合成标准差 来表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著㊂2结果2.1l n c R N A-L R T N4R L1-A S的筛选以及核质分离利用测序得到的L R T N4R L1-A S序列放入U C S C和N C B I数据库进行比对,发现L R T N4R L1-A S位于牛第19号染色体上,由L R T N4R L1基因所在D N A链的反义链转录而来,含有3个外显子(图1A)㊂通过C P C(c o d i n gp o t e n t i a l c a l c u l a t o r,h t-t p://c p c.g a o-l a b.o r g/p r o g r a m s/r u n_c p c.j s p)和C P A T(c o d i n g p o t e n t i a l a s s e s s m e n t t o o l,h t t p://l i l a b. r e s e a r c h.b c m.e d u/c p a t/)两个软件预测转录本的编码能力,结果表明,L R T N4R L1-A S序列不具有编码蛋白质的能力(图1B)㊂利用牛乳腺上皮细胞进行核质分离试验,确定L R T N4R L1-A S的亚细胞定位,结果显示,L R T N4R L1-A S主要分布于细胞质(图1C)㊂A.通过数据库对比确定l n c R N A-L R T N4R L1-A S的位置;B.预测l n c R N A-L R T N4R L1-A S不具有编码功能;C.l n c R N A-L R T N4R L1-A S的亚细胞定位:左侧为实时定量P C R结果,右侧为凝胶电泳图(1.细胞核;2.细胞质)A.T h el o c a t i o n o fl n c R N A-L R T N4R L1-A S w a sd e t e r m i n e d b y d a t a b a s ec o m p a r i s o n;B.I ti s p r e d i c t e dt h a tl n c R N A-L R T N4R L1-A Sh a sn oc o d i n g f u n c t i o n;C.S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no f l n c R N A-L R T N4R L1-A S:r e a l t i m e q u a n t i t a t i v eP C R r e s u l t s o n t h e l e f t a n d g e l e l e c t r o p h o r e s i s o n t h e r i g h t(1.N u c l e u s;2.C y t o p l a s m)图1l n c R N A-L R T N4R L1-A S基本信息F i g.1B a s i c i n f o r m a t i o no f l n c R N A-L R T N4R L1-A S2.2l n c R N A-L R T N4R L1-A S对乳腺上皮细胞乳脂合成的影响将s i R N A和N C分别转染进B M E C s细胞中,处理后48h检测干扰效率,发现s i R N A-600与s i R N A-642的L R T N4R L1-A S均显著低于N C组(P<0.05,图2A),s i R N A-642的干扰效率达60%满足后续的试验要求㊂干扰L R T N4R L1-A S后甘油三酯的含量也显著低于对照组(P<0.05,图2B),脂滴形成的数量明显减少(图2C)㊂同时,干扰L R T N4R L1-A S显著下调脂质合成关键基因9641Copyright©博看网. All Rights Reserved.畜 牧 兽 医 学 报54卷C E B P α(P <0.01)㊁C E B P β(P <0.01)和P P A R γ表达(P <0.05,图2D ㊁E ),而脂质分解基因H S L则显著上调(P <0.05,图2D );P P A R γ基因W B试验结果和定量结果一致(图2F )㊂结果表明,干扰L R T N 4R L 1-A S 抑制奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成㊂A.L R T N 4R L 1-A S 干扰效率检测;B .干扰L R T N 4R L 1-A S 对牛乳腺上皮细胞甘油三酯合成的影响;C .细胞油红O 染色(400ˑ);D.成脂相关基因表达;E .P P A R γ基因的相对表达量;F .P P A R γ蛋白表达量(*.P <0.05;**.P <0.01,下同)A.L R T N 4R L 1-A Si n t e r f e r e n c ee f f i c i e n c y d e t e c t i o n ;B .E f f e c t so f i n t e r f e r i n g L R T N 4R L 1-A So nt r i g l y c e r i d es yn t h e s i s i n b o v i n em a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l s ;C .C e l l O i l R e dOs t a i n i n g (400ˑ);D.A d i p o g e n e s i s r e l a t e d g e n e s e x pr e s s i o n ;E .T h e r e l a -t i v e e x p r e s s i o no f P P A R γ;F .P r o t e i ne x p r e s s i o no fP P A R γ(*.P <0.05;**.P <0.01,t h e s a m e a sb e l o w )图2 干扰L R T N 4R L 1-A S 抑制乳腺上皮细胞的脂肪合成F i g .2 I n t e r f e r i n g w i t hL R T N 4R L 1-A S i n h i b i t s l i p o g e n e s i s i nb o v i n em a m m a r y e pi t h e l i a l c e l l s 2.3 l n c R N A -L R T N 4R L 1-A S 与m i R -27a -3p 的关系通过软件(B i b i s e r v 2)预测发现,L R T N 4R L 1-A S 与m i R -27a -3p 具有两个结合位点(图3A ),且发现干扰L R T N 4R L 1-A S 后m i R -27a -3p 表达显著上调(P <0.05,图3B ),表明l n c R N A -L R T N 4R L 1-A S 与m i R -27a -3p 可能存在靶向结合关系㊂构建野生741Copyright ©博看网. All Rights Reserved.4期贾鸿儒等:L R T N 4R L 1-A S 通过m i R -27a -3p 靶向PP A R γ调节奶牛乳腺细胞乳脂合成型与突变型p G L 3-L R T N 4R L 1-A S 载体并与m i m i c s -m i R -27a -3p 共同转染进乳腺上皮细胞,发现L R T N 4R L 1-A S 野生型组(L R T N 4R L 1-A S WT+m i m i c s -m i R -27a -3p)荧光素酶活性显著低于突变型组(L R T N 4R L 1-A S MT+m i m i c s -m i R -27a -3p )(P <0.01,图3C )㊂以上结果表明,L R T N 4R L 1-A S与m i R -27a -3p 存在靶向结合的关系㊂A.预测m i R -27a -3p 与L R T N 4R L 1-A S 的结合位点;B .干扰L R T N 4R L 1-A S 对m i R -27a -3p mR N A 水平的影响;C .双荧光素验证靶向关系A.T h e p r e d i c t e db i n d i n g s i t e s o fm i R -27a -3p t oL R T N 4R L 1-A S ;B .I n f l u e n e co f i n t e r f e r i n g L R T N 4R L 1-A So nm i R -27a -3pm R N Al e v e l ;C .D o u b l e f l u o r e s c e i nw a su s e d t ov e r i f y t h e t a r g e t i n g r e l a t i o n s h i p图3 检测L R T N 4R L 1-A S 突变与b t a -m i R -27a -3p 的结合位点F i g .3 D e t e c t i n g t h e b i n d i n g s i t e o f b t a -m i R -27a -3p toL R T N 4R L 1-A Sm u t a t i o n 2.4 m i R -27a -3p 对乳腺上皮细胞乳脂合成的影响利用m i m i c s -m i R -27a -3p 和N C 转染B M E C s ,发现m i m i c s -m i R -27a -3p 组的m i R -27a -3p 表达量极显著高于N C 组(P <0.01,图4A )㊂m i m i c s 处理后乳腺上皮细胞脂滴的数量明显减少(图4C ),甘油三酯的含量显著低于对照组(P <0.05,图4B ),同时显著下调成脂关键基因C E B P α㊁C E B P β㊁A C A -C A 和P P A R γ表达(P <0.01,图4D ㊁E ㊁F ),而脂质分解基因H S L 表达则显著上调(P <0.01,图4D )㊂将i n h i b i t o r s -m i R -27a -3p 和NC 转染B M E C s ,发现i n h i b i t o r s -m i R -27a -3p 组m i R -27a -3p 表达量极显著低于对照组(P <0.01,图5A ),乳腺上皮细胞中脂滴形成数量(图5C )和甘油三酯的含量显著高于对照组(P <0.01,图5B ),成脂相关基因C E B P α㊁C E B P β㊁P P A R γ㊁A C A C A 的表达极显著上调(P <0.01,图5D ㊁E ㊁F ),而脂质分解基因H S L表达显著下调(P <0.05,图5D )㊂结果表明m i R -27a -3p 抑制乳腺上皮细胞的乳脂的合成㊂2.5 m i R -27a -3p 介导ln c R N A -L R T N 4R L 1-A S 调控P P A R γ表达来调节乳脂合成 在验证l n c R N A -L R T N 4R L 1-A S 与m i R -27a -3p 存在靶向结合基础上研究ln c R N A -L R T N 4R L 1-A S 是否通过竞争性结合m i R -27a -3p 发挥调节作用㊂结果显示,i n h i b i t o r -m i R -27a -3p 逆转了干扰L R T N 4R L 1-A S 对乳脂合成的抑制作用(P <0.05,图6A ㊁B );同时发现,i n h i b i t o r s -m i R -27a -3p 也能够逆转s i -L R T N 4R L 1-A S 对L R T N 4R L 1-A S ㊁m i R -27a -3p 以及成脂关键基因P P A R γ的表达(图6C ㊁D ㊁E ㊁F )㊂结果表明L R T N 4R L 1-A S 通过与m i R -27a -3p 结合调控P P A R γ表达进而调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂的合成㊂1741Copyright ©博看网. All Rights Reserved.畜 牧 兽 医 学 报54卷A.m i R -27a -3p 的过表达效率;B .甘油三酯的含量;C .油红O 染色(400ˑ);D.成脂相关基因表达;E .P P A R γ的相对表达量;F .P P A R γ蛋白表达量A.O v e r e x p r e s s i o ne f f i c i e n c y o fm i R -27a -3p ;B .T h e c o n t e n t o f t r i g l y c e r i d e s ;C .O i l r e dOs t a i n i n g (400ˑ);D.A d i p o ge n e s i s r e l a t e d g e n e e x p r e s s i o n ;E .T h e r e l a t i v em R N Ae x p r e s s i o nof P P A R γ;F .P r o t e i ne x pr e s s i o no fP P A R γ图4 过表达m i R -27a -3p 抑制乳腺上皮细胞的脂肪合成F i g .4 O v e r e x p r e s s i o no fm i R -27a -3p i n h i b i t s l i p o g e n e s i s i nb o v i n em a m m a r y e pi t h e l i a l c e l l s 3 讨 论乳脂肪是牛奶的主要营养成分,可为人类提供营养和能量,因此生产具有足够乳脂肪含量的优质牛奶是健康食品的发展趋势,而挖掘影响乳脂肪合成的功能基因一直是奶牛分子育种中的研究热点㊂目前已鉴定了大量与乳脂代谢相关的功能基因,此外,随着候选基因筛选策略和比较基因组学研究方法的发展,非编码R N A 成为调控乳脂肪合成的一类重要因子,一些非编码R N A 被研究证明参与乳脂肪合成调控[26],但相较于m i R N A ,l n c R N A 在乳腺上皮细胞乳脂肪合成中的作用及机制研究刚刚起2741Copyright ©博看网. All Rights Reserved.4期贾鸿儒等:L R T N 4R L 1-A S 通过m i R -27a -3p 靶向PP A R γ调节奶牛乳腺细胞乳脂合成A.m i R -27a -3p 的干扰效率;B .甘油三酯的含量;C .油红O 染色(400ˑ);D.成脂相关基因表达;E .P P A R γ的相对表达量;F .P P A R γ蛋白表达量A.I n t e r f e r e n c e e f f i c i e n c y o fm i R -27a -3p ;B .T h e c o n t e n t o f t r i g l y c e r i d e s ;C .O i lR e dOs t a i n i n g (400ˑ);D.A d i p o ge n e s i s r e l a t e d g e n e e x p r e s s i o n ;E .T h e r e l a t i v em R N Ae x p r e s s i o nof P P A R γ;F .P r o t e i ne x pr e s s i o no fP P A R γ图5 干扰m i R -27a -3p 促进乳腺上皮细胞的脂肪合成F i g .5 I n t e r f e r i n g w i t hm i R -27a -3pp r o m o t e s l i p o g e n e s i s i nb o v i n em a m m a r y e pi t h e l i a l c e l l s 步,Y a n g 等[27]通过对奶牛干奶期和泌乳期乳腺组织进行高通量R N A 测序,鉴定出3746个差异表达的l n c R N A s ;M u m t a z 等[28]对不同产奶量奶牛的乳腺组织测序鉴定出45个差异表达的l n c R N A s,但l n c R N A 功能及作用机制还有待进一步深入研究解析㊂鉴于此,本研究在前期测序的基础上研究l n c R N A -L R T N 4R L 1-A S 对乳腺上皮细胞乳脂合成的作用及其机制㊂本研究发现,干扰l n c R N A -L R T N 4R L 1-A S 抑制脂滴形成和甘油三酯的积累,同时显著下调了乳脂合成相关基因(C E B P α㊁C E B P β和P P A R γ)和上调了脂质分解的基因(H S L )的表达㊂C C A A T/增强3741Copyright ©博看网. All Rights Reserved.4741畜牧兽医学报54卷A.油红O染色(400ˑ);B.甘油三酯的含量;C.L R T N4R L1-A S相对表达量;D.m i R-27a-3p相对表达量;E.P P A Rγ基因相对表达量;F.P P A Rγ蛋白表达㊂N C组为s i R N A-N C+i n h i b i t o r-m i R-N C,干扰m i R-27a-3p组为s i R N A-N C+i n h i b i t o r-m i R-27a-3p,干扰L R T N4R L1-A S组为s i R N A-L R T N4R L1-A S+i n h i b i t o r-m i R-N C,共转组为s i R N A-L R T N4R L1-A S+i n-h i b i t o r-m i R-27a-3p㊂同一个图中所标字母相异表示差异显著(P<0.05),所标字母相同表示差异不显著(P>0.05) A.O i lR e dOs t a i n i n g(400ˑ);B.T h ec o n t e n to f t r i g l y c e r i d e s;C.R e l a t i v ee x p r e s s i o no fL R T N4R L1-A S;D.R e l a t i v e e x p r e s s i o no fm i R-27a-3p;E.R e l a t i v e e x p r e s s i o n o f P P A Rγ;F.P r o t e i n e x p r e s s i o n o f P P A Rγ.T h eN C g r o u p i s s i R N A-N C+ i n h i b i t o r-m i R-N C,t h ei n t e r f e r i n g m i R-27a-3pg r o u p i ss i R N A-N C+i n h i b i t o r-m i R-27a-3p,t h ei n t e r f e r i n g L R T N4R L1-A S g r o u p w a s s i R N A-L R T N4R L1-A S+i n h i b i t o r-m i R-N C,a n d t h e c o t r a n s f o r m a t i o n g r o u p w a s s i R N A-L R T N4R L1-A S+i n h i b i-t o r-m i R-27a-3p.I n t h e s a m e f i g u r e,t h em a r k e d d i f f e r e n t l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05),b u t t h e s a m e l e t t e r i n d i c a t en o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05)图6共同转染L R T N4R L1-A S与m i R-27a-3p对乳腺上皮细胞的脂肪合成影响F i g.6E f f e c t o f c o t r a n s f e c t i o no fL R T N4R L1-A S a n dm i R-27a-3p o n l i p o g e n e s i s i nb o v i n em a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l sCopyright©博看网. All Rights Reserved.4期贾鸿儒等:L R T N4R L1-A S通过m i R-27a-3p靶向P P A Rγ调节奶牛乳腺细胞乳脂合成子结合蛋白(C E B P)是乳脂合成过程中的重要转录因子,可以通过激活P P A Rγ的表达从而调节脂肪细胞的脂滴形成,是脂肪生成过程有丝分裂克隆扩增所必须的基因,在乳脂合成中发挥关键的作用㊂过氧化物酶体增殖物激活受体γ(P P A Rγ)是P P A R 家族成员,是脂肪合成的关键调节剂,作为激活剂启动脂肪分化[29-30]㊂在干扰P P A Rγ后能够显著降低脂肪细胞分化[31]与甘油三酯含量[32-33],且有研究发现其参与了乳脂的合成调节㊂激素敏感性脂肪酶(H S L)是最早发现的脂质分解基因,影响脂肪细胞功能,促进甘油二酯水解[34],同时L i u等[35]发现, H S L可以减少脂肪细胞中的脂质形成㊂表明l n c R N A-L R T N4R L1-A S通过正向调控乳脂合成相关基因C E B Pα㊁C E B Pβ和P P A Rγ的表达促进乳脂合成,同时负调控脂质分解基因H S L的表达抑制脂质分解,进而促进乳脂合成㊂本试验通过核质分离发现,L R T N4R L1-A S主要位于细胞质中,研究发现L R T N4R L1-A S和m i R-27a-3p之间存在靶向结合关系,而前期研究表明位于细胞质中的l n c R N A可以作为海绵分子与m i R N A竞争性的结合调控靶基因的表达使其发生相应的表型变化[36],表明L R T N4R L1-A S可能通过与m i R-27a-3p结合发挥其功能作用㊂进一步研究发现,m i R-27a-3p对乳腺上皮细胞脂滴形成和甘油三酯的积累具有负调控作用,与现有研究结果一致[37-38],而且前期已有研究表明P P A Rγ是m i R-27a-3p的靶基因,m i R-27a-3p可以通过靶向P P A Rγ影响大脑发育[39-40]㊁耐药性和糖代谢[41-43],特别是已有研究表明m i R-27a-3p负调控P P A Rγ参与奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成[33];此外,本研究证实,i n h i b i t o r-m i R-27a-3p逆转了干扰L R T N4R L1-A S对乳脂合成的抑制作用,同时降低了干扰L R T N4R L1-A S对P P A Rγ基因的表达抑制,表明L R T N4R L1-A S通过与m i R-27a-3p结合靶向P P A Rγ调控奶牛乳腺上皮细胞的乳脂合成㊂4结论本研究揭示新的l n c R N A-L R T N4R L1-A S通过竞争性结合b t a-m i R-27a-3p调控P P A Rγ的表达来调节乳脂合成,为后续深入研究乳腺上皮细胞脂肪合成分子机制提供了理论基础㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B I O N A Z M,L O O RJ J.G e n e n e t w o r k s d r i v i n g b o v i n em i l k f a t s y n t h e s i s d u r i n g t h e l a c t a t i o nc y c l e[J].B M CG e n o m i c s,2008,9:366.[2]J IH,E R F A N I N,T A U R O BJ,e ta l.D i f f e r e n c e g e le l e c t r o p h o r e s i s a n a l y s i s of R a s-t r a n s f o r m e d f i b r o b l a s tc e l l-de r i v e de x o s o m e s[J].E l e c t r o p h o r e s i s,2008,29(12):2660-2671.[3]母童,虎红红,冯小芳,等.功能性非编码R N A调控反刍家畜乳脂代谢的研究进展[J].中国农业大学学报,2021,26(6):80-89.MU T,HU H H,F E N GXF,e t a l.R e s e a r c h p r o g r e s so ff u n c t i o n a l n o n-c o d i n g R N A r e g u l a t i n g m i l k f a tm e t a b o l i s m i n r u m i n a n t s[J].J o u r n a lo f C h i n aA g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,2021,26(6):80-89.(i nC h i n e s e)[4] N A Y L O R MJ,O A K E SSR,G A R D I N E R-G A R D E NM,e t a l.T r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s u n d e r l y i n g t h es e c r e t o r y a c t i v a t i o n p h a s e o f m a m m a r y g l a n dd e v e l o p m e n t[J].M o l E n d o c r i n o l,2005,19(7):1868-1883.[5] Z HA N G L,WU Z Q,WA N G Y J,e ta l.M i R-143r e g u l a t e s m i l kf a ts y n t h e s i sb y t a r g e t i n g S m a d3i nb o v i n em a m m a r y e p i t h e l i a lc e l l s[J].A n i m a l s,2020,10(9):1453.[6] Y A N G W C,G U O W L,Z A N L S,e ta l.B t a-m i R-130a r e g u l a t e s t h eb i o s y n t h e s i so fb o v i n em i l kf a tb yt a r g e t i n g p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r-a c t i v a t e d r e c e p t o rg a m m a[J].JA n i mS c i,2017,95(7):2898-2906.[7] Z HA N G Y Y,F A N X Y,Q I U L H,e ta l.L i v e rXr e c e p t o rαp r o m o t e s m i l k f a ts y n t h e s i si n b u f f a l om a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l sb y r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o no f F A S N[J].J D a i r y S c i,2021,104(12):12980-12993.[8]陈存仙.山羊乳腺分泌上皮细胞单克隆培养及m i R-200c对A C A C A基因靶向调控研究[D].泰安:山东农业大学,2014.C H E N C X.S i n g l e-c e l l c l o n a l c u l t u r e o f g o a tm a m m a r y s e c r e t o r y e p i t h e l i a l c e l l s a n d t a r g e t i n gr e g u l a t i o no f A C A C A g e n eb y m i R-200c[D].T a i a n:S h a n d o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,2014.(i nC h i n e s e)[9] MU T,HU H H,MA Y F,e ta l.R e g u l a t i o no fk e yg e n e s f o r m i l kf a ts y n t h e s i si nr u m i n a n t s[J].F r o n tN u t r,2021,8:765147.[10] L IZ,L U S,C U IK,e t a l.F a t t y a c i db i o s y n t h e s i s a n dt r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o no fS t e a r o y l-C o A D e s a t u r a s e1(S C D1)i nb u f f a l o m i l k[J].B M C G e n e t,2020,21(1):23.[11]段安琴,陆杏蓉,马小娅,等.L P I N1基因对水牛乳腺5741Copyright©博看网. 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