中国药典2010年版无菌检查及发展趋势
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《中国药典2010年版(二部) 概况
凡例的增修订情况
正 文
• 八、正文系根据药物自身的理化与生物学特性，按照批准的处方来源、 生产工艺、贮藏条件等所制定的、用以检测药品质量是否达到用药要求 并衡量其质量是否稳定均一的技术规定。
附 录
• 十、附录主要收载制剂通则、通用检测方法和指导原则。制剂通则系按 照药物剂型分类，针对剂型特点所规定的基本技术要求；通用检测方法 系各正文品种进行相同检查项目的检测时所应采用的统一的设备、程序、 方法及限度；指导原则系为执行药典、考察药品质量、起草与复核药品 标准等所制定的指导性规定。
应在后续的生产环节予以有效去除。除正文已明确列
有“残留溶剂”检查的品种必须依法进行该项检查外，
其他未在“残留溶剂”项下明确列出的有机溶剂与未 在正文中列有此项检查的品种，如生产过程中引入或 产品中残留有机溶剂，均应按本版药典附录“残留溶 剂测定法”检查并应符合相应溶剂的限度规定。
药典标准—体现高质量药品
合国家有关的管理规定。 （3）来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确，所用脏 器均应来自经检疫的健康动物，涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区
的健康牛群；来源于人尿提取的药品，均应取自健康人群。上述药品均
应有明确的病毒灭活工艺要求以及质量管理要求。
凡例的增修订情况
项目与要求
• 十七、（第二段）对于生产过程中引入的有机溶剂，
各论的增修订情况（1）：名称与性状
药品通用名称 （制剂）
规范并真正反映药品的组成和剂型特点，明确了剂型的亚类，与制剂 通则一致。 将胶丸统一修改为软胶囊 硫糖铝片改硫糖铝咀嚼片。 替硝唑注射液（均为大容量规格）改名为替硝唑氯化钠注射液 把甲硝唑注射液中大容量规格改名为甲硝唑氯化钠注射液
2010年版药典微生物限度检查法
附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。
中国药品检验标准操作规范2010年版104无菌检查法
无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常验证还需对试验环境进行监控。
菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
第一部分准备及保障1 洁净室（区）的要求无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。
无菌加查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
洁净室（区）应采光良好、避免潮湿。
远离厕所及污染区。
由1~2个缓冲间和操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。
在缓冲间内应有拖鞋、无菌衣放置架和挂钩等，缓冲间可设手消毒设备，不应放置培养箱和其他杂物；洁净室（区）内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间和缓冲间内不应安装下水道。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18~26℃，相对湿度40%~60%。
中国药典2010无菌检查法
液悬菌的?位单成形落菌?ufc001于小数菌含lml每成制液溶钠化氛?90用物养培述上?时小84?42养培52?02?上基养培脂琼丁马良改或中基养培丁马良改至物养培鲜新的菌珠念色白种接?时小42?81养培53?03?中基养培体流盐酸醇乙硫至物养培鲜新的菌梭孢生种接?上基养培脂琼养营或中基养培汤肉养营至物养培鲜新的菌杆孢芽草枯菌胞单假绿铜菌球萄葡色黄金种接备制液菌30089fccmcreginnsulligrepsa?霉曲黑?l0089fccmcsnaciblaadidnac?菌珠念色白14946bccmc?senegoropsmuidirtsolc?菌梭孢生10536bccmcsilitbussullicab?菌杆孢芽草枯?40101bccmcasonigureasanomodues?菌胞单假绿铜?30062bccmc??sueruasuccocolyhpats?菌球萄葡色黄金?性特学物生的株菌验试证保以?存保行进术技藏保种菌的宜适用采应种菌用验试??代o第为种菌燥干冻冷的得获心中藏保种菌从?代5过超得不数次代传株菌的用所查检度敏灵基养培种菌查检度敏灵
装管每基养培丁马良改� lm51于少不量装管每基养培体流盐酸醇乙硫�时同�%01的积体基 养培于大得不�积体品试供的种接合符应量用的基养培中器容个每�外定规有另除。 ) 1:2为 比之数瓶或数支种接的基养培种 2�中基养培丁马良改和基养培体流盐酸醇乙硫至种接别分 量等 �品试供量定规取。品试供的查检菌无行进法滤过膜薄用法无于用适法种接接直 法种接接直�2 。查检菌无的头针菌无的带配所中装包行进法种接接直用采应时同 。作操法方下项品试供性溶水按后然 �滤过即立�匀混�内器容菌无的液释稀量适含至合混或�滤过接直�解溶剂溶的示所签标 或液释稀人吸可要需若�物容内的中器射注将�量定规取 品试供器射注的物药有装 。作操法方的下项品试供剂制性溶水非或液溶水照后然�中器容菌无至 移转液溶品试供将并�器容启开菌无再后剂射抛放释�孔小一钻端上器容在速迅作操菌无以 。时小 1约冻冷室冰的 ℃ 02-少至置器容各将�量定规取 品试供剂雾�喷�气菌无 。作操法方的下项品试供性溶水非照基养培入加及洗冲膜滤后滤过 。滤过液溶品试供为作相水层下取�置静�取萃摇振分充�液释稀的 lm001于少不入加中液溶 品试供的中酯丙异酸烷四十菌无的量适有含于�品试供的滤过法无然仍对。滤过速迅热趁并 � ℃ 44过超得不度温但 �热加当适可要需果如 。解溶分充品试供使 �摇振烈剧 �中酯丙异酸烷 四十菌无的量适至合混 �量定规取 品试供剂油性黏和剂膏的酯丙异酸烷四十于溶可 。作操法 方的下项品试供液溶水照他其。基养培的 08酯梨山聚含不或含入加。次 3于少不般一数次洗 冲�膜滤洗冲液洗冲的 08酯梨山聚� 1� % 1.0含用。滤过即立�合混分充�内器容菌无的 lm003液释稀的剂化乳宜适他其或 08酯梨山聚含于溶合混 �量定规取 品试供性溶水非 。作操法方的下项品试供液 溶水照后然 �溶复明说签标按或解溶液释稀的宜适加 �量定规取 品试供体固性溶水 。 lm001基养培丁马良改 入加中器滤一另� lm001各基养培体流盐酸醇乙硫入加中器滤个 2�后洗冲。验试证验法方 同法方洗冲、量洗冲的用所�次 3于少不般一数次洗冲�膜滤洗冲液洗冲用须�剂腐防含或 用作菌抑有具品试供如。滤过即立�匀混�内器容菌无的液释稀量适含至移转部全或�滤过 接直者上以 lm5为量装品试供�瓶�支每�滤过即立�匀混�内器容菌无的 lm001液释稀宜 适含至移转部全�者下以及 lm5为量装品试供�瓶�支每�量定规取 品试供液溶水 。伤损受物生微的上膜滤免避以� lm000l 过超得不量洗冲总� lm001为般一量洗冲 次每膜滤张每�膜滤洗冲液洗冲用要需若�后滤过膜薄经液溶品试供。面表膜滤个整盖粗液 洗冲及液溶品试供持保意注应�率效滤过大最的膜滤挥发为。燥干分充应前用使在器滤过和 膜滤其�品试供类油。膜滤湿润以�滤过液洗冲的量少将先前滤过液溶品试供性溶水 。性整完的后前滤过在膜滤证保应�时用使。质材膜滤择选性特的剂溶 其及品试供据根。 mm05为约径直 mμ54.0于大不应径孔膜滤�器滤过膜薄式闭封用采 法滤过膜薄�1 。行进法方列下按�外定规有另除 基养培种接及理处品试供 。物容内出取�器容开启作操菌无 按再�气空菌无入导内器容向�头针的器滤过菌除有带如�材器菌无的宜适用可�度空真的 定一有内器容品试供果如。毒梢底彻行进面表器容品试供对液毒消的宜适用�时作操 。同相法方的证验与应件条验检和法方查检的用采所查检菌无 的品试供 。法滤过膜薄用采应�许允状性品试供要只。法种接接直和法滤过膜薄括包法查检菌无
装管每基养培丁马良改� lm51于少不量装管每基养培体流盐酸醇乙硫�时同�%01的积体基 养培于大得不�积体品试供的种接合符应量用的基养培中器容个每�外定规有另除。 ) 1:2为 比之数瓶或数支种接的基养培种 2�中基养培丁马良改和基养培体流盐酸醇乙硫至种接别分 量等 �品试供量定规取。品试供的查检菌无行进法滤过膜薄用法无于用适法种接接直 法种接接直�2 。查检菌无的头针菌无的带配所中装包行进法种接接直用采应时同 。作操法方下项品试供性溶水按后然 �滤过即立�匀混�内器容菌无的液释稀量适含至合混或�滤过接直�解溶剂溶的示所签标 或液释稀人吸可要需若�物容内的中器射注将�量定规取 品试供器射注的物药有装 。作操法方的下项品试供剂制性溶水非或液溶水照后然�中器容菌无至 移转液溶品试供将并�器容启开菌无再后剂射抛放释�孔小一钻端上器容在速迅作操菌无以 。时小 1约冻冷室冰的 ℃ 02-少至置器容各将�量定规取 品试供剂雾�喷�气菌无 。作操法方的下项品试供性溶水非照基养培入加及洗冲膜滤后滤过 。滤过液溶品试供为作相水层下取�置静�取萃摇振分充�液释稀的 lm001于少不入加中液溶 品试供的中酯丙异酸烷四十菌无的量适有含于�品试供的滤过法无然仍对。滤过速迅热趁并 � ℃ 44过超得不度温但 �热加当适可要需果如 。解溶分充品试供使 �摇振烈剧 �中酯丙异酸烷 四十菌无的量适至合混 �量定规取 品试供剂油性黏和剂膏的酯丙异酸烷四十于溶可 。作操法 方的下项品试供液溶水照他其。基养培的 08酯梨山聚含不或含入加。次 3于少不般一数次洗 冲�膜滤洗冲液洗冲的 08酯梨山聚� 1� % 1.0含用。滤过即立�合混分充�内器容菌无的 lm003液释稀的剂化乳宜适他其或 08酯梨山聚含于溶合混 �量定规取 品试供性溶水非 。作操法方的下项品试供液 溶水照后然 �溶复明说签标按或解溶液释稀的宜适加 �量定规取 品试供体固性溶水 。 lm001基养培丁马良改 入加中器滤一另� lm001各基养培体流盐酸醇乙硫入加中器滤个 2�后洗冲。验试证验法方 同法方洗冲、量洗冲的用所�次 3于少不般一数次洗冲�膜滤洗冲液洗冲用须�剂腐防含或 用作菌抑有具品试供如。滤过即立�匀混�内器容菌无的液释稀量适含至移转部全或�滤过 接直者上以 lm5为量装品试供�瓶�支每�滤过即立�匀混�内器容菌无的 lm001液释稀宜 适含至移转部全�者下以及 lm5为量装品试供�瓶�支每�量定规取 品试供液溶水 。伤损受物生微的上膜滤免避以� lm000l 过超得不量洗冲总� lm001为般一量洗冲 次每膜滤张每�膜滤洗冲液洗冲用要需若�后滤过膜薄经液溶品试供。面表膜滤个整盖粗液 洗冲及液溶品试供持保意注应�率效滤过大最的膜滤挥发为。燥干分充应前用使在器滤过和 膜滤其�品试供类油。膜滤湿润以�滤过液洗冲的量少将先前滤过液溶品试供性溶水 。性整完的后前滤过在膜滤证保应�时用使。质材膜滤择选性特的剂溶 其及品试供据根。 mm05为约径直 mμ54.0于大不应径孔膜滤�器滤过膜薄式闭封用采 法滤过膜薄�1 。行进法方列下按�外定规有另除 基养培种接及理处品试供 。物容内出取�器容开启作操菌无 按再�气空菌无入导内器容向�头针的器滤过菌除有带如�材器菌无的宜适用可�度空真的 定一有内器容品试供果如。毒梢底彻行进面表器容品试供对液毒消的宜适用�时作操 。同相法方的证验与应件条验检和法方查检的用采所查检菌无 的品试供 。法滤过膜薄用采应�许允状性品试供要只。法种接接直和法滤过膜薄括包法查检菌无
2010版中国药典
1019
634
2165
1146
《中国药典》发展与展望
2010版药药典二部化药增收15.4％，辅料增收86%
2005版收载 1970
新增品种 修订品种 2010版收载
330
1500
2271
其中（辅料） 72
62
52
132
《中国药典》发展与展望
2010版药药典三部（生物制品）增收29.7％
类别
收载总数
140
新增 14 15 18
修订
2010版 收载
47
112
69
152
39
149
《中国药典》发展与展望
中国药典2010版概况
管理创新 强化系统性、规范性、基础性工作
标准验证和复核;一般检查项目的增补和完善；中药材拉丁名词序 变更；规范功能与主治等。
注重体现中药 特色，表达中药特点
重视中药材与中药材饮片标准，注重质量控制的专属性，一测多 评技术，多指标成分定量；特征和指纹图谱技术的应用。
2010版中国药典概述来自010版中国药典一、 《中国药典》发展与展望 二、 《中国药典》2010年版通用检测方法和指导原则 三、 2010年版中国药典凡例附录简介 四、 《中国药典》 2010年版一部增修订情况简介 五、 《中国药典》2010年版药用辅料概述 六、 《中国药典》2010年版无菌检查和微生物限度检查部分增修订内容
新增品种
修订品种
未收载 2010版收载
3217
1386(43%) 2237（70%） 36
4567
《中国药典》发展与展望
2010版药药典品种收载情况
内容
新增
修订 2010年版 2005年版
2010年版《中国药典》
Other Controlled Environments
<1117>Microbiological Best Laboratory Practices
<1223>Validation of Alternative Microbiological Methods
2010版微生物检验方法增修订要点
药品微生 物实验室 规范指导
关于微生物限度检查法应用指导原则
4）、对照培养基概念、用途及分发： 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质 量优良的培养基，用于培养基适用性检查。 由中国药品生物制品检定所研制及分发。
5）、方法验证试验时没有适宜的方法消除供试 品中的抑菌作用怎么办？ 更高稀释级的选择及原则 最接近要求的方法及进行风险评估的要求
• 药品质量事故高发期，如何快速、准确地获得 检验结果，又是对当前药品微生物检验工作的 一个挑战。
• 对事件的反思正在逐步深入，深化微生物控制 及检验的监管措施正在陆续推出。
微生物重点实验室建设
增强系统能力 应对应急检验
2009年4月23日中检所会同北京、天津、上海、黑龙江、江苏、浙江、广州、四 川、总后等九家药检所的主管业务所长及微生物检验部门负责人在浙江省杭州市 首次对药品检验所微生物检验重点实验室的建设问题开展研讨。
目的：在生产过程中添加适合的防腐剂以保证药 品的质量，为保证药品的质量和用药安全，添 加防腐剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性， 保持最低有效量。防腐剂效力的测定可使生产 者正确掌握产品中添加防腐剂的效力，有助于 选择合适的防腐剂，也可对防腐剂使用的正确 性给予评价。
关于抑菌效力检查法指导原则
• 设计实验方案； • 验证计数测定方法； • 制备浓菌液（108cfu/ml）； • 原包装接种； • 立即计数与第7、14、28天计数； • 计数结果的常用对数值比较； • 结果判断。
02 2010年版《中国药典》微生物检查法
11
2010年版微生物限度检查法修订
9、附录109页，修订：供试品检查（法） • （取按验证的方法制备的均匀供试液，）按计数方法的验 证试验确认的程序进行供试液制备。用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释成1∶10、1∶102、1∶103等稀释级。 • 1.平皿法 • （采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀 释级的供试液。）
10
2010年版微生物限度检查法修订
8、附录109页，增加： • 若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物 回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品 不能被试验菌污染。然而，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作 用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物 限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用 能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试 验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试 品检验。 • 计数方法验证时，若采用上述计数方法总存在一株或多株试验菌的回 收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进 行供试品的检测。
16
二、培养基适用性实验的实施与操作
• 1.计数培养基的适用性检查
（一）应用范围;细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适 用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培 养基均应检查。 （二）菌种及菌液制备 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从 菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕 白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕 黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕 菌液制备同微生物限度检查方法学验证
无菌检查法2010
无菌检查法
无菌检查的定义
中国药典2010年版对无菌检查的定义是：无菌 检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种 方法。 由于无菌是一个相对的概念，因此，对无菌检 查的结果应该有一个正确的认识－即产品通过 无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品 未发现有微生物污染，并不表示所有的产品都 是无菌的。 反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认 为批产品的微生物污染风险相当高。
18
物品表面微生物样本的采集：
采用拭子涂抹取样的方式采样。当人体表面微生物 样本采集完毕后，取拭子，采集直接接触药品的包 装容器表面和瓶塞、瓶盖等处的微生物样本，应选 取不少于3个采样点；取拭子，对集菌过滤器、稀释 剂、冲洗剂等外表面进行微生物采样，每种不少于3 个采样点。拭子按使用说明书的要求立即释放微生 物，并尽快加入培养基。采样完毕后，应使用消毒 剂清洁被采样表面。
12
人流、物流程序
物流 取塑料筐数个，内外表面均用适宜消毒剂消毒后 （普通区使用的消毒剂），备用。从样品室取规定 量的注射剂产品，用消毒剂消毒外包装后，放入塑 料筐中。将灭菌好的物品从灭菌器内取出后，放入 塑料筐中。取集菌过滤器、环境微生物采集器材、 稀释剂、冲洗剂和洁净室内用消毒剂，消毒外表面 后，放入塑料筐中。上述物品在控制区内转移入洁 净室的传递窗内，其中样品需要脱去外包装。打开 传递窗内的紫外灯，照射不少于0.5小时。
22
方法验证的具体操作： 例、薄膜过滤法无菌检查方法的验证
23
例1、薄膜过滤法无菌检查方法的验证 一、目的 考察薄膜过滤法无菌检查的有效性， 确定供试品的稀释浓度，冲洗剂的种类、 用量和冲洗方式以及阳性对照菌 二、供试品 薄膜过滤法检验数量为20瓶，分别接 种每种培养基。验证时的检验量应从全 量开始。
无菌检查的定义
中国药典2010年版对无菌检查的定义是：无菌 检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种 方法。 由于无菌是一个相对的概念，因此，对无菌检 查的结果应该有一个正确的认识－即产品通过 无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品 未发现有微生物污染，并不表示所有的产品都 是无菌的。 反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认 为批产品的微生物污染风险相当高。
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物品表面微生物样本的采集：
采用拭子涂抹取样的方式采样。当人体表面微生物 样本采集完毕后，取拭子，采集直接接触药品的包 装容器表面和瓶塞、瓶盖等处的微生物样本，应选 取不少于3个采样点；取拭子，对集菌过滤器、稀释 剂、冲洗剂等外表面进行微生物采样，每种不少于3 个采样点。拭子按使用说明书的要求立即释放微生 物，并尽快加入培养基。采样完毕后，应使用消毒 剂清洁被采样表面。
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人流、物流程序
物流 取塑料筐数个，内外表面均用适宜消毒剂消毒后 （普通区使用的消毒剂），备用。从样品室取规定 量的注射剂产品，用消毒剂消毒外包装后，放入塑 料筐中。将灭菌好的物品从灭菌器内取出后，放入 塑料筐中。取集菌过滤器、环境微生物采集器材、 稀释剂、冲洗剂和洁净室内用消毒剂，消毒外表面 后，放入塑料筐中。上述物品在控制区内转移入洁 净室的传递窗内，其中样品需要脱去外包装。打开 传递窗内的紫外灯，照射不少于0.5小时。
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方法验证的具体操作： 例、薄膜过滤法无菌检查方法的验证
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例1、薄膜过滤法无菌检查方法的验证 一、目的 考察薄膜过滤法无菌检查的有效性， 确定供试品的稀释浓度，冲洗剂的种类、 用量和冲洗方式以及阳性对照菌 二、供试品 薄膜过滤法检验数量为20瓶，分别接 种每种培养基。验证时的检验量应从全 量开始。
微生物(无菌)检查讲义
2010年无菌、微生物限度检查培训班讲义《中国药典》2010年版微生物限度（无菌）检查新增修订情况2010年版《中国药典》为建国以来的第九版药典。
2007年底开始工作，2010元月正式出版，2010年10月1日起实施（中华人民共和国卫生部公告（第5号））国家局、国家药典委员会、 120多家参与单位、数百位专家第一部分：无菌检查的新增修订前言部分1、新增规定：“防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
”2、新增规定：“日常检验还需要对环境进行监控。
”3、新增规定：“无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基部分1、删除：1. 硫乙醇酸盐流体培养基后括号（用于培养好氧菌、厌氧菌）的说明2、删除：2. 改良马丁培养基后括号（用于培养真菌）的说明3、删除：3. 选择性培养基项下加入适量中和剂或表面活性剂后面的“如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶（用于β-内酰胺类供试品）¡±等说明。
修订为：在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
(中和剂、灭活剂见微生物限度检查法中表1）4、将原第 6. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）修订排列为第 4. ——按顺序排列归类培养基1.～4. 均为直接用于无菌检查的液体培养基。
培养基灵敏度检查部分1、修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法：规定应使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，洗脱孢子及稀释孢子液，制成每1ml中含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）吸出孢子悬液的操作方法2、新增加稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限：“菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～8℃，在验证过的贮存期内使用。
无菌检查法-2010版中国药典
附录Ⅻ A 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10 000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基培养基的制备培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2℃～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液 1.0 ml硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g(或硫乙醇酸) （0.3 ml) 水1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1 ±0.2 。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2 ，灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ，否则，须经100 ℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
2.改良马丁培养基胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g 水1000 ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 值约为6.8 ，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH 值使灭菌后为6.4 ±0.2 ，分装，灭菌。
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干扰物
戊二醛 酚类、乙醇、吸附物
醛类 季铵类化合物（QACs）、对
羟基苯甲酸酯 汞类制剂
双胍类化合物 碘酒、洗必泰类
卤化物 乙二胺四乙酸（EDTA）
磺胺类 ß-内酰胺类抗生素
可选用的中和剂或灭活方法 亚硫酸氢纳 稀释法
稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 卵磷脂、聚山梨酯
亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 卵磷脂 聚山梨酯
通过系统的方法验证促进我国药品微生物检查 标准化建设。
2005年版药典的执行在全国引起了巨大反响！
无菌检查方法学验证回顾
药品微生物检查中的验证试验做一回顾，
主要涉及三个方面内容：
为什么验证？
验证的思路 ？
怎样验证？
为什么验证？
① 采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本要 求，是各种法规遵循的工作基础。
2010年版中国药典一、二、三部的 无菌检查法基本延续2005年版。
2010年版中国药典三部逐渐向一、 二部看齐。
增、修订涉及范围
前言部分 培养基部分 培养基灵敏度检查 稀释液、冲洗液 方法验证 薄膜过滤法 培养及观察 结果判断 表1、表2和表3
前言部分
✓新增规定：“防止污染的措施不得影响供试 品中微生物的检出。”
硫代硫酸盐 镁或钙离子 对氨基苯甲酸 ß-内酰胺酶
培养基部分
✓将原第 6. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸 链霉素等抗生素的无菌检查） 修订排列为第 4. ——按顺序排列归类培养基1.～4. 均为直接 用于无菌检查的液体培养基。
培养基灵敏度检查
修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法： 规定应使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％ 无菌氯化钠溶液，洗脱孢子及稀释孢子液，制成 每1ml中含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
剂后面的 “ 如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品） 、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶 （用于β-内酰胺类供试品）”等说明。 修订为：在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、 灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
(中和剂、灭活剂见微生物限度检查法中表1）
表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
供试品的的无菌检查-2
薄膜过滤法：
1、新增规定：抗生素供试品应选择低吸附的 滤器及滤膜
2、新增规定：对每片滤膜的总冲洗量不得过 1000ml
✓新增规定：“日常检验还需要对环境进行监 控。”
✓新增规定：“ 无菌检查人员必须具备微生物 专业知识，并经过无菌技术的培训。”—— 对无菌检查的人员资质提出了要求
培养基部分
✓ 删除了硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧 菌的规定
✓ 删除了改良马丁培养基用于培养真菌的规定 ✓ 删除了选择性培养基项下加入适量中和剂或表面活性
供试品的无菌检查-1
✓1、阳性对照用量：
2005年版：“若采用直接接种法，应增加供 试品1支（或瓶）作阳性对照用。”
2010年版修订为 ：若采用直接接种法，应增 加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样 品量作阳性对照用。
——因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法， 若是固体制剂每管接种量可能不止1支（或瓶 ），应按验证的方法确定。
⑤ 验证也是实验室质量控制的手段。
验证的思路 ？-1
验证体系：阴性对照、阳性对照、微生物 挑战试验；
通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的 活性来检验微生物的方法，应通过验证， 以确定所用检验方法测定结果的可信度；
验证的思路 ？-2
利用供试品与微生物的差异，降低或消除 供试品的影响，通过模拟实验对降低或消 除效果加以检验；
稀释液、冲洗液及其制备方法
在原有—— 1. 0.1%蛋白胨水溶液 —— 2. pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
的基础上新增加： “可根据供试品的特性，选用其他经验证的
适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。”
方法验证试验
1、验证试验用菌种及菌液制备在培养基 灵敏度所用菌种的基础上，删除了铜绿 假单胞菌，增订了大肠埃希菌。
② 验证的理念其实早已贯穿微生物 检查方法的验证进行了系统化的规定和要求。
④ 有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性菌 选择不合理，而造成的漏检与误判，这一点无论对于 当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认可、 以其新的药品注册管理办法的要求都是一致的。
中国药典2010年版无菌 检查及发展趋势
中国医药教育协会 2010年4月29日
WHO的GMP中验证的定义：能证 明任何程序、工艺、设备、物料、 活动或系统，确实能导致预期结果 文件的证明行为。
无菌检查法的现状 及方法学验证回顾
无菌检查现状
2005年版药典重大变化之一是对方法验证进行 了系统的规定；这是我国药品微生物检查方法 迈向科学化、合理化的一个重要标志。
——是因在验证试验的实践中，发现作 为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌 在验证试验中对大部分抗生素不敏感， 而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主 的抗生素敏感性较好。
2、验证试验中样品用量的规定：
删除了原：“ 将规定量供试品按… ”
2010年版修订为： 薄膜过滤法验证试验样品量： “ 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜 过滤法过滤。” 直接接种法验证试验样品量： “…其中1管接入每支培养基规定量的供试品量，” —— 明确了验证试验所需样品量是供试品的检 验量而不是供试品的检验数量。
依据抗菌谱通过预实验确定敏感菌株（阳 性对照菌） 通过敏感菌株确定冲洗量 通过方法验证验证该取样量以及冲洗量下 敏感菌株生长情况 确定试验方案进行 检验。
无菌/微生物限度检查理念
环境保证
培养基保证
无菌性检查 灵敏度检查
SOP操作
有效的方法
方法验证
有效的结果 可靠的结论
结果判断
2010版中国药典无菌 检查法的主要增修订情况
删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过 滤菌丝的无菌毛细吸管） 吸出孢子悬液的操作方
法。
培养基灵敏度检查
新增加稀释后的工作用菌液的保存条件和保 存期限：“菌液制备后若在室温下放置，应 在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小 时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～ 8℃，在验证过的贮存期内使用。”