实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质

葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。

分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。

一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。

这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。

2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。

四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。

2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。

3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。

4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。

五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。

葡聚糖凝胶柱的特点
葡聚糖凝胶柱是一种常用的色谱柱，用于分离和纯化生物大分子，如蛋白质、核酸和多糖等。

它具有以下几个特点：
1. 大孔结构：葡聚糖凝胶柱内部存在着大量的孔隙，这些孔隙可以提供足够的表面积和空间来容纳样品分子。

这种大孔结构使得样品分子可以在柱内自由扩散和迁移，从而实现有效的分离。

2. 选择性：葡聚糖凝胶柱的选择性主要取决于其孔径大小和孔隙结构。

不同孔径的葡聚糖凝胶柱可以用于分离不同大小的生物大分子。

较大孔径的葡聚糖凝胶柱适用于分离较大分子，而较小孔径的葡聚糖凝胶柱适用于分离较小分子。

3. 高效性：葡聚糖凝胶柱由于具有大孔结构和选择性，可以提供高效的分离和纯化。

样品分子可以在柱内快速扩散和迁移，从而实现高效的分离。

此外，葡聚糖凝胶柱还具有较高的样品加载容量，可以处理大量样品。

4. 稳定性：葡聚糖凝胶柱具有良好的化学和物理稳定性。

它们可以在不同的溶剂和温度下使用，并且可以承受较高的压力。

这种稳定性使得葡聚糖凝胶柱可以在多种条件下进行分离和纯化。

5. 可重复使用：葡聚糖凝胶柱可以反复使用。

在使用后，可以通过适当的清洗和再生方法将其恢复到初始状态，以便下一次使用。

葡聚糖凝胶柱在生物分离和纯化领域具有广泛的应用。

它们常用于蛋白质和核酸的分离和纯化，如蛋白质层析、核酸净化和多糖分析等。

葡聚糖凝胶柱的特点使其成为生物大分子分离和纯化的重要工具，为科学研究和生物制药提供了有力支持。

葡聚糖凝胶使用说明书一、产品名称产品名称：葡聚糖凝胶型号：Gel-300二、适用范围葡聚糖凝胶适用于生物实验室、化学实验室、制药厂等场所，用于分离、纯化蛋白质、核酸、肽类等生物分子。

三、使用方法1. 准备葡聚糖凝胶和缓冲液。

根据所需的分离纯化效果，选择合适的缓冲液类型和浓度。

2. 将缓冲液加入玻璃柱或层析柱中，直至填满整个柱子。

3. 加入适量的葡聚糖凝胶，使其均匀分布在柱子的底部。

4. 将样品溶液缓慢地加入柱子中，注意不要过快，以免影响分离效果。

5. 收集洗脱液，并进行分析。

根据分离纯化的目的，可以采用不同的收集方法，如分步收集或集中收集。

6. 在每次使用后，及时清洗和保存凝胶柱，以延长其使用寿命。

四、注意事项1. 在使用葡聚糖凝胶前，应仔细阅读本说明书并遵守操作规程。

2. 避免直接接触皮肤和眼睛，若不慎接触，应立即用清水冲洗。

3. 使用过程中要避免剧烈震动或晃动，以免影响分离效果。

4. 在使用前应确认所需缓冲液的种类和浓度是否合适，避免浪费和影响分离效果。

5. 不要使用已经过期或变质的凝胶和缓冲液。

6. 在储存和使用过程中要保持环境干燥，避免潮湿和高温。

7. 使用后要及时清洗和保存凝胶柱，以免被污染和变质。

五、常见问题及解决方案1. 分离效果不佳：可能是由于凝胶或缓冲液质量问题、操作不当等原因引起的。

解决方法是检查凝胶和缓冲液的质量和浓度是否合适，确认操作规程是否正确。

若问题仍未解决，建议更换新的凝胶柱。

2. 柱子压力过高：可能是由于样品溶液中存在杂质或凝胶柱堵塞等原因引起的。

解决方法是检查样品溶液是否含有杂质，或者对样品进行预处理以去除杂质。

同时检查凝胶柱是否堵塞，若堵塞则进行清洗或更换新的凝胶柱。

3. 柱子漏液：可能是由于接头松动或密封圈损坏等原因引起的。

解决方法是重新拧紧接头或更换新的密封圈。

若问题仍未解决，建议联系售后服务与支持部门寻求帮助。

4. 洗脱液中含有杂质：可能是由于样品溶液中存在杂质或缓冲液不纯等原因引起的。

1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。

方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。

在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。

2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。

纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。

去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。

柱太短，影响分离效果。

柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。

层析柱的内径也要选择适当。

内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。

所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。

对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。

凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。

一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。

通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。

3.加样与洗脱（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。

如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。

例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。

一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。

通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。

样品体积过大，分离效果不好。

对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用一、蛋白FITC标记1. 准备FITC溶液：将FITC溶解在适量的溶剂中（如PBS缓冲液），使其浓度为1 mg/ml。

2. 准备蛋白溶液：将待标记的蛋白溶解在PBS缓冲液中，使其浓度为1 mg/ml。

3. 将FITC溶液加入蛋白溶液中：将适量的FITC溶液加入蛋白溶液中，使其FITC蛋白的浓度为10 μg/ml。

溶液要充分混合，可以轻轻摇晃或使用旋转器。

4.反应：将反应溶液在室温下孵育30分钟至1小时。

反应时间可以根据实验需要进行调整。

5.停止反应：将反应溶液加入适量的停止溶液中，如甘氨酸溶液。

停止溶液可以中和未反应的FITC，并保护标记的蛋白不被降解。

6.蛋白FITC标记的纯化：可以通过蛋白层析或其他纯化方法将蛋白FITC标记纯化。

葡聚糖凝胶柱是一种常用的蛋白层析方法，用于分离和纯化蛋白。

1.准备葡聚糖凝胶柱：将葡聚糖凝胶柱放入层析柱中，并用适量的缓冲液（如PBS）均匀填充柱内。

2.样品加载：将待分离的蛋白样品加入层析柱中，样品可以预先进行适当的处理，如去除杂质、调整pH值等。

3.缓冲液洗脱：通过加入适量的缓冲液（如PBS），将未结合的蛋白从凝胶柱中洗脱。

可以通过监测洗脱液的吸光度或测定蛋白浓度来确定洗脱的程度。

4.目标蛋白洗脱：通过加入适量的洗脱缓冲液（如含有高浓度盐的缓冲液），将目标蛋白从凝胶柱中洗脱。

可以根据实验需要选择不同的洗脱条件，如改变盐浓度、改变pH值等。

5.纯化目标蛋白：通过收集洗脱的蛋白样品，可以进行进一步的纯化步骤，如使用其他层析方法、电泳等。

葡聚糖凝胶柱的使用可以根据实验需要进行调整，如选择不同的凝胶柱大小、调整缓冲液成分和流速等。

通过葡聚糖凝胶柱的分离和纯化，可以获得纯度较高的蛋白样品，用于后续的实验分析。

总结：蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是常见的蛋白实验技术。

蛋白FITC标记可以用于检测蛋白的位置和定量，通过将FITC与蛋白共价结合。

一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析技术，对混合物中的不同分子量物质进行分离和纯化。

具体目标包括：1. 掌握凝胶层析的原理和操作步骤。

2. 学习如何根据分子量差异对蛋白质等生物大分子进行分离。

3. 观察和分析实验结果，验证凝胶层析技术的有效性和可行性。

二、实验原理凝胶层析（Gel Filtration）又称分子筛层析，是一种基于分子量差异进行物质分离的方法。

该技术利用凝胶作为固定相，凝胶具有多孔结构，分子量不同的物质在凝胶中的移动速度不同，从而实现分离。

实验中常用的凝胶材料包括葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。

凝胶颗粒的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制。

交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松。

因此，不同型号的凝胶具有不同的分子量分级范围。

实验过程中，将待分离物质加入凝胶柱中，在溶剂的作用下，各组分因分子量差异在凝胶柱中以不同的速度移动。

分子量大的物质在凝胶柱中的移动速度较慢，先流出柱子；而分子量小的物质则可以进入凝胶颗粒的网孔内，移动速度较快，后流出柱子。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 待分离的混合物- 葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）- 洗脱液（例如磷酸盐缓冲液）- 标准蛋白质溶液（例如牛血清白蛋白、肌红蛋白等）- 紫外分光光度计- 凝胶层析柱- 量筒- 移液器- 离心机2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 紫外分光光度计- 移液器- 量筒- 离心机四、实验步骤1. 准备凝胶柱：将葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）用洗脱液充分溶胀，装入凝胶层析柱中。

2. 准备样品：将待分离的混合物用洗脱液稀释，调整蛋白质浓度至适当水平。

3. 加样：将样品加入凝胶柱中，待样品完全进入凝胶柱后，用洗脱液冲洗柱子，直至流出液为无色。

4. 收集洗脱液：用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质浓度，收集不同分子量范围的蛋白质组分。

5. 分析结果：将收集到的蛋白质组分进行SDS-PAGE电泳或Western blot分析，观察蛋白质的分子量和纯度。

实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐（一）目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作技术。

（二）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。

脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。

前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。

凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。

它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。

其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。

网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。

人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。

凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。

分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。

这样被分离物质即被按分子的大小分开。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项葡聚糖凝胶柱是一种常用的色谱柱，其主要由多糖聚合物构成，具有多孔结构以及极高的比表面积。

葡聚糖凝胶柱在生物分离、蛋白质纯化以及分析等方面有重要的应用。

下面将介绍葡聚糖凝胶柱的使用方法以及注意事项，并列举了几种常见溶剂的溶胀系数作为参考。

使用方法：1.预处理：新柱使用前需进行预处理。

首先，在使用前用适当的缓冲液再生柱子，一般推荐使用PBS缓冲液进行再生。

其次，用去离子水进行洗脱，去除缓冲液中的离子。

2.样品准备：准备好带有样品的溶液，可以是蛋白质溶液、核酸溶液或者其他需要分离的溶液。

3.进样：将样品溶液注入到柱子中，可以使用曲线尖管或者注射器进行。

4.溶剂流动：使用适当的流动缓冲液进行柱子的着色，常用的缓冲液有PBS缓冲液、甲醇和乙醇。

5.收集分离的组分：通过收集分离的组分，可以进行后续的实验操作或者分析。

注意事项：1.柱子的平衡：在使用柱子前，将柱子放入合适的缓冲液中，进行平衡处理，通常需要约30分钟。

2.柱子的保管：使用完毕后，需将柱子用适当的缓冲液保存，避免干燥。

3.柱子的温度：柱子的运行温度一般在室温下进行，避免过高温度的使用，以免影响柱子的性能。

4.溶液选择：在选择适当的缓冲液时，应根据样品的性质以及需求进行选择，不同的缓冲液对分离的效果会有影响。

5.柱子的清洗：使用完毕后的柱子需要进行彻底的清洗工作，尤其是对于经常使用的柱子，清洗工作要做得彻底。

下面是几种常见溶剂的溶胀系数参考值：1.水：溶胀系数为1，对于葡聚糖凝胶柱来说，水是适用的溶剂。

2.硫酸：溶胀系数为0.57，硫酸能够完全渗透葡聚糖凝胶柱。

3.乙醇：溶胀系数为0.44，适量的乙醇可以使用，但过高浓度的乙醇可能会影响柱子的性能。

4.甲醇：溶胀系数为0.65，甲醇也可以使用，但同样需要注意控制浓度。

总结：葡聚糖凝胶柱是一种常见的色谱柱，具有广泛的应用。

在使用葡聚糖凝胶柱时，需进行适当的处理以及注意事项，以保证柱子的性能和寿命。