蛋白 A 、蛋白 G 、蛋白L
蛋白A (Protein A) 是金黄色葡萄球菌的一个株系的细胞壁蛋白，它通过Fc区与哺乳动物的IgG结合，天然的Protein A，42kDa，含有四个Ig Fc结合位点，其中2个是有活性的，而用于纯化抗体的，一般是重组的protein A，含有4个Ig Fc区域结合位点。
蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上即蛋白A琼脂糖（protein A agarose），可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白不结合，具有极高的选择性。1个蛋白A 分子至少可以结合2个IgG。天然蛋白A 和重组的蛋白A对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。但重组的蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与抗体的结合能力。蛋白A与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，蛋白A琼脂糖常用于免疫沉淀鼠IgG2a, IgG2b, IgA, 兔IgG, 以及人的IgG1, IgG2和IgG4几种抗体。
蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞壁蛋白，分子量25kDa，为三型Fc受体。蛋白G可以与IgG的Fc 区域特异性结合，与Protein A相比对IgG具有更好的结合能力，血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。重组蛋白G已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。
蛋白G作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上即蛋白G琼脂糖（protein G agarose），可以特异性的和样品中的抗体分子结合，Protein G能结合所有的人和鼠的IGG抗体亚型，包括鼠的IGG1。Protein G也可以与小鼠的IGG2a和IGG2b结合，而Protein A则不能。
Protein L是从马格努斯消化链球菌分离出来的能和免疫球蛋白特异性结合的蛋白质，分子量36Kd，与蛋白A和蛋白G结合到（抗体）的Fc区不同的是，蛋白L通过轻链相互作用结合的抗体。因为重链的任何部分都不会参与结合相互作用，蛋白L结合更宽范围的抗体类大于蛋白A或G蛋白L结合所有抗体类，包括IgG，IgM，IgA的，IgE和IgD的代表。尽管有很宽的结合范围内，蛋白质L不是一个通用的抗体结合蛋白。L蛋白结合仅限于那些含有κ轻链的抗体，在人类和小鼠抗体，抗体分子除了包含κ轻链，其余有ι轻链。例如，它结合人VκI，VκIII和VκIV亚型但不结合VκII亚型。
补充：Antibody and antibody fragment purification: MabAffinity & FabAffinity Platform
We offer an extensive product line of high-flow agarose based chromatography media and resins for fast and convenient purification of antibody and fragments of various species and subclasses from different sources, including recombinant protein A, protein G or protein L as affinity ligands.
Protein A, Protein G, and Protein L are native and recombinant proteins of microbial origin that bind to mammalian immunoglobulin molecules.The high chemical stability of these proteins makes them ideal choices as affinity chromatography ligands for repeated binding-elution and cleaning cycles.
Coupling these ligands with a high-flow agarose matrix gives our MabAffinity and FabAffinity separation toolboxes the power to do one-step antibody and antibody fragment purification at a very high yield.
Compared with cyanogen bromide activation, or other traditional mult-point attachment chemistries, our enhanced alkaline-stable and oriented coupling chemistry with long hydrophilic spacer arm not only extend greatly the pH range both for working and CIP with much better life time and less leakage, but also increase the exposure of coupled ligand to target with higher capacity for less steric hindrance .
铁蛋白结构与功能 摘要：铁元素是生物体中的半微量元素，铁元素子生物体内的平衡对生物体的健康有着很重要的作用，而作为可以调节体内铁元素平衡的铁蛋白很早就出现在学者的研究中。铁蛋白不仅直接在人体内发挥作用，也通过植物食物的铁元素积累影响着人类的健康，所以通过阅读了几篇文献后，简单概括一下目前对铁蛋白的结构和功能的研究情况。 关键词：铁蛋白结构功能 铁是生物体很重要的一种半微量元素，对生物体的健康有着极为重要的作用，铁在动物体内参与造血、运输氧气、免疫和防御等生理过程，在植物体内则参与叶绿素的形成，但是铁含量超标则会造成消化功能紊乱、生长受阻等。所以，维持生物体体内铁含量平衡至关重要。铁蛋白是生物体内的铁贮藏蛋白质，起着调节生物体铁平衡的作用。 目前，在动物、植物和微生物体内都对铁蛋白进行了大量研究[1]，除了对其基因[2]、结构和功能做了大量研究之外，也在不断探索研究铁蛋白的方法[3]、铁蛋白的新作用[4-5]以及铁蛋白的作用方法等6-7]。由于铁元素在生物体内的重要作用和植物性食物的铁含量很低，甚至在某些地区有缺铁现象的发生，为了提高植物食物中的铁含量，有学者已经开始了通过转基因技术，将豌豆铁蛋白基因专人水稻[8-9]。
虽然铁蛋白对动物和植物都很重要，但是无论是存在分布、结构和功能上，动物和植物体内的铁蛋白都不同[10]。与动物铁蛋白相比，植物铁蛋白具有两个显着的特点：首先，植物铁蛋白在其N端具有一个独特的EP 肽段；其次，植物铁蛋白只含有H型亚基，且有两种不同的H型亚基组成。 1.铁蛋白的结构 铁蛋白分子通常由24个亚基形成一个中空的球状蛋白质外壳，内径通常为7~8nm，外径为12~13nm，厚度为2~。每个球状铁蛋白分子大约有4500个三价铁原子储存在其中。每两个铁蛋白亚基反向平行形成一组，再由这十二组亚基对构成一个近似正八面体，成4-3-2重轴对称的球状分子 (图1)。每个铁蛋白亚基外形成空心的柱状(长约5nm，直径约，且由一个两两成反向平行的4个α螺旋簇 (A、B和C、D)、C末端第五个较短α螺旋(E)以及N末端的伸展肽段 (EP) 构成。B和C螺旋之间由一段含18个氨基酸的BC环连接，E螺旋位于4α螺旋簇的尾端并与之成60° 夹角 (图2)。每个铁蛋白分子形成12个二重轴通道、8个三重轴通道和6个四重轴通道，这些通道被认为是铁蛋白内部与外部离子出入铁蛋白的必经之路，起着联系铁蛋白内部空腔与外部环境的作用。
铁的吸收 铁是人体内必需的微量元素之一，有着重要的生理功能。成人体内含铁量为35．8～89．5毫摩尔，小儿每公斤体重含0．525～1．074毫摩尔，仅占人体体重的万分之四左右，属于微量元素。正常人体每天铁的需要量：18岁少女为18毫克，青年男子15毫克，成年男子为12毫克，孕妇、乳母为18毫克。小儿由于生长发育，体重和血容量的增长，以及铁的不断丢失，必须每日从食物中摄取铁15～18毫克。 铁的来源 人们体内铁的来源平常大多由于食用含铁丰富的食物。以血红素形式存在的铁最容易被人体吸收。动物肝脏每百克含铁（25mg）、动物全血（每百克含铁15mg）和肉中的铁均是以这种形式存在，其吸收率一般为22%，最高可达25%。而植物类食物中铁大多以植酸铁、草酸铁等不溶性盐的形式存在，所以难以被人体吸收。其吸收率一般在10%以下。含铁丰富的植物类食物主要有黑木耳、海带、芝麻、大豆、南瓜子、西瓜子、芹菜、苋菜、菠菜、韭菜、小米、红枣、紫葡萄、红果、樱桃等。我们日常的食物中多数含铁量较少，有的基本测不到，有些含铁食物，不利于吸收。一般食物铁的吸收率在1％～22％。所以很容易引起铁缺乏性疾病。但有如下几种食物含铁量(每100克食物含铁量)较高：动物血含铁量最高约340毫克，吸收率也最高，为10％～76％。动物肝如猪肝含铁25毫克，牛肝含9，0毫克，猪瘦肉中含2．4毫克，吸收率也高至7％。蛋黄含铁量亦较高，但吸收率仅3％。其它含铁较高的食物有，芝麻50毫克、芥菜12毫克、芹菜8．5毫克、紫菜33．2毫克、木耳185毫克、海带150毫克、米6．7毫克等，应根据不同饮食及条件混合食用。 铁的吸收部位 近端小肠(十二指肠和空肠)是铁吸收的主要部位，也是调节铁平衡的一个关键环节。动物消化道的其它部位如胃、回肠、盲肠也能吸收少量的铁。Darrell 于1965年利用结扎小肠段技术，研究得到大鼠不同消化道部位吸收铁的能力依次为：十二指肠>回肠>小肠中段>胃。由此可见，动物整个消化道都可以吸收铁，但主要吸收部位在十二指肠。机体内铁的稳定态主要受肠道对铁的吸收率的控制。 铁的吸收形式 铁主要是Fe2+被吸收，肉类食品中的肌红蛋白所含的铁可被完整地直接吸收，植物中的铁多为Fe3+，需要还原成Fe2+或与铁螯合物结合后才容易被吸收。维生素c和其他还原剂能使Fe3+还原成Fe2+；蛋白质分解后的氨基酸、酰胺剂、胺类可促进铁成为溶解状态，均可促进铁的吸收。虽然过去的几十年已经投入了相当大的努力，各种假说，如载体转运、离子通道等机制已相继提出，但小肠黏膜铁吸收的机制一直是不清楚的。一般认为，铁在许多组织细胞被吸收(或摄取) 都是通过经典的转铁蛋白(transferrin，Tf)和转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)的途径。即三价铁首先与Tf 结合，两者的结合物再与细胞表面的TfR 结合，之后经过内吞、酸化、释放和移位等步骤，铁进入胞浆，最终被细胞利用，合成血红蛋白及其他物质。但小肠肠腔表面的吸收上皮细胞不存在TfR 表达，因此，铁穿过小肠进入机体不可能通过Tf－TfR 的经典转运途径实现。近年来，在小肠黏膜细胞相继发现了DMT1(divalent metal transporter 1，二价金属离子转运蛋白)、DCb(duodenal cytochrome b，肠细胞色素B)、MTP1(metal transporter protein 1金属转运子蛋白1)和Fp1 (ferroportin 1，膜铁转运蛋白1) 和Hp (hephaestin，膜铁转运辅助蛋白) 等几种铁转运相关的蛋白质。这些蛋白的发现是铁代谢领域中近年取得的最大突破，也使小肠如何吸收铁这一重要问题有了基本答案。新的研究证实，DMT1 和DCb 两种蛋白质参与黏膜铁吸收过程(铁穿过肠吸收上皮细胞的顶端进入细胞)，而Fp1 和Hp 则参与黏膜转运过程(从肠上皮细胞的基底侧转运入血液循环)。近年来，国外学者从肠道提纯一种新的铁结合蛋白
蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法 一、目的： （1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。 （2）学习用标准蛋白质混合液制作Ve，Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。 二、原理： 凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即： Vt=Vo+Vi+Vg Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体 积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此Vt—Vo等于Vi+Vg 。它们之间的关系可用图17-3表示。洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。 它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成： 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的
第十一章细胞的信号转导 一、名词解释 1、细胞通讯 2、受体 3、第一信使 4、第二信使 5、G 蛋白 6、蛋白激酶A 二、填空题 1、细胞膜表面受体主要有三类即、、和。 2、在细胞的信号转导中，第二信使主要有、、、和。 3、硝酸甘油之所以能治疗心绞痛是因为它在体内能转化为，引起血管，从而减轻的负荷和的需氧量。 三、选择题 1、能与胞外信号特异识别和结合，介导胞内信使生成，引起细胞产生效应的是( )。 A、载体蛋白 B、通道蛋白 C、受体 D、配体 2、下列不属于第二信使的是（）。 A、cAMP B、cGMP C、DG D、CO 3、下列关于信号分子的描述中，不正确的一项是（）。 A、本身不参与催化反应 B、本身不具有酶的活性 C、能够传递信息 D、可作为酶作用的底物 4、生长因子是细胞内的（）。 A、结构物质 B、能源物质 C、信息分子 D、酶 5、肾上腺素可诱导一些酶将储藏在肝细胞和肌细胞中的糖原水解，第一个被激活的酶是（）。 A、蛋白激酶A B、糖原合成酶 C、糖原磷酸化酶 D、腺苷酸环化酶 6、（）不是细胞表面受体。 A、离子通道 B、酶连受体 C、G蛋白偶联受体 D、核受体 7、动物细胞中cAMP的主要生物学功能是活化（）。 A、蛋白激酶C B、蛋白激酶A C、蛋白激酶K D、Ca2+激酶 8、在G蛋白中，α亚基的活性状态是（）。 A、与GTP结合，与βγ分离 B、与GTP结合，与βγ聚合 C、与GDP结合，与βγ分离 D、与GDP结合，与βγ聚合
9、下面关于受体酪氨酸激酶的说法哪一个是错误的 A、是一种生长因子类受体 B、受体蛋白只有一次跨膜 C、与配体结合后两个受体相互靠近，相互激活 D、具有SH2结构域 10、在与配体结合后直接行使酶功能的受体是 A、生长因子受体 B、配体闸门离子通道 C、G蛋白偶联受体 D、细胞核受体 11、硝酸甘油治疗心脏病的原理在于 A、激活腺苷酸环化酶，生成cAMP B、激活细胞膜上的GC，生成cGMP C、分解生成NO，生成cGMP D、激活PLC，生成DAG 12、霍乱杆菌引起急性腹泻是由于 A、G蛋白持续激活 B、G蛋白不能被激活 C、受体封闭 D、蛋白激酶PKC功能异常 13下面由cAMP激活的酶是 A、PTK B、PKA C、PKC D、PKG 14下列物质是第二信使的是 A、G蛋白 B、NO C、GTP D、PKC 15下面关于钙调蛋白（CaM）的说法错误的是 A、是Ca2+信号系统中起重要作用 B、必须与Ca2+结合才能发挥作用 C、能使蛋白磷酸化 D、CaM激酶是它的靶酶之一16间接激活或抑制细胞膜表面结合的酶或离子通道的受体是 A、生长因子受体 B、配体闸门离子通道 C、G蛋白偶联受体 D、细胞核受体 17重症肌无力是由于 A、G蛋白功能下降
铁的吸收与代谢 摄入的食物铁在胃内，经胃酸的消化作用，溶解、离子化并还原成为亚铁状态，形成低分子的螯合物质。正常胃液含有一种未明的化学稳定因素，可能是内源性螯合物在小肠中碱性条件下，此种因素可使摄人的铁减慢沉降，而易为肠粘膜吸收。 (一)铁的吸收 铁的吸收主要在小肠的上段，且吸收效率最佳，但铁吸收在小肠的任何一段都可逆行。 大部分被吸收入血流的铁以小分子的形式，很快通过粘膜细胞，与脱铁铁蛋白(aoferritin) 结合形成铁蛋白，一部分铁蛋白的铁可在以后解离，以便进入血流，但大部分却可能留在粘膜细胞内直至此种细胞破坏死亡而脱落。 小肠粘膜上皮细胞对铁的吸收代谢有以下特点： ①对血红素铁和非血红素铁的吸出不同，血红素与肠粘膜上血红素受体结合，将血红素铁中的含铁卟啉复合物整个吸收并由血红素加氧酶裂解成卟啉和铁，随后铁与细胞内的脱铁铁蛋白结合成铁蛋白，再运转到身体其他部位而被利用。而非血红素铁则需先被还原成二价铁，才被吸收。 ②控制和调节铁的吸收，当人体内缺铁时，小肠粘膜上皮细胞就能多吸收铁，此时铁的吸收率就升高。肠内铁增高时，其吸收率则下降，但吸收量仍有增加。(二)铁吸收的影响因素 铁在食物中主要以三价铁形式存在，少数食物中为还原铁(亚铁或二价铁)。肉类等食物中的铁约一半左右是血红素铁(约40％)，而其他为非血红素铁，后者则明显受膳食因素的影响。无机铁被吸收时，对肠道环境的改变非常敏感，但血红素铁的吸收则不受其影响。非血红素铁在吸收前，必须与结合的有机物，如蛋白质、氨基酸和有机酸等分离，而且必须在转化为亚铁后方可被吸收。因而有很多因素可影响非血红素铁的吸收。 1.蛋白质与“肉因子”肉、禽、鱼类食物中铁的吸收率较高，除与其中含有一半左右(约40％)血红素铁有关外、也与动物肉中一种叫肉因子(meat factor)或肉鱼禽因子(MFPfactor)有关。此种“因子”能促进非血红素铁的吸收。动物组织蛋白
第二节膜表面受体介导的信号转导亲水性化学信号分子： * 有神经递质、蛋白激素、生长因子等 * 它们不能直接进入细胞 只能通过膜表面的特异受体，传递信号 使靶细胞产生效应 膜表面受体主要有三类（图8-7）： ①离子通道型受体（ion-channel-linked receptor） 存在于可兴奋细胞 ②G蛋白耦联型受体（G-protein-linked receptor） ③酶耦联的受体（enzyme-linked receptor） 后2类存在于大多数细胞 在信号转导的早期 表现为一系列蛋白质的逐级磷酸化 使信号逐级传送和放大。
图8-7 膜表面受体主要有3类 一、离子通道型受体 离子通道型受体（图8-8）： * 离子通道的受体 即，配体门通道（ligand-gated channel） * 主要存在于神经、肌肉等，可兴奋细胞其信号分子为神经递质
* 神经递质＋受体，而改变通道蛋白的构象 离子通道，开启or关闭 改变质膜的离子通透性 瞬间（1/1000秒），胞外化学信号→电信号 继而改变突触后细胞的兴奋性 * 位于细胞膜上的受体，一般4次跨膜 位于内质网上的受体，一般6次跨膜 * 离子通道型受体分为 阳离子通道，如乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺的受体阴离子通道，如甘氨酸＆γ－氨基丁酸的受体 * 如：乙酰胆碱受体（图8-9、10）以三种构象存在2分子乙酰胆碱的结合 使通道处于开放构象 但受体处于通道开放构象状态，时限十分短暂 在几十毫微秒内，又回到关闭状态 然后，乙酰胆碱与受体解离 受体恢复到初始状态 做好重新接受配体的准备 图8-8 离子通道型受体 synaptic cleft：突触间隙
植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (6): 779?788, https://www.doczj.com/doc/f219017867.html, 收稿日期: 2007-05-29; 接受日期: 2007-09-24 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30530460) * 通讯作者。E-mail: hqling@https://www.doczj.com/doc/f219017867.html, .综述. 植物铁吸收、转运和调控的分子机制研究进展 吴慧兰, 王宁, 凌宏清* 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 植物细胞与染色体工程国家重点实验室, 北京 100101 摘要 铁是植物正常生命活动所必需的微量矿质元素, 铁离子的吸收、转运和利用是一个复杂的过程, 很多基因参与了这一过程。本文对近10年来发现和分离的参与植物铁吸收、转运及调控的基因研究进展进行了综述。根据最近的研究结果, 提出了植物控制铁吸收的分子调控模式(机理I)。 关键词 铁, 矿质营养元素, 铁吸收的分子调控模式, 植物营养, 吸收与转运 吴慧兰, 王宁, 凌宏清 (2007). 植物铁吸收、转运和调控的分子机制研究进展. 植物学通报 24, 779?788. 铁离子由于具有活跃的价态变化, 即三价与二价的 互变, 因此是细胞内氧化还原反应所必需的组分。铁在 细胞呼吸、光合作用和金属蛋白的催化反应过程中发 挥重要作用, 是重要的电子传递体, 因此铁元素在原核和 真核生物的生命活动中具有不可替代的功能。而另一 方面由于Fe 3+/Fe 2+的高氧化还原势, 细胞内游离态的铁 容易发生Fenton 化学反应, 激活还原态的氧, 产生有害 的超氧化合物, 对细胞造成伤害(Briat and Lebrum, 1999)。因此, 所有生物都必须通过一套严密的调控机 制来保持铁供给和需求的动态平衡。 铁在地壳中的含量丰富, 但地球上许多生物的生存 却受缺铁的限制。这是因为铁多以Fe 3+的形式存在, 而 这种形态的铁在中性和碱性土壤中的溶解度极低, 从而 限制了土壤中铁的有效性。缺铁会导致叶绿素合成减 少, 光合速率降低, 严重缺铁时叶绿素合成停止, 新叶变 黄, 生物量大幅度下降。植物缺铁不仅影响植物的生长 发育, 造成巨大的经济损失, 而且也影响动物和人类对铁 的获取, 从而导致许多缺铁性疾病的发生。人类铁营养 的缺乏已经成为当今世界最为严重的营养缺素症之一。 当人体由于某种原因不能摄入足量的铁营养时, 就会引 起如Wilson 、Pakinson 、Menken 及贫血病(anemia) 等许多生理功能异常疾病, 危及患者智力和体能的发育 及身体健康(Yuan et al., 1995)。植物在漫长的进化过程中, 由于生长环境的差异, 形成了不同的铁高效吸收机制, 以保证从土壤中获取充足的铁营养, 维持植株的生长发育, 乃至整个物种的生存。在土壤中, 尤其是碱性土壤中铁主要以不溶的Fe 3+形式存在, 因此根据铁吸收形式的不同, 植物被划分为机理I (strategy I)和机理II(strategy II)植物(R ?mheld and Marschner, 1986)。双子叶植物和非禾本科单子叶植物采用机理I(strategy I)的高效活化和吸收机制从土壤中获取铁。该机理主要由3个部分组成: (1)H +-ATPase 泵系统, 分泌H +降低土壤pH 值, 增加根际土壤颗粒中铁的可溶性; (2)Fe 3+还原系统, 包括将Fe 3+还原成Fe 2+的还原酶和与之耦联的NADPH 脱氢酶; (3)Fe 2+的转运系统, 包括一系列的铁转运蛋白, 将还原的亚铁离子转运到细胞内, 再由其它转运蛋白输送到各个细胞器和器官中供利用。而禾本科植物, 则采用另一种铁的吸收机制——机理II(strategy II)。机理II 植物在受低铁胁迫时,体内合成大量的植物铁载体(phytosiderophores, PS),并分泌到根际土壤中, 与土壤中的Fe 3+直接结合, 以螯合物的形式转运至细胞内, 再释放出Fe 3+, 供代谢利用(Roberts et al., 2004)。最近的研究表明, 在禾本科植物水稻中, 也存在机理 I 的亚铁离子转运系统, 即水稻既
实验六报告： SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1.研究背景及目的 根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1] 。 通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成 带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合，不仅 使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率 主要取于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 2.原理 由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带 来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间结构，所以引入负电，结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电 荷量约为蛋白质本身静电荷 10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷
实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分 子量 实验数据： 标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条 溴酚蓝前沿距离/cm 4.70 距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400 LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16 样品 1 2 3 溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60 样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70 相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37 标准曲线： y=5.05-1.10x
结果： 样品 1 2 3 Mr 12706 59566 43954 mr 4.104 4.775 4.643 一. 实验目的和要求 1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 2 掌握垂直板电泳的操作方法。 3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。 二 .实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个： 1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～ 100mmol/L 3) 二硫键是否完全被还原
细胞的跨膜信号转导 1、跨膜信号转导或跨膜信号传递的共性 各种外界信号(物理、生物、化学等信号) ↓ 膜蛋白构型变化 ↓ 信号传递到膜内 ↓ 靶细胞功能变化(如电变化) ２、跨膜信号转导的方式有3种:①离子通道介导 ②G蛋白耦联介导 ③酶耦联受体介导 3、受体 定义:能与激素、神经递质、药物或细胞内的信号分子结合并引起其功能的改变的生物大分子 分类:部位——胞膜、胞浆、胞核受体 配基——胆碱能、肾上腺素能、多巴胺能受体 结构——离子通道、Ｇ蛋白、酶、转录调控受体 特征: ①高度特异性 ②饱与性 ③竞争抑制 ④亲与力 ⑤可逆性 ⑥高效性 功能:①识别与结合 ②传递信息 一、由离子通道介导的跨膜信号传导 (一)、化学门控通道——配体门控通道 定义:当膜外特定的化学信号(配体)与膜上的受体结合后通道就开放,因而称为化学门控通道或配体门控通道,也称为通道型受体 分布:神经元突触后膜,肌细胞终板膜受体—化学信号结合位点-促离子型受体 转到途径: 化学信号膜通道蛋白 ↘↙ 通道蛋白变构 ↓ 通道开放 ↓ 离子异化扩散 ↓ 完成跨膜信号传导 ↓ 产生效应
(二)、电压门控通道 分布在除突触后膜与终板膜以外的细胞膜 (三)、机械门控通道 定义:感受机械刺激引发细胞功能改变的通道结构 二、由G蛋白耦联受体介导的跨膜信号转导 1、G蛋白耦联受体就是一种与细胞内侧Ｇ蛋白的激活有关的独立受体蛋白质分子 2、G蛋白就是鸟苷酸结合蛋白:G蛋白未被激活时,她与一个分子的GDP结合,G蛋白的 激活很短暂 3、G蛋白效应器,:催化生成第二信使的酶与离子通道 ４、蛋白激酶:丝氨酸∕苏氨酸激酶可就是底物蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化, 包括:蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白激酶C 5、几条主要跨膜信号转导途径 ①受体－G蛋白－AC信号转导途径 Gs ＡTP→cＡＭP↑ ﹢↗↘﹢﹢↗↘ 配体+受体Ａ C PKA ﹢↘↗﹣﹣↘↗ GｉＡTP→ｃAMＰ↑ ②受体-Ｇ蛋白－ＰＬＣ信号转导途径 IP3+IP３受体→内质网或肌浆网释放Ga+ ＰLC ↗ PIL2→→→ Gｉ﹨Gp↘ DG→→受体
细胞信号转导 第一套 一、选择题（共10题，每题1分） 1、Ca2+在细胞信号通路中是（） A. 胞外信号分子 C. 第二信使 B. 第一信使 D. 第三信使 2、动员细胞内源性Ca2+释放的第二信使分子是（）。 A. cAMP C. IP3 B. DAG D. cGMP 3、细胞通讯是通过（）进行的。 A. 分泌化学信号分子 C. 间隙连接或胞间连丝 B. 与质膜相结合的信号分子 D. 三种都包括在内 4、Ras蛋白由活化态转变为失活态需要( )的帮助。 A. GTP酶活化蛋白（GAP） C. 生长因子受体结合蛋白2（GRB2） B. 鸟苷酸交换因子（GEF） D. 磷脂酶C-γ(PLCγ) 5、PKC在没有被激活时，游离于细胞质中，一旦被激活就成为膜结合蛋白，这种变化依赖于（）。 A. 磷脂和Ca2+ C. DAG和 Ca2+ B. IP3和 Ca2+ D. DAG和磷脂 6、鸟苷酸交换因子（GEF）的作用是（）。 A. 抑制Ras蛋白 C. 抑制G蛋白 B. 激活Ras蛋白 D. 激活G蛋白 7、cAMP依赖的蛋白激酶是（）。 A. 蛋白激酶G（PKG） C. 蛋白激酶C（PKC） B. 蛋白激酶A（PKA） D. MAPK 8、NO信号分子进行的信号转导通路中的第二信使分子是（）。 A. cAMP C. IP3 B. DAG D. cGMP 9、在下列蛋白激酶中，受第二信使DAG激活的是（）。 A. PKA C. MAPK B. PKC D. 受体酪氨酸激酶 10、在RTK－Ras蛋白信号通路中，磷酸化的（）残基可被细胞内的含有SH2结构域的信号蛋 白所识别并与之结合。 A. Tyr C. Ser B. Thr D. Pro 二、判断题（共10题，每题1分）
碱基与蛋白换算 创建者: zizip 最后修改: 2010-6-4 23:05:47 状态: 公开 核酸数据 (Nucleic Acid Data) Kd是kilodaltons的缩写，既千道尔顿。是氨基酸的分子量单位。 Kbs是千碱基对的意思，是核酸的单位名称。 1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons（道尔顿） 1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons（道尔顿） DNA与表达蛋白之间分子量换算： 1 kb DNA = 333 amino acid ≈3.7 × 104 Da（道尔顿） 10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA 30,000 Da Protein≈ 810 bp DNA 50,000 Da Protein ≈1350 bp DNA 100,000 Da Protein ≈ 27 kb DNA 一个DNA碱基对（钠盐）的平均分子量= 650 道尔顿 1.0 A260 unit ds DNA = 50 μg/ml = 0.15 mM (in nucleotides) 1.0 A260 unit ss DNA = 33 μg/ml = 0.10 mM (in nucleotides) 1.0 A260 unit ss RNA = 40 μg/ml = 0.11 mM (in nucleotides) 双链DNA分子的分子量(道尔顿) = 碱基对数目×650 双链DNA分子的末端摩尔数= 2 ×DNA质量（克）/ DNA分子量（道尔顿）限制性内切酶酶切后的DNA末端摩尔数: a) 环状DNA分子: 2 × DNA摩尔数×位点数 b) 线性DNA分子: 2 × DNA摩尔数×位点数+ 2 × DNA摩尔数 1 μg 1000 bp DNA = 1.5 2 pmol = 9.1 × 1011 molecules 1 μg pUC18/19 DNA (2686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 × 1011 molecules
蛋白质分子量标准（高） Protein Molecular Weight Marker (High) 使用说明书 Takara Code : D531A 浓度: 10 μg/μl 制品内容（约200次量） Protein MW Marker（high）50 μl 5×Loading Buffer 1000 μl 1 M DTT（Dithiothreitol）100 μl 制品说明 Protein Molecular Weight Marker（High）是由五种纯化好的不同分子量的蛋白质组成的，它的分子量范围为：44.3 KDa～200KDa。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，经考马斯亮蓝R－250染色后的各种蛋白质的条带强度均一。每微升本制品的蛋白量为10 μg，稀释20倍后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每次取5 μl（for SDS-PAGE mini gel）。以每次使用5 μl（20倍稀释液）计算时本制品约可使用200次。 保存条件 制品原液可在-20℃下长期保存，制品的20倍稀释液可在-20℃下保存2～3个月，制品的原液和制品的20倍稀释液都应避免多次反复冻融。 制品中的各种蛋白质种类 使用注意 推荐使用7.5～10％的聚丙烯酰胺凝胶。浓度太高，高分子量的蛋白分离效果不好，有可能聚集于分离胶的上部。使用方法 1. 首先按以下方法配制“稀释液”。 1 M DTT 2 μ l 5×Loading Buffer 20 μl * 稀释液可于室温下放置一个月左右。 2.按以下方法稀释本制品。 稀释液22 μl 灭菌蒸馏水73 μl * 20倍的制品稀释液可在-20℃下保存2～3个月，但应 避免多次反复冻融。如果一次稀释量较多时，可以小量 分装后在-20℃下保存，以避免反复冻融。 3. 均匀混合后，100℃加热处理5分钟，然后取5 μl进行7.5～10％ 的聚丙烯酰胺凝胶电泳（for SDS-PAGE mini gel）。 4. 7.5%、10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经考马斯亮蓝R-250染 色后的结果如下。 V2012,01 KDa 200.0 116.0 97.2 66.4 44.3 200.0 116.0 97.2 66.4 44.3 KDa 7.5% 10%
蛋白质分子量测定方法的比较 梁永达 （复旦大学药学院，上海） 摘要：分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。该文概述了目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法，并比较了这几种方法的优缺点。 关键词：蛋白质分子量粘度法凝胶过滤层析法凝胶渗透色谱法SDS-凝胶电泳法渗透压法电喷雾离子化质谱技术基质辅助激光解吸电离质谱技术光散射法超速离心沉降法 Comparison of the methods of molecular weight determination of proteins LiangYongda (School of Pharmacy in Fudan University, Shanghai) Abstract: Molecular weight is one of the most important characteristic parameters of proteins，which leads the methods to determine protein molecular weight to develope rapidly in recent years. In this paper，the mechanism and application are briefly overviewed for the most widely used technologies including viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation. Plus, we compare these methods’advantages and disadvantages. Key words:molecular weight determination of proteins, viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation 分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种，以下将对实验室最常用的几种方法进行介绍： 1.粘度法 一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。 如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之间的经验关系式为： 式中，M 为粘均分子量；K为比例常数；α是与分子形状有关的经验参数。K和α值与温度、
①铁蛋白 ( Ｆｎ) ，是主要的细胞内储存铁的蛋白质, 在铁代谢中发挥关键作用。ＦｎｍＲＮＡ的５＇端非翻译区有一个呈茎－环结构的ＩＲＥ. ②转铁蛋白受体（ＴｆＲ）有两种，转铁蛋白受体１（ＴｆＲ１）和转铁蛋白受体２（ＴｆＲ２）。ＴｆＲ１由ＴｆＲ１基因编码，后者产生一种重要的ｍＲＮＡ , 它的３′端非翻译区有５个聚集在一起的铁反应元件（ＩＲＥ），每一个ＩＲＥ都能结合一个铁调节蛋白（ＩＲＰ）。 ③二价金属离子转运蛋白（ＤＭＴ１）ＤＭＴ１是与小肠铁吸收相关的重要蛋白。人类ＤＭＴ１ｍＲＮＡ有两种形式，即“＋ＩＲＥ”和“－ＩＲＥ”型。“＋ＩＲＥ”型ｍＲＮＡ在３′端非翻译区有一个铁反应元件 “－ＩＲＥ”型则不含此元件。在小肠中，主要表达的是ＤＭＴ１同源异构体Ⅰ ＋ＩＲＥ ，定位于肠上皮细胞绒毛面细胞膜上，参与小肠铁的吸收，受铁缺乏的向上调节。 ④铁调节蛋白 ＩＲＰ 铁调节蛋白有两种，ＩＲＰ １和ＩＲＰ ２，前者起主要作用。当细胞铁充足时，ＩＲＰ １具有顺乌头酸酶活性，不能结合ＩＲＥ，即无铁调节蛋白活性；当细胞内铁缺乏时，ＩＲＰ 1无顺乌头酸酶活性，却具有铁调节蛋白活性，可与ＩＲＥ结合。 ⑤铁浓度变化对基因表达的调节机制： 在铁缺乏的情况下，ＩＲＰ就会结合到铁蛋白基因ｍＲＮＡ５′端非翻译区的ＩＲＥ上，阻止ｍＲＮＡ与核糖体结合，因而抑制翻译
的起动，从而减少铁蛋白的表达，减少铁的贮存。在铁充足的情况下，ＩＲＰ就会从ｍＲＮＡ离开并启动铁蛋白ｍＲＮＡ的翻译，使铁蛋白合成增加，增加铁的贮存。 在铁缺乏的情况下，ＩＲＰ就会结合到ＤＭＴ１ ＋ＩＲＥ 和ＴｆＲ１ｍＲＮＡ的３＇非翻译区的ＩＲＥ上，以便保护ｍＲＮＡ，防止被核糖核酸酶降解，从而使ｍＲＮＡ的稳定性增强、增加由ｍＲＮＡ翻译成蛋白的数量，即ＤＭＴ１ ＋ＩＲＥ 和ＴｆＲ１数量增加，小肠吸收上皮细胞对食物中铁的吸收增加，外周组织需铁细胞对铁的摄入增加；在铁充足的情况下，由于ＩＲＰ失去了与ＩＲＥ结合能力，因此ＩＲＰ就会从ＤＭＴ１ ＋ＩＲＥ 和ＴｆＲ１ｍＲＮＡ上离开，ｍＲＮＡ就会被核糖核酸酶降解，从而降低了ｍＲＮＡ的翻译，降低了ＤＭＴ１ ＋ＩＲＥ 和ＴｆＲ１的合成，最终降低了机体对铁的吸收和细胞对铁的摄入。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量 实验目的 了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。 学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。 实验原理 SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。 1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =K―bm R 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b 和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋
白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 仪器、原料和试剂 仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。 原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 试剂： （1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。 （2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子