23卷4期2007年7月生 物 工 程 学 报Chinese J ournal o f Biotechnology Vol.23 No.4
July 2007
Received:November 13,2006;Accepted:Dece mber 27,2006.
This work was supported by the grants from the Nati onal Natural Science Foundati on of China (No.20536040)and the Nati onal Basic Research Program of Chi na (No.2003CB716003,No.2007CB707802).
*Corresponding author.Tel:+86-22-27406770;Fax:+86-22-27406770;E -mail:xmz hao@https://www.doczj.com/doc/ff17753709.html,
国家自然科学基金(No.20536040)和国家重点基础研究发展计划项目(No.2003CB716003,No.2007CB707802)资助。
琥珀酸发酵菌种研究进展
The Research Progress of Succinic Acid Fermentation Strains
王庆昭,赵学明
*
WANG Qing -Zhao and Z HAO Xue -Ming
*
天津大学化工学院生化工程系,天津市生物与制药工程重点实验室,发酵技术国家工程研究中心(天津),天津 300072
Sch ool o f Ch emica l Eng in ee rin g &Te chn ology ,De pa rtme nt o f Bioch emica l En gin eerin g ;Tia n jin Un ive rsity ,Tia n jin Ke y Labora tory o f Biologica l an d Pha rma ceu tica l Eng inee rin g ;Nationa l En ginee rin g Resea rc h Cen ter for Fe rmen tation Tech nolog y (Tian jin ),Tian j in 300072,Chin a
摘 要 琥珀酸作为一种重要的化学中间体的潜力已经为人们所认识,而发酵法生产琥珀酸是使这一潜力变为经济上可行的最好方法之一。菌种在发酵法中占有非常重要的地位,是决定整个过程的关键。系统介绍了关于发酵法生产琥珀酸的菌种研究进展,并对各种菌株的发酵特点和问题做了分析,最后展望了菌种的发展方向。关键词 琥珀酸,发酵,大肠杆菌,产琥珀酸厌氧螺菌,产琥珀酸放线杆菌
中图分类号 TQ46417 文献标识码 A 文章编号1000-3061(2007)04-0570-07
Abstract The po tential of succinic acid as an important chemic al inter mediates had been re alized and fer mentation is one of the best ways to make it possible in economical aspect.Fermenta t ion organism is the key pa rt of the fer me nta tion method.The updated researc h developments of fermentation organisms and the fe rmentation characte ristics and problems of the m were revie wed and analyzed in this pape r.Finally,the development future of fe rmenation organism was forecasted.
Key words succinic acid,fermentation,Escherichia coli ,Anaerobios pirillum succinipro ducens ,Actinobacillus succinogenes
琥珀酸,学名丁二酸,是一种常见的天然有机
酸,广泛存在于人体、动物、植物和微生物中[1]
。作为一种重要的有机酸,琥珀酸在食品、化学、医药以及其他领域有广泛的应用,但其真正的潜力是作为大规模工业原料的应用。它可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品,如果降低成本将可能有超过400万吨的市场容量[2]
。但一直以不可再生的战略资源石油产品作为原料的传统琥珀酸生产方法导致了高价格和高污染,抑制了琥珀酸作为一种优秀的化学平台产品的发展潜力。而发酵法生产琥珀酸由
于其高效率、环保性,以及原料的可持续利用性而受到一些研究工作者的推崇。美国能源部2004年发布的报告中(https://www.doczj.com/doc/ff17753709.html, P biomass P pdfs P 35523)将琥珀酸列为12种最有潜力大宗生物基化学品中的第一位。早在20世纪90年代初美国能源部就联合Argonne 等四个国家实验室以及应用碳化学公司,投资700万美元联合进行琥珀酸的发酵和提取的研究(W -31-109-Eng -38)。2003年后又资助了多个琥珀酸发酵和分离的相关研究项目(DE -FG02-02ER83477,DE -FG02-00ER83034d 等)。本文将就琥
珀酸发酵菌种的十几年研究进展进行回顾、分析并展望了菌种的发展方向。
1琥珀酸发酵菌种的多样性
琥珀酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物。丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌能够分泌琥珀酸。据报道一些乳酸菌(Lactobacillus)也能在特定的培养基上不同程度地产生琥珀酸[3]。表1列出了已经报道的产琥珀酸菌种及其基本生理特性。
由于天然菌株的产琥珀酸能力非常低,发酵产物多种多样,对糖或琥珀酸的耐受性比较差而使其基本不具有使用价值。因此必须运用生物工程技术对现有的菌种进行改造。目前主要的研究进展集中在产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobios pirillum succiniproducens),产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)和大肠杆菌(Escherichia coli)等菌种上。
表1琥珀酸产生菌
Table1The succinic acid producing organisms
Strai ns Temperature P e Fermentation products Oxygen Anaerobiospirillum succ inici pro duce ns
ATCC*29305[4]37succinate,ace tate Anaerobic Actinobac illus succino gene s A TCC55618[5]37s uccinate,acetate,lactate Fac ultati ve Esche ric hia coli[6]37succinate,acetate,lac tate,formate,etanol Fac ultati ve Bacteroides fragilis H17[7]37s uccinate,acetate,lactate Anaerobic Cytophaga suc cinic ans DSM#4002[8]38succinate,acetate,formate Fac ultati ve Clostridium the rmosuccinogenes DSM5809[9]58succinate,acetate,lactate,formate,ethanol Anaerobic Ruminococcus flave facien A TCC19208[10]37succinate,acetate,formate Anaerobic Fibrobacter succinogene[11]39succinate,acetate,formate Anaerobic Mannheimia s p.55E[12]42succinate,acetate,formate Anaerobic Bacteroides succ inogenes S85[13]39succinate,ace tate Anaerobic Bacteroides amyophilus ATCC29744[14]37succinate,ace tate Anaerobic Succinivibrio de xt rinosolvens ATCC19716[15]39s ucci nate,acetate,lactate,formate Anaerobic Enterococ cus fae calis DSM20478[16]37succinate,acetate,lactate,formate,ethanol Fac ultati ve Woline lla succ inogenes D SM1740[17]37succinate,acetate,lactate,formate,ethanol Anaerobic Prevotella ruminocola A TCC19188[18]37s ucci nate,acetate,lactate,formate Anaerobic Sul furospirillum s p.D SM806[19]30succinate,ace tate Anaerobic *ATCC:美国典型菌种保藏中心;#DSM:德国菌种保藏中心.
2琥珀酸厌氧螺菌的研究进展
产琥珀酸厌氧螺菌(ATCC29305)是从小猎犬的口腔中分离得到的一种革兰氏阴性严格厌氧菌,以葡萄糖乳糖为碳源发酵主产物为琥珀酸和乙酸,同时生成少量的甲酸、乙醇和乳酸[4]。一般认为产琥珀酸厌氧螺菌的代谢路径如图1所示。其中最主要的控制酶为PE P羧激酶、苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸脱氢酶。产琥珀酸厌氧螺菌发酵过程中, CO2浓度控制PEP的流向;在低C O2浓度时(011mol CO2P mol葡萄糖)以乳酸作为还原的产物;而在高CO2浓度时(1mol CO2P mol葡萄糖)更多的流向还原臂,琥珀酸是主要的产物,仅有微量的乳酸产生。在最优条件下(pH612,高浓度CO2),琥珀酸的产量可以达到35g P L;有65%的葡萄糖被用于琥珀酸的生产[20]。在此情况下,可以检测到固定CO2的关键酶,PEP羧激酶浓度升高。此酶被进一步分离纯化,并进行了特性研究[21-24]。发现其满足米氏方程动力学模型,并且需要Mn2+、Co2+、Mg2+来表现最大活力。Laivenieks等人[25]进一步对编码PEP羧激酶的pck A基因进行了克隆、测序,发现产琥珀酸厌氧螺菌的PEP羧激酶和大肠杆菌的PEP羧激酶具有6713%的同源性,7912%的相似性。但在大肠杆菌中成功表达后却并未导致琥珀酸的产量升高。之后,Jabalquinto等人[26,27]又运用定点突变的技术对此关键酶的动力学参数和催化活力中心进行了研究。
Glassner等人[28]以产琥珀酸厌氧螺菌(ATCC 29035)为出发菌株,通过筛选得到了比出发菌株更耐单氟乙酸钠的自发突变株FA-10(ATCC55617)。此菌株的发酵产物中琥珀酸P乙酸的比例由大概4B1提高到80B1。此菌株对初始糖浓度最高耐受浓度为60g P L,最优初始糖浓度为30~50g P L。在最优发
571
王庆昭等:琥珀酸发酵菌种研究进展
酵条件下琥珀酸的产量可以超过30g P L,得率超过70%,并有一定程度的丙酮酸积累。Samuelov 等人[20]
的研究结果表明,在最适条件下,产琥珀酸厌
氧螺菌琥珀酸的产率可以达到120mol P 100mol 葡萄糖。最高浓度为65g P L
。
图1 产琥珀酸厌氧螺菌和产琥珀酸放线杆菌代谢路径[35]
Fig.1 Succinic acid metabolic pathways of A .succin iproducens and A .succinogenes
研究结果一般认为产琥珀酸厌氧螺菌具有以下发酵特性
[29-32]
:
(1)可以利用的发酵底物比较广泛,可以以通常的碳水化合物为底物,例如葡萄糖、乳糖、甘油等。采用山梨糖醇为底物时会促进代谢向有利于产琥珀酸的方向代谢。
(2)厌氧发酵过程中,通入C O 2对琥珀酸的代谢具有关键的作用,通入氢气可能会有利于琥珀酸的产生,最优C O 2P H 2比例一般在95B 5。
(3)一般不能耐受高渗透压,最优底物葡萄糖浓度一般在20~80g P L 之间,而且不能耐受高浓度的琥珀酸盐。因此对分离步骤操作要求比较高。(4)发酵最优pH 一般为518~616,似乎较低pH 有利于琥珀酸的生产。一般为混合酸发酵,乙酸为主要的副产物。
3 产琥珀酸放线杆菌的研究进展
产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes ATCC 55618)是从瘤胃中分离得到的一种革兰氏阴性新菌株,经16S rRNA 鉴定为巴斯德菌科放线杆菌属。它是一种兼性厌氧菌,能够利用多种碳源,并能够耐受高浓度的琥珀酸盐,而生长不受影响
[5]
。
以葡萄糖为底物时,发酵产生琥珀酸、乙酸以及少量的甲酸和乙醇。与产琥珀酸厌氧螺菌相似,CO 2对琥珀酸的产量有很大影响,还原性底物有利于琥珀
酸和乙醇的发酵产生。能够利用外源氢气作为电子供体,并以富马酸作为电子受体
[33]
。一般条件下琥
珀酸的最后发酵含量可达50g P L,当使用100%氢气
时,琥珀酸的产量可达110g P L [33]
。Guettler 等人[33,34]
以产琥珀酸放线杆菌130Z (Actinobacillus succinogenes ATCC 55618)为出发菌株,筛选出对单氟乙酸抗性的自发突变株。此菌株发酵产物中的琥珀酸P 乙酸比例高达85B 1;琥珀酸P 甲酸比例高达160B 1。在最适条件下,此抗性株的琥珀酸产量可以达到80~110g P L,发酵时间48h,得率高达97%。
此菌株的主要研究工作由MBI (Michigan Biotechnology Institute)完成。目前还没有其他研究单位的公开文献。从MBI 对于此菌的产酸特性研究以及代谢方面的研究中总结,产琥珀酸放线杆菌中
包含有EMP 、PP 途径的关键酶,而且其磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶和富马酸酶的活性明
显高于大肠杆菌K -12[34]。Kim 等[102]
克隆并在大肠杆菌中表达了此菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶,当敲除原菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶后,琥珀酸产率增加615倍。虽然研究较少,但此菌株是迄今为止报道的耐高糖和高盐的菌种,已经具备初步工业
化生产的能力[35]
。
4 大肠杆菌的研究进展
大肠杆菌在氧气缺乏的情况下,通常发酵糖或其衍生物为甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、乙醇等产物[36]
。通常情况下,大肠杆菌不会过量合成琥珀酸,因此其琥珀酸的产量很低,一般在0112mol P mol 葡萄糖。虽然大肠杆菌琥珀酸产量比较低,但因为其基础研究比较深入,能够采用各种分子生物学的技术对菌种进行改造,所以采用大肠杆菌发酵琥珀酸已经成为一个热点。
一般认为大肠杆菌的琥珀酸合成途径如图2所示,可以看到在大肠杆菌中产琥珀酸的途径比较复杂,可以多达6种[6]
。综合文献的研究结果,可以概括为如下线索:
(1)以野生型大肠杆菌W1485为出发菌株:W1485能够利用大部分糖及其衍生物进行厌氧发酵。在LB 培养基上生长旺盛,大约6~8h 后到达稳定期。发酵产物为琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇,
572
Chinese J ournal o f Biotechnology 生物工程学报 2007,Vol 123,No 14
图2大肠杆菌代谢途径
Fig.2T he metabolic pathway of E.coli
其中乙醇、乙酸、甲酸的产量最大,琥珀酸产量一般为0115~012mol P mol葡萄糖[6]。Clark等人[6]通过插入抗性基因的方法构建了丙酮酸甲酸裂解酶pfl和乳酸脱氢酶ldhA的插入失活菌株NZN111(F-pflA:: Ca m;ldhA::Kan)。NZN111不能以葡萄糖为碳源发酵生长,但可以以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等为碳源发酵生成琥珀酸、乙酸和乙醇。
Stols等人[37,38]发现,在大肠杆菌突变株NZN111中,表达Ascaris suum苹果酸酶能够使其生长恢复,琥珀酸的得率提高到0139mol P mol葡萄糖,琥珀酸是主要的发酵产物;进一步的研究发现,在NZN111中表达NAD+依赖的大肠杆菌苹果酸酶后几乎进行单一的琥珀酸发酵,最优条件下发酵琥珀酸的得率能够达到112g P g葡萄糖。
Charterjee等[39]对NZN111在含有卡那霉素的琼脂平板上培养后筛选到了能够重新发酵葡萄糖的自发突变株AFP111。AFP111能够发酵葡萄糖产生琥珀酸、乙酸和乙醇;并且能够利用外源氢为还原剂。当使用100%的C O2时,琥珀酸的产量可以增加到45g P L,生产能力可以达到116g P(L#h),得率可达到99%。
通过对AFP111的进一步研究发现其自发突变位置在编码PEP转移酶的基因ptsG,对于许多大肠杆菌和产乳酸杆菌的ptsG基因突变后都能够导致琥珀酸的产量上升[39]。Ve muri等人[40]进一步将编码Rhizobium etli丙酮酸羧化酶基因的质粒转移到AFP111中(AFP111P pTrc99A-pyc),通过IPTG诱导表达后,导致了琥珀酸产量的进一步提高。经过测定发酵过程中的酶活力发现,在AFP111有氧生长时,葡萄糖激酶和异柠檬酸裂解酶的活力上升。因此推测在AFP111中,存在两种葡萄糖的转运体系,并且乙醛酸循环占有一定比例。
通过对AFP111P pTrc99A-pyc的发酵条件研究发现,在两步法培养(即先有氧培养,然后无氧发酵产酸)中转换时间的选择对其产酸具有决定作用。在最适的转换条件下(即溶氧浓度开始下降,但仍为90%时),琥珀酸的最终浓度可达到9912g P L,得率为110%,生产能力113g P(L#h)[41]。
(2)Pan等人[42]以大肠杆菌W3110作为受体菌株,构建了乙酸和乳酸形成缺陷的双重突变株SS373(W3110pta::Tn10ldhA::Kan)。SS373大肠杆菌能够在葡萄糖培养基上厌氧条件下生长,因为它可以产生乙酰辅酶A,而大肠杆菌NZN111却不能。在两步法培养中,琥珀酸和丙酮酸是主要的发酵产物。当使用非PTS糖类发酵时,可以发酵产生几乎纯的琥珀酸。
Lee研究组[43]最近发表了一篇采用将大肠杆菌和M.succiniciproducens基因组进行比较,从而识别提高大肠杆菌琥珀酸产量的关键基因的方法。依照此方法识别出了ptsG、pykF、sdhA、pyk A、mqo和aceB A等关键基因。虽然全部敲除这些基因并没有导致琥珀酸的增产,但通过这些基因的组合,确实找到了ptsG、pykF、pykA的组合,基因敲除后,琥珀酸的产率可以提高7倍。
(3)Millard等人[44]通过在大肠杆菌JC L1208中过量表达PEP羧化酶,可以使其产量提高315倍,但过量表达PEP羧激酶却没有任何效果。Gorkan等人[45]通过在大肠杆菌JC L1242中表达Rhizobium etl 的丙酮酸羧化酶基因发现,pyc的表达不影响糖的消耗速率和细胞的生长速率。在无氧条件下,pyc 的表达使琥珀酸的产量提高了217倍,同时乳酸的得率明显下降。
(4)Rice大学San研究组最近连续发表多篇论文[46-49]及专利[50,51]论述了一系列大肠杆菌产琥珀酸研究。由于有氧条件下大肠杆菌具有高代谢速度和产物生成的优点,首先他们对大肠杆菌进行了基因工程改造以适应有氧发酵的条件。通过s dhAB、icd、poxB、ackA-pta、iclR等5个基因的敲除可以实
573
王庆昭等:琥珀酸发酵菌种研究进展
现对有氧条件下乙酸代谢副产物的消除以及乙醛酸循环的激活,从而使琥珀酸成为主要的发酵产物。但仍旧有相当量的柠檬酸和异柠檬酸发酵产生[47]。以sdhAB、poxB、ackA-pta、iclR四个基因敲除菌为平台,进一步通过ptsG基因敲除和PEP羧化酶的表达将有氧发酵产琥珀酸的得率提高到了理论值1mol P mol葡萄糖[49],从而显示了大规模有氧生产的潜力。
厌氧情况下,其主要采取的策略为通过基因缺失来消除代谢副产物的生成。首先发现在adhE、ldhA双缺失菌SBS110MG中表达丙酮酸羧化酶能够大幅度提高琥珀酸的得率到112mol P mol葡萄糖[48];他们通过进一步引入arcA、ack-pta、iclR基因缺失构建一系列菌株,发现在以上5个基因缺失菌SBS660MG中共同表达柠檬酸合成酶和丙酮酸羧化酶可以将厌氧琥珀酸的得率提高到接近理论值的117mol P mol葡萄糖[46],同时可以在24h内完全利用18g P L的葡萄糖。其在厌氧条件下的实验设计具有很高的理论价值,但在所有的实验中均采用了一种大接种量的接种方法(OD600=20)。在比较高的接种量下可以部分克服基因工程菌生长缓慢的缺点,但具体到工业化可能还需要做很多的工作。关于以上设计为何会导致高琥珀酸得率的理论问题,他们主要认为除了减少代谢副产物的消耗外,以上基因操作还使细胞内的可利用还原型NAD H增加,从而有利于需要更多还原力的琥珀酸发酵[50]。
(5)其他重要菌株的研究进展:除了以上所详细描述的菌种以外,Lee SY等[12,52,53]连续发表了有关产琥珀酸新菌种Mannheimia succiniciproducens MBEL55E的多篇论文。此菌株为兼性厌氧革兰氏阴性菌,在pH610~715时生长良好。厌氧发酵产生琥珀酸、乙酸、甲酸的比例为2B1B1。之后,他们进一步对此菌种的PEP羧激酶进行了克隆、测序和特性研究[54],并且在2004年对此菌株进行了全基因组测序以及基因组规模的代谢通量分析和代谢特点研究[55]。研究结果发现,此菌株非常适应CO2环境,以富马酸作为电子受体代谢;其主要产生琥珀酸的途径为TC A循环的还原臂(CO2对PEP反应成为OAA的羧化步骤非常重要)以及甲萘醌系统。这种代谢特点非常有利于高产琥珀酸。虽然此菌的总体产量和得率都不高,但能够利用木质纤维素水解液以及乳清和玉米水解液等多种碳源。以木质纤维素水解液为碳源时批培养的琥珀酸最后浓度及得率分别为11173g P L和56%,生产能力1117g P(L#h);连续培养的琥珀酸得率为55%,生产能力3119g P(L# h)[12,52]。连续培养条件下的生产能力是目前报道的最高值,显示了良好的应用前景。
除了细菌之外,许多研究者也对真菌的产琥珀酸特性作了研究。苹果酸产生菌Aspergillus s pp.能够在生产苹果酸的同时分泌占总酸大约25%的琥珀酸[56]。Penicillium sim plicissimum能够发酵葡萄糖在有氧和厌氧条件下产生少量的琥珀酸,最高产酸速率为01063g P(g DW#h)[57]。虽然琥珀酸产量比较低,但由于其能够在厌氧条件下产生单一的发酵产物,以及揭示了菌球形成和产酸的关系等原因,真菌产琥珀酸也必将是一个非常有前途的研究领域。
5菌种研究的分析和展望
对于研究比较多的产琥珀酸厌氧螺菌(ATCC 29305,ATCC53488,ATCC55617),共同存在的工业生产中的问题是:11需要严格的厌氧环境,甚至用水都必须经过脱气处理,这在工业生产中难以实现。21需要的营养条件比较复杂,往往需要添加比较昂贵的氮源,因此会造成成本的升高,也会给后提取工艺增加困难。31菌种普遍不能耐高渗透的盐和酸,因此必须采取原位分离的技术,这也为工业生产带来困难。因此必须改变菌种的严格厌氧特性和耐粗放的发酵环境,而达到这样的目的还需要付出很大的努力。
产琥珀酸放线杆菌ATCC55618的突变株是迄今报道的产琥珀酸最高的菌株,可以达到110g P L,而且能够耐一定浓度的盐溶液,具备了初步工业化生产的能力。本实验室初步研究了产琥珀酸放线杆菌ATCC55618,并对其发酵条件进行了研究。发现此菌种的营养要求比较复杂,而且在最优条件下38h 发酵产酸最高11149g P L。可以看到这个数据和报道的数据差距比较大。通过选育单氟乙酸抗性突变株,可以进一步验证菌株的产酸能力。而且由于对此菌株的相关研究很少,因此有必要对其生理状态以及发酵特性进行进一步的研究。在此基础上,将利用基因工程技术结合代谢工程的方法来确定最优的发酵代谢路线,以及反应中的关键基因和酶。
大肠杆菌是目前最有潜力的产琥珀酸发酵菌株,研究也取得了上述的众多进展。目前唯一公开报道的进行产琥珀酸中试的发酵菌株就是大肠杆菌。但大肠杆菌同样面临许多的问题。最主要的就
574Chinese J ournal o f Biotechnology生物工程学报2007,Vol123,No14
是大肠杆菌厌氧发酵比琥珀酸生成效率相对较低[最高113g P(L#h)],通常进行混合酸发酵,以及不能耐高浓度糖发酵等。
为了获得发酵菌株的全面性能改进,可以预计单独依赖对某个具体基因或途径进行考察的传统还原论方法很难获得更大的进展,而必须通过以各种组学的合理联用,以及计算机辅助的菌株设计为特征的系统生物学的方法。目前已经有了许多基于组学规模的代谢关键途径或靶点识别的研究进展[43,58],可以预计系统生物学方法必将在琥珀酸菌株的改良中发挥更重要的作用。
REFERENC ES(参考文献)
[1]Lin G T(凌关庭).Handbook of Food Additives,2nd ed.Beijing:
Chemical Indus try Pres s,1991,pp.638-639.
[2]Wang QZ(王庆昭),Wu W(吴巍),Zhao X M(赵学明).Market
analysis for bioconversion of succinic acid and its derivati ves.
Che mic al Industry and Engineering Progress(化工进展),2005,23:
794-798.
[3]Bryant MP,Small N.Characteris tics of two new genera of anaerobic
curved rods isolated from the rumen of cattle.J Bacte riol,1956,
72:22-26.
[4]Davis CP,Cleven D,Brown J.Anaerobi os pirill um,a new genus of
spira-l s haped bacteria.Int J Syst Bacte riol,1976,26:498-500.
[5]Guettler MV,Rumler D,Jain MK.Actinobacillus suc cinoge nes sp.
nov.,a novel s ucci nic aci d producing s train from the bovine rumen.
Int J Syst Bac teriol,1999,49:207-216.
[6]Clark DP.The fermentati on pathways of Esche richia c oli.FEMS
Mic robiol Re v,1989,63:223-234.
[7]Datta R,Glass ner DA,Jain MK,et al.Fermentation and purification
proces s for succinic acid,1992,US patent5,168,055.
[8]Anders on R L,Ordal EJ.CO2-dependent fermentation of glucos e by
Cytophaga succ inicans.J Bac tero p,1961,81:139-146.
[9]Sridhar J,Ei te man M A,Metabolic flux anal ysis of clostridium
thermosuccinogenges.Appl Biochem and Biotechnol,2000,94:51-
69.
[10]Skerman VB,M c Gowan V,Sneath P H A.Approved li st of bac teri al
names.Int J Syst Bacte riol,1980,30:225-420.
[11]M alburg LM,Smith DC,Schellhorn HE,e t al.Fibrobacter
succinogenes S85has multiple xylanase genes.J Appl Bac teriol,75:
564-573.
[12]Lee PC,Lee SY,Hong SH,et al.Batch and continuous cultures of
Mannhe imia succ inici produc ens MBEL55E for the production of
succinic aci d from whey and corn s teep liquor.Bioprocess Biosyst
Eng,2003,26(1):63-67.
[13]Schei fi nger CC,Wolin MJ.Propionate formation from cellulose and
soluble sugars by c ombi ned cul tures of Bacteroides succinogenes and
Selenomonas ruminantium.Appl Mic robiol,1973,26(5):789-
795.[14]Caldwell JR,Keeney M,Van Soast PJ.Effects of carbon dioxide on
growth and maltose fermentation by Bacte roide s amylo philus.J
Bac teriol,1969,98(2):668-676.
[15]O.Herri n SM,Keneaiy WR,Gl ucos e and carbon di oxide metabolis m
by Succinivibriod e xtrinosolve ns.Appl Env iron Mic robiol,1993,59:
748-755.
[16]Skerman VBD,McGowan V,Sneath P HA.Approved lists of
bacterial na mes.Int J Syst Bacte riol,1980,30:225-420.
[17]Kno wles CJ.Divers ity of Bacterial Respi ration Sys tems,Volume2.
Boca Raton:CRC Press,1980,pp.1941-1944.
[18]White DC,Bryant MP,Caldwell DR.Cytochromelinked fermentation
in Bacteroides ruminicola.J Bac teriol,1962,84:822-828. [19]Laanbroek HJ,Kingma W,Veldkamp H.Is olation of aspartate-
fermenting,freeliving Campylobucte r spe cies.FEMS Mic robiol Lett,
1997,1:99-102.
[20]Samuelov NS,Lamed R,Lowe S,e t al.Infuence of CO2-HCO3
levels and pH on growth,s uccinate production and enz yme ac tivities
of Anaerobiospirillum succiniciproducens.Appl Environ Microbiol,
1991,57:3013-3019.
[21]Podkovyrov S,Zeikus J G.Purifcation and characteriz ation of
phos phoenol pyruvate carboxykinase,a catabolic CO2-fixi ng enz yme,
fro m Anaerobiospirillum succinic iproducens.J Gen Mic robiol,1993,
139:223-228.
[22]Colombo G,Carls on G M,Lardy HA.Phosphoenol pyruvate
carboxykinas e(guanosine59-triphosphate)from rat li ver c ytosol.
Dua-l cation require ment for the carboxylati on reaction.
Bioc he mistry,1981,20:2749-2757.
[23]Cannata JB,de Flombaum MAC.Phos phoenolpyruvate carboxykinase
fro m bakers yeas t.Kinetics of phos phoenolpyruvate formati on.J
Biol Chem,1974,249:3356-3365.
[24]Gutter MF,Kolenbrander HM.Formati on of Oxal oacetate by CO2
Fixation on Phosphoenolpyruvate.In:P.Boyer ed.The Enz ymes,
3rd ed.,Vol.61Ne w York:Academic Press,1972,pp.117-1681 [25]Lai venieks M,Vieille C,Zei kus JG.Cl oni ng,sequencing and
overexpress ion of the Anae robiospirillum succ inici pro duce ns
phos phoenol pyruvate carboxykinase(pckA)gene.Appl Environ
Microbiol,1997,63:2273-2228.
[26]Jabalquinto AM,Lai venieks M,Zeikus JG,et al.Characterization of
the oxaloacetate decarboxylas e and pyruvate kinase-like activi ties of
Sacc haromyc es c erevisiae and Anae robiospirillum succ inici pro duce ns
phos phoenolpyruvate carboxykinases.J Protein Che m,1999,18:
659-664.
[27]Jabalquinto AM,Lai venieks M,Gonz lez-Nilo FD,et al.Evaluation
by site-di rected mutagenesis of acti ve si te amino aci d residues of
Anae robiospirillum succinici producens phosphoenol pyruvate
carboxykinas e.J Protein Chem,2002,21:393-401.
[28]Glassner D A,Datta R.Proces s for the production and purificati on of
succinic acid,1992,US patent5,521,075.
[29]Lee PC,Lee WG,Kwon S,et al.Succinic acid production by
Anae robiospirillum suc cinic iproduc ens:effects of the H2:CO2supply
and glucose concentrati on.Enzyme Mic rob Te chnol,1998,24:549
-554.
575
王庆昭等:琥珀酸发酵菌种研究进展
[30]Lee PC,Lee WG,Lee SY,et al.Effects of medi um components on
the growth of Anae robios pirillum succ inici pro duce ns and succinic acid
producti on.Proce ss Bioc hem,1999,35:49-55.
[31]Lee PC,Lee WG,K won S,et al.Batch and conti nuous fermentation
of succinic acid from whey by Anaerobiospirillum suc cinic iproducens.
Appl Microbiol Biotec hnol,2000,54:23-27.
[32]Guettler M V,J ai n MK.Method for making succinic acid,
Anae robios pirillum succinici produce ns variants for use i n proces s and
methods for obtaini ng variants.1996,US patent5,521,075. [33]Guettler M V,J ain MK,Rumler D.M ethod for maki ng s ucci nic acid,
bacterial variants for use in the process,and methods for obtaining
variants.1996,US patent5,573,931.
[34]Van der Werf MJ,Guettler MV,J ai n MK,et al.Environmental and
physiological factors affec ti ng th1e s ucci nate product rati o during
carbohydrate fermentation by Actinobac illus sp.130Z.Arc h
Mic robiol,1997,167:332-342.
[35]Zeikus JG,J ain MK,Elankovan P.Biotec hnology of s uccinic acid
producti on and markets for derived industrial products.Appl
Mic robiol Biotechnol,1999,51:545-552.
[36]Gottschalk G.Bacterial metabolis m,2nd ed.New York:Spri nger-
Verlag,1985.
[37]Stols L,Kulkarni G,Harris BG,et al.Expression of Asc aris suum
malic enzyme in a mutant Esche richia c oli allows production of
succinic aci d from glucose.Appl Bioc he m Biotec hnol,1997,63-
65:153-158.
[38]Stols L,Donnell y M L.Production of succinic acid through
overexpres sion of NAD+dependent malic enzyme i n an Esche richia
coli mutant.Appl Environ Mic robiol,1997,63:2695-2701. [39]Chatterjee R,Millard CS,Champion K,et al.Mutation of the ptsG
gene resul ts i n i ncreased produc tion of succinate i n fermentation of
glucose by Escheric hia coli.Appl Environ Microbiol,2001,67:148
-154.
[40]Vemuri G N,Eiteman MA,Altman E.Effects of growth mode and
pyruvate carboxylase on s uccinic acid production by metabolically
engineered strains of Esc he richia coli.Appl Environ Microbiol,
2002,68:1715-1727.
[41]Vemuri GN,Eiteman MA,Altman E.Succinate production in dua-l
phase Escherichia coli fermentations depends on the time of
transition from aerobic to anaerobic condi tions.J Ind Microbiol
Biotec hnol,2002,28(6):325-332.
[42]Pan J G,Shin SA,Park CK.P ta ldhA double mutant Escheric hia coli
SS373and the method of producing s uccinic acid therefrom.2002,
US patent6,448,061.
[43]Lee SJ,Lee DY,Kim TY,et al.Metabolic engi neering of
Esche richia c oli for enhanced production of s ucci nic acid,based on
genome comparison and in silico gene knockout simulation.Appl
Environ Mic robiol,2005,71:7880-7887.
[44]M illard CS,Chao YP,Liao JC,et al.Enhanced produc tion of
succinic acid by overexpres sion of phosphoenol pyruvate carboxyl as e
Esche richia coli.Appl Environ Mic robiol,1996,62:1808-1810.[45]Gokarn RR,Eiteman MA,Al tman E.Metabolic analysis of
Esc herichia coli in the presence and absence of the carboxylating
enzymes phosphoenolpyruvate carboxylase and pyruvate carboxylase.
Appl Environ Mic robiol,2000,66:1844-1850.
[46]Sanchez AM,Bennett G N,San KY.Novel pathway engineering
design of the anaerobic central metabolic pathway in Esche ric hia coli
to increase s ucci nate yield and productivity.Metab Eng,2005,7:
229-239.
[47]Lin H,Bennett GN,San K Y.Fed-batch cul ture of a metabolically
engineered Esc he richia c oli s train desi gned for hi gh-level succinate
production and yiel d under aerobic conditions.Biotechnol Bioeng,
2005,90:775-779.
[48]Sanchez A M,Bennett GN,San KY.Efficient succinic acid
production from glucose through overexpres sion of pyruvate
carboxylase in an Esc he richia c oli alc ohol dehydrogenase and lactate
dehydrogenase mutant.Biote chnol Prog,2005,21(2):358-365.
[49]Lin H,Bennett G N,San KY.Metabolic engineeri ng of aerobic
succinate producti on systems in Esc he richia coli to i mprove process
productivity and achieve the maxi mum theoretical succinate yield.
M e tab Eng,2005,7:116-127.
[50]San KY,Bennett GN,Sanchez AM.Hi gh molar s uccinate yield
bacteria by increasing the i ntracellular NADH https://www.doczj.com/doc/ff17753709.html,
patent2005042736.
[51]San KY,Bennett GN,Sanchez A M.Increasing intracell ular NADP H
availability in E.c oli.2005,US patent2005196866.
[52]Kim DY,Yi m SC,Lee PC,et al.Batch and continuous fermentation
of succinic acid from wood hydrolysate by Mannhe imia
suc cinic iproducens MBEL55E.Enzyme Mic rob Tec hnol,2004,35:
648-653.
[53]Hong SH,Ki m J S,Lee SY,et al.The genome sequence of the
capnophilic rumen bacteri um Mannhe imia succ inici produce ns.Nat
Biotechnol,2004,22(10):1275-1281.
[54]Lee PC,Lee SY,Hong SH.Cloning and characterization of
M annhe imia succinic iproducens MBEL55E phosphoenol pyruvate
carboxykinas e(pckA)gene.Biotec hnol Bioproce ss Eng,2002,7:
95-99.
[55]Hong SH,Ki m J S,Lee SY,et al.The genome sequence of the
capnophilic rumen bacteri um Mannhe imia succ inici produce ns.Nat
Biotechnol,2004,22(10):1275-1281.
[56]Bercovitz A,Peleg Y,Battat E,et al.Localiz ati on of pyruvate
carboxylase in organic aci d producing Aspe rgillus strains.Appl
Environ Mic robiol,1990,56:1594-1597.
[57]Gallme tzer M,Meraner J,Burgstaller W.Succinate s ynthesis and
excreti on by Penic illium simplicissimum under aerobic and anaerobic
conditions.FEMS Mic robiol Le tt,2002,210:221-225.
[58]Wang QZ,Chen T,Chen X,e t al.Genome scale in silico aided
metabolic flux analysi s comparisons for succinic acid production.
Appl Mic robiol and Biote chnol,2006,73(4):887-894.
576Chinese J ournal o f Biotechnology生物工程学报2007,Vol123,No14
发酵工程的研究进展 【前言】发酵工程是泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。它包括厌氧发酵的生产过程（如酒精、乳酸、丙酮丁醇等）和有氧发酵的生产过程（如氨基酸、柠檬酸、抗生素等）。广义的概念：生物学(微生物学、生物化学)和工程学(化学工程)结合。狭义的发酵概念：微生物培养和代谢过程。 发酵技术是人类最早通过实践掌握的生产技术之一，产品也很多，以传统食品来说，东方有酱、酱油、醋、白酒、黄酒等，西方有啤酒、葡萄酒、奶酪等。这些发酵食品都是数千年来凭借人类的智慧和经验，在没有亲眼看到微生物的情况下，巧妙地利用微生物生产的产品。 【关键词】发酵发展应用 1、发酵工程的内容 1.1 定义 发酵工程是指采用工程技术手段，利用生物（主要是微生物）和有活性的离体酶的某些功能，为人类生产有用的生物产品，或直接用微生物参与控制某些工业生产过程的一种技术。 1.2现代发酵工程 人们熟知的利用酵母菌发酵制造啤酒、果酒、工业酒精，乳酸菌发酵制造奶酪和酸牛奶，利用真菌大规模生产青霉素等都是这方面的例子。随着科学技术的进步，发酵技术也有了很大的发展，并且已经进入能够人为控制和改造微生物，使这些微生物为人类生产产品的现代发酵工程阶段。 现代发酵工程作为现代生物技术的一个重要组成部分，具有广阔的应用前景。例如，用基因工程的方法有目的地改造原有的菌种并且提高其产量；利用微生物发酵生产药品，如人的胰岛素、干扰素和生长激素等。已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。 现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶、维生素和单细胞蛋白等。 1.3组成 从广义上讲，发酵工程由三部分组成：是上游工程，中游工程和下游工程。 1.3.1 上游工程：包括优良种株的选育，最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定，营养物的准备等。 1.3.2 中游工程：主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。这里要有严格的无菌生长环境，包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。
生物工程专业综合实训 （2016 年 11 月
谷氨酸生产工艺 摘要： 谷氨酸做为一种人体所必须的氨基酸，在生命的生理活动周期中具有很大的作用。不仅参与各种蛋白质的合成，组成人体结构，还做为味精可以给我们带来味蕾上的享受。现代生产谷氨酸的工艺主要是利用微生物发酵提取而来。不同的发酵方法和不同的发酵条件会造成产量的很大不同。本次谷氨酸的生产工艺，主要是掌握发酵方法和发酵条件的控制，还有各种仪器的使用方法。通过测得的数据来观察菌种的生长变化，同时谷氨酸发酵工艺各个工段的原理和使用方法。关键词：谷氨酸；发酵；工艺；等电点。
引言 谷氨酸是一种酸性氨基酸，是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。不论在食品、化妆品还是医药行业，谷氨酸都有很大的用途。 谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。医学上谷氨酸主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。食品工业上，味精是常用的仪器增鲜剂，其主要成分是谷氨酸钠盐。过去生产味精主要用小麦面筋（谷蛋白）水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产。不论在食品、化妆品还是医药行业，谷氨酸都有很大的用途。 谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。用于食品内，有增香作用。甘氨酸具有甜味，和味精协同作用能显着提高食品的风味。谷氨酸作为风味增强剂可用于增强饮料和食品的味道，不仅能增强食品风味，对动物性食品有保鲜作用。
一、谷氨酸简介 谷氨酸一种酸性氨基酸。分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊1856年发现的，为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。医学上谷氨酸主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。食品工业上，味精是常用的仪器增鲜剂，其主要成分是谷氨酸钠盐。过去生产味精主要用小麦面筋（谷蛋白）水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产。 谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。L －谷氨酸是蛋白质的主要构成成分，谷氨酸盐在自然界普遍存在的。多种食品以及人体内都含有谷氨酸盐，它即是蛋白质或肽的结构氨基酸之一，又是游离氨基酸，L型氨基酸美味较浓。 L－谷氨酸又名“麸酸”或写作“夫酸”，发酵制造L－谷氨酸是以糖质为原料经微生物发酵，采用“等电点提取”加上“离子交换树脂”分离的方法而制得。 谷氨酸产生菌主要是棒状类细菌，这类细菌中含质粒较少，而且大多数是隐蔽性质粒，难以直接作为克隆载体，而且此类菌的遗传背景、质粒稳定尚不清楚，在此类细菌这种构建合适的载体困难较多。需要对它们进行改建将棒状类细菌质粒与已知的质粒进行重组，构建成杂合质粒。受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株，特别是选用谷氨酸缺陷型变异株为受体，便于从转化后的杂交克隆中筛选产谷氨酸的个体，用谷氨酸产量高的野生菌或变异菌作为受体效果更好。供体菌株选择短杆菌及棒杆菌属的野生菌或变异株，只要具有产谷氨酸能力都可选用, 但选择谷氨酸产量高的菌株作为供体效果最好。这样就可以较容易地在棒状类细菌中开展各项分子生物学研究。有了合适的载体及其转化系统后，就可通过DNA体外重组技术进行谷氨酸产生菌的改造。这对以后谷氨酸发酵的低成本、大规模、高质量有较大的发展空间。
发酵工艺标准操作流程 (SOP) 一生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量足够下次生产所需、 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路就是否畅通,所有阀门就是否良好,并关闭所有阀门、 2检查电路、控制柜、开关的状态,确保控制柜运行正常、 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等就是否正常,确保空压机运行正常、 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水就是否正常、 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0、2-0、25MPa时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0、15-0、2MPa,此时打开压力表下跑分,计时灭菌2-2、5小时、灭菌结束后启动空压机,当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0、15-0、2MPa,保持通气在15-20小时,当出气阀跑分与排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌、 四分过滤器灭菌 1当蒸汽管路压力为0、2-0、25MPa时,打开蒸汽过滤器的进气阀与排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,就是压力稳定在0、11-0、15MPa,计时灭菌30-35分钟、灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器,再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0、11-0、15MPa,备用、
第三章发酵工业微生物菌种 微生物发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种有用物质的现代工业，它是以培养微生物进行发酵为主。而在这个过程中，优良的菌种是一个现代化的发酵工业必不可少的，最为重要的环节。其他如先进的生产工艺和先进的设备，则是为了更充分发挥优良菌种的性能而设计的。 第一节工业微生物菌种的分离和选育 第二节工业微生物菌种的改良 第三节发酵工业中菌种的退化 第四节工业微生物菌种的保藏 第五节工业微生物菌种的扩大培养 第一节工业微生物菌种的分离和选育 一般来说，从自然界直接分离到的菌种，不能立即适应实际的生产需要，只有通过选育，才能提高代谢产物的产量、改进产品质量直至简化工艺。在微生物发酵工业中生产菌种的选育方法有：?微生物菌种的分离和选育 ?菌种的改良 第一节工业微生物菌种的分离和选育 一、微生物菌种的选育 二、微生物常规育种 三、根据代谢的调节机理选择高产突变菌株 一、微生物菌种的选育 从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤： 1、采样 2、增殖培养 3、纯种分离 4、性能测定 1、采样 采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。如果不了解某种生产菌的具体来源，一般可以从土壤中分离。 ①、确定选好地点 取离地面5——15cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备查考。 ②、尽快分离 一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌孢子忍耐不良环境能力较强，不太容易死亡。但一般应尽快分离。
③、酵母菌或霉菌类微生物采样 酵母菌或霉菌类微生物，它们对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸环境，所以在普通植物花朵、瓜果种子及腐植质等上面比较多。 2、增殖培养 收集到的样品，如含有所需的菌种较多，可直接进行分离。如果样品含有所需要的菌种很少，就要设法增加该菌种的数量，进行增殖（富集）培养。 富集培养： 富集培养就是指利用不同微生物之间的生命活动特点的不同，制定出特定的环境条件，使仅仅适应于这种条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加的微生物的分离方法。人们能够利用这种方法很容易地从自然界中分离到所需要的特定微生物。富集的条件可根据所需分离的微生物特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。 3、纯种分离 通过增殖培养还不能得到微生物单一的纯种，有必要进行分离纯化，来获得纯种。 这是因为生产菌种在自然条件下通常是与各种菌混杂在一起的。 纯种的分离方法很多，常用的有划线法和稀释法。 ①、划线法 ①、划线法——是将含有菌样的样品在固体培养基表面作有规则的划线培养。 ?扇形划线法、 ?方格划线法 ?平行划线法等 菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。 ②、稀释法。 是通过不断地稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种 ③、两种方法的比较 ③、两种方法的比较 ?划线法简单较快； ?稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的机率大，特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。 为了提高筛选的工作效率，除增殖培养时应控制增殖条件外，在纯种分离时，培养条件对筛选结果影响也很大，一般可通过： ?控制营养成分 ?调节培养基PH ?添加抑制剂
江西科技师范学院 生物工程专业《化工原理课程设计》说明书 题目名称2m3 产谷氨酸发酵罐的设计 专业班级2009 级生物工程（1）班 学号 学生姓名唐盼阙素云周婷 指导教师常军博士 2011 年10 月31 日
目录 一、设计方案的确定1 谷氨酸的生产工艺流程1 生产原料1 发酵菌株1 培养基的制备2 二、发酵罐主体设计计算2 发酵罐主要条件及主要技术指标2 罐体选型、几何尺寸的确定、罐体主要部件尺寸的设计计算3发酵罐的选型3 发酵罐容积的确定 3 发酵罐装液量的确定3 冷却装置的设计3 罐体选料4 罐体壁厚4 封头壁厚计算5 夹套直径5 挡板的设计5 搅拌器的设计5 搅拌器的计算5 搅拌轴功率的计算 6 管道设计8 通风管管径计算8 进出物料管8 冷却水进出口管径 8 管道接口8 仪表接口8 三、其他附件选型9 四、附录及图纸10 附录1计算结果汇总表10 附录2计算结果汇总表10 五、总结11 六、参考文献及资料12
一、设计方案的确定 谷氨酸的生产工艺流程 谷氨酸的生产主要包括以下工作：谷氨酸发酵的原料处理和培养基的配制； 子培养；发酵工艺条件的控制；谷氨酸提取；谷氨酸的精制。 发酵法生产谷氨酸的工艺流程如下： 图1 谷氨酸生产工艺流程图 生产原料 谷氨酸生产时发酵原料的选择原则：首先考虑菌体生长繁殖的营养；考虑到有利于谷氨酸的大量积累；还要考虑原料丰富，价格便宜；发酵周期短，产品易提取等因素。目前谷氨酸生产上多采用尿素为氮源，采用分批流加，以生物素为生长因子。国内大多数厂家用淀粉为发酵原料，主要有玉米、小麦、甘薯、大米等，其中甘薯的淀粉最为常用。少数厂家用糖蜜为发酵原料，主要有甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。 发酵菌株 现有谷氨酸生产菌分属于棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属。目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。目前国内各味精厂所使用的谷氨酸生产菌主要有（1）纯齿棒状杆菌及其 （2）天津短杆菌T613及其诱变株FM-415、CMTC6282、诱变株B9、B9-17-36、F-263等菌株； S9114等菌株；（3）北京棒杆菌及其诱变株D110等菌株。本实验选择北京棒杆菌。
绿色环保型阻垢剂聚环氧琥珀酸的研究进展 于莉莉李国云 弗克科技（苏州）有限公司 摘要：详细叙述了绿色阻垢剂聚环氧琥珀酸的合成及其性能，并对其发展方向作出了展望。关键词：绿色阻垢剂，合成，性能 1前言 21世纪，全球都面临着水资源紧缺的突出矛盾，特别是中国。中国水资源匮乏，加上水环境污染严重，可利用的水资源很少，因此如何节约和保护水资源成为当务之急。节约水资源最主要的是节约工业冷却水。其主要方法是循环利用冷却水，提高浓缩倍率，但由于不断的蒸发和浓缩，水中的各种矿物质、藻类及泥沙等不断增多，会导致设备结垢、腐蚀和造成水质污染。这样，就要求向水中投加药剂，以减少损害，其中，使用最多的为投加阻垢剂。 绿色化学是20世纪90年代出现的一个多学科交叉的研究领域[1]，随着人们环境保护意识的不断增强，绿色化学成为研究的重点。在水处理化学中，开发可生物降解的“环境友好”型水处理化学品已经越来越受到人们的重视，成为21世纪中水处理领域的一个重要发展方向，研究绿色阻垢剂也成为当前水处理剂研究中的重要课题。 绿色阻垢剂的发展经历了由天然高分子绿色阻垢剂到人工合成型绿色阻垢剂的过程。天然绿色阻垢剂因其原料来源广泛、无毒、易降解、价廉和易回收等特点，在水处理界得到高度的重视和广泛的研究，发展也很快。常见的天然高分子绿色阻垢剂有葡萄糖酸钠、木质素、淀粉和单宁及其衍生物等[2]。由于天然绿色阻垢剂具有投加量大（50~200mg/L）高温条件下易分解、杂质含量高等缺陷，现在应用较少。目前发展的人工合成型绿色阻垢剂主要包括聚天冬氨酸（PASP）和聚环氧琥珀酸（PESA）。这两种阻垢剂是目前国际公认的具有无磷、可生物降解特性的绿色水处理剂。本文主要介绍PESA的合成、性能及其发展。 2 PESA的发展 聚环氧琥珀酸（PESA）是20世纪90年代初由美国Betz实验室首先开发出来的一种绿色水处理剂[3,4]。下面为聚环氧琥珀酸钠的结构式：
发酵工程发展现状及趋势 引言 发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。发酵技术有着悠久的历史，早在几千年前，人们就开始从事酿酒、制酱、制奶酪等生产。作为现代科学概念的微生物发酵工业，是在20世纪40年代随着抗生素工业的兴起而得到迅速发展的，而现代发酵技术又是在传统发酵技术的基础上，结合了现代的基因工程、细胞工程、分子修饰和改造等新技术。由于微生物发酵工业具有投资少、见效快、污染小、外源目的基因易在微生物菌体中高效表达等特点，日益成为全球经济的重要组成部分。 摘要 当前，发酵工程的应用是十分广泛的，在不同的工业领域中都有重要应用，例如医药工业、食品工业、能源工业、化学工业、农业、环境保护等，且随着生物技术的发展，发酵工程的应用领域也在不断扩大。 一、发酵工程在各领域的发展现状 1、医药行业 微生物发酵是生物转化法之一,在中药中早有应用。真菌是发酵中药的主要功能菌。发酵时大都采用单一菌种纯种发酵法。现代中药发酵技术分为液体发酵和固体发酵。中药发酵技术按应用方式可分为无渣式和去渣式,前者可直接用药,后者要提取和制剂用药。发展发酵中药可进一步推进中药现代化和国际化进程,提高中药行业的竞争力,为中药走向世界、造福人类作出新的贡献。 2、食品工业 现代化生物技术的突飞猛进，改写了食品发酵工艺的历史。据报道，由发酵工程贡献的产品可占食品工业总销售额的15%以上。目前利用微生物发酵法可以生产近20种氨基酸。该法较蛋白质水解和化学合成法生产成本低，工艺简单，且全部具有光学活性。 3、能源工业 乙醇作为一种生产工艺成熟，生产原料来源广泛的替代能源越来越受到人们的关注。燃料酒精不仅可以缓解能源短缺的问题，从长远的利益和能源的可再生性来看，燃料酒精又是一种潜力巨大的物能源。酒精发酵的方式有间歇式发酵、半连续式发酵和连续发酵。
目录1.谷氨酸发酵生产工艺简介 1.1工艺流程 1.2工艺参数 1.3工艺要求 2串级控制系统特点与分析 2.1串级系统特点 2.2串级控制结构框图及分析 3控制方案 3.1总体方案 3.2系统放图 3.3待检测点的控制系统流程图 4仪表的选型 4.1热交换器 4.2仪表清单 5控制算法选择 5.1控制规律 5.2调节器正反作用的选择 6总结 7参考文献 附图
串级控制系统-----两只调节器串联起来工作，其中一个调节器的输出作为另一个调节器的给定值的系统。 例：加热炉出口温度与炉膛温度串级控制系统 1. 基本概念即组成结构
串级控制系统采用两套检测变送器和两个调节器，前一个调节器的输出作为后一个调节器的设定，后一个调节器的输出送往调节阀。 前一个调节器称为主调节器，它所检测和控制的变量称主变量（主被控参数），即工艺控制指标；后一个调节器称为副调节器，它所检测和控制的变量称副变量（副被控参数），是为了稳定主变量而引入的辅助变量。 整个系统包括两个控制回路，主回路和副回路。副回路由副变量检测变送、副调节器、调节阀和副过程构成；主回路由主变量检测变送、主调节器、副调节器、调节阀、副过程和主过程构成。 在该反应中，主要控制的指标是釜温。但由于测量元件的测量滞后，以及由于测量套管插入其内，在套管的外表面有反应发生，很容易造成釜温的假象。因此在升温-恒温控制的过程中需要热水和冷水的交换切换，以便使谷氨酸发酵充分反应，提高产品质量。 主、副变量，主、副控制器（调节器），主、副对象，主、副检测变送器，主、副回路。 作用在主、副对象上的干扰分别为一、二次干扰 系统特点及分析 * 改善了过程的动态特性，提高了系统控制质量。 * 能迅速克服进入副回路的二次扰动。 * 提高了系统的工作频率。 * 对负荷变化的适应性较强 串级控制系统的特点：
第一章、绪论 一、琥珀酸简介： 早在1550年，.Agricold 首先用蒸馏琥珀的方法得到丁二酸，并由此得名琥珀酸⑴ 它是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，并广泛地用于医 药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料和照相材料工业，是合成 30多种重要商业 产品关键化合物，具有很高的商业价值。随着国民经济的迅速发展?琥珀酸的使用量和 需求量正在日益增大，目前，琥珀酸大体是由化学法生产的，但直接生产出来的琥珀酸 纯度未达标，市场要求的琥珀酸纯度一般大于 95%,而除了采用顺酐加氢法制琥珀酸时 产品中的琥珀酸纯度会大于 90%以外，其它方法生产琥珀酸产物中琥珀酸的含量通常 都很低，尤其是生物发酵法和石蜡氧化法生产的产品，含有许多种副产物，产物中琥珀 酸的浓度不会大于30%，因此提纯琥珀酸至关重要。在这一背景下，研究一种更有效 的琥珀酸提纯技术便是非常有必要的。 图1琥珀酸为基础的化学制品 1.1.1物理性质 琥珀酸(Succinic Acid ，Butanedioic Acid)，分子式 C 4H 6O 4,分子量 118. 09, 大亂生产型化学品 专业代学品 帕物牛长则激物 1,4 + 丁二静 四翅咲哺 J 内酯 2- 4-亂基丁醸 峙来酸肝 马来酸 弭基琥tflrtt 天#穌酸 丁嫦二 ?剂 二甲華/二乙棊 — 琥珀股盐‘ 4,4-酣类 饲料添加剂 信品廉料 绿色瘠剂 消面嗣- 农面活性剤 保世品
图2琥珀酸结构式 琥珀酸性状为无色三斜晶体或单斜晶体，熔点460—461K，溶于水、乙醇、乙醚等溶剂中，几乎不溶于苯、二硫化碳、四氯化碳和乙醚。琥珀酸无臭，低毒，可燃。比重 1. 572,熔点180C ---187 C,沸点235C （分解）。 温度（C）0 10 20 25 30 40 50 60 70 80 溶解度 （W/W%） 2.80 4.51 6.80 8.06 10.58 16.21 24.42 35.83 51.07 7.07. 1.1.2化学性质 琥珀酸具有二元酸大多数的典型反应，由于琥珀酸分子含有两个活泼的亚甲基，因此又具有许多别的重要反应特性，如卤化、脱水、酯化、磺化、酰化、氧化、还原等。琥珀酸具有优良的性质，所以可合成多种复杂有机物的中间体和制造药物，广泛用于合成塑料、橡胶、医药、食品、涂料等工业中。丁二酸是二元羧酸，134. 8°C时两个羧基脱水生成丁二酸酐，水中可解离为质子和丁二酸根阴离子。 琥珀酸及琥珀酸盐可以参与很多化学反应，其主要反应如下 ①氧化作用：与H2O2反应，氧化为过氧丁二酸。KMnO 4作用下生成草酸等化合物。 ②还原作用：在还原剂作用下还原为I，4.丁二醇和四氢呋喃。 ③可与SQ反应生成2，3—二磺酸基丁二酸。 ④酯化反应：与醇反应脱水可得一系列单酯和双酯。 图3琥珀酸与氨化合物反应 ⑦与氯化铁溶液反应：氯化铁溶液与琥珀酸盐在中性溶液中作用时，即有碱式琥珀 酸铁的淡棕色沉淀形成；同时有若干游离的琥珀酸生成，致溶液呈酸性反应。 3C2H4（CO2Na）2+2FeCl3+2H2O2—C 2H4（CO2）2Fe（OH）+6NaCI+C 2H4（CO2H）2 1.2、琥珀酸的市场及其用途 琥珀酸是一种二羧酸，是三羧酸循环的中间产物，同时也是厌氧代谢的发酵产物之 一，很多微生物生产琥珀酸盐做为它们能量代谢的主要终产物。琥珀酸已被美国FDA 认定为GRAS（一般认为安全），这使得它可以用于多种用途。它是一种重要的二元羧酸平台化合物，是制造新一代生物可降解材料PBS聚酯的主要原料，利用可再生的非粮生物质资源及C（）2 ⑤卤代反应：与PCI3、PCI5反应生成丁二酰氯。
生物技术121班刘倩芸 0116 我国发酵工程的发展现状和发展趋势 引言 发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。发酵技术有着悠久的历史，作为现代科学概念的微生物发酵工业是在传统发酵技术的基础上，结合了现代的基因工程、细胞工程等的新技术。由于发酵工业具有投资少、见效快、污染小等特点，日益成为全球经济的重要组成部分。 摘要：发酵工业是指人们利用微生物的发酵作用大规模生产发酵产品的一门传统工业。至今，我国已形成了一个品种繁多，门类较齐全，具有相当规模的独立工业体系，在不同的工业领域中都有重要应用，例如医药工业、食品工业、农业、环境保护等，且随着生物技术的发展，发酵工程的应用领域也在不断扩大。【1】 关键词：我国发酵工业现状趋势问题意见 很早以前，人们就利用发酵技术来生产产品，直到近代才发现发酵是由微生物引起的。发酵工业自20世纪60年代以来迅猛发展，所涵盖的产品也从原来的抗生素、食品等几个方面渗透到人民生活的各方面如医药、保健、农业、环境、能源、材料等。发酵工业是一种以高科技含量为特征的新型工业。发酵工业的迅速发展不仅带动了相关行业的发展，而且对提高产品质量及改善环境等，发挥了重要作用。【2】 一、我国发酵发展的历史 我国传统发酵历史悠久，在《黄帝内经素向》、《汤液醪醴论》里，
已有酿酒的记载。在汉武帝时代开始有了葡萄酒，距今已有两千多年的历史。改革开放促进了社会经济和科学技术的迅速发展，发展了一批具有现代生物技术特征的新产品，使发酵工业进入了一个新的发展阶段。【3】二、我国发酵工业的现状 我国生物化工行业经过长期发展，已有一定基础。特别是改革开放以后，生物化工的发展进入了一个崭新的阶段。目前生物化工产品也涉及医药、保健、农药、食品与饲料、有机酸等各个方面。 随着科技创新和技术进步的推进，科技推广应用和产业化步伐的加快，发酵产业产品空间进一步拓展、产业链不断延伸，发展前景更加广阔。【4】 我国发酵工业的巨大发展不仅在于产量的巨大提升，更在于发酵技术和发酵工艺的巨大进步。当前发酵技术进步主要表现为1．技术经济指标有明显提高；2．工艺技术有重大改进；3．装备水平大大改善。【5】 三、发酵工程在各领域的发展现状 医药行业 微生物发酵是生物转化法之一,在中药中早有应用。真菌是发酵中药的主要功能菌。发酵时大都采用单一菌种纯种发酵法。现代中药发酵技术分为液体发酵和固体发酵。中药发酵技术按应用方式可分为无渣式和去渣式,前者可直接用药,后者要提取和制剂用药。 食品工业 现代化生物技术的突飞猛进，改写了食品发酵工艺的历史。据报道，由发酵工程贡献的产品可占食品工业总销售额的15%以上。目前利用微生
1味精的生产工艺流程简介 味精的生产一般分为制糖、谷氨酸发酵、中和提取及精制 等4个主要工序。 1．1液化和糖化 因为大米涨价，目前大多数味精厂都使用淀粉作为原材 料。淀粉先要经过液化阶段。然后在与B一淀粉酶作用进入糖 化阶段。首先利用一淀粉酶将淀粉浆液化，降低淀粉粘度并 将其水解成糊精和低聚糖，应为淀粉中蛋白质的含量低于原来 的大米，所以经过液化的混合液可直接加入糖化酶进入糖化阶 段，而不用像以大米为原材料那样液化后需经过板筐压滤机滤 去大量蛋白质沉淀。液化过程中除了加淀粉酶还要加氯化钙， 整个液化时间约30min。一定温度下液化后的糊精及低聚糖在 糖化罐内进一步水解为葡萄糖。淀粉浆液化后，通过冷却器降 温至60℃进入糖化罐，加入糖化酶进行糖化。糖化温度控制在60℃左右，PH值4．5，糖化时间18-32h。糖化结束后，将糖化罐加热至80 85℃，灭酶30min。过滤得葡萄糖液，经过压滤 机后进行油水分离(一冷分离，二冷分离)，再经过滤后连续消 毒后进入发酵罐。 1．2谷氨酸发酵发酵 谷氨酸发酵过程消毒后的谷氨酸培养液在流量监控下进入谷氨酸发酵罐，经过罐内冷却蛇管将温度冷却至32℃，置入 菌种，氯化钾、硫酸锰、消泡剂及维生素等，通入消毒空气，经一
段时间适应后，发酵过程即开始缓慢进行。谷氨酸发酵是一个 复杂的微生物生长过程，谷氨酸菌摄取原料的营养，并通过体 内特定的酶进行复杂的生化反应。培养液中的反应物透过细胞 壁和细胞膜进入细胞体内，将反应物转化为谷氨酸产物。整个 发酵过程一般要经历3个时期，即适应期、对数增长期和衰亡期。每个时期对培养液浓度、温度、PH值及供风量都有不同的 要求。因此，在发酵过程中，必须为菌体的生长代谢提供适宜的生长环境。经过大约34小时的培养，当产酸、残糖、光密度等指标均达到一定要求时即可放罐。 1．3 谷氨酸提取与谷氨酸钠生产工艺 该过程在提取罐中进行。利用氨基酸两性的性质，谷氨酸 的等电点在为pH3．0处，谷氨酸在此酸碱度时溶解度最低，可经长时间的沉淀得到谷氨酸。粗得的官司谷氨酸经过于燥后分 装成袋保存。 1．4谷氨酸钠的精制 谷氨酸钠溶液经过活性碳脱色及离子交换柱除去C a 、 Mg 、F e 离子，即可得到高纯度的谷氨酸钠溶液。将纯净的 谷氨酸钠溶液导入结晶罐，进行减压蒸发，当波美度达到295 时放入晶种，进入育晶阶段，根据结晶罐内溶液的饱和度和结 晶情况实时控制谷氨酸钠溶液输入量及进水量。经过十几小时 的蒸发结晶，当结晶形体达到一定要求、物料积累到80％高度时，将料液放至助晶槽，结晶长成后分离出味精，送去干燥和筛
【关键字】化学、生物、设计、指南、建议、方法、条件、进展、空间、效益、质量、增长、传统、问题、矛盾、系统、机制、有效、大力、深入、继续、现代、合理、优良、公开、健康、持续、合作、保持、发展、建立、提出、发现、研究、突出、关键、热点、成果、根本、基础、需要、素质、环境、工程、途径、资源、能力、需求、方式、作用、规模、结构、水平、形势、速度、增强、检验、分析、借鉴、调控、形成、拓展、丰富、保护、推广、满足、服务 中药发酵技术研究进展 摘要：现代生物技术与中药传统发酵制药技术的有机结合为中药发酵技术的迅速发展提供了广阔的空间，与传统发酵工艺技术相比，现代中药发酵技术有了长足的进步。对现代中药发酵技术进行初步概述、总结，着重介绍当前发酵技术中的热点——药用真菌双向性固体发酵技术，而后对现代中药发酵技术的优势及前景进行探讨，为进一步的探索研究奠定基础。 关键词：中药；发酵；双向性发酵 Research survey on fermentation of Chinese materia medica Abstract: The combination of the modern biotechnology and traditional fermentation technology of Chinese materia medica (CMM) provides a broad space for the rapid development of fermentation technology of CMM. Compared with the traditional fermentation technology, the modern fermentation technology has made considerable progress, this paper attempts to preliminarily summarize the modern medicine fermentation technology for CMM, and emphasizes the hotspot in the current fermentation technology―medicinal fungi bidirectional solid-state fermentation technology, then discusses the advantages and prospect of fermentation technology in order to lay the foundation for the further study. Key words: Chinese materia medica; fermentation; bidirectional fermentation 中医中药作为中华民族的瑰宝，在预防和治疗 疾病方面做出了突出贡献。近年来，随着人们对健 康的日益关注，国际市场对天然药物以及传统药物 的需求正迅速上升 [1-2] 。我国拥有极为丰富的中药资 源，但是中药成分结构复杂，有效成分的量低，且 人工不易合成，而中药的人工培植又面临成本高、 周期长的问题，因而难以达到工业化生产的要求， 无法满足日益增长的市场需求 [3] 。究其根本原因， 在于我国中药现代化技术水平较低，无法满足中药 现代化发展的需要。而随着现代生物技术的日益发 展，其与中药发酵技术的有机结合为解决这一矛盾 提供了广阔的空间
1、味精是L-谷氨酸单钠的商品名称，含有一分子的结晶水，其分子式为NaC5H8O4N·H2O 2、国内味精厂所使用的谷氨酸生产菌株主要有北京棒杆菌AS1.299、钝齿杆菌AS1.542 和天津短杆菌T 6-13三类。 3、谷氨酸发酵中，谷氨酸产生菌只有一条生物合成途径中，生成谷氨酸的前体物为α-酮戊二酸。而在赖氨酸发酵中，存在两条不同的生物合成途径，即二氨基庚二酸途径和α-氨基己二酸途径 4、谷氨酸制味精过程中，中和操作时一般应先加谷氨酸后加碱，否则会发生消旋化，生成DL- 谷氨酸钠。 5、在谷氨酸发酵中，溶解氧的大小对发酵过程有明显的影响。若通气不足，会生成乳酸或琥珀 酸，若通气过量，会生成ɑ－酮戊二酸 6、从发酵液中提取赖氨酸，目前一般采用离子交换方法。影响提取得率最大的是菌体和钙离子 7、谷氨酸的晶型分为α-型结晶和β-型结晶两种，等电点提取谷氨酸时，首先必须形成一定数量 的晶核，然后才能进行育晶。谷氨酸起晶有自然起晶和加晶种起晶两种方法。 8在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶有谷氨酸脱氢酶（GHD）、转氨酶（AT）和谷氨酸合成酶（GS）三种。 9、L–谷氨酸在水溶液中的等电点是3.22，L–赖氨酸的等电点是6.96 10、在谷氨酸发酵过程中，对生物素的要求是亚适量，而在赖氨酸发酵生产中要求生物素过量。 11、游离的赖氨酸具有很强的呈盐性，因此，一般工业制造产品是以赖氨酸盐酸盐形式存在，其化学性质相当稳定。 二、单项选择题（共10小题，每小题2分，共20分） 得分评卷人 1、下列菌株中，_C_属于赖氨酸产生菌。 A．Hu7251 B．FM84-415 C．AS1.563 D．WTH-1 2、下列哪种氨基酸发酵是在供氧不足的条件下产酸最高？（D ） A．精氨酸B．赖氨酸C．苏氨酸D．亮氨酸 3、谷氨酸发酵产酸期的最适温度一般为（C ）。 A．30℃~32℃B．32℃~34℃C．34℃~37℃D．38℃~40℃ 4、在谷氨酸（AS1.299菌）发酵中后期，为有利于促进谷氨酸合成，pH值维持在___C__范围为好。A．pH6.2~6.4 B．pH6.8~7.0 C．pH7.0~7.2 D．pH7.3~7.6
琥珀酸工业发酵菌种 ——大肠埃希氏菌Escherichia coli CICC 23845 z背景 琥珀酸是重要的生物基平台化合物，在食品、医药、新材料等领域有着重要的应用价值，利用农副产品进行生物转化生产琥珀酸是目前产业发展的一个趋势。大肠埃希氏菌CICC 23845是分离于黄牛瘤胃，并经多重诱变筛选获得的高产琥珀酸生产菌种。 z生产特性描述： 产量: ≥70 g/L； 转化率: ≥70%； 验证规模: 30m3； 生产原料: 薯类、玉米、大米等淀粉质原料的糖化液； 发酵温度: 38℃； 发酵周期: 48~60 h； 需氧特性: 厌氧； 说明: 非转基因高转化琥珀酸发酵菌种。 z发酵产物HPLC图谱：
z菌体形态：SEM照片 z GENEBANK 登录号：KR824068（16S rDNA） z生理生化特性： 碳源产酸： 甘油 ＋赤藓糖醇 － D‐阿拉伯糖 ＋ L‐阿拉伯糖 ＋ D‐核糖 ＋D‐木糖 ＋ L‐木糖 － 阿东醇 － β‐甲基‐D‐木糖苷 －D‐半乳糖 ＋ D‐葡萄糖 ＋ D‐果糖 ＋ D‐甘露糖 ＋L‐山梨糖 － L‐鼠李糖 ＋ 卫矛醇 ＋ 肌醇 －甘露醇 ＋ 山梨醇 ＋ 葡萄糖酸钾 ＋ α‐甲基‐D‐葡萄糖 －N‐乙酰葡糖胺＋ 苦杏仁苷 － 熊果苷 － 苷 七叶灵 －水杨苷 － D‐纤维二糖 － D‐麦芽糖 ＋ D‐乳糖 ＋D‐蜜二糖 ＋ D‐蔗糖 ＋ D‐海藻糖 ＋ 菊糖 －D‐松三糖 － D‐棉籽糖 ＋ 淀粉 － 糖原 －木糖醇 － D‐龙胆二糖 ＋ D‐土伦糖 － D‐来苏糖 －D‐塔格糖 － D‐岩藻糖 － L‐岩藻糖 ＋
D‐阿拉伯醇 －L‐阿拉伯醇 － α‐甲基‐D‐甘 露糖苷 － 2‐酮基‐葡萄 糖酸盐 － 5‐酮基‐葡萄糖 酸盐 － 其它： β‐半乳糖苷酶 ＋精氨酸双水解 酶 － 赖氨酸脱羧 酶 － 鸟氨酸脱羧 酶 ＋ 色氨酸脱氨酶 －脲酶 － 柠檬酸利用－ H2S产生 － 吲哚产生 ＋VP 试验 － 明胶水解 － 符号说明：“+”，阳性；“-”，阴性；“+w”，弱阳性。
发酵工程综述 娄宏跃 （12级生物工程专业（1）班） 摘要：抗体酶是具有催化活性的免疫球蛋白，又被称为催化抗体。[1]由于它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性，因而催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值。本文主要对抗体酶的生产工艺及其应用进行综述。 关键词：抗体酶；发酵；微生物；酶工程 前言： 自从1986年Schultz和Lerner首次证实由过渡态类似物为半抗原,通过杂交瘤技术产生的抗体具有类似酶的催化活性以来,抗体酶一直是科学界的“宠儿”。[2]短短十几年,抗体酶已显示出在许多领域的潜在应用价值,包括许多困难和能量不利的有机合成反应,前药设计,临床治疗,材料科学等多个方面。抗体酶和天然酶在功能上有许多相似之处,如催化效率高,具有专一性、区域和立体选择性,可进行化学修饰和具有辅助因子等,并且在饱和动力学与竞争性抑制方面也极其相似。 一、抗体酶的发现 1946年，Pauling用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。他指出，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。这个过渡态构型中某些键在形成，另一些键在断裂，存在时间极短，半衰期约为10 ~10 s，实际中极难捕获。[3]同时，Pauling又指出酶和抗体的根本不同在于前者选择性的结合一个化学反应的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子。 既然过渡态分子难以捕获，而过渡态类似物是能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质，于是人们就设想，只要寻找到与反应中决定性步骤的相应酶紧密结合的酶竞争性抑制剂，就等于发现了过渡态类似物；还有一种思路，就是这种类似物也能根据化学反应机制推测设计出来。然后，以过渡态类似物为半抗原，利用哺乳动物的免疫系统，诱导与其互补构象的抗体产生，这种抗体即具有催化活性——这就是1969年
发酵法产琥珀酸 琥珀酸,学名丁二酸,广泛存在于动植物和微生物体内,是生物进行TCA循环的中间产物之一。它是一种重要的有机合成中间体,主要应用于食品、医药、生物降解塑料、表面活性剂、洗涤剂、绿色溶剂和动植物生长刺激物等领域。人们主要是利用化学合成的方法,从丁烷通过顺式丁烯二酐生产琥珀酸。该方法以石油为原料,生产成本高,环境污染严重,从而限制了琥珀酸的广泛应用。因此,人们开始将目标转向通过生物发酵法来生产琥珀酸。微生物发酵生产琥珀酸以可再生资源糖和二氧化碳等作为主要原料,不仅摆脱了对石油化工原料的依赖,而且可以固定二氧化碳,减少温室气体,绿色环保,具有一定的环境效益。在众多的琥珀酸生产菌中，目前研究最多的是琥珀酸放线杆菌( Actinobacillus succinogenes ) , 产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens) , 产琥珀酸厌氧螺(Anaerobiospirillum succiniciproducens) 和大肠杆菌( Escherichia coli)等。 产琥珀酸厌氧螺菌可自然产生高浓度琥珀酸, 但对高浓度葡萄糖和琥珀酸盐耐受性较差,而且要求严格厌氧环境,营养条件复杂,产物分离困难,生产成本较高,代谢途径尚未完全清楚,并且具有引起人类菌血症的潜在病毒性。产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸曼氏杆菌都属于瘤胃细菌,与其它测序基因组相比,二者的基因组序列更为相似,有很多共同的代谢特征:如能利用葡萄糖、果糖、木糖等多种碳源;以甲酸、乙酸和琥珀酸为主要发酵产物。产琥珀酸放线杆菌能耐受高浓度的琥珀酸盐和葡萄糖,是最具发展前景的琥珀酸生产菌之一,其突变株
中国农业大学 食品学院教案 课程名称：发酵工程学 教材名称：俞俊棠，唐效宣主编的《生物工艺学》 授课对象：食品学院生物工程专业本科生05 级（共30 人）开课时间：2007 年春学期1-14 周 开课地点：东校区 讲课学时：40学时 主讲教师：刘萍，韩北忠，陈晶瑜 工作单位：食品学院 编写时间：2006-2007 年
第一章：绪论 学时：2 主要内容：发酵工程 教学目标：掌握发酵工程的基本知识；了解发酵工程的一般工艺过程和工艺发展趋势。 教学重点为： 1．发酵工程的概念和研究内容 2．发酵工程的发展历史和研究方法 3．发酵工程的主要学习方法 教学难点是： 1．发酵工程的一般工艺过程和 2．发酵工程发展趋势需要在学习中时刻做到理论联系实际 主要教学方法：讲解，看投影片，举例说明，问题讨论 课程进展流程： 1、课程导入（时间：5分钟） 介绍本节课程讲授内容的总体框架，以对比发酵与发酵工程的区别导入本节课程的第一个内容：发酵工程定义。 出示图片：微生物与发酵工程设备图 引导学生观察发酵工程在工厂中的发酵工程操作。 2、课程讲授 （1）发酵工程定义（5分钟） 提问并讨论同学们自己眼中的发酵工程，引入生化角度、传统角度及现代工为上发酵工程的定义。 （2）发酵工程组成（10分） 引入发酵工程主要图片，并分别讲授什么是发酵工程上游、代谢控制和及下游工程。对发酵工程上每一步骤进行详细解释，使同学们从整体上了解通过发酵工程生产出产品的全过程。 （2）发酵工程研究内容（10分） 从整体上介绍发酵工程研究的内容，并对每一个知识点进行讲解，结合图作分析说明。 （3）发酵工程工艺流程（15分）
第一章文献综述 1.1谷氨酸简介 谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。目前，我国许多工厂采用多种方法来提高谷氨酸产率，如选育高产菌种、改进发酵工艺、搞好发酵控制、引进微机控制、增加控制参数等。这些方法对于提高谷氨酸产率非常有效。 谷氨酸是生产味精的主要原料，随着发酵法生产谷氨酸技术的发展，我国味精生产始于1923年，至今已有80多年历史，随着科学技术的不断进步，味精生产技术也在不断变革，由创建之初的以面筋、豆粕为原料水解法生产工艺，改变为现在以淀粉为原料发酵法生产工艺，发酵法生产工艺从1964年在上海味精厂首次投入生产以来，发酵法生产谷氨酸的生产技术进步较大，尤其是近几年随着菌种的突破以及新技术，新设备的应用进展更快，进入九十年代，尤其九五年后，技术进步较快，目前行业最好水平时（仅少数厂家）制糖收率99%以上，发酵产酸11-12%，转化率59-62%，提取收率96-98%精制收率96%，与80年代比较全行业平均制糖收率提高了10%，发酵产酸率提高了117%，转化率提高了43%，提取收率提高了20%，精制收率提高了8.8%，综合技术指标淀粉消耗下降了166%
1.2谷氨酸的生产工艺流程 1.2.1液化和糖化 因为大米涨价, 目前大多数味精厂都使用淀粉作为原材料。淀粉先要经过液化阶段。然后再与β- 淀粉酶作用进入糖化阶段。首先利用α- 淀粉酶将淀粉浆液化, 降低淀粉粘度并将其水解成糊精和低聚糖, 应为淀粉中蛋白质的含量低于原来的大米, 所以经过液化的混合液可直接加入糖化酶进入糖化阶段, 而不用像以大米为原材料那样液化后需经过板筐压滤机滤去大量蛋白质沉淀。液化过程中除了加淀粉酶还要加氯化钙，整个液化时间约30min。一定温度下液化后的糊精及低聚糖在糖化罐内进一步水解为葡萄糖。淀粉浆液化后, 通过冷却器降温至60℃进入糖化罐, 加入糖化酶进行糖化。糖化温度控制在60℃左右, pH 值4.5, 糖化时间18～32h。糖化结束后, 将糖化罐加热至80～85℃, 灭酶30min。过滤得葡萄糖液, 经过压滤机后进行油水分离( 一冷分离, 二冷分离) , 再经过滤后连续消毒后进入发酵罐。 1.2.2谷氨酸发酵