国处医堂鱼痤堂坌避２堂生§旦筮垫鲞筮≥翅塑趔盥必趟坠毁塑墅煎蚀垡鱼婴妇。鳖２蝼。塑垫：№：≥‘１４３?
６ＫｏｂａｙａｓｈｉＡ，ＧｍｅｎｂｌａｔｔＲＭ，ＡｎｅｓｔｅｓＫ，ｅｔａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｔｔｒｉｂｕｔｅｓｏｆｍｕ－ｃｏｓａｌｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｌａａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆＨＩＶｉｎ－ｆｂｃｄ∞［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲ∞，２００４，６４（１８）：６７６６－６＂７７４．
７ＣｉｎｔｏｒｉｎｏＭ，ＴｒｉｐｏｃｌｉＳＡ，ＲｏｍａｇｎｏｌｉＲ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅａｆｅｒｏｍａｎｄｔｈｅｉｒｌ℃ｃｅｐｔｏｒ８ｉｎｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓｌｅｓｉｏｎｓｏｆｔｈｅｕｔｅｒｉｎｅｃｅｒｖｉｘ［Ｊ］．Ｆａｎ＂ＪＧｙｎａｅｃｏｌＯｎｃｄ，２００２，２３（２）：１４５－１５０．
８Ｉ（ｉｍＴＧ，硒ｍＣＨ，Ｗ抽ＥＨ，ｅｔａ１．ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓａｃｔａ８ａｐｏｔｅｎｔａｄｊｕｖａｎｔｆｏｒＥ７ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｌｉｖｅｒｙｔｏｉｎｄｕｃｅａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉ－ｔｕｒｎｏｕｔｉｍｍｍｉｔｙｉｎａⅢ）ｖ１６Ｅ＇／－ａｓｓｏｅｉａｔｅｄａｎｉｍａｌｔｕｎｌｏｕｒＨ旺ｌｅｌ［Ｊ］．Ｉｍ?ＩＩⅢＤｌｏ盯。２００４，１１２（Ｉ）：１１７—１２５．
９ＹａｈＭ，ＰｅｎｇＪ，ＪａｂｂａｒＩＡ。ｅｔａＩ．ＤｅｓｐｉｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｉｌｓａｎｄＬｍ群ｇｈ８ｎｓｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｌｄｅａｎｔｉ－ｇｅｎｕｐｔａｋｅ，ｂｏｔｈｃｅｌｌｓ嘲．ｐｒｉｍｅＴｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，３２４（２）：２９７．３１０．
１０Ｂｅｒｍｕｄ船－ＨｕｍａｒａｎＬＧ，Ｃｏｒｔｅｓ－Ｐｅｔ％ＮＧ，ＬｅＬａｉｒＹ，ｅｔａ１．Ａｎｉｎｄｕｃｉｂｌｅｓｕｒｆａｃｅｐｒｅ船ｎｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｍｐｒｏｖｅｓｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｉｔｙａ鲥惜ｔｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓｔｙｐｅ１６Ｅ７ａｎｔｉｇｅｎｉｎｍｉｃｅａｆｔｅｒｎａｓａｌ
ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌａｅｔｅｃｏｃｅｉ［Ｊ］．ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉａｌ，２００４，５３（ｏｒ５）：仞４３３．１１ｄｅＪｏｎｇＡ。ｖａｉｌＰｃｅｌｇｅｅｓｔＭＩ。Ｖ蚰ｄｅｒＨｕｌｓｔＪＭ，ｅｔａ１．Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａ?ｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１６?ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｒｖｉｃａｌ鲫。ｅｒｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｉ呷函ｒｅｄＣＤ４＋Ｔ－ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｉｔｙａｇａｉｎｓｔｅａｒｌｙａｎｔｉｇｅｎｓＥ２ａｎｄＥ６［ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００４，６４（１５）：５４４９－ｓ４５５．
１２ＳｔｅｅｌｅＪＣ，ＢｏｂｅｒｔｓＳ，Ｒｏｏｋ∞ＳＭ，ｅｔａ１．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣＤ４（＋）－ａｎｄＣＤ８（＋）?’Ｉ：ｏｅｌｌｍｐｍ瞄ｔｏｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓｔｙｐｅ１ａｎｔｉｇｅｎｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔｖａｒｉｏｕｓｓｔａｇ胬ｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｌｉｆｅｃｙｃｌｅｂｙｕｓｉｎｇａｎｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｎｍａｕ－ｎｃｔ驴ｏｔａｓｓａｙｏｆｇａｍｍａｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｒｅｌｅａｓｅｄ］．Ｊｖｉｍｌ，２００２，７６（１２）：６０２７－
６０３６．
１３ＳｄｔｉＬ－ｍｍｓＭＷ，ＳｃｈｄｔｅｎＫＢ，Ｋｕｅｔｅｒ聊，ｅｔｄ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｌｉｆｅｓｐａｎｅｘｔ≈ｍｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐ叩ｉⅡⅨｍ晴ｒ∞ｔｙｐｅ１６－ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｈｅａｌｔｈｙｄｏ－ｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄＣＴＬｄｏｎｅｓ［Ｊ］．Ｊｌｍｍｕｎｄ，２００３，１７１（６）：２９１２－２９２１．
１４ＬｅｅＢＮ，ＦｏｌｌｅｎＭ，￥ｈｏｎＤＹ，ｅｔ止Ｄｅｐｒｅｓｓｅｄｔｙｐｅ１ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＣＩＭ＋Ｔｃｅｌｌｓｏｆｗｏｍｅｎｗｉｔｈｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒ?ｍ－ｒｅｌａｔｅｄｈｉ曲?ｇｎＩｄｅＷ８ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｄｉａｌｌｅｓｉｏｍ［Ｊ］．ＣｌｉｎＤｉａｇｎＬａｂＩｍｍｕｎｄ，２００４，１１（２）：２３９－２４４．
１５ＫａｄｉｓｈＡＳ，ＴｉｍｍｉｎｓＰ，ＷａｎｇＹ，ｅｔａ１．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅ—ｌｉａｌｎｅｃｖｌａｓｉａａｎｄｌｏｓｓｏｆｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ（ＨＰＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｓ∞ｏ—ｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｍｍｕｎｅｍｐ∞嘲ｔｏａｎＨＰＶｔｙｐｅ１６Ｅ７ｐｅｐ—ｔｉｄｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒｇｅｄ“ｄＢｉｏｍａｒｋｅｒｓＰｒｅｖ，２００２，１１（５）：４８３－４８８．
１６ＶａｍｂｕｔａｓＡ。ＢＩｍａ斟ｍＶＲ，ＳｔｅｉｎｂｅｒｇＢＭ．ＡｌｔｅｒｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＡＰ－１ａｎｄｎ岫０ｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘｃｌａｓｓＩｉｎｌａｒ”日ｅ８ｌｐａｐｉｌｌｏｍａｔｅｓｉｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆＴＡＰ－１ｗｉｔｈｄｉｓ朗∞［Ｊ】．ＧｌｉｎＤｉａｇｎＩａｔｂＩｒｒｍｍｎｏｌ，２０００，７（１）：７９．８５．
１７Ｌｗ押ｔｔＧＲ，ＤａｎｎＬＡ，ＤｅＫｌｕｙｖｅｒＲＬ，ｅｔａ１．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａｅｎｈａｎｃｅｓｃｙｔｅｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｐｅｐｔｉｄｅｉｎｋｅｒａｔｉｎｅｃｙｔｅｓｗｉｔｈｏｕｔｌｏｗｅｒｉｎｇｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒ眺ｅｐｅｐｔｉｄｅ［Ｊ］．１ｒｎｍｕｎｏｌＱ－ｕＢｉ－０ｌ，２００２。８０（５）：４１５拟．
１８ＴｉｎｄｌｅＲＷ．Ｉｍｎｕｎｅｅｖａｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ?ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｅｒｖｉｃａｌⅢｎｃｅｒ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ，２００２，２（１）：５９．６５．
１９ＭｅｎｄｏｚａＬ，ＢｕｂｅｎｉｋＪ，ＳｉｍｏｖａＪ，ｅｔａ１．Ｔｕｍｏｎｒ－ｉｎｈｌｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｅｎ－ｄｄｔｉｃｃｅｌｌｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄａｔｔｈｅｓｉｔｅｏｆ肿Ｖ１６一ｉｎｄｕｃｅｄｎｅｏｐｌａｓｍｓ［Ｊ］．Ｆｏ—ｌｉａＢｉｄ，２００２，４８（３）：１１４－１１９
（收稿１３期：２００４—０２—０２）
布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗的发展：过去、现在和未来
曾政邓小红
摘要布鲁氏菌病（Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ）是目前世界上流行最广，危害最大的人畜共患病之一，其致病菌为胞内寄生的革兰氏阴性杆菌，感染机体后主要激发细胞保护性免疫反应。新兴的ＤＮＡ疫苗将表达的目的蛋白以肽的形式递呈给ＭＨＣＩ后能激活抗原特异性Ｔ细胞，诱发细胞介导的免疫反应，为控制布鲁氏菌病提供了一条可行途径。１９９７年第一种布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗ｐＣＤＮＡ３－－Ｌ７／Ｌ１２构建成功并在动物实验中表现出了潜在的应用前景。本文介绍了现有的目前几种较为成功的布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗，分析其优、缺点，并探讨了未来提高其免疫效果的可能途径。
关键词布鲁氏菌；ＤＮＡ疫苗；免疫
文章编号１００１—１０３ｘ（２０Ｑ５）０３—０１４３—０４中图分类号Ｒ３７８．５文献标识码Ａ
布鲁氏菌病（Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ）是目前世界上流行最广，危害最大的人畜共患病之一。它以流产和发热为特征，严重威胁着人和多种动物的生命健康，仅在拉丁美洲布鲁氏菌病每年造成６亿美元的损失，而
基金项目：国家自然科学基金资助项目（１２０３０１１４０３１３０１７０８５３）
作者单位：４０１１４７，重庆市动物卫生监督总站（曾政，硕士研究生）；２０００３１上海，中国科学院神经生物研究所（邓小红，硕士研究生）审校者：军事医学科学院微生物流行病学研究所王希良在９０年代的美国这一数字平均为１．５亿美元…。布鲁氏菌共有６种，１９个生物型，对人致病的有羊布鲁氏菌（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、牛布鲁氏菌（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、猪布鲁氏菌（Ｂ．ｓｕｉｓ）和犬布鲁氏菌（Ｂ．ｃａｎｉｓ）。在我国流行的主要是牛、羊、猪３种布鲁氏菌病。
ｌ布鲁氏菌传统疫苗概况
疫苗在布鲁氏菌病的防治上发挥了积极的作用。早在上个世纪３０年代Ｂｕｃｋ等无意中得到了减
‘１４４。国处医堂鱼瘗堂筮避麴§生§旦筮垫鲞筮≥塑坠趔匹丛苎直墅ｉ鲤堂塾鲤塑丛！塾鲤！丛蚁：丛型垫堕：型垫：№：３
毒的布鲁氏菌株Ａ１９，发现其有一定的保护作用。但持续存在的血清学反应，田间实验中引起牛的流产（１％。２．５％）以及对其稳定性和可能造成的免疫抑制性的担心使得人们把眼光投向了灭活疫苗的研究。１９６４年Ｒｅｎｏｕｘ等将一种光滑型羊布鲁氏菌株Ｈ３８经灭活后以矿物油为佐剂免疫动物，发现能很好地防止流产的发生，但由于血清阳性以及剧烈的局部反应限制了其进一步应用，而且灭活苗还有其他缺陷：在灭活过程中抗原表位易丢失，用量大，无内源性蛋白产生，所以不能诱导ＣＴＬ反应。随后人们尝试着从布鲁氏菌中提取蛋白再配以佐剂免疫动物，所选的蛋白包括细菌包膜、外膜蛋白、布鲁氏菌可溶性抗原（ＢＡＳＡ）、光滑型和粗糙型ＬＰＳ等。但这些抗原仍不能诱导有效的保护性免疫反应。从９０年代起，人们开始致力于布鲁氏菌突变株的研究，ＲＢ５１就是一种具有氨苄抗性的粗糙型菌株，免疫后血清不呈阳性而且有较好的保护效果【２’３Ｊ，已在美国、墨西哥、巴西获批准使用。对于突变株疫苗（ＲＢ５１，Ｒｅｖ．１等），人们最担心的莫过于其安全性，一旦毒性返强，则后果是灾难性的【４ｊ】。
２布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗研究进展
随着分子生物学的发展，对细菌蛋白的分离提取技术不断成熟，多种保护性抗原分子已被发现：包括细菌表面蛋白（ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＣＳＰ），主要外膜蛋白（ｔｈｅｍａｊｏｒｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＯＭＰｓ），核蛋白及其他酶类等。目前，布鲁氏菌的全基因组序列已经测出，疫苗学家开始利用已知保护性抗原分子的基因进行基因工程苗的研制。但单纯的蛋白苗用量大，制作工艺复杂，还不能诱导有效的细胞介导的免疫反应（ｃｅｌｌ．ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓＣＭＩ）。而布鲁氏菌为胞内感染茵，其免疫以细胞免疫为主，布鲁氏菌感染宿主后激发抗原递呈细胞分泌ＩＬ－１２，引起Ｔｈ０细胞分化为Ｔｈｌ细胞，Ｔｈｌ细胞再分泌ＩＦＮ一７从而上调巨噬细胞的吞噬作用【６１；同时，ＣＤ４＋，ＣＤ８＋Ｔ细胞分泌的ＩＤ２、ＩＦＮ一７还能直接杀灭被布鲁氏菌感染的巨噬细胞，达到保护宿主的目的＂Ｊ。新兴的ＤＮＡ疫苗将表达的目的蛋白以肽的形式递呈给ＭＨＣＩ后能激活抗原特异性Ｔ细胞，诱发细胞介导的免疫反应并且可以克服上述几种布鲁氏菌常规疫苗的缺陷，为控制布鲁氏菌病提供了一条可行途径。
事实上对布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗的研究还有限，但在小动物模型上已经诱导了一定水平的免疫应答，表现出潜在的应用前景。Ｌ７／Ｌ１２是重要的布鲁氏菌免疫优势抗原，在布鲁氏菌的核糖体亚单位中以４个拷贝的形式存在。其Ｎ一端对于Ｌ１０核糖体蛋白的二聚化是必需的，ｃ．端能帮助其与延伸因子ＥＦ－Ｔｕ和ＥＦ－Ｇ结合，还能帮助其从ＧＴＰ的水解中获得能量。研究发现，重组Ｌ７／Ｌ１２融合蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞，并诱导ＩＮＦ－７的转录和表达，从而起到保护作用。１９９７年Ｋｕｒａｒ【８１等人第一次利用ｐＣＤＮＡ３真核表达载体构建了编码布鲁氏菌Ｌ７／Ｌ１２核蛋白的ＤＮＡ疫苗。对小鼠进行肌肉注射后发现诱导产生了特异性抗体和ＣＭＩ，与对照组相比表现出较高水平的免疫保护（Ｏ．４７～１．２６ｌｏｇ）。免疫小鼠在较短的时间里出现了高水平的抗体，这表明在肌肉中表达的Ｌ７／Ｌ１２蛋白被递呈给了ＭＨＣＩ类分子并刺激了ｎ细胞活性。作者也曾以ｐＣＤＮＡ３．１－Ｌ７／Ｌ１２核酸疫苗和重组Ｌ７／Ｌ１２蛋白疫苗进行动物实验，显示二者都能刺激机体产生较高抗体水平，但核酸疫苗诱导产生了更强的Ｔｈｌ型免疫应答旧Ｊ。Ｌ７／Ｌ１２是优秀的Ｔ细胞优势抗原，在牛布鲁氏菌的几种保护性基因中以它为基础的疫苗对感染具有最显著的抵抗作用。值得一提的是一般的ＤＮＡ疫苗对不同的抗原都能诱导长期的细胞和体液免疫反应，但ｐＣＤＮＡ３一Ｌ７／Ｌ１２刺激的免疫反应只能保持较短时间（４周）。作者认为这与剂量有关，单一剂量免疫不能产生足够的保护，所以需要大剂量质粒ＤＮＡ免疫或使用包含多个基因的ＤＮＡ疫苗。
Ｐ３９（布鲁氏菌胞质结合蛋白）是很好的Ｔ细胞抗原，Ｐ３９基因存在于所有的布鲁氏菌中，但有３种菌株内并不产生Ｐ３９蛋白，Ｐ３９在豚鼠体内能诱发强烈的迟发性超敏反应（ＤＴＨ）并产生ＩＦＮ一７，因此它是公认的ＤＮＡ疫苗候选分子。２００１年ＡＬ－Ｍａｒｉｒｉ等¨刨研究了编码布鲁氏菌Ｐ３９和细菌铁蛋白（ＢＦＲ）的ＤＮＡ疫苗在诱发细胞免疫和体液免疫方面的能力，并评估了疫苗对ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的保护作用。实验发现免疫Ｐ３９３周后动物体内出现高滴度的特异性抗体（以ＩｇＧｌ和ＩｇＣ２ａ为主），Ｐ３９和ＢＦＲ都诱导产生了较强的Ｔ细胞免疫反应和高水平的ＩＮＦ一７产量，而ＩＬ－５水平与对照组无变化。由此证明了这种疫苗诱发的免疫反应为Ｔｈｌ型。研究人员还发现，此ＤＮＡ疫苗能产生强烈的和长期的免疫记忆效应，三免后第１２周仍能检测到免疫应答。随后的保护性实验发现Ｐ３９真核疫苗只有较低的保护，而在攻毒８周后这一效果才变得明显（１０９０．７３），但是与Ｓ１９弱毒苗还是有一定差距。作者还比较了Ｐ３９ＤＮＡ疫苗与重组蛋白苗的免疫效果：发现ＤＮＡ疫苗免疫效果较差，合理的解释是抗原量、佐剂以及对不同制剂的免
围处医堂鱼痤堂盆避２Ｑ堕生§旦筮２§鲞筮３期曼咝逾丛笪丛墅ｉ塑塑§熊迪堡！磐型趔哑：迪２Ｑ堕。ｙ迪２§：№：３。１４５?
疫应答不同。Ｐ３９在ＣＯＳ一７细胞瞬时表达的产量以
及ＤＮＡ疫苗免疫小鼠后Ｐ３９在体内的表达量通常都在微克级和纳克级［１１’１２】，所以虽然ＤＮＡ疫苗能持续
地表达蛋白但其总量远远低于重组Ｐ３９的使用量（３
次量共为２０ｔ上ｇ），抗原量的差异可引起免疫效果的不
同。
热休克蛋白在分枝杆菌的抗感染免疫中扮演着重要的角色，于是人们猜想布鲁氏菌的热休克蛋白
可能也具有免疫保护作用。２００２年，Ｌｅｃｌｅｒｃｑ等利用
ｐＣＭＶ真核表达载体构建了编码布鲁氏菌热休克蛋白（ｇｒｏＥＬ）的核酸疫苗。经肌肉免疫后成功地诱导了
在脾淋巴细胞培养物中以ＩｇＧ２ａ和ＩＦＮ．７为特征的Ｔｈｌ型免疫反应。但遗憾的是这种以热休克基因为基础的核酸疫苗对布鲁氏菌的攻击并无任何保护作用㈨。
１９９３年Ｇｏｌｄｂａｕｍ等从牛布鲁氏菌中提取出一种１８ＫＤ的胞质蛋白，它存在于大多数光滑型以及粗糙型布鲁氏菌中。从感染牛的血清中能检测到此蛋
白的抗体证明了它是一种有价值的诊断性抗原。随后的免疫学实验表明布鲁氏菌致病性与１８ＫＤ蛋白
的免疫原性之间有直接的联系。作者对一定数量的
牛血清样品进行分析后发现只有已感染牛才能产生抗１８ＫＤ抗原的抗体。以后的实验重点放在其结构
与功能的关系上：通过生物学功能分析和ｘ射线结
晶分析等一系列实验证明了１８ＫＤ蛋白与二氧四氢蝶啶合成酶包括细菌核黄素合成相似（同源性：
３０％），应该是一种２，４＿二氧四氢蝶啶合成酶【１４ｉ。此蛋白酶排列成２０面体衣壳形式与其他由此酶形
成的细菌相似，其多形态的排列结构决定了其高免
疫原性，因此作者认为此蛋白能够作为有效的非细
胞苗。最近Ｖｅｌｉｋｏｖｓｋｙ等人［１５’蚓利用ｐｃＤＮＡ３真核载体构建了表达这种１８ＫＤ蛋白的ＤＮＡ疫苗（记为
ｐｃＤＮＡ—ＢＬＳ），经肌肉免疫ＢＡＬＣ／ｃ小鼠后成功诱导体
液和细胞免疫反应。抗体以ＩｇＧ２ａ为主；ｐｃＤＮＡ．ＢＬＳ免疫鼠后取其脾淋巴细胞在体外经重组ＢＬＳ（ｒＢＬＳ）刺激产生了ＩＬ－２和ＩＮＦ一７，但没有¨和ＩＬ－ＩＯ产生，
表明了ｐｃＤＮＡ—ＢＬＳ以诱导Ｔｈｌ型免疫反应为主。随后用牛布鲁氏菌Ａ５４４对免疫鼠进行攻毒实验，并以注射ＰＢＳ小鼠作阴性对照，以注射Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓＳ１９活苗为阳性对照，研究中发现实验组小鼠保护水平（１．６５）远高于ＰＢＳ组（Ｐ＜０．０１），与接受Ｓ１９免疫对照组相当，重复实验结果仍然如此。虽然ｐｃＤＮＡ．ＢＬＳ并没有诱导完全的保护，但是其大大降低了布鲁氏菌在体内的数量，其刺激产生的体液和细胞免疫水平在布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗研究历史上也是前所未有的。这项研究也有几个现象值得注意：①抗体产生速度快，一免后１５天即可检测到（抗体效价：１００～２００），并且多次免疫后抗体水平上升很快（抗体效价：５１２００。１０２４００）；②ＤＮＡ疫苗使用了４倍剂量，在４免后一个月才攻毒表明此疫苗由于基因快速沉寂而需要不断激发才有效；③ｒＢＬＳ免疫动物后虽然产生的抗体水平高于ｐｃＤＮＡ—ＢＬＳ，但其并无任何免疫保护作用，再次证明了布鲁氏菌的免疫保护要以激发ＣＭＩ为主。布鲁氏菌超氧化物歧化酶（Ｃｕ．Ｚｎｓｕｐｅｍｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ．ＳｏＤ）是布鲁氏菌的毒力因子也是目前研究得较多的保护性抗原分子之一。早在１９９２年Ｔａｔｕｍ等以ＳＯＤ缺陷的布鲁氏菌突变株感染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，发现ＳＯＤ在布鲁氏菌的存活和致病性方面起一定作用，证明了ＳＯＤ在布鲁氏菌疫苗研制上的潜在价值。１９９４年Ｔａｂａｔａｂａｉ等证明了ＳＯＤ的免疫原性，随后又以合成的ＳＯＤ肽段免疫小鼠取得了较好的免疫保护效果。但后来构建的亚单位苗在免疫保护性上并无任何意义。而另外一些研究者发现以ＳＯＤ蛋白苗免疫动物同时诱导了Ｔｈｌ和Ｔｈ２型反应，但只有将其免疫反应扭转为Ｔｈｌ型为主时才能成功地保护实验动物免受布鲁氏菌的攻击¨７】。要改变反应类型除了加一定佐剂就是构建以诱导Ｔｈｌ型反应为主的ＤＮＡ疫苗。最近Ｏｎａｔｅ等人构建了编码布鲁氏菌ＳＯＤ的ＤＮＡ疫苗（ｐｃＤＮＡ．ＳＯＤ），并评估了其免疫原性和保护效率。重组质粒经肌肉免疫动物后诱导了细胞和体液免疫应答，而ＳＯＤ特异性的抗体中以ＩｇＧ２ａ为主；同时Ｔ淋巴细胞增殖反应和ＩＦＮ一７产量也表明此ＤＮＡ疫苗诱导了典型的Ｔｈｌ型为主的免疫反应。随后作者以布鲁氏菌毒力株２３０８攻毒，发现其保护水平与弱毒疫苗株ＲＢ５１接近【１８｜，表明ｐｃＤＮＡ—ＳＯＤ有进一步研究的价值。
３布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗的未来发展趋势
从已发表的关于布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗的文章可以看出，还没有一种ＤＮＡ疫苗可以较好地保护动物免受致病株的攻击，从而代替现有的死苗和弱毒苗。除了ＤＮＡ疫苗共同的安全性问题外，主要是其所诱导的保护性免疫反应不够高。究其原因可能是所选择的保护性抗原免疫原性不好或者是所构建的布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗虽然能在真核细胞中表达目的抗原，但在动物体内其表达量较低或某个时间段出现了基因沉寂不表达的情况。解决免疫应答低的问题首先得寻找优秀的保护性抗原分子，以此为基础构建筛选有保护作用的ＤＮＡ疫苗。其次应选用合适的真
核表达载体。Ｋｕｒａｒ【８１利用ＰＣＤＮＡ３和Ｐ６真核表达载体构建了编码布鲁氏菌Ｌ７／Ｌ１２核蛋白的ＤＮＡ疫苗，ＰＣＤＮＡ３含有人类巨细胞病毒启动子，而Ｐ６含有牛的ＭＨＣ启动子。Ｐ６一Ｌ７／Ｌ１２免疫小鼠产生的抗体水平明显低于ＰＣＤＮＡ３．Ｌ７／Ｌ１２免疫小鼠的抗体水平，在￥２３０８菌株的攻击实验中，仅ＰＣＤＮＡ３为载体的重组质粒使小鼠获得了免疫保护，表明不同的表达载体会影响免疫效果。
免疫方法的不同也表现出不同的免疫效果，ｖｅ—ｍｕｌａｐａＵｉ曾经以ＰＣＤＮＡ３为载体，分别构建了含１０种布鲁氏菌不同保护性抗原的重组质粒，免疫动物后在以布鲁氏菌２３０８株攻击后均未表现出长期而明显的保护水平。而以这些质粒免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠两次后，再以突变株疫苗ＲＢ５１加强免疫１次，则Ｌ７／Ｌ１２、ＰＡＬ和Ｐ３１的保护水平比单独使用ＲＢ５１高（Ｌ７／Ｌ１２为ｌ０９１．８４，队Ｌ为ｌ０９１．４７，Ｐ３１为ｌ０９２．４４，ＲＢ５１为１０９１．２６）。这说明组合式免疫可能是提高ＤＮＡ疫苗免疫效果的有效途径。
包括ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＧＭ—ＣＳＦ和ＣｐＧ基序在内的１ｈ１型佐剂在提高ＤＮＡ疫苗的免疫效果方面能发挥一定作用。天然的和合成的ＣｐＧ基序都可直接刺激免疫系统，扭转免疫应答类型，并具有主动的抗感染功能。早在１９９７年，带有ＣｐＧ基序的疟疾ＤＮＡ疫苗就被ＦＤＡ批准进入Ｉ期临床实验，目前已率先进入Ⅲ期临床试验。合适的佐剂可能解决布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗免疫原性较低的缺陷。
疫苗投递系统（ＶＤＳ）的开发可以减少免疫次数，提高免疫效果。研究者将质粒与某些物质或载体组成微小颗粒引入动物体内，可以使疫苗有效地，较长期地与免疫系统接触从而加强免疫水平ｕ引。近几年对细菌载体的研究渐多，其原理是将质粒中外源基因置于真核转录调控单元的控制下，在伤寒沙门菌，鼠疫杆菌或李斯特菌的介导下，经细胞对载体细菌的传递，在真核细胞表达系统的控制下以真核模式表达抗原，诱发机体产生免疫诱答，这种疫苗形式兼有活细菌载体核裸ＤＮＡ疫苗两者的优点。此外，细菌载体可将编码外源抗原的质粒ＤＮＡ传递到树突状细胞等抗原递呈细胞中，利于特异性免疫应答的诱导。ＭＡＲＩＲＩ等曾利用活的肠鼠疫耶耳森菌的弱毒株Ｏ：３以及Ｏ：９分别作为布鲁氏菌Ｐ３９和ＢＦＲ核酸疫苗的载体给ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠进行胃内免疫，成功地诱导了抗原特异性ＩｇＧ和卟ｌ型免疫应答，并且与预期相符合；以Ｏ：９免疫小鼠的血清中检测到了Ａ５４４菌脂多糖的抗体，并对Ａ５４４的攻击具有抵抗，证明了鼠疫耶耳森菌载体以及抗ＬＰＳ抗体在布鲁氏菌保护性免疫应答中的作用啪１
４展望
当然，机体对不同保护性抗原的免疫应答与抗原的基因背景有关，因此开发成功的布鲁氏菌ＤＮＡ疫苗，应针对特定抗原分子，寻找合适的载体、用量、投递系统及佐剂，以期最大限度的发挥免疫保护效果。同时由于ＤＮＡ疫苗多为单一分子免疫，其免疫效果始终不如成分完整的死苗，因此，有必要研究带有两种或两种以上保护性抗原基因的多价ＤＮＡ疫苗，以融合蛋白的表达形式在体内表达来激发机体
的免疫系统。
参考文献
１ＳｒｅｅｖａｔｓａｎＳ，ＢｏｏｋｏｕＪＢ，ＲｉｎｇｌａｉｓＦ，ｅｔａ１．Ａｍｕｌｔｉｐｌｅｓａｐｐｒｏａｃｈｔｏｍｏｈｃｕ?ｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢｒｕｃｅｌｌａａｂｏｎｕｓａｎｄ／ｏｒＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｒｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎ
ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｄ）ｉｏｌ，２０００，３８（７）：２６０２－２６１０．
４ＡｓｈｆｏｒｄＤＡ，ｄｉＰｉｃｔｒａＪ，Ｈｎ孕ｐｐａＪ，ｅｔａ１．Ａｄｖｅｒｓｅｅｖｅｎｔｓｉｎｈｕｍａｎｓａｓｓｏ?
ｄａｔｅｄｗｉｔｈａｃｃｉｄｅｎｔａｌｄｐⅫＩｅｔｏｔｈｅｌｉｖｅｓｔｏｃｋｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓｖａｃｃｉｎｅＲＢＳｌ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４，２２（２５－２６）：３４３５－３４３９．
５ＰａｓｑｕａｌｉＰ，ＲｅｓａｎｎａＡ，ＰｉｓｔｏｉａＣ，ｅｔａ１．ＢｍｃｅＵａａｂｏｄｍｓＲＢ５１ｉｎｄｕｃｅｓｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｏｒａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｔｓｔｒａｉｎＢ．ａｂｏｒｔｕｓ２３０８［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ。２００３，７１（５）：２３２６－２３３０．
６ＣｌｏｅｃｋａｅｒｔＡ。ＪａｃｑｕｅｓＩ，ＧｒｉｌｌｏＭＪ，ｅｔａ１．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｓｖａｃｃｉｎｅｓｉｎｍｉｃｅｏｆＢｍｃｅｕａｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＲｅｖ．１ｓｉｎｇｌｅａｎｄｄｏｕｂｌｅｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓｏｆｔｈｅｂｐ２６ａｎｄｏｍｐ３１ｇｅｎｅｓｃｏｄｉｎｇｆｏｒａｎｔｉｇｅｎｓｏｆｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓｉｇ－ｎｉｆｌｃａｎｃｅｉｎｏｖｉｎｅｂｍｃｅｌｌｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４，２２（２１－２２）：２８２７－２８３５．７ＵｇａｌｄｅＪＥ，Ｃｏｍ目ｃｉＤＪ，ＬｅｇｕｉｚａｍｏｎＭＳ，ｅｔａ１．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＢｍｃｅｌｌａａｂｏｒ－ｔｕｓｐｈｅｓｐｈｏｇｌｕｅｏｍｕｔａｓｅ（ｐｇｍ）ｍｕｔａｎｔ８，８ａｎｅｗｌｉｖｅＩⅢ曲一ｐｈｅｎｏｔｙｐｅＶａｃ—ｃｉｎｅ［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ，２００３，７１（１１）：６２６４－６２６９．
８Ｄｕｒａｎ—ＦｅｒｒｅｒＭ，ｌｅｏｎＬ，ＮｉｅｌｓｅｎＫ，ｅｔａ１．Ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｇａｍｍａ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆ
ｖａｃｃｉｎａｔｅｄａｎｄｕｎｖａｃｃｉｎａｔｅｄ
ｐｒｅｇｎａｎｔｓｈｅｅｐｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ
ｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＢｒａｅ．ｅｌｌａｍｅｌｌｔｏｎｓｉｓ［Ｊ］．ＶｅｔＭｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００４，１００（３－４）：２１９－２３１．
９ＭｕｓｈｙＥＡ，ＳａｔＮｙａｓｅｅｌａｎＪ，ＰａｒｅｎｔＭＡ，ｅｔａ１．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａｉｓｅｌ＇ｕ－ｅｉａｌｆｏｒｓｕｒｖｉｖｉｎｇａＢｍｅｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｂｏｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｔＣ５７ＢＵ６ａｎｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＢＡＬＢ／Ｃ
ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，１０３：５１１－５１８．
１０ＫｕｒａｒＥ．ＳｐｌｉｔｔｅｒＧＡ．ＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｏｆＢｍｃｅｌｌａａｂｏｌ＇ｔｕ８ｒｉｂｅｓｏ?ｒｅａｌＬ７／１２ｇｅｎｅｅｌｉｃｉｔｓｉｍｍｕｎｅⅪ删＿ｌｓｅ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９７，１５（１７／１８），１８５１．１８５７．
１ｌ曾政，王英，赵光字，等．布氏杆菌ｐＣＤＮＡ３．１．Ｌ７／Ｌ１２核酸疫苗的构建及其免疫学评价［Ｊ］．免疫学杂志，２００４，２０（３）：２０８—２１２．
１２ＡＩ—ＭａｒｉｆｉＡ，ＴｉｂｏｒＡ，ＭｅｒｔｅｎｓＰ，ｅｔａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｅｍ叩∞∞ｉｎＢＡＬｆｆｃｍｉｃｅｗｉｔｈａＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｂａｃｔｅｆｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎ∞Ｐ３９ｏｆＢｍｃｅｌｌａｓｐｐ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ，２００１，６９（１０）：６２６４－６２７０．
１３ＧｕｍｎａｔｈａｎＳ，ｋｑｉｎｍｕｎＤＭ，ＳｅｄｅｒＲＡ．ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓ：ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ａｐ－ｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎｎａＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２０００，１８：９２７－９７４．
１４ＧｕｍｎａｔｈｕｎＳ，ＦｒｅｉｄａｇＢＬ，ＳｅｄｅｒＲＡ．ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓ：ａｋｅｙｆｏｒｉｎｄｕｃｉｎｇｌｏｎｇ－ｔｅｎｎｃｅｌｌｕｌａｒ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．ＣｕｒｔＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，２０００，１２：４４２－４４７．
１５ＬｅｃｌｅｒｃｑＳ，ＨａｒｍｓＪＳ，Ｒ∞ｉｎｈａＧＭ，ｅｔａ１．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆａＴｈｌ—ｔｙｐｅｏｆｉｍ－ｍｕｎｅＩ＇ｅ￥ｐｏｌｌ∞ｂｕｔｎｏｔｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｂｙｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒＤＮＡｉｍｍｕ—
国处匿堂焦瘴堂坌避２堂生§旦筮垫鲞筮≥塑匦ｌ殛幽ｉ囡墅ｉ塑曼塑墅蜘煎墅婴烈蚁：丛业２Ｑ堕：型垫：№：３。１４７。
ｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＢｍｃｄｌａａｂｏｒｔｕａＧｒｕＥＬｈｅａｔ－ｓｈｅｃｋｓｅｎｄＪ］．ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉ．ｏｌ，２００２，５１：２１．２６．
１７ＧｏｌｄｂａｕｍＦＡ，ＣＡＬｒｌＯ￥Ａ，ＰａｂｌｏＣ．Ｔｈｅ１８?Ｋｄａ删枷ｃｐｒｏｔｅｉｎ《ｂｍ?ｃｅｌｉａｓｐｅｃｉｅｓ－船ａｎｔｉｇｅｎｕｓｅｆｕｌｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓ－ｉｓａｌｕｍａｆｉｎｅｓｙｎｔｈｍ［Ｊ］．ＪＭｅｄＭｉｃｍｂｉｏｌ，１９９９。４８：８３３－８３９．
１８ＣａｒｌｏｓＡ，叫ｉｅｎａＣ，ｇｕｉｌｈｎｎｏＨ，ｅｔａ１．ＦｅｍｅｎｄｏＡ．ｅｔ，ＡＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｌｕｍａｎｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｆｒｏｍｂｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓｉｎｄｕｃｅｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍ－ｍｕｎｉｔｙｉｎＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅＣＪ］．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ
Ｉｍｎ删ｔｙ，２００２，７０（５）：２５０７．２５１１．
１９ＶｅｌｉｋｏｖｓｋｙＣＡ，ＧｏｌｄｂａｕｍＦＡ，ＣａｓｓａｔａｒｏＪ，ｅｔａ１．Ｂｍｃｅｌｌａｈｍａｚｉｎｅｓｙｎ—
ｔｈａｓｅｄｉｃｉｔｓ
ａｒｍｘｅｄＴｈｌ—Ｔｈ２ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｌ－ｅｄｕｃｅ８ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｗｉｔｈＢｍｃｅＵａａｂｏｒｔｕｓ５４４ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｏｆｔｈｅ删ｕｖｅｎｔｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｕｓｅｄ［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ，２００３，７１（１０）：５７５０－５７５５．
２２Ｙａ％－，ｑｕｎＨｅ，ＶｅｍｕｌａｐａｌｌｉＲ，ＧｅｒｈａｒｄｔＣ－Ｓ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ０ｃ｝Ｉｒｏｂ∽ｔｎＪｍ
皿ｌ吐ＩｍｐｉｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＢｒｕｃｄｌａａｂｏｒｔｕｓＣｕ，Ｚｎｓｕｐｒａ－ｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅｐｒｏｔｅｃｔｓｍｉｃｅ唰ｎｓｔＢ．ａｂｏｒｔｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｏｎｌｙａｆｔｅｒｓｗｉｔｃｈｉｎｇ《ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＴｈｌｔｙｐｅ［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｅｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，２００２，７０（５）：２５３５－２５４３．
２３ＯｎｓｔｅＡＡ，Ｃｚｓｐｅｄｅ８Ｓ，ＣａｂｒｅｒａＡ，ｅｔａ１．ＤＮＡＶａｃｃｉｎｅＥｎｃｏｄｉｎｇＣｕ，ＺｎＳｕｐｃｒｍｄｄｅＤｉｓｍｕｔａｓｅｏｆＢｍｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓＩｎｄｕｃｅｓＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＩｎｍｍｎｉｔｙｉｎＢＡＬＢ／ｃＭｉｃｅ［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ，２００３，７１（９）：４８５７－４８６１．
２５ＭｕｆｉＨｏＭ．ＩｍｃｈｅＪＭ。ＥｓｔｅｖｅｎＭ。ｅｔａ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｃｏ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓｏｎｔｈｅｐｒｏｐ硎∞ｏｆｐｏｌｙｅｓｔｅｒｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔｂｒｕｃｄｌｏｓｉｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＰｈａｎｎ，２００４，２７１（１－２）：１２５—１３５．
２６ＡＩ—ＭａｒｉｆｉＡ，ＴｉｂｏｒＡ，ＬｅｓｔｒａｔｅＰ，ｅｔａ１．Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｆｉｃａ∞ａｖｓｈｉｃｌｅｆｏｒａｎａｋｅｄＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇＢｍｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓｂａｃｔｅｆｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎｏｒＰ３９ｅｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔＩｉｎｎｍｎ，２００２，７０（４）：１９１５．１９２３．
（收稿１３期：２００３—１２—３０）
噬菌体抗体库技术的发展及应用
宋文全
摘要近年来，治疗性抗体的临床应用对抗体的研究和改造提出了更高的要求。随着分子生物学的不断发展，抗体也由多克隆抗体、单克隆抗体发展到基因工程抗体阶段。噬菌体抗体库技术的出现，为抗体的发展提供了广阔的前景。
关键词噬菌体展示；抗体库
文章编号１００１一１０３ｘ（２００５）０３—０１４７—０３中图分类号Ｒ３９２—３３文献标识码Ａ
噬菌体抗体库技术结合了噬菌体展示与抗体组合文库技术。其基本原理是把外源的ＤＮＡ插入噬菌体编码的外壳蛋白ＰⅢ或ＰⅧ的基因中，使外源ＤＮＡ片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ），它最大的特点和优点是实现了直接将基因型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）和表型（ｐｈｅｎｏ．ｔｙｐｅ）联系在一起。该技术经过了十几年的发展和完善，对生命科学领域产生了极其广泛的影响，也已逐渐为人们接受和掌握。目前人们采用各种不同的策略已成功构建了多个全套抗体库并已广泛地应用于临床和科研领域［１】。它可以短时间内提供完全人源化的、高亲和力的抗体，其临床应用证明是安全有效的，其筛选过程也为抗体药物复杂的设计开辟了广阔的前景，现已成为现代药物研究的一个重要手段。可以预测，蛋白质三维结构预测、分子模建及噬菌体展示技术的结合必将推动分子相互作用、分子识别、受体作用、酶学机制及生物疫苗等领域的研究进程。
作者单位：１００８５０北京，军事医学科学院基础医学研究所（硕士研究生）
审校者：军事医学科学院基础医学研究所黎燕１展示技术的发展
随着人们对生命科学领域研究的不断深入，越来越多的新技术和新方法为人们熟悉和掌握，展示技术就是近年来建立和发展起来的一种新的技术，自问世不到２０年的时间便得到了飞速发展，被应用于生命科学的多种领域，其可分为体内展示技术和体外展示技术：
１．１体内展示技术
１９８５年首先Ｓｍｉｔｈ应用丝状噬菌体展示（Ｆｉｌａ．ｍｅｎｔｏｕｓｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ；Ｆｆｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技术，并提出了分子库的概念。１９９０年，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等用此方法构建了１０６大小的库，并成功地从中筛选到目的抗体。以后相继有报道用此方法筛选到多种抗体，其库容大多数在１０８左右，最大的达到１０１０～１０１１【２Ｊ。它有ｐⅢ、ｐⅧ两个主要展示系统，ＰＩｌＩ编码噬菌体的次要外壳蛋白有两个位点可供外源基因的插入即ｇⅢ基因氨基端（Ｎ端）或近Ｎ端可曲伸臂区内，每个噬菌体有４～５个拷贝，可容纳大片段基因的插入。ｐⅧ编码噬菌体主要衣壳蛋白，它适合于小片段基因的表达。目前趋向于用Ｐｍ系统展示抗体，用ＰⅧ系统展示多肽。除了丝状噬菌体外，又发展了Ｔ７、入、Ｔ４
布鲁氏菌DNA疫苗的发展:过去、现在和未来
作者：曾政， 邓小红
作者单位：曾政(401147,重庆市动物卫生监督总站)， 邓小红(200031,上海,中国科学院神经生物研究所)
刊名：
国外医学（免疫学分册）
英文刊名：SECTION OF IMMUNOLOGY FOREIGN MEDICAL SCIENCES
年，卷(期)：2005，28(3)
被引用次数：0次
参考文献(20条)
1.Sreevatsan S.Bookou JB.Ringpis F A multiples approach to molecular detection of Brucella abortus and/or Mycobacterium bovis infection in cattle 2000(07)
2.Ashford DA.di Pietra J.Lingappa J Adverse events in humans associated with accidental exposure to the livestock brucellosis vaccine RB51 2004(25/26)
3.Pasquali P.Rosanna A.Pistoia C Brucella abortus RB51 induces protection in mice orally infected with the virulent strain B. abortus 2308 2003(05)
4.Cloeckaert A.Jacques I.Grillo MJ Development and evaluation as vaccines in mice of Brucella melitensis Rev. 1 single and double deletion mutants of the bp26 and omp31 genes coding for antigens of diagnostic significance in ovine brucellosis 2004(21/22)
5.Ugalde https://www.doczj.com/doc/f714786079.html,erci DJ.Leguizamon MS Evaluation of Brucella abortus phosphoglucomutase (pgm) mutant as a new live rough-phenotype vaccine 2003(11)
6.Duran Ferrer M.Leon L.Nielsen K Antibody response and antigenspecificgamma-interferon profiles of vaccinated and unvaccinated pregnant sheep experimentally infected with Brucella melitensis
2004(3/4)
7.Murphy EA.Sathiyaseelan J.Parent MA Interferon - gamma is crucial for surviving a Brucella abortus infection in both resistant C57BL/6 and susceptible BALB/C mice 2001
8.Kurar E.Splitter GA Nucleic acid vaccinationof Brucella abortus ribosomal L7/12 gene elicits immune response 1997
9.曾政.王英.赵光宇布氏杆菌pCDNA3.1-L7/L12核酸疫苗的构建及其免疫学评价[期刊论文]-免疫学杂志 2004(03)
10.Al-Mariri A.Tibor A.Mertens P Induction of immune response in BALB/c mice with a DNA vaccine encoding bacterioferritin or P39 of Brucella spp 2001(10)
11.Gurunathan S.Klinman DM.Seder RA DNA vaccines:immunology,application,and optimization 2000
12.Gurunathan S.Freidag BL.Seder RA DNA vaccines: a key for inducing long-term cellular immunity 2000
13.Leclercq S.Harms JS.Rosinha GM Induction of a Th1-type of immune response but not protective immunity by intramuscular DNA immunization with Brucella abortus GroEL heat-shock gene 2002
14.Goldbaum FA.Carlos A.Pablo C The 18-Kda cytoplamic protein of brucella species-an antigen useful for diagnosis-is a lumazine synthase 1999
15.Carlos A.Juliana C.guillermo H Femando A. et, A DNA vaccine encoding lumazine synthase from brucella abortus induces protective immunity in BALB/c mice 2002(05)
16.Velikovsky CA.Goldbaum FA.Cassataro J Brucella lumazine synthase elicits a mixed Th1-Th2 immune response and reduces infection in mice challenged with Brucella abortus 544 independently of the adjuvant formulation used 2003(10)
17.Yongqun He.Vemulapalli R.Gerhardt GS Recombinant ochrobactrum anthropi expressing Brucella aboruts Cu, Zn superoxide dismutase protects mice against B. abortus infection only after switching of immune response to Th1 type 2002(05)
18.Onate AA.Cespedes S.Cabrera A DNA Vaccine Encoding Cu,Zn Superoxide Dismutase of Brucella abortus Induces Protective Immunity in BALB/c Mice 2003(09)
19.Murillo M.Irache JM.Estevan M Influence of the co-encapsulation of different excipients on the properties of polyester microparticle-based vaccine against brucellosis 2004(1-2)
20.Al-Mariri A.Tibor A.Lestrate P Yersinia enterocolitica as a vehicle for a naked DNA vaccine encoding Brucella abortus bacterioferritin or P39 antigen 2002(04)
相似文献(5条)
1.学位论文周丽丽布鲁氏菌BLS-L7/L12重组亚单位疫苗的初步研究2007
布鲁氏菌病(Brucellosis)(简称布病)是由布鲁氏菌(BrLicella．spp)引起的人、畜共患传染病。世界上有170多个国家和地区有人、畜布病存在和流行。在我国布病已波及28个省市区，并且近年呈死灰复燃，给畜牧业和人类的健康带来严重危害，因此防控布鲁氏菌病形势相当严峻。
布鲁氏菌属包括新发现的海洋哺乳动物种在内，有7种21个生物型，感染人的主要有牛、羊、猪三种。布鲁氏菌是革兰氏阴性菌，兼性寄生于巨噬细胞内，从而逃避宿主的免疫清除，它主要引起人的波状热和慢性感染，造成反刍动物不育和流产等，同时它又是一种潜在的生物战剂和生物恐怖剂。控制布鲁氏菌病传播关键是进行疫苗接种，目前在一些国家使用的弱毒疫苗(牛型19号疫苗以及羊Rev.1弱毒苗)对预防布鲁氏菌病能够起到一定的作用，但弱毒疫苗接种与感染难以鉴别以及存在潜在安全性的问题，因此研制新一代布鲁氏菌病疫苗成为生命科学的重要课题。
当前布鲁氏菌新型疫苗的研究主要集中在毒力相关基因缺失的突变株疫苗和重组亚单位疫苗两个领域。突变株疫苗虽然有较好的保护性，但安全性和稳定性仍需进一步的评价，并且可能有毒力返强的现象。布鲁氏菌重组亚单位疫苗能产生一定的免疫原性和免疫保护性，但保护效果不完全。于是我们认为，采用多价保护性抗原分子和利用不同的抗原提呈系统开展的布鲁氏菌重组亚单位疫苗的研究，可能为新型布鲁氏菌疫苗提供一条可行途径。
本研究首先从布鲁氏菌M16中克隆L7/L12和BLS基因，并进一步用重叠延伸PCR扩增BLS-L7/L12基因，分别构建在pET32a表达载体上，转化大肠杆菌
8L21，经诱导表达、纯化相应重组蛋白，铝盐吸附制备L7/L12、BLS和BLS-L7/L12重组蛋白疫苗；同时将3种蛋白抗原基因克隆到真核表达载体pVAX1上，转染COS-7细胞后证明有目的蛋白表达，大提质粒制备L7/L12、BLS和BLS-L7/L12 DNA疫苗；并利用依赖asd基因的宿主-载体平衡致死系统，把BLS-
L7/L12基因转化入减毒沙门氏菌，构建以减毒沙门氏菌为载体的BLS-L7/L12蛋白疫苗和基因疫苗。
随后将候选的BLS-L7/L12蛋白疫苗、DNA疫苗和减毒沙门氏菌为载体的蛋白疫苗和基因疫苗疫苗分别免疫Balb/c小鼠，三免后ELISA测定结果显示
，各实验组均能诱导产生特异性抗体；抗体亚型分类实验表明重组蛋白疫苗诱导产生Th2型为主的免疫应答，DNA疫苗及以减毒沙门氏菌为载体的疫苗产生Th1型为主的免疫应答；MTT法测定免疫Balb/c小鼠T淋巴细胞增殖发现DNA组及以减毒沙门氏菌为载体的疫苗组脾脏T淋巴细胞增殖反应增强，而重组蛋白疫苗组却无显著变化；FCM测定疫苗免疫Balb/c小鼠淋巴细胞亚群分类，CD4<'+>/CD8<'+>DNA疫苗组及减毒沙门氏菌组减少，而重组蛋白组有升高趋势；ELISPOT检测特异性活化的可分泌IFN-γ的CD8<'+>T细胞数，DNA免疫组的斑点数显著多于对照组。牛种布鲁氏菌544A强毒株对免疫Balb/c小鼠攻毒实验证明我们所构建的疫苗都具有一定的免疫保护性，DNA疫苗好于蛋白疫苗，双价疫苗好于单价，以减毒沙门氏菌活载体双价基因疫苗略好于DNA疫苗
，但保护性不完全。以上研究为布鲁氏菌病疫苗的深入研究奠定了基础。
2.期刊论文周丽丽.姚碧涛.罗德炎.焦新安.刘秀梵.王希良.ZHOU Li-li.YAO Bi-tao.LUO De-yan.JIAO Xin-an. LIU Xiu-fan.WANG Xi-liang以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析-免疫学杂志
2007,23(5)
目的 构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础.方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd+-pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd+-pVAX1-BLS-L7/L12).以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价.结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-
L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生.通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主.结论 所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主.可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗.
3.学位论文曾政布鲁氏菌新型疫苗的构建及其免疫原性研究2004
该研究所选的L7/L12核蛋白为公认的T细胞保护性抗原,它具有高度的保守性,研究发现,重组L7/L12蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞,并上调INF-γ的转录和表达,从而起到保护作用.以其为基础构建的重组蛋白苗和DNA疫苗都表现了较好的免疫保护效果;而OMP16外膜脂蛋白存在于所有6种布鲁氏菌中,也有一定的免疫保护作用;17.3kDa蛋白与布鲁氏菌18kDa的外膜蛋白(优秀的保护性抗原)的AA序列相似,因此,我们通过实验来验证17.3kDa蛋白是否具有保护作用.对翻译起始因子3蛋白进行抗原预测表明其具有免疫原性.该课题以4种蛋白分子为研究对象,分别构建了真核,原核表达质粒并表达了这4种蛋白,免疫动物后,研究其诱导产生的细胞免疫和体液免疫应答.从布鲁氏菌中提取其全基因组DNA,利用PCR技术扩增出4种蛋白的编码基因,测序正确后分别克隆至原核表达载体PET32a(+)上,经诱导表达出相应的4种重组蛋白,WB鉴定后纯化待用;同时,4种编码基因隆至真核表达载体PCDNA3.1(+)上,将重组质粒转染COS-7细胞后经WB证实重组质粒构建成功.将重组蛋白混合弗氏佐剂免疫动物,同时DNA疫苗以PUMVC1-mGM-CSF重组质粒为佐剂(各100μg/只)肌肉免疫动物;每15d免疫一次,加强免疫三次后检测免疫应答指标,并进行组间比较.ELISA法检测到较高滴度的特异性抗体,WB也证实特异性抗体的产生;抗体亚型分类表明重组蛋白组的特异性IgG1/IgG2a大于1,而DNA疫苗免疫组却小于1,说明重组蛋白疫苗诱导产生了Th2型为主免疫应答,DNA疫苗产生了Th1型为主的免疫应答.MTS法测小鼠T淋巴细胞增殖试验发现DNA组小鼠脾脏T淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应增强,而重组蛋白组却无显著变化.进一步通过ELISPOT方法检测特异性活化的可分泌IFN-γ的CD8+T细胞数,DNA免疫组的斑点数显著多于对照组(P<0.05);说明诱导了特异性CD8+T淋巴细胞应答.流式细胞仪所得到的淋巴细胞亚群分类也得到了同样的结果.本课题利用真核表达载体PCDNA3.1成功构建了含4种布鲁氏菌编码蛋白的重组质粒,并利用原核表达载体表达了相应的重组蛋白.通过ELISA、WB、ELISPOT及淋巴细胞亚群分类检测疫苗在免疫小鼠体内诱导产生的体液及细胞免疫指标.该研究成功构建了
验室质控标准方法的建立和发展,为他们的临床应用奠定基础.进一步的攻毒实验尚在进行中.
4.学位论文毛颖佳共表达EGFP与布鲁氏菌P39基因逆转录病毒载体的构建2009
目的：本研究主要目的是构建表达羊型布鲁氏菌M5株P39基因的逆转录病毒载体，为研发新型布鲁氏菌DNA疫苗奠定实验基础。
方法：1．目的基因的获取：对主要在我国流行以及对人致病性最高的羊型布鲁氏菌M5株扩增培养，并提取全基因组。根据Genbank中已公布的基因组序列选择已知的免疫原性高、主要诱导细胞介导免疫应答(cell-mediated immunity，CMI)的蛋白编码基因(P39基因)，设计特异性引物利用PCR扩增目的基因片段。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，将P39基因与克隆载体pMD19-T载体连接并转化感受态E．coli DH5α，经蓝白筛选得到连接正确的重组质粒，将其命名为pMD19-T-P39质粒，并应用酶切、PCR以及基因测序等方法对其进行鉴定。2．共表达P39和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因逆转录病毒载体的构建：对上述得到的重组质粒pMD19-T-P39进行酶切后，将目的基因P39插入到携带EGFP基因的逆转录病毒载体pRev-IRES2-EGFP载体的多克隆位点(MCS)中。构建的逆转录病毒载体经限制性内切酶鉴定后，采用脂质体(Lipofectin)介导方法转染包装细胞(PT67)，经G418筛选后将得到的阳性克隆进行培养扩增。用收获的培养上清液感染鉴定细胞(NIH-3T3)测定每毫升病毒液中感染性病毒颗粒的数量。此时，包装细胞产生的假病毒即可作为携带羊型布鲁氏菌特异性抗原基因P39的DNA疫苗。
结果：通过PCR方法成功地获得了目的基因P39，并将其构建到克隆载体中。经鉴定分析并测序后，将目的基因构建到携带EGFP基因的逆转录病毒载体中。用重组逆转录病毒载体转染包装细胞，获得了产生逆转录病毒载体的细胞PT67/P39。最后进行病毒滴度检测结果为6×104CFU/ml。
结论：应用分子生物学的方法，成功构建了共表达EGFP和羊型布鲁氏菌P39基因的逆转录病毒载体，为进一步检测该新型疫苗的免疫效果奠定了一定的实验依据。
5.学位论文吴朔布鲁氏菌外膜蛋白免疫蛋白质组学的初步研究2008
布鲁氏菌病(Brucellosis)(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人、畜共患传染病，在我国被列为二类传染病。世界上170多个国家和地区有人、畜布病的存在和流行。在我国布病波及28个省市区，并且近年来死灰复燃，给畜牧业和人类的健康带来严重危害。
布鲁氏菌包括新发现的海洋哺乳动物种在内，有7种21个生物型，感染人的主要有牛、羊、猪、犬和新发现的海洋种。布鲁氏菌属革兰氏阴性菌，兼性寄生于巨噬细胞内，从而逃避宿主的免疫清除。它主要引起人的波状热和慢性感染，造成反刍动物不育和流产等，同时又是一种潜在的生物战剂和生物恐怖剂。
因布病独特的致病机制和感染后难以根治的特点，疫苗一直在布病的综合防治措施中占有极为重要的地位。其中减毒活疫苗应用较早至今仍占主要地位，但在安全性和有效性方面仍存在很多问题。随着羊种、猪种和牛种布鲁氏菌基因组测序的完成和反向疫苗学理论和技术的发展，使布病疫苗研究进入“后基因组学”时代。“后基因组学”时代迫切需要解决现有疫苗的缺陷，即“安全性不足”和“保护效力有限”。目前研究表明布鲁氏菌重组亚单位疫苗能产生一定的免疫原性和免疫保护性，但是目前发现的分子保护效果不完全，提示还有新的保护性抗原没有被发现，因此找到布病疫苗新靶标是发展新一代疫苗的重大科学问题。基于以上思路，本研究对我国羊种布鲁氏菌五号菌种简称M5的外膜蛋白进行免疫蛋白质组学的初步研究，以期筛选布鲁氏菌保护性抗原分子，为安全、有效的布鲁氏菌重组亚单位疫苗研制提供保证。本研究的主要内容包括以下几方面：
(1)制备布鲁氏菌免疫血清(兔血清)，然后制备布鲁氏菌M5的外膜蛋白样品，通过双向电泳分离外膜蛋白质样品，将蛋白质转移到PVDF膜上，利用兔血清通过Western blot来探测免疫蛋白点。21个免疫蛋白点经胶内酶切、肽提取后用基质辅助激光解析/电子飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定。每个蛋白点的肽质量指纹图谱用Mascot进行检索后，代表了12个开放阅读框。这些蛋白不全是外膜蛋白，还存在胞浆蛋白，其功能涉及生物合成和物质代谢等领域，还有一个功能未知的蛋白。结果成功建立了布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法，不仅验证了传统使用的抗原，同时也鉴定了新的免疫分子。为寻找保护性抗原分子及新型疫苗抗原候选提供新思路。
(2)通过文献调研和生物信息学的分析，本部分选取5个免疫蛋白基因，进行PCR扩增目的片段，分别构建在原核表达载体pET32a上，转化大肠埃希菌BL21，经诱导表达、纯化相应的蛋白，结果成功的诱导表达了4个免疫蛋白并进行了Western blot的鉴定具有反应原性。其中一个未诱导成功，条件正在摸索中。同时将5个蛋白基因构建到真核表达载体pVAX1上，转染COS-7细胞后验证有目的蛋白表达，大提质粒制各相应的候选DNA疫苗，构建基因工程疫苗。免疫Balb/c小鼠，共免疫3次，前2次用重组基因产物免疫，后1次用相应重组蛋白产物加强免疫。通过ELISA、ELISPOT、FCM及MTT来检测疫苗在免疫小鼠体内诱导产生的体液及细胞免疫指标。结果表明DNA候选疫苗可同时激发体液免疫和细胞免疫。以上研究为基于疫苗策略的有效预防布病的深入研究奠定了基础。
本文链接：https://www.doczj.com/doc/f714786079.html,/Periodical_gwyx-myxfc200503005.aspx
授权使用：吉林大学农学部(jldxnxb)，授权号：4b855bf7-8d71-468d-9703-9db2014e06d0
下载时间：2010年7月13日