浙江省自然科学基金申请书
浙江省自然科学基金委员会
二OO六年制
基本信息
ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2006版) 第3页
项目组主要成员
说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；
2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；
3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。
申请书版本号：23310772
个人介绍：
申请经费预算20.0 万元
注：开支范围和标准参见《浙江省省级科技项目经费管理暂行办法》（浙财教字[2002]20号）。
申请者承诺：
我保证：
（1）申请书内容是真实的；
（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；
（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；
（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；
（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。
若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。
签字：日期：
项目依托单位承诺:
已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。
依托单位公章
日期
.
正文撰写提纲
1、项目名称
天然来源新型抗肿瘤药物先导的快速识别研究
2、研究工作对浙江经济、社会和科技发展的意义
中草药（药用植物）有效成分研究是发现与创制新药的一条重要途径，一直令人关注。长期以来，该研究获得了许多极具应用价值的新型药物如紫杉醇等或其他药物先导化合物如鬼臼毒素等, 为人类健康做出了贡献。数十年来，我国在中草药有效成分的研究方面取得了长足的进步，也积累了丰富的经验，为天然药物的创新研究奠定了良好的基础。然而，由于中草药化学成分一般都十分复杂，传统的研究模式（科技条件限制）往往只关注含量较为丰富的主要化学成分，且其有效成分的分离提取与药效验证实验往往是脱节的；这种方式经常会形成费时费力的无效分离；既大大降低了从中草药有效成分出发创制新药的效率，又往往会忽略一些含量极其低微的新型有效成分；而这些新的微量有效成分很可能是新型药物先导的重要源泉。因此，在中草药有效成分的研究过程中，必须充分借用现代高新技术手段，发展与建立微量水平上的生物活性成分快速识别的新方法，才能突破传统研究模式的制约，加大寻找与发现新型药物先导的可能性。
在药物（西药）的研究中，曾发展通过筛选化学库（组合库、化合物库）来寻找及优化药物先导(西药)的新技术[1]，这一研究途径可改变传统的逐一合成或分离提取、逐一纯化及逐一识别的模式，从而加快了药物先导化合物出现的速度，这一技术也为中草药有效成分（天然的复杂的化合物库中的某些特定化合物）的研究提供了新思路。
在快速筛选化合物库的新技术中，基于生物亲合等分子间相互作用（力）分析的靶向筛选受到了广泛的关注[2]，其中一些与生命活动密切相关的酶或蛋白等常常作为靶标分子而被研究；这种基于靶标分子与药物分子（配体或抑制剂）的相互作用的体外生物活性筛选，便形成一种十分灵敏的生物活性分子的快速发现的途径，这一研究方法的成功应用除一是要选择合适靶标分子，二是要寻求与之匹配的活性分子定性检测的高灵敏度的分析方法，飞速发展的现代质谱技术如电喷雾电离结合高分辨技术质谱（ESI-HRMS）等因其具有快速，灵敏度高以及易与分离手段（如HPLC）联用等特点正成为现代药物研究最重要的分析手段之一[3-4]。
抗肿瘤药物的研究与创制是关系到人类健康的重大课题之一，而从中草药出发寻求与发现高效低毒的新型抗肿瘤药物一直是医药行业极为关注的热点研究领域；如前所述，在传统的中草药有效成分
研究基础上，尽快开展微量水平上的生物活性成分的研究，将大大丰富抗肿瘤药物先导的新源泉，在我们前期的研究中，本课题组曾以拓扑异构酶以及微管蛋白作为靶分子，结合质谱分析对一些抗癌药物分子进行了成功的筛选与分析[5-6]，然而由于拓扑异构酶，微管蛋白的活性保持较为困难，因此基于这些靶标分子的活性成分筛选的应用受到很大的限制，为了探讨并建立更具应用前景的微量新型天然来源抗肿瘤活性成分筛选与分析一体化的新途径，合适靶标分子的选择与应用一直是我们极为关注的问题。近年来癌基因蛋白产物Src的发现引起人们的广泛兴趣，由于Src蛋白含有两种主要形式即病毒癌基因表达蛋白v-Src与细胞原癌基因表达蛋白c-Src，c-Src蛋白的表达和活性异常是某些肿瘤发生、发展的原因之一，而v-Src蛋白本身就能诱导细胞的转化与肿瘤的发生；因而研究开发Src蛋白抑制剂作为强效肿瘤抑制剂已成为目前国际医药界广为关注的亮点[7-8]。为此，本项目拟以基因工程获得的具有激酶活性的病毒癌基因表达蛋白-v-Src作为蛋白质靶标分子, 在分子水平上对中草药中的一些新的微量抗肿瘤活性分子进行靶向筛选, 结合高分辨质谱及液质联用分析手段，对这些活性分子进行分析确定，从而发展并建立微量水平上的天然来源新型抗肿瘤药物先导的快速识别新途径。
浙江省药用植物资源分布极其丰富，对这些药物，除需要充分发挥传统的天然产物化学的研究方法优势外，还需尽快借鉴国际上先进的研究方法，开辟新的研究思路，将为我省研制具有自主知识产权的新药奠定扎实基础并提供一条可行的捷径。本项目研究将为寻找发现新药先导提供新途径，为促进我省乃至我国医药事业的振兴与发展做出贡献，课题的实施既具有重要的学术理论价值又有广阔的应用前景。
3、本项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系；
项目研究目标：
本项目拟以浙江民间抗癌药用植物体为研究对象，以v-Src蛋白作为靶分子，对天然来源抗肿瘤活性分子进行快速筛选，结合高分辨质谱及液质联用技术对这些分子进行分析确定，以建立微量天然来源抗肿瘤药物先导的快速识别新途径，并应用该途径寻找发现一系列具有应用前景的抗肿瘤药物先导。
与申请者研究工作长期目标的关系：
申请者长期从事（天然）药物化学研究，围绕新的生物活性分子的寻找与发现这一研究方向，进行了以下的研究工作：1）近几年通过10余种药用植物的植化研究，分离得到80多种新化合物，其中10余种是具有应用前景的新的生物活性分子，在国际知名专业学术期刊《Phytochemistry》、《Steroids》、《Journal of Natural Products》，《Tetrahedron letters》(影响因子均大于2.0) 以及《Planta Medica》上发表了多篇论文；2）在天然来源生物活性成分分离与分析研究中进行大量的积累：进行了新的逆流色谱
技术研究与开发并应用于天然药物有效成分的分离纯化的研究中，其成果在《Journal of Chromatography A》(影响因子：IF为3.35)发表了论文6篇；负责承担了一项国家自然科学基金“抗氧化植物多酚的逆流色谱分离方法研究”（2005-2007）项目；应用质谱及其联用技术开展了生物活性分子筛选与分析研究等一系列探索工作，分别在《Analytica Chim.Acta》, 《Rapid Communications in Mass Spectrometry》等杂志上发表论文多篇；3）发展与建立了生物活性分子在线分离分析的新途径，进行了抗癌药物分子的靶向筛选与快速鉴定等研究探索，其研究成果已在《Analytical Biochemistry》, 《科学通报》，等杂志上发表，目前有一篇论文已递交美国《Analytical Chemistry》(影响因子：IF为5.45); 负责承担了两项国家自然科学基金“质谱在天然抗肿瘤活性成分快速筛选与分析中的应用”（1999-2001）与“天然来源抗肿瘤活性成分靶向筛选与质谱分析”（2004-2006）项目。4）课题组通过绿色合成途径开展了天然活性分子的合成与衍生以及目标生物活性分子的药物合成等研究工作，迄今已在《Organic Letters》(影响因子：IF为4.19)发表论文3篇；在《Bioorganic and Medicinal chemistry Letters》、《Tetrahedron》、《European Journal of Organic Chemistry》(影响因子均大于2.0)等其他杂志上发表论文多篇。5）基于靶向筛选必须拥有高效的新型蛋白靶标的原则，近期与从事生命科学研究的相关课题组开展了合作研究，并于2006年在国际著名杂志《Journal of Biological Chemistry》(影响因子：IF为6.35)发表论文一篇。
总之，寻找与发现新的药物先导是我们研究的重要课题，为了顺利实施该课题，发展与建立新的研究途径与方法，归纳总结科学规律并促进学科发展，一直是我们研究工作的长期目标。
天然来源抗肿瘤化合物是我们在长期的天然药物研究中极为关注的一类活性成分，这不仅是因为抗肿瘤活性成分在天然药用植物中分布较广泛，具有复杂的结构多样性，对其研究必将大大促进天然药物化学（有机结构分析）研究技术与方法的发展与更新，既可丰富天然有机（药物）化学理论内容，更重要的是对这类活性成分的深入研究可大大丰富抗癌药物先导的源泉（为药物合成提供靶标）从而为创制新药奠定良好基础，为我省、我国的医药事业做出贡献。在我们近期的相关研究中，我们从一些药用植物中得到的一系列具有抗肿瘤活性化合物，并申报了专利，这些化合物拥有多类结构骨架如萜类、糖苷以及黄酮等，多数新结构含量甚微，其分离分析颇为艰难，常规的正反相层析与高效液相制备要么效果不佳要么代价太大，因而发展微量水平上新的抗肿瘤活性成分分析的新途径具有极其重要的意义。鉴于此，本项目拟以v-Src 蛋白作为靶标分子，基于该靶分子与抗肿瘤活性分子的相互作用进行中草药中抗肿瘤活性成分的靶向筛选，结合高效液相色谱/质谱联用技术对上述筛选出的成分进行在线分离分析与鉴定，从而发展与建立关于天然来源抗肿瘤活性成分快速识别的新途径。
本项目的实施是我们长期研究目标的最重要内容之一。
4、项目研究内容，研究方案和进度安排
研究内容：
浙江省原生的兰科植物石豆兰属和石斛属植物广东石豆兰（Bulbophyllum kwangtungense Schlecht ）与细茎石斛（Dendrobium.moniliforme ）等几种植物根茎的乙醇提取物在体外抗肿瘤实验中，对人卵巢癌HO-8910细胞，人宫颈癌细胞和人早幼粒白血病HL60等细胞株呈现出明显的抑制作用，在已展开的植物化学研究中，我们从几种植物的富含成分中分离得到一系列9,10-二氢二苯并[b,f]氧杂卓类化合物与单体毛兰素(Erianin)、毛兰菲(Confusarin)等，这些化合物均显示较强的体外抗肿瘤活性。
O HO
OCH 3
OCH 3
OCH 3
OH
9,10-二氢二苯并[b,f]氧杂卓类
H 3CO
H 3C0
H 3CO OH
OCH 3
OH HO OCH 3OCH 3H 3CO
毛兰素(Erianin) 毛兰菲(Confusarin)
本项目即以这几种植物为研究对象，重点关注这些植物中含量低微，结构新颖的有效成分的研究，拟以基因工程获得的具有激酶活性的病毒癌基因表达蛋白v-Src 作为蛋白质靶标分子, 在分子水平上对上述一系列新的微量抗肿瘤活性分子进行靶向筛选, 通过高分辨质谱分析及其联用手段进行分析确定，发展并建立微量水平上的天然来源新型抗肿瘤药物先导的快速识别新途径，并在此基础上发现若干具有应用前景的新型药物先导，具体研究内容如下：
一： 植物中的富含有效成份的分离分析---常规研究途径
1）运用传统色谱方法得到富含成分有效部位分离提取，所获得化合物多为已知结构的化合物；
对新结构化合物，通过现代波谱技术（1D,2D-NMR等）确定结构，并进行抗肿瘤活性验证。该过程可去除有效部位的富含成分，富集有效部位的微量成分。
二：植物中的微量有效成份的分离分析—发展新的研究途径
选择病毒癌基因表达蛋白v-Src作为靶标分子，自行组装生物活性快速筛选装置，见下图所示：靶标分子溶液与天然混合物溶液分别置于由关键膜隔离的上下两个筛选池中，由于靶标具有亲水胶体的性质始终被截留在一个筛选池中，隔离膜对天然化合物小分子保持良好的通透性。当液相多组分天然药物化学成分通过膜在两个筛选池运动时，基
于生物亲合作用，具有抗肿瘤活性的药物分子（v-Src的抑制剂）与靶标分子结合形成
图一: 靶向筛选池
复合物而被截留在装有靶标分子的筛选池中，其他未发生亲合作用的化合物分子则呈游离状态平衡分布在两个筛选池中，随后运用HPLC-HRMS对要研究的化合物组分在实施筛选前后分别进行分析，获取化学成份指纹图谱，通过比较这两类指纹图谱差异后，发现新的活性成份。由于该研究中所应用的高分辨质谱可给出有机分子的元素组成（分子式），而多极质谱分析能给出丰富的结构信息，因而我们可结合在线的SCI-finder直接获得所筛选出的有效成分是否拥有新结构，本项目重点关注新型活性成分研究。对于上述途径得到的一些结构复杂的新成份，也可通过半微量制备型HPLC制备，经多维高分辨NMR技术（微量探头）进行结构确定。
研究方案
1. 靶蛋白—v-Src 蛋白的制备
克隆v-src全基因，在pGEX-KT高效表达质粒中诱导表达，得到GST-Src融合蛋白，用Glutaione Sepharose 4B亲和层析柱进行纯化，并采用Western blot和以polyGlu:Try (4:1)为底物的ELISA法鉴定其免疫原性和酪氨酸激酶活性。（该实验程序已经非常成熟，10天就可得到足量的GST-Src融合蛋白，且该融合蛋白具有较高的靶标蛋白v-Src的免疫原性和酪氨酸激酶活性，可以直接作为靶标蛋白）。
2．药用植物化学研究。
一：关于植物中富含活性成份的研究与微量成分的富集。
1）对广东石豆兰与细茎石斛等几种植物根茎部分粉碎，用70% 酒精浸泡提取，通过不同极性化学溶剂进行化学部位分段，体外抗肿瘤药理实验获得若干有效部位。
2）运用逆流色谱技术，大孔吸附树脂及正反相柱层析对有效部位进行分段分离，得到一系列主要成分，运用现代波谱技术进行结构确定，一般为已知化合物。
3）对上述分离得到的未知结构的单体成分进行结构确定并进行药理验证。
4）通过LH－20凝胶柱层析对上述已经分出主要成分的有效部位进行微量成分的富集与分段，得到若干含有多组分（微量成分）部位，体外药理跟踪得到系列有效部位。
二：关于植物中含量低微的活性成份的快速识别研究
1）制备并组装含靶标分子的筛选池，探讨快速筛选的最佳条件。
2）以抗肿瘤作用确定的天然化合物如紫杉醇、长春新碱等若干已知抗癌成分为对照，通过实验考察温度、PH值、有机溶剂、化学计量比以及相互作用时间对靶向筛选的影响, 结合HPLC色谱定量分析，确定筛选的最佳实验条件。
3）在上述实验的基础上，对若干含多种微量成分的有效部位进行快速识别研究，在靶向筛选平衡后，活性成分与靶标结合形成复合物而被截留，未被筛选化合物分子游离分布在两个筛选池中，应用HRMS或HPLC/MS对筛选前后的天然混合物溶液制备指纹图谱，从指纹图谱中发现差异，可获得生物活性成分的信息。
4）锁定筛选出的活性成分，通过高分辨质谱可提供元素组成（分子式）的功能，结合联机数据库检索，确定新成分；运用多级质谱技术，进行新化合物的结构信息提取，初步鉴定其结构。
5）对在线分析并结合检索确定结构的复杂新结构成分，通过多次富集并结合半微量制备，运用微量探头多维NMR测定其结构。
6）运用体外肿瘤细胞株培养等常规药理方法对一些具有新颖结构的成分进行药理验证。
图二：快速筛选流程见下图：
图三. 抗肿瘤活性成分靶向快速识别技术路线如下：
进度安排
本项目拟用三年时间完成各项研究任务，预期进展情况如下：
1）2007.1~2007.12 完成具体实验方案设计，药用植物的采集，有效部位的提取分段，微量有效成分部位的制备。
2）2008.1~2009.6 完成各种药用植物中富含化学成份的分离提取与结构确定，同时建立微量或超微量抗肿瘤有效成份的快速识别的试验方法；完成多种的微量抗肿瘤活性成份的快速实验。
3）2009.6~2009.12 归纳，整理，分析总结并提交研究论文与总结报告。
5、项目创新之处
关于天然来源的有效成分的研究, 国内外研究人员通常还是采用常规的植物化学研究途径结合离线的活性实验；今年来在分离材料、高灵敏度色谱制备手段上进行大量的探索，对于一些微量成分的
研究，目前尚无通用的方法，只有采用较为经典的多次制备的途径, 与活性衔接也是较难的, 因而本项目拟以v-Src 蛋白作为靶蛋白，基于该靶标与抗肿瘤活性分子的相互作用进行中草药中抗肿瘤活性成分的靶向筛选，结合高分辨质谱及其联用技术对上述筛选出的成分进行在线分离分析与鉴定，其创新之处在于：
(1) 靶蛋白对药物分子的靶向筛选以及高分辨质谱分析均是极其灵敏的途径，该方法适用于微量或超微量生物活性成分的分析研究，为从天然来源（药用植物）中发现一些含量低微的抗肿瘤活性成分提供新手段，该研究未见文献报道，丰富了有机与生物分析的理论内容。
（2）本项目关于生物活性成分的靶向筛选与分析鉴定可在线一体化实施，丰富了天然有机（药物）化学研究方法，可大大提高了天然有机化学及药物化学研究工作的效率。
（3）靶标与抗肿瘤活性分子的相互作用用于中草药（药用植物）中微量的抗肿瘤活性物质的靶向筛选，可发展成为一种分子水平上的微量或超微量分离途径，该研究无疑为分离科学增添了新的内容。
（4）本项目重点进行多种药用植物中微量成分的研究，以发现大量的拥有新结构的生物活性成分，该研究可大大丰富抗癌药物先导的源泉（为药物合成提供靶标）从而为创制新药奠定良好基础。
（5）上述途径也可适用于其他天然来源生物活性微量成分的快速识别.
6、工作基础与工作条件
1）本项目申请人自1988年以来一直从事具有生物活性天然有机化合物的分离提取、结构鉴定研究，迄今已分离出80多个新化合物，在国际知名专业学术期刊等上发表了多篇论文，在探索与发展天然药物有效成份分离新技术，进行一系列研究工作，开展了新的逆流色谱仪技术的开发与应用工作，申报专利两项，在《Journal of Chromatography A》发表论文多篇，在发展生物活性分子质谱分析研究领域，进行了一系列的探索工作，分别在《Analytica Chim.Acta》等杂志上发表论文多篇；在发展与建立生物活性分子在线分离分析新途径方面，在《Analytical Biochemistry》等杂志上发表论文多篇；同时课题组也开展药物合成的一些研究工作，迄今已在《Organic Letters》发表论文3篇；在新的蛋白靶标，与从事生命科学研究的相关课题组开展了合作研究，并于2006年在国际著名杂志《Journal of Biological Chemistry》发表论文一篇。总之，围绕药物化学研究，本课题组已发表学术论文120余篇，其中SCI收录100余篇，申报专利6项，获批2项，其研究成果共获省部级及其他部门科技奖三项。
（2）课题申请者近几年来负责承担了的三项国家自然科学基金项目，其中两项课题“亲合超滤-质谱分析在天然来源抗肿瘤活性成分快速筛选中的应用”与“质谱在天然来源抗肿瘤活性成分靶向筛选中应用”分别以拓扑异构酶以及微管蛋白等作为靶标分子，对一些抗肿瘤活性的物质进行了筛选分析研究，取得的结果可为本课题的实施提供有益的经验，部分方法也可借用。由于酶与微管蛋白制备相
对困难，活性保持也有一定的限制，本项目基因工程获得的v-Src 蛋白作为靶分子, 对中草药中的潜在的抗肿瘤活性分子进行靶向筛选。该工作是本课题组前期工作延伸，已有较为扎实的基础。
（3）我们在近期的相关研究中，从一些药用植物中分离得到的一系列具有抗肿瘤活性化合物，这些化合物拥有多类结构骨架如萜类、糖苷以及黄酮等，多数新结构含量甚微，其分离分析颇为艰难，常规的正反相层析与高效液相制备要么效果不佳要么代价太大，因而要获得结构骨架新颖的活性成分，发展微量水平上快速识别的新途径非常必要。
工作条件
申请人所在研究所拥有Bruker 电喷雾Espuire3000 plus-HPLC/MS联用仪一台，500MHz超导核磁仪一台，该仪器带有微量探头（Nano-probe），可用于本研究中一些新的微量活性成份的结构分析研究。目前也在管理着Bruker Apex III FT-ICR-MS 高分辨质谱一台，可进行多级质谱的实验，本仪器已与HPLC联用，可充分应用于本项目中微量活性成分的快速定性分析。此外，本实验室拥有较完备的用于分离提取的各种仪器材料，拥有了各型常规正相柱色谱、中压色谱、各型葡聚糖凝胶色谱（Sephdex LH-20)、反相层析色谱（RP-4、RP-18)、半微量制备型高效液相色谱外，还有自行研制的立式高速逆流色谱仪与二维逆流色谱各一套。
v-Src 蛋白的制备已经程序化，整个周期可在10天内完成。
7、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路
通过本项目的研究，预计可取得如下成果：
（1）通过本项目的实施，发展并建立基于v-Src 蛋白作为靶标分子并结合质谱手段应用于天然来源的微量新型抗肿瘤生物活性成分快速识别的新途径。
（2）通过该途径广泛进行多种天然来源生物活性成分的快速识别, 期望发现3-5具有应用前景的新型药物先导物，为抗肿瘤新药创制奠定基础。
（3）通过研究，可申报专利1-2项。
（4）预计可发表包括SCI论文在内的较高水平学术论文8~10篇。
（5）通过本项目实施，培养乐于献身新药创制前瞻性应用基础研究领域的一批年轻人。
今后本课题组还将以此研究获得抗肿瘤活性分子为基础，开展药物先导的合成与衍生研究，为深入开展相关的药理学研究奠定基础，并可望获得一些有开发价值的创新药物先导，并拟在3-5年内，在具有自主知识产权的创新药物研究中获得突破。
如前所述，从中草药出发寻求与发现高效低毒的新型抗肿瘤药物无疑是医药行业极为关注的热点研究领域；本研究的结果可直接服务于浙江省大型制药企业，因此可以寻求企业的投资来实现本项目的长远目标。
8、参考文献
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