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国活性干酵母生产的现状与发展-----------------------作者：
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国活性干酵母生产的现状与发展 一、中国活性干酵母生产的现状 酵母是一种单细胞微生物，属于真菌类，早在公元前3000多年前，人类就开始利用酵母来制作发酵产品，只是当时人们还没有认识酵母。但作为一种工业，从最初的啤酒酵母泥开始在市场上销售算起，酵母工业的发展历史仅200 多年。 中国酵母生产始于1922年，1949年以前只有大华利酵母厂，产品为压榨酵母（含水量70％左右）。国活性干酵母的研究和生产始于20世纪70年代，1974年，酵母厂首先试制出面包活性干酵母。国酵母的生产作为一种产业的出现则是在20世纪80年代，随着80年代中期安琪酵母股份（原名中国生物开发中心食用酵母基地）、丹宝利酵母厂和梅山马利酵母的相继投产，标志着中国的活性干酵母工业化生产达到了国际水平。 活性干酵母是以固体形式存在，而不失去活性的酵母细胞产品。活性干酵母有两个基本特征：一是常温下长期贮存而不失去活性，二是将活性干酵母在一定条件下复水活化后，即恢复成自然状态并具有正常酵母活性的细胞。 其中，细胞含量超过200 亿cfu ／g ，含水量小于6 ％的活性干酵母被称为高活性干酵母。高活性干酵母具有含水量低、复水快、贮藏时间长、使用方便等优点。 活性干酵母具有性能稳定、易于运输等优点，被广泛地应用于发酵面食加工和酿酒领域。 在食品工业中，活性干酵母作为优良的发酵剂和生物膨松剂被用于面包、馒头、包
子、打饼干等食品的加工，制成的食品香松可口、别具风味。与用化学发酵粉和老面头发酵剂制成的食品相比较，具有发酵力强、营养丰富、使用简便等优点，无苦涩粘牙和需要用碱中和等缺点。 在酿酒行业，活性干酵母也得到了广泛地使用。 目前国酒精厂、白酒厂都在使用酒精活性干酵母，其应用围包括酒精、麸曲白酒、液态白酒、小曲酒和大曲酒及制曲，具有提高发酵的安全性和稳定性、提高出酒率、节能降耗等优点。酒用活性干酵母自问世以来累计创造社会效益达30亿元。 除此以外，活性干酵母在医药、饲料、化妆品等领域也大有用武之地。酵母成为目前世界上唯一年产量超过百万吨的微生物。 1.活性干酵母产品产量、产值稳步增长，生产规模不断扩大 活性干酵母行业处于快速发展期，全国的销售量每年基本上以10％-15 ％的速度递增。1998年国高活性干酵母的总产量为1.8 万t ，2001年活性干酵母总产量达3.5 万t ，2002年的总产量在4.5 万t 左右，2003年国高活性干酵母总产量可达4.8 万t ，活性干酵母生产企业也由1998年的3 家发展到目前规模不等的企业14家。 2.活性干酵母品种由单一化向多样化发展 按品种分，目前国产活性干酵母已问世正式推向市场的有家庭用小包装面包酵母、面包高活性面包酵母（低糖）、面包高活性面包酵母（高糖）、耐高温酒精活性干酵母、常温酒精高活性干酵母、生香酒用高活性干酵母、黄酒高活性干酵母、葡萄酒高活性干酵母、啤酒高活性干酵母等。 3.国产活性干酵母的发酵技术、生产工艺逐步提高，装备水平达到国际先进水平糖蜜处理、杂菌控制、发酵、离心、过滤、干燥、包装技术水平不断提高，生产线自动化
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
酵母的发展和现状 一、活性酵母在国民经济中的作用 活性酵母: 是指以粮食、糖类等为原料，利用生物工程技术、发酵通风培养得到的、具有发酵活性的纯微生物制品。 1. 食用酵母 食用酵母一般是指用发酵法生产的供人类食用或食品加工用的活性酵母制品。产品含有丰富的蛋白质、B 族维生素、脂肪、核酸、固醇和多种酶类等物质，同时又具有将糖类发酵产生酒精和CO2的特性。 从酵母所含的蛋白质量来衡量，它高于大豆，为瘦猪肉、牛肉、鱼类鸡蛋的2 倍多。 2. 酵母抽提物 酵母抽提物（yeast extract ) ，又称为酵母浸出物。它是将具有活性的酵母细胞经过加工得到，是酵母细胞内物质的浓缩物，产品本身已不具备发酵活性。 国内酵母抽提物的商品名称有酵母精、酵母味素和酵母调味料等。 3. 药用酵母 一般是将酵母制成酵母片或酵母粉供人摄取。如在酵母培养过程中加人微量元素制成硒酵母、铬酵母等特种酵母制品，用于补充不同人群微量元素的不足，以预防一些特殊病症的发生。 如含硒酵母用于治疗克山病和大骨节病，并有一定的防止细胞衰老的作用；含铬酵母可用于治疗糖尿病等。 4 饲料酵母 饲料酵母是将培养的酵母，或从酿酒过程中回收的废酵母经过干燥制成的粉末状或颗粒状产品，一般不具备发酵活性。 它含有丰富的蛋白质（40 ％一48 % ）、B 族维生素、氨基酸等物质，广泛用作动物饲料的蛋白质补充剂。 二、活性酵母发展史 从酵母在人类历史的发展过程中的作用来看，可以分为3 个阶段: 1. 利用啤酒和酒精生产副产物―废酵母的阶段
1781 年，荷兰人用离心机将上面发酵啤酒中的酵母除去酒花苦味、采用螺旋压榨机压干的块状产品，第一次在市场销售。产品被称为压榨酵母（compressed yeast ）或面包鲜酵母，这是最早出现的商品酵母。 2. 形成专业化商品活性酵母生产的阶段 从19 世纪末至20 世纪中期约50 年期间，压榨酵母的生产在欧洲得到了快速的发展，生产工艺和生产装备逐步完善，生产原料从粮食改为废糖蜜，使面包酵母的生产水平大幅度提高。 3 活性干酵母产业的发展 最早出现的活性干酵母（active dry yeast , ADY ）起源于19 世纪上半世纪。 20 世纪60 年代末，荷兰Gist 公司首先开发成功并生产出发酵活性高、保质期长、可直接与面粉混合制成面团的干酵母，产品被称为高活性干酵母（high active dry yeast 或instant active dry yeast ) ，发酵活性一般可以保持在1 一2 年。 三、酵母生长与生产 1 面包酵母的生长特性和要求 面包酵母(顾名思义是制造面包用的)和酿造酵母(造酒用的)在酵母分类中都划分在一种，即Sacchromyces cerevisiae。 酵母的自然的生境(habitat)大都是含糖丰富的，通气不良的中温场所。通常在花的蜜腺，水果，甘蔗表面等地方。它们以发酵的方式生活，即由糖产生乙醇和CO2，可以用下式表述： C6H12O6→2C2H5OH+2CO2 由于酵母菌体是活性干酵母的生产原材料，因此活性干酵母工厂必须对酵母菌体的生产倍加注意。 酵母的耐干性或对制造活性干酵母时所施的烘干工艺的配套性和酵母细胞内所含的海藻糖的量呈正相关，因此菌种的选择至关重要，如中科院微生物所的X 8、美国ATCC的7752菌株都是可用的优良菌株，而且极易由商品自行分得。 2 酵母生长的动态 由酵母的生长曲线(图19-1)可以看到酵母的细胞增殖主要是在对数期完成的。而且酵母的培养工艺要求接种到生产罐的酵母立即进入对数增殖状态，即在生产罐以前就完成了迟缓期。
（化学转化） 如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。 主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。 LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG 240ml 1mmol/L LiCl 36 ml 单链鲑精DNA 25ml 线性化质粒DNA 10 ml (约10mg) 用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。 LiCl 转化方法 作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间 溶液： 1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。（稀释使用无菌水。） 50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存 2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。 准备感受态细胞： 1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。 2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。 3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。 4.使用最大转速离心15s，吸去LiCl上清。 5.重悬细胞于400ul体积的100mMLiCl中。 6.每个转化组取50ul细胞悬液置于1.5ml离心管中，立即使用。勿要存于冰上或冻存于 -20℃。 转化： 1.取1ml单链DNA鲑鱼精标准煮沸5min，后快速于冰上降温并存于冰上。注意：不需要 也不推荐在每次使用前煮沸载体DNA。分装冻存于-20℃，并且每使用3-4次后再次煮沸更加适宜。 2.离心上面步骤6的细胞，吸去残留的LiCl。 3.每次转化都要向细胞中顺次加入下列试剂。PEG可以保护细胞不会因高浓度的LiCl而受 到损伤。 I.240 ul50% PEG 3350 II.36 ul 1M LiCl III.25 ul 2mg/ml 单链鲑鱼精DNA IV.质粒DNA（5~10ul）溶于50ul无菌水中。
培养基的配方： YPD完全培养基：酵母提取物10g/L ，蛋白胨20g/L ，葡萄糖20g/L，（固体培养基1.5%琼脂）； MM：13.4 g/L YNB，4x10-4 g/L 生物素，5 ml/L 甲醇，15 g/L 琼脂 MD：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖 操作方法： 用无菌牙签挑取his+转化子的单克隆并分别按先后顺序划到MM和MD平板上（不同的克隆需换牙签），30℃培养两天，观察平板。在MM和MD平板上均能正常生长的菌落表型为Mut+（Methanol utilization plus），在MD 平板上能正常生长但在MM 平板上生长相对缓慢或者不生长的菌落表型为Muts (Methanol utilization slow)。 用点MM、MD平板点方法。 准备几块MM、MD，平板用maker笔划小格子，标号，两种平板点标号要一一对应。准备无菌牙签，点取G418板上长出点菌落，先轻轻点MM平板（小格内），再点到MD平板相同标号点小格内。如此点约100个转化子，30℃培养2-5天，观察比较MM、MD上相同标号点菌落，MD平板上生长快，MM平板上生长缓慢或不生长点为Muts，生长速度一样点为Mut+。 原理是Mut+能够快速利用甲醇为碳源，而Muts则不能利用甲醇为碳源。所以Mut+能够在含甲醇（MM)平板也快速生长，而Muts只能在含葡萄糖（MD)平板快速生长。 MD培养基是怎么筛选酵母的?细菌在这种培养基上是不是不生长?MD （Minimal Dextrose Medium，最小葡萄糖培养基）组成如下：（YNB 13.4g/l、葡萄糖20g/l、生物素4×10-4g/l、若制平板加琼脂粉15g/l），它属于组氨酸缺陷型培养基，细菌能生长，配制完后仍需高压蒸气灭菌处理。 用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的，只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。 酵母菌可以利用有机物和无机物作为氮源，有机氮源有酵母浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨等，无机氮源有尿素、醋酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵等铵盐。
毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参
设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。
https://www.doczj.com/doc/fb14137404.html, GS115 毕赤酵母PEG感受态细胞 组成规格： 货号名称规格数量 GT2504 GS115酵母感受态细胞50ul 20支 GT2505 GS115酵母感受态细胞50ul 50支 GT2506 GS115酵母感受态细胞50ul 100支 为了满足广大科研工作者对大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和农杆菌等菌种感受态细胞的需求，华越洋现推出各种系列的感受态细胞供大家选择。 毕赤酵母感受态细胞试剂盒 1 介绍 本试剂盒包括酵母感受态细胞、Solution 1和Solution 2。其中酵母感受态细胞是用于转化的细胞，需-70度低温保存；Solution 1和Solution2为转化时使用的试剂，均为无菌，需-20度保存，使用时解冻即可。本酵母感受态细胞采用专利技术制备的感受态，有别于传统山梨醇制备的感受态细胞，并配有Solution 1和Solution 2，可直接用于热击法转化，而不需要使用电转仪和电击杯。本方法是电击法的替代方法，也避免了LiCl方法需要现制备感受细胞的繁琐。转化效率可以达到102-103cfu/ug线性化DNA，经本公司反复验证-80保存6个月不影响转化效率。 2 转化步骤 2.1 线性化质粒片段的制备 取过夜培养的质粒菌种3ml,使用质粒抽提试剂盒抽提质粒，最后溶解于50ul的TE或水中。将所有的质粒片段在200μl的体系中酶切线性化。用酚氯仿试剂去除蛋白并且浓度片段至20ul体系中（保证有100μg的质粒片段）。 2.2 转化 2.2.1直接加于冻结的酵母细胞中，以获得最大转化率；（注意加入至冻结的细胞中，而不是解冻的细胞中）； 2.2.2. 加入后迅速放入37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 2.2. 3. 取出离心管，加入1.5ml Solution 1，彻底混匀；(注意可以弹或移液器轻轻混合，不可用移液器剧烈来回混合也不可用涡旋振荡器) ； 2.2.4. 30℃水浴孵育1h； 2.2.5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml Solution 2中； 2.2.6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml Solution 2中； 2.2.7. 将所有转化液铺于选择性平板（例如MD板），于30℃孵育3～4天后，鉴定；
毕赤酵母感受态细胞制作 1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。 2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。 3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。 4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。 5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。 6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。 7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。 7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。 8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。 毕赤酵母电击法转化 1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。 2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。 3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。 4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。 5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。 6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。 要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
V o l .30N o.62004212 华 东 理 工 大 学 学 报 Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy 基金项目:教育部科学技术研究重点项目(99166);上海市重点学科基金 E -ma il :qye @ecust .edu .cn 收稿日期:2003212208 作者简介:谢静莉(19742),女,江苏南京人,博士研究生,研究方向为 发酵工程。 研究简报 文章编号:100623080(2004)0620723204 重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响 谢静莉1, 周庆玮2, 杜 鹏2, 甘人宝2, 叶 勤13 (1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237; 2.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031) 摘要:采用M u t S 表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油2甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g L ,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mm o l L 时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH 调节方式并在发酵后期添加25mm o l L (N H 4)2SO 4使发酵液中铵离子浓度维持在150mm o l L 以上,血管生长抑制素的表达产量达到108m g L 。 关键词:巴斯德毕赤酵母;血管生长抑制素;发酵;铵离子浓度中图分类号:TQ 920.6文献标识码:A Effect of Amm on iu m Concen tration on the Expression of Ang iostati n i n H igh Cell D en sity Culture of Recom bi nan t P ich ia p astoris X IE J ing 2li 1 , ZH OU Q ing 2w ei 2 , DU P eng 2 , GA N R en 2bao 2 , Y E Q in 13 (1.S ta te K ey L abora tory of B ioreactor E ng ineering ECU S T ,S hang ha i 200237,Ch ina ;2.Institu te of B ioche m istry and Cell B iology ,S hang ha i Institu te of B iolog ica l S cience , Ch inese A cad e m y of S cience ,S hang ha i 200031,Ch ina ) Abstract :In fed 2batch cu ltivati on of recom b inan t P ich ia p astoris (M u t S pheno type ),feeding w ith glycero l and m ethano l w as conducted du ring the exp ressi on phase to enhance the cell grow th and angi o 2statin exp ressi on .T he cell den sity reached 174g L at the end of fer m en tati on ,w h ich w as abou t 3fo ld of that ob tained w ith m ethano l as the so le carbon sou rce in the inducti on phase .H igh cell den sity resu lted in a qu ick drop of amm on ium concen trati on in the fer m en tati on b ro th ,and w hen the amm on ium concen trati on w as below 40mm o l L ,the p roducti on of angi o statin also decreased .T he change of pH con tro l strategy and additi on of 25mm o l L (N H 4)2SO 4w ere app lied to release the effect cau sed by low amm on ium concen 2trati on .T he amm on ium concen trati on w as m ain tained above 150mm o l L in the inducti on p hase ,and 108m g L angi o statin w as ach ieved at the end of fer m en tati on . Key words :P ich ia p astoris ;angi o statin ;fer m en tati on ;amm on ium concen trati on 3 27
活性干酵母和非活性酵母 活性干酵母实际上是处于“冬眠状态”，它还是活的生物体，它在遇到水和有糖分的环境之后，就会“苏醒”，繁殖生长。比如在做馒头、面包的时候加的就是活性干酵母。活性酵母不能直接食用。 而非活性的酵母是被灭杀了的酵母，是死的酵母，但是它们的营养物质还存在。比如可以直接食用的营养酵母（或者叫即食酵母）。 你说的做面膜的酵母粉实际上就是通用的营养酵母，是非活性的。含有优质的高蛋白、多种微量元素，对美白、增强皮肤弹性效果非常显著。 很多知名化妆品都使用营养酵母作为原料生产美白护肤用品。 在网上也可以购买到营养酵母（安琪酵母公司就有），既可以内服（有一定减肥效果），也可以用酸奶和营养酵母做成面膜直接涂抹在脸上，保持30分钟左右洗净即可。每周做1-2次。相信你一定会变的更美丽！ 即食酵母粉是一种纯天然的食物。它能有合理的促进营养平衡吸收。它含有丰富的蛋白质、必需氨基酸、B族维生素、矿物质和膳食纤维，而糖、胆固醇和脂肪比较少，因此非常适合现代人食用。 如果妈妈食用这种东西，可以在短时间获得牛羊无法达到的蛋白含量，所”产”出的奶中含有的蛋白是牛羊的2000倍，而且它大大降低了牛羊所带来的负面癌症几率，因为它增加了人体抗癌的一些元素。吸收到即食酵母粉进入体内后的硒便与即食酵母粉蛋白、多糖等结合起来，形成生物态的硒元素。这样不仅有效地降低了单独补充无机硒的毒性，而且硒的吸收率也特别高。如果每天人体摄入200微克微量元素硒，会使大肠癌降低48％，肺癌降低46％，前列腺癌降低63％。即食酵母粉还有含有很多人体所需的微量元素，很适合儿童和孕妇食用，是安全食物。 酵母菌一般有很高的营养价值，特别是含有较多蛋白质，很多B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物质。维生素B群可控制人体的代谢功能，保持正常的神经作用。维生素B2与维生素B6对皮肤是很重要的维生素。维生素B12有防止贫血的作用，且有促进肠内维生素合成的作
生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第3期 ·综述与专论· 收稿日期：2008-09-01 基金项目：国家自然科学基金（30560184），国家“863”计划（2007AA02Z114），新世纪优秀人才支持计划（NCET -04-0837），海南省重点学科建 设项目专项与海南省教育厅高等学校科研项目（Hjkj200719） 作者简介：高炳淼（1982-），男，安徽明光人，硕士研究生，研究方向：海洋药物通讯作者：罗素兰，Tel ：0898-********，E -mail ：luosulan2003@https://www.doczj.com/doc/fb14137404.html, 从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一直是个难题。对于基因重组蛋白纯化技术来说，选择合适的表达系统是相当重要的，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白。毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白质的表达载体。毕赤酵母能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并分泌多种蛋白质，使产物易于提纯。纯化重组蛋白质的主要目的是分离出目的蛋白，主要的方法有浓缩沉淀、离子交换、亲和层析、反相层析等。 1酵母表达体系 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是在酿酒酵母 表达体系的基础上，用其他的酵母菌株构建的、可高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养 型酵母（Methy -lotrophicyeast ）表达系统[1]。作为第2代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处[2]。 巴斯德毕赤酵母表达系统具有强有力的醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；同时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性[3]。另外，毕赤酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到 毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化 高炳淼 长孙东亭罗素兰安婷婷 （热带生物资源教育部重点实验室海南大学海洋学院材料与化工学院海南大学生物技术实验中心，海口570228） 摘 要：随着基因重组技术的快速发展，基因工程产品的利用越来越广泛，但其分离纯化的成本约占总成本的 60%~70%。因此，探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要。简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系，着重概述了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况。 关键词：毕赤酵母 重组蛋白质 分离 纯化 Study on Separation and Purification of Recombinant Proteins in Pichia pastoris Expression System Gao Bingmiao Zhangsun Dongting Luo Sulan An Tingting （Key Laboratory for Tropical Biological Resources ，Ministry of Education Ocean College College of Materials &Chemical Engineering Center for Experimental Biotechnology ，Hainan University ，Haikou 570228） Abstract ：Along with fast development of the gene recombinant technology ，the application of genetic engineering product is getting widespread ， but the cost of the separation and purification approximately have been being high.So it is essential to explore simple and effective separation and purification method to decrease the cost.This review focused on progress of Pichia pastoris yeast expression system ，the technique of separation and purification of the recombinant proteins recently. Key words ：Pichia pastoris R ecombinant protein Separation Purification
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选 菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜； 2. 取100-500μl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬 5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤3 离心，用160μl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul； 备注：可将其分装为80 μl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。 比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。 ?KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的 ?对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性? 菌种保存： 挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存 （一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。 乙醇沉淀主要步骤如下： 1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀 2)-20℃ 20分钟沉淀 3)13200rpm，20min，离心后弃上清 4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清 5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。 6)20ul ddH2O重溶） 电击转化： 8. 将5~20 μ g 的线性化DNA 溶解在5~10 μ l TE溶液中，与80 μ l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中； 9. 将电转化杯冰浴5min； 10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击； 11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP 管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板） 12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 μ l 涂布一块平板； 13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。
毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生 稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的， 也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载 体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的 1-10%。 1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点 GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动 子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或 aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插入的表达盒没有破坏 原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Muts表型。 2. 基因替换AOX1位点
在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交 换事件(取 代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Muts 表型。以AOX1 位点由基 因替 代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表 型。基因取 代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4 的表达 盒。基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。 3. 基 因插入His4位点 GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之 间发生 单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1 或 aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。 4. 多拷贝插入 尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记， 还是很容 易在转化子中筛选到插入多拷贝的表达核的转化子。
胃动力-（反刍动物专用） 邦士富反刍专用高活性干酵母，商品名胃动力，是中国科学院微生物所的刘明博士经过十多年的纯化培养，并经本动物的反复适应，优选出的天然酵母菌种，是被美国FDA和中国农业部批准，可以直接饲喂动物的安全的酵母菌种。采用先进的生产工艺，经过深层通气发酵和低温干燥技术精制而成的活性酵母精品。有效成分及含量：处于休眠状态的纯天然酵母活菌，纯度高达99.5%以上， 水分≤6.0，活菌数≥200亿个/克，活细胞率在90%以上。 状态：淡黄色颗粒状或条状 产品优势：优选菌种，适应性强，在动物体内存活率高，纯度高，活性强，微量添加 作用机理： 1、消耗瘤胃中的氧气，维持厌氧环境, 为瘤胃提供一个良好的发酵环境； 2、促进瘤胃中乳酸利用菌的生长和代谢，进而促进了由乳酸向丙酸的转换，使得动物从日粮中获得更多的能量，降低乳酸盐的浓度，稳定瘤胃PH； 3、刺激纤维消化菌的生长，促进纤维素的消化，提高纤维物质和干物质消化率； 4、刺激瘤胃和后消化道有益微生物（总厌氧菌）的生长，提高消化吸收能力； 5、促进瘤胃微生物生长，增加十二指肠菌体蛋白流量，提高瘤胃挥发性脂肪酸生成量，微生物蛋白的产量。 6、能吸附反刍动物消化道内病原菌，抑制病原菌在肠壁的粘附和定植，减少疾病发生； 7、可与病原菌产生的毒素竞争性的结合肠道中的结合位点，协助消除毒素； 8、增强免疫力和抗病力； 产品功效： 1、提高反刍饲料的适口性，促进反刍动物粗饲料的采食量，提高饲料转化率； 2、改善瘤胃微生态环境，促进有益菌增殖，降低临床和隐性酸中毒的发生，减少细菌性腹泻； 3、改善消化道的生态环境，促进消化吸收及粪便成型、减少“过料”现象，减少粪便中的有害气体排放，改善养殖环境； 4、提高产后采食量，改善泌乳早期能量负平衡，提高产奶量，乳蛋白率，乳脂率，延长泌乳高峰持续时间，改善繁殖性能； 5、降低奶牛体细胞数，降低隐性和临床性乳房炎的发生； 6、促进免疫系统的完善与发育，增强动物自身的免疫机能，提高抗应激能力； 7、促进神经，内分泌的调控，减少药物使用； 8、对常用抗生素十大类不敏感，不影响饲料中抗生素的正常添加； 9、促进肉牛、肉羊生长，降低料肉比； 10、是一种天然添加剂，动物不会产生耐受性，正常使用无任何副作用；