基因敲除小鼠的制备流程
基因敲除小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型，在生命科学、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用。基于胚胎干细胞的基因打靶技术、EGE技术（基于Crispr cas9技术）是当下比较火热的基因敲除小鼠制备技术。利用这两种技术制备基因敲除小鼠的流程是什么样的？
一、基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠的流程：
1.课题设计，订购课题BAC菌；
2.按照课题设计，完成打靶载体设计和构建；
3.将重组载体电转到胚胎干细胞中，用G418筛选转染后的胚胎干细胞，
得到阳性克隆；
4.进一步通过PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标
准）对上一步得到的阳性克隆进行筛选，得到稳定整合外源基因的胚
胎干细胞阳性克隆；
5.将胚胎干细胞阳性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫
内；
6.得到嵌合鼠，并获得F1阳性杂合子小鼠。
基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠是目前为止唯一一个
可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术，但目前只应用在小鼠的基因敲除上，而且其周期长工作量大。
二、利用EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠的流程
1.设计构建识别靶序列的sgRNA;
2.设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒；
3.利用百奥赛图自主开发的UCA试剂盒对sgRNA/Cas9进行活性检测；
4.设计构建打靶载体；
5.体外转录sgRNA/Cas9 mRNA;
6.小鼠受精卵原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体；
7.获得Fo代小鼠，利用PCR对Fo代小鼠进行基因型鉴定；
8.获得F1代小鼠，利用PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小
鼠检测金标准）对F1代小鼠进行基因型鉴定。
虽然EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠看似比基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠流程繁琐，其实不然，EGE技术（基于Crispr cas9技术）系统构建简单，基因敲除/敲入效率高，速度快，可实现多基因、多物种基因敲除/敲入，最快2个月即可得到F0代阳性鼠，5个月得到F1F1代杂合子小鼠。
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]
转基因小鼠的制备 【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。 【实验原理】 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。 【实验步骤】 一、显微注射法 1.受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入 用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备 将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植 将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。 二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
如何设计条件性基因敲除小鼠模型 摘要： 小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。 小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。 条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。 Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。 所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。 那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP 序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF 内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧)，该外显子的碱基数目不能是3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法 一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理： 通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。 二、具体步骤如下： 一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。 二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具 （https://www.doczj.com/doc/fb12717589.html,/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。 1、制备sgRNA的实验方法步骤： 1）线性化pUC57-GDNA-T7载体 中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。胶回收保存备用。 2）引物退火及加磷酸 将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。 3）连接&阳性菌落筛选
取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用 4）制备转录模板 以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。再吸1 μl测DNA浓度，浓度应介于300-500ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0范围内。 5）最后进行sgRNA转录，将得到的sgRNA测浓度，跑电泳，分装保存。 三）Cas9/sgRNA的显微注射：将转录好的Cas9 mRNA，sgRNA混合使用显微操作仪将混合物显微注射到小鼠受精卵的胞浆中，再将受精卵移植到假孕的母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生。 四）F0 小鼠的鉴定：在F0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠，并将剪取鼠尾组织用在靶区域设计的引物进行鉴定，选取PCR阳性的样品进行测序。 五）F0代小鼠的可遗传性检测：将PCR以及测序正确的F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠进行交配，产生F1代小鼠，依据F0代小鼠的鉴定方法对F1代小鼠进行鉴定，获得的阳性F1代杂合子小鼠即可稳定遗传。
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与
转基因小鼠的应用及其制 备方法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。
转基因小鼠的应用及其制备方法 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications ofTransgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@https://www.doczj.com/doc/fb12717589.html,；Tel： *通讯作者：E-mail： 兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医
转基因小鼠制备实验方法 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)
基因敲除技术 1．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"
（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
基金项目：国家自然科学基金资助（３１２７１２７１ ）＊通讯作者文章编号：１ ００７－４２８７（２０１９）０７－１２３９－０６Ｔ ＳＣ１转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究 王 红１， ２，３，蒋 莉４，王 岩５，许振凯６，王威平６，方 航１，２，３，孙 鹏７，８，９＊，白晓春１，２，３，６＊（１． 南方医科大学附属第三医院，广东广州５１０６３０；２．广东省骨科研究院，广东广州５１０６３０；３．广东省骨科医院，广东广州５１０６３０；４．吉林大学第一医院急诊科，吉林长春１３００２１； ５． 吉林大学中日联谊医院科学研究中心，吉林长春１３００３３；６．南方医科大学，广东广州５１０５１５；７．中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东广州５１００６０；８．华南肿瘤学国家重点实验室广东广州５１００６０； ９． 肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东广州５１００６０）摘要：目的 为探讨ｍＴＯＲ信号通路在骨骼发育过程中的机制作用，建立骨骼发育相关的ＴＳＣ１转基因小鼠， 提供稳定的动物模型。方法 取８周龄健康清洁级ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶（Ｐｒｘ－１－Ｃ ｒｅ）小鼠、软骨细胞特异性重组酶（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）小鼠及成骨细胞特异性重组酶（Ｏｓｘ－Ｃ ｒｅ）小鼠进行杂交。将繁殖出的小鼠继续与ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠回交，并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及ｍＴＯＲ活性检测。结果 杂交后分别获得肢芽 干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠和成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠各８只。与正常组 比较，上述３种转基因小鼠ｐ－ Ｓ６均比正常组升高（Ｐ＜０．０５）。结论 本实验成功应用Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统构建肢芽干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠，均提示ｍＴＯＲ活性增高， 有明显ＴＳＣ１敲除效果，为ｍＴＯＲ信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础。 关键词：基因敲除小鼠；骨发育；Ｔ ＳＣ１；ｍＴＯＲ信号通路中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇ ｅｎｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｅｆｆｅｃｔ ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ１，２，３，ＪＩＡＮＧ Ｌｉ４，ＷＡＮＧ Ｙａｎ５，ｅｔ ａｌ．（１．Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆ ｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇ ｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉ Ｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｓ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｂｏｕｔ ｂｏｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ ｔｏ ｐｒｏ－ｖｉｄｅ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｂｏｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ ｈｅａｌｔｈｙ ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ ｍｉｃｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ ｗｉｔｈ ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）ｃｈｏｎｄｒｏ－ｃｙ ｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｏｓｘ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ ｗｉｔｈ ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ ｍｉｃｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｍＴＯＲ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｏｆｆ－ｓｐｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｗｅ ｏｂｔａｉｎ ８ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ａｎｄ ｐ －Ｓ６ｏｆ ｔｈｏｓｅ ３ｔｒａｎｓ－ｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｂｙ Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｙ ｓｈｏｗ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈ ｍＴＯＲ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｈａｖｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｅｆｆｅｃｔ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ；ｂｏｎｅ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＴＳＣ１；ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇ ｎ，２０１９，２３：１２３９） 结节性硬化复合物１（Ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｃｏｍ－ｐ ｌｅｘ１，ＴＳＣ１），是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐ ａｍ－ｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）有着密切的联系。目前研究发现，ｍＴＯＲ能整合细胞内外各种信号，是机体与细胞感受营养的信号通路［１］。ＴＳＣ１位于ｍＴＯＲ信号通路的上游，对ｍＴＯＲ有一定抑制作用。既往研究主要集中ｍＴＯＲ信号通路对心脑疾病及肿瘤发病机制的探讨，而近期实验发现ｍＴＯＲ信号通路在骨骼— ９３２１—中国实验诊断学 ２０１９年７月 第２３卷 第７期
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），
利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
1. 基因准备 2. 实验用鼠的饲养 小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。本项试验将全部应用C57/BL6 ×DBA杂交的F1代小鼠。 转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。 2.1 供体鼠 一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。一般用4～6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。 2.2 受体鼠（即假孕母鼠） 母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。母鼠一般4～5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20～25％进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2～3只母鼠。也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2～4只母鼠。一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。 2.3 结扎公鼠 结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。用作母鼠假孕的结扎公