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现代生物实验原理与技术考试整理

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现代生物实验原理与技术考试整理

蛋白质表达技术

DNA重组表达:在合适表达元件(如转录启动子、终止子、翻译调控序列、转录酶、翻译因子等)调控下,目的基因表达成目的蛋白质的技术。

外源基因在大肠杆菌中的表达:

大肠杆菌表达外源基因的优势:

1、全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架

2、基因克隆表达系统成熟完善

3、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定

4、被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

大肠杆菌表达外源基因的劣势:

1、缺乏对真核生物蛋白质的复性功能

2、缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统

3、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白

4、细胞周质内含有种类繁多的内毒素

大肠杆菌表达载体分类:

按蛋白质类型分:

?单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体

?融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc

分泌表达: pel/ompT分泌肽

按启动子分:

lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子IPTG诱导

lamda phage PL和PR 启动子热诱导

T7 启动子IPTG诱导

T5 启动子IPTG诱导

ara启动子阿拉伯糖诱导

选择表达系统:

1.蛋白质的大小:

小的胞质蛋白和多肽最好能与运载序列连接,以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。运载序列能起到稳定靶蛋白的作用,使其免受胞内蛋白酶的降解,并能提供用于亲和纯化的配基结合位点。用蛋白酶在融合蛋白的适当位置进行切割,可以回收有活性的靶蛋白。

2. 蛋白质的需要量:

如果需要少量的靶蛋白、酶的活性可以用粗提物来分析,一般不需要进行优化表达。

3. 蛋白质是否需要保留活性:

(1)若只用于生产抗体,包涵体有利于分离。

(2)若靶蛋白用于生物化学或细胞生物学研究,就要考虑活性,其次考虑纯化问题。(3)若要用于结构研究,最好能以可溶性状态表达。

外源基因在大肠杆菌中的表达:

外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理:

转录:启动子、终止子、核糖体结合位点

翻译:密码子、质粒拷贝数

启动子:

Lac表达系统

以大肠杆菌lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

转录调控机理:

具有多顺反子结构,基因排列次序为:启动子(lacP)- 操纵基因(lacO)- 结构基因(lacZ-lacY-lacA)、正调节因子CAP、负调节因子lac I

正调节因子CAP :

cAMP激活CAP,CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后,能促进RNA 聚合酶与–35、–10 序列的结合,进而促进Plac 介导的转录。基因工程中使用的lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型,即Plac UV5

lac UV5 突变体:

Plac UV5 突变体能够在没有CAP 存在的情形下非常有效的起始转录,受它控制的基因在转录水平上只受lacI 的调控,因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac 更易操作。

负调节因子lac I :

在无诱导物情形下,lac I基因产物形成四聚体阻遏蛋白,与启动子下游的操纵基因紧密结合,阻止转录的起始。

Trp表达系统:

以大肠杆菌trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

转录调控机理:

色氨酸启动子Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏,转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸(IAA),便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中,除去色氨酸是困难的,因此基因工程中往往添加IAA 诱导Ptrp介导的目的基因表达

Tac 表达系统:

tac 启动子是由trp 的–35 序列和lacUV5 的–10 序列拼接而成的杂合启动子调控模式与lacUV5 相似,但mRNA 转录水平更高于trp 和lacUV5启动子(P tac = 3 P trp = 11 P lac),因此在要求有较高基因表达水平的情况下,选用tac 启动子比用lacUV5 启动子更优越。

lac、tac启动子对宿主菌的要求:

在普通大肠杆菌中,LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac 操纵子转录调控的需要。当多拷贝的lacO 随着带有lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后,LacI 阻遏蛋白与lacO的比例显著下降,无法保证每一个lacO 都能获得足够的LacI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下,lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。为了使以Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力,一种能产生过量的LacI 阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacI q 被应用于表达系统。大肠杆菌JM109 等菌株的基因型均为lacI q ,常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控,在使用高拷贝复制子构建表达载体时,仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacI q基因以保证有较多的LacI 阻遏蛋白产生。

lac、tac表达系统存在的问题:

IPTG 用于诱导lac、tac 启动子的转录,但由于IPTG 本身具有一定的

毒性。从安全角度,对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。

一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG 解决方法:

lac和tac 启动子的转录受温度严紧调控

乳糖替代IPTG 诱导lac和tac 启动子的转录

PL和PR 表达系统:

以l 噬菌体早期转录启动子PL 、PR为核心构建的表达系统在野生型l 噬菌体中,

PL 、PR 启动子转录与否决定了l 噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。

转录调控的机理:

由l 噬菌体PE启动子控制的cI 基因的产物是PL 、PR 启动子转录阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的。因此PL 、PR 表达系统都选用温度敏感突变体cI 857(ts) 的基因产物来调控PL 、PR启动子的转录。

在较低温度(30℃)时以活性形式存在

在较高温度(42℃)时失活脱落

宿主菌中没有cI 基因产物,PL、PR 启动子的高强度直接转录,带有PL 或PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。

对宿主菌的要求:

用溶源化l 噬菌体的大肠杆菌作PL、PR启动子表达载体的宿主菌N4830-1,POP2136 等菌株已经溶源化cI 857(ts)l 噬菌体,可用作表达外源基因时的宿主菌。把cI 857(ts)基因组装在表达载体上宿主菌选择范围更大

PL和PR 表达系统存在的问题:

由于PL 和PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂,成本又低廉,最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL 或PR 表达系统。

缺陷:

在热脉冲诱导过程中,大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活,其中一些是蛋白水解酶,有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时,通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间,这种缓慢的升温方式影响诱导效果,对重组蛋白表达量有一定的影响。

T7 表达系统:

大肠杆菌T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系,利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7 表达系统。

含T7噬菌体启动子的表达载体:

在pET系列载体中,外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控:带有pBR322的大肠菌素E1(colE1)复制区,从而使宿主菌有氨苄青霉素或卡那霉素抗性。外源基因插入多克隆位点,置于天然T7RNA聚合酶启动子或T7 lac启动子的控制之下。T7 噬菌体基因 1 编码的T7 RNA 聚合酶选择性的激活T7 噬菌体启动子的转录。T7 RNA 聚合酶活性高,其合成RNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下,大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7 噬菌体转录体系,最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。

转录调控的机理:

T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA 聚合酶,因此T7 RNA

聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

化学诱导型

温度诱导型

双质粒系统

转录调控的机理:

化学诱导型:

噬菌体DE3 是l 噬菌体的衍生株,一段含有lacI、lacUV5启动子和T7 RNA

聚合酶基因DNA 片段被插入其int 基因中用噬菌体DE3 的溶源菌作为表达载体的宿主菌,调控方式为化学诱导型,类似于Lac 表达系统。

温度诱导型:

PL启动子控制T7 RNA 聚合酶基因,通过热诱导方式激发T7 噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到很低的水平,尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。

双质粒系统:

一个质粒带有T7 RNA 聚合酶基因,另一个质粒带有T7 启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7 RNA 聚合酶的启动子调控类型

T7 表达系统存在的问题:

T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的,但也不可避免出现在相对较高的本底转录,如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性,会影响细胞的生长。解决办法之一:

在表达系统中低水平表达T7 溶菌酶基因。因为T7 溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外,还能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7 溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统,它能明显降低本底转录,但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。

其他表达系统:

营养调控型:

采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因phoA 启动子或甘油3‘-磷酸转移系统ugp 启动子构建表达载体。这两个启动子受在培养基中的无机磷(Pi)浓度调控(Pi﹥5mmol/L 时抑制,Pi﹤1mmol/L 时激活),具有较高的转录水平。

糖原调控型:

采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统(mglBAEC) mgl 启动子或沙门氏菌阿拉伯糖基因araB 启动子构建表达载体。这两个启动子受葡萄糖抑制,岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。其调控机理类似于Lac 表达系统.

pH调控型:

采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA 启动子构建表达载体。cadA 启动子受培养基中H+ 浓度,即pH 值调控。(在pH﹥8 时抑制,pH ﹤6时激活,pH = 6时转录活力最高)。该表达系统要求菌体发酵温度控制在27 ~30℃之间才能使目的基因得到稳定的表达.

溶氧调控型:

采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl启动子,硝基还原酶基因nirB 启动子或透明颤菌血红蛋白基因vgb启动子构建表达载体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子fnr的作用位点。在富氧条件下转录被抑制,在贫氧或微氧条件下转录被激活。大肠杆菌GJ100 有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)启动子控制下的T7 RNA 聚合酶基因表达质粒,vgb 基因的转录是受环境溶氧浓度调控的,在贫氧条件下vgb 基因的启动子被激活。因此,用大肠杆菌GJ100 作为宿主时,表达系统调控方式为贫氧诱导型,菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量加以调节,与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程。生物素调控型:

用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体,菌体生长过程中生物素会不断消耗,当浓度到达2ng/ml 以下时启动子被激活。能够在没有外界的物理,化学信号的介入条件下自动诱导表达目的基因是这类表达载体的特点,其缺陷是不容易精确控制自动诱导的时刻。

终止子:

强化转录终止的必要性:

外源基因在强启动子的控制下表达,容易发生转录过头现象,即RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA 序列,形成长短不一的mRNA 混合物,过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下:

转录产物越长,RNA聚合酶转录一分子mRNA 所需的时间就相应增加,外源基因本身的转录效率下降;如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域,如选择性标记基因和复制子结构等,则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能,甚至导致重组质粒的不稳定性;过长的mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗;更为严重的是,过长的转录物往往不能形成理想的二级结构,从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率

强终止子的选择与使用:

目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA 操纵子上的rrnT1T2 以及T7 噬菌体DNA 上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子,通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构,以增强其转录终止作用

核糖体结合位点:

核糖体结合位点:

外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率,而且在很大程度上还与mRNA 的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA 翻译的起始效率主要由其5?端的结构序列所决定,称为核糖体结合位点(RBS)

大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素:

位于翻译起始密码子上游的6–8 个核苷酸序列5‘UAAGGAGG 3‘即Shine-Dalgarno(SD)序列,它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3‘端区域3‘AUUCCUCC 5‘并与之专一性结合将mRNA 定位于核糖体上,从而启动翻译;翻译起始密码子,大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点,有些基因也使用GUG 或UUG 作为翻译起始密码子SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5‘端若干密码子的碱基序列

核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD 序列的影响

一般来说,mRNA 与核糖体的结合程度越强,翻译的起始效率就越高,而这种结合程度主要取决于SD (UAA GGAG G)序列与16S rRNA 的碱基互补性,其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言,上述四个碱基中任何一个换成 C 或T,均会导致翻译效率大幅度降低

SD 序列与起始密码子之间的距离的影响

SD 序列与起始密码子AUG 之间的精确距离保证了mRNA 在核糖体上定位后,翻译起始密码子AUG 正好处于核糖体复合物结构中的P 位,这是翻译启动的前提条件。在很多情况下,SD 序列位于AUG 之前大约七个碱基处,在此间隔中少一个碱基或多一个碱基,均会导致翻译起始效率不同程度的降低

起始密码子及其后续若干密码子的影响

大肠杆菌中的起始tRNA 分子可以同时识别AUG、GUG 和UUG 三种起始密码子,但其识别频率并不相同,通常GUG 为AUG 50%,而UUG 只及AUG 的25%。除此之外,从AUG 开始的前几个密码子碱基序列也至关重要,至少这一序列不能与mRNA 的5‘端非编码区形成茎环结构,否则便会严重干扰mRNA 在核糖体上的准确定位

目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上,均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列,序列和间隔是最佳的。

密码子:

生物体对密码子的偏爱性

不同的生物,甚至同种生物不同的蛋白质编码基因,对简并密码子使用频率并不相同,具有一定的偏爱性,其决定因素是:

生物基因组中的碱基含量

在富含AT 的生物(如单链DNA噬菌体φX174)基因组中,密码子第三位上的U 和A 出现的频率较高;在GC 丰富的生物(如链霉菌)基因组中,第三位上含有G 或C 的简并密码子占90% 以上的绝对优势

密码子与反密码子相互作用的自由能中等强度规律

如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少

如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多

细胞内tRNA 的含量

密码子偏爱性对外源基因表达的影响:

由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。

一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达:

外源基因全合成

同步表达相关tRNA 编码基因

质粒拷贝数:

质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响

目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝,质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内,而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢,进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降

解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道外源基因在大肠杆菌中的表达:

目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是:

表达质粒的构建比较简单;

能够达到很高的目标蛋白表达量,一般可以达到占细胞总蛋白的20%~40%。

目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种:

在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒(存在于大肠杆菌细胞质)

在细胞内表现为可溶性的蛋白质(存在于细胞质中外,还可分泌到周质空间)

包涵体型异源蛋白的表达:

包涵体及其性质

在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB)由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质,后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。

包涵体表达形式的优点

在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用,有利于目标蛋白的富集简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细

胞碎片和细胞成分,菌体经超声波裂解后,直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白

包涵体表达形式的缺点

?以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性,必须通过有效的变性复性操作,才能回收得到具有正确空间构象(因而具有生物活性)的目标蛋白?经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性,有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋

?复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。

分泌型异源蛋白的表达

在细胞内表现为可溶性的蛋白质

目标蛋白以可溶性蛋白质形式表达虽然可以避免包涵体复性带来的问题,但是也有一定的缺陷,主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的,甚至没有半胱氨酸残基。富含半胱氨酸残基,需要形成二硫键的蛋白质大部份被转运到细胞的其他部位。

这是因为大肠杆菌细胞质微环境的氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成,而且缺少一种形成二硫键所必须的体系。一些需要通过二硫键的形成来维持其构象的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠。

解决这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白还原酶基因trxB 缺陷株作为宿主菌表达目标蛋白。研究表明trxB 缺陷株细胞质的氧化还原态势发生了变化,蛋白质在trxB 缺陷株的细胞质中能够形成二硫键。这一菌株对于表达结构复杂的蛋白质而言是一·个相当重要的工具。

在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质

在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质需要起始密码,通常为编码甲硫氨酸的ATG。

⑴在多数情况下,N端附加的甲硫氨酸对蛋白质的性质没有特别的影响,但是也有附加的甲硫氨酸严重影响蛋白质生物学活力的报道。

⑵另外,附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质。从制备用于医疗目的的蛋白质的角度来看,这是一个需要引起重视的问题。

去除附加的甲硫氨酸有二种方法:

⑴在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。

⑵在分离纯化后在体外用外肽酶处理。

但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨基酸残基类型有一定要求,因此在使用上有一定的限制。

目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达

与纯化包涵体相比,细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂,一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。

目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率,又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。

金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z,日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶,大肠杆菌麦芽糖结合蛋白,His-tag 等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。

目标蛋白在周质空间中表达

目标蛋白在周质空间中表达的优点

⑴大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为100 种,只占菌体总蛋白数量的4%。蛋白水解酶的含量与在细胞质中相比也少得多,因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离

纯化和减少蛋白水解酶的降解。

⑵目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除,有效地避免了N 端附加的甲硫氨酸的产生。

⑶周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠,维持正确的构象。高效表达目标基因的战略和技术:

表达质粒的优化和设计

共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA 基因

提高目标基因mRNA 和目标基因产物的稳定性

高密度发酵和工程化宿主细胞

表达质粒的优化和设计:

在各种表达载体中,启动子和SD序列的下游都设计了一段含有各种限制性酶切位点的序列,用于目标基因的插入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的一部分,因此它对于构建高效表达质粒是至关重要的。

由于每一个基因都具有各自独特的5‘端结构,最终构建成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。

构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码A TG 与SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。

核糖体结合位点序列的变化对mRNA 的翻译效率有显著影响,具体表现为:

SD 序列UAAGGAGG 的翻译效率要比AAGGA 高3~6倍翻译起始密码ATG 与UAAGGAGG的最适距离是6~8 个碱基长度,与AAGAA 的最适距离是5~7 个碱基长度ATG 与UAAGGAGG 至少相隔 3 ~4个碱基,与AAGAA 至少相隔 5 个碱基;mRNA 的翻译才能进行A TG 与SD 序列之间的碱基组成为A,T 碱基丰富时,mRNA 翻译效率较高。

共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA 基因

表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA 基因由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA 的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA 的丰度很低,有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。

解决这一问题的办法:

通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子。在表达系统中共表达稀有密码子tRNA 基因,以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子tRNA 的丰度

提高目标基因mRNA 和目标基因产物的稳定性

由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用,大肠杆菌中的核酸酶和蛋白水解酶能够降解目标基因mRNA 和目标基因产物,这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的,具有一定的专一性和选择性。

蛋白水解酶的特点

细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域,目标蛋白在细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。通过对已知大肠杆菌细胞内蛋白质的半衰期进行统计学分析,发现N末端为Arg 、Lys 、Leu 、Phe 、Tyr 、Trp 残基的蛋白质,含有Pro、Glu 、Ser 、Thr 丰富区的蛋白质容易降解,稳定性较差在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理因素的刺激的条件下,大肠杆菌细胞内的蛋白水解酶活力往往能达到比较高的水平。

提高目标蛋白的稳定性的措施主要有:

利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间,或分泌到培养基中

采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。

对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达。

共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子,如分子伴侣基因。

对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造。

在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。

大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的较运和分泌效率一般比较低,不能满足大规馍制备的需要。

?蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛,生长速率慢,使高密度发酵比较困难。

?融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样,导致生物比活力降低,甚至没有活性。

?融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学的方法切割出单体目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离去除。化学法比酶法成本低,但不少裂解试剂有毒性。

?对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数据,而目前这方面的数据库还不完整。

高密度发酵和工程化宿主细胞

大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下,通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。

目前常用的发酵方式有:恒定培养、流加补料培养、连续培养三种

构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌:

高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高,培养基中的溶氧饱和度往往比较低,氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积,乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题。

虽然在发酵过程中可采取通氧气,提高搅拌速度,控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度,减少乙酸的产生。但从实际应用上看,这些措施都有一定的滞后效应,难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌,是从恨本上解决问题的途径之一。利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质,把透明颤菌血红蛋白基因vgb导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。

用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因pta1和乙酸激酶基因ackA,使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断。

改变代谢流的方向,通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS,单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc1 和乙醇脱氢酶基因adh2 导入大肠杆菌,使丙酮酸的代谢有选择地向生成3?-羟基丁酮或乙醇的方向进行。

对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋日而言,随着发酵后期各种蛋白水解酶的累积,目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。为了使对蛋白水解酶比较敏感的目标蛋白也能获得较高水平的表达,需要构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。

rpoH 基因编码大肠杆菌RNA 聚合酶的r32 亚基,r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH 基因缺陷的突变株己经被构建,研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。到目前为止,已知的大肠杆菌蛋白水解酶基因缺陷的突变株都巳被获得,其中一部分具有实际应用的潜力。

甲醇酵母表达系统:

甲醇酵母(methylotrophic yeast)

指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。

毕赤酵母(Pichia pastoris)\汉森酵母(Hansenula ploymorpha)\假丝酵母(Candia boidinii)

甲醇氧化酶:

A、甲醇代谢关键酶,占可溶蛋白的30%以上。

B、名称和拷贝数不同

毕赤酵母/假丝酵母汉森酵母

醇氧化酶甲醇氧化酶

alcohol oxidase, AOX methanol oxidase, MOX

AOX1、AOX2 MOX

甲醇氧化酶启动子

A、目前已发现的、最强的真核启动子

B、严谨调控型启动子

AOX1:葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导。MOX:葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导

甲醇酵母表达系统的优缺点

A、表达水平高(最高水平的系统)

B、产物可翻译后修饰:糖基化、磷酸化、酰脂化

C、过糖基化程度比酿酒酵母少(8-15个vs100-150个甘露糖)

D、产物可正确折叠和高效分泌(最高分泌表达系统)

E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵,生物量大。

F、实验室和工业操作简单

G、不能满足结构要求严格的糖基化

甲醇酵母表达系统操作原理:

宿主株与标记基因、甲醇酵母系统的整合事件、胞内表达与分泌表达

甲醇酵母系统的整合事件:

YRp型载体:汉森系统

传代不稳定,传代过程同源或非同源重组,高选择压力迫使高拷贝数整合,可达100拷贝。YIp型载体:

A、在靶序列处线性化载体DNA,诱导同源重组

B、有―插入‖和―取代‖二类整合模式

C、主要为单拷贝整合,1-10%为多拷贝整合

甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策:

1、载体稳定性

同拷贝数时,整合型的比自主复制型的表达水平高

YRp型载体的稳定化:选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子,但费时,整合位点不确定。

采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚

2、基因剂量

外源基因表达存在基因剂量效应

3、筛选多拷贝整合子

1.载体引入G418/Zeocin抗性标记,整合子拷贝数与抗性成正相关,采用高G418/Zeocin

抗性转化子。

2.体外串联多个表达盒,直接获多拷贝整合子

3.采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子

4.构建高拷贝整合型表达载体

4、整合位点

外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处,均可高效表达毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低

5、甲醇利用表型

在分泌表达情况下,甲醇慢生长型更利于表达

6、mRNA5’端

mRNA5‘端非翻译区(UTR)的组成与长度应尽量与AOX1/MOX的一致

应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构

7、AT含量分泌信号

AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构;分泌表达效率与所用分泌信号高度相关可采用酿酒酵母来源的MFα、PHO或SUC等的信号肽,或野生型信号肽,但适用性要比较分析。

表达蛋白的检测:

酶活力测定、SDS-PAGE、Western blotting

RNA技术

RNA分子特征:

A/U/C/G构成,核糖的2'位子为-OH,在碱性条件下不稳定;

●为单链分子,内部易形成二级结构,普通电泳不能显示其真实大小,应使用甲醛变性电泳检测;

●胞内外存在有多量RNA酶,该酶极稳定,RNA易受其降解。

RNA处理:

RNA酶无处不在:

RNA酶稳定性极高,仅SDS或苯酚不能使其完全失活;酶活性也不依赖于金属离子,EDTA 无作用;RNA酶热稳定好,煮沸不能失活。

避免RNA酶降解:

创造不利于酶活性发挥的环境!使用专用试剂、器械;使用专用环境/台柜;使用RNA酶活抑制剂。

常用RNA酶活抑制剂:

焦碳酸二乙酯(DEPC):高活性的烷化剂,可不加选择的修饰蛋白质和RNA,用于灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNA酶。分离和纯化RNA过程不用。易挥发致癌,通风橱操作。

酶的蛋白质抑制剂(RNasiin):从人胎盘组织分离的蛋白质,分子量约50KD,单一多肽,可与多种RNA酶紧密结合形成非共价等摩尔复合物使其失活。使用时至少需要1mM DTT存在才有抑制活性,最适pH5-8。常-20 ?C保存于5mM DTT的50%甘油中。不同公司产品商品名不同,易变性失活。

氧钒核糖核苷复合物(VRC):与多种RNA酶活性位点结合,几乎全部抑制酶活性。不能共价修饰RNA酶,故在提取纯化RNA的全过程都需添加,浓度10mM。

器皿和试剂的处理:

干热灭菌:玻璃、金属及耐热品,用RNA酶去除剂洗涤后铝箔包裹,180-200 ?C 4小时以上;

湿热灭菌:一次性塑料品等,灭1-2小时;无菌水也用此法灭,盛水器皿先干热灭菌;DEPC处理水:用灭菌水配成0.1%浓度,室温或37 ?C 12h处理,后打开瓶口,高温高压20min灭菌处理2次;

RNA酶去除剂:玻璃、塑料品用2% Absolve(Dupout公司)浸泡过夜,再无菌水漂洗、干燥。

RNA质量检测:

吸光度检测:A260/A280在1.8-2.0范围内;

电泳检测:28S和18S条带清晰,两者亮度比值在2倍以上;

保温检测:70 ?C保温1h,电泳检测没有新降解

RNA制备(一)

AGPC法(acid-guanidine-phenol-chloroform):

原理:核酸在酸性水溶液中亲水性低,酸性酚抽提时,DNA溶于酚相,RNA溶于水相,据此用于少量RNA制备。

RNA制备(二)

NP-40法(Nonidet P-40):

原理:细胞置于低渗压下,吸水膨胀处于易裂解状态,用表面活性剂(乙基苯基聚乙二醇)可提出胞质RNA。适用于RNA少量制备,不易被RNA酶降解,也不易被基因组DNA污染。RNA制备(三)

试剂盒法:QIAGEN Co. RNeasy 试剂盒

RNA纯化:

前述提取的RNA为总RNA,rRNA占80-85%, tRNA占10-20%, mRNA仅2-5%,甚至更少; 真核生物mRNA在被转录时,其3'-端总是被添加一些腺苷酸,形成聚腺苷酸尾,而rRNA 与tRNA不具有Poly(A)尾。

oligo(T) 磁珠法:poly(A) 与poly(U) 或poly(T)能退火配对,将后者固定,可用于吸附纯化poly(A) +mRNA。oligo(dT)?纤维素法纯化poly(A)+ mRNA

复习思考题

1. 有哪些RNA提取方法?其主要原理是什么?RNA提取过程中如何防止RNase污染?

2. 如何进行RNA的电泳检测?如何通过电泳图谱判定RNA质量?

3. 简述纯化poly(A)+RNA的基本原理?

4. 为何要纯化poly(A)+RNA?操作过程中需要注意哪些问题?

1 cDNA文库

通过一系列酶催化使总poly(A) mRNA制剂转变成双链cDNA群体,并重组于适当的载体分子,转化大肠杆菌细胞,便构成了包含所有基因编码序列的cDNA文库。

2 cDNA克隆法

运用cDNA文库技术,以mRNA为模板合成双链DNA,并对真核生物基因进行克隆的技术。

3 cDNA文库构建

(1)细胞总RNA的制备及mRNA的纯化

是进行cDNA文库构建的第一步。从供体细胞制备总RNA相对容易,但总RNA 中含有大量的tRNA和rRNA,mRNA含量相对较少(一般占2-5%),文库构建时一般需用纯化的mRNA分子。

mRNA纯化方法:真核基因mRNA分子的3′-末端都有一段poly(A)尾巴,可用一段偶联于惰性物质(纤维素/琼脂糖)的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸[oligo (dT)]通过吸附层析进行纯化。纯化程序:

制备oligo(dT)?纤维素层析柱,使总RNA流过纤维素柱,mRNA的Poly(A)尾巴与oligo(dT)序列杂交而吸附于柱上,rRNA和tRNA流过柱子,用100mM NaCl充分洗脱rRNA 和tRNA分子,再用10mM Tris/1mM EDTA洗下含有目的mRNA的部分。

2)合成第一链cDNA

通常有两种方法:

一种是oligo(dT)引导法;

另一为随机引物引导法(randomly primed cDNA synthesis)

目前普遍采用后一方法。

①oligo(dT)引导法:

利用真核生物mRNA分子具有poly(A)尾巴的特性,先用12-20个脱氧胸腺嘧

啶核苷组成的oligo(dT)短片段,与上述制备的mRNA分子混合(杂交),并以其作为引物,在反转录酶作用下,以mRNA分子为模板合成cDNA第一链。

该反应产物为DNA/RNA杂交分子,此法有一定局限性,即:对于大分子的mRNA第一链cDNA合成效率低。

因为这种方法进行cDNA合成时,必须从3′-末端开始,而逆转录酶较难有效到达长的mRNA分子的5′-末端。

②随机引物引导cDNA合成法

能克服上述方法不足。

使用根据许多可能序列合成的寡聚核苷酸片段混合物(6-10 bp),作为合成第一链的引物,cDNA的合成可从mRNA模板的许多位点同时进行,对于长的mRNA分子也比较有效。

(3)双链cDNA分子的生成

从mRNA/DNA杂交分子合成双链cDNA分子也有多种方法:

①自我引导法

②RNaseH 酶解取代法,等,

其中①自我引导法是最经典方法,现仍常用。

①自我引导法

实验程序:

①先用碱处理,将mRNA模板水解,使第一链cDNA游离出来,并在其末端自发形成发夹环结构(hairpin loop);②再以此结构为引物,引导cDNA第二链合成,产生含有一个完整发夹环结构的双链cDNA;③之后用S1 核酸酶切割处理,去除单链部分,得到双链的cDNA 分子。

但该方法受S1核酸酶纯度影响,往往会使得到的双链cDNA丢失原有mRNA 的5′-端的许多序列,目前已被下述方法所取代。

②RNaseH 酶解取代法

RNaseH 酶能识别mRNA/DNA中的mRNA组分,并将其降解成许多短碎片,这些片段仍能与第一链cDNA分子杂交,故可作为DNA聚合酶I 活性的引物。因此,可利用原来的cDNA第一链合成第二链cDNA。

当然,此情况下合成的第二链cDNA分子是处于间断不连续的状态(存在有许多切口),但通过DNA连接酶连接后,即可转化为连续完整的双链cDNA分子。

RNaseH 降解取代法合成双链cDNA,基本上不丢失从mRNA分子5′-端开始的全部核苷酸序列。

(4)全长cDNA合成的方法

①oligo(dG)引导合成法

在第一链cDNA分子未与mRNA模板分离前, 先在其3′-端加上一段oligo(dC), 碱性蔗糖梯度离心处理,使mRNA分子发生水解,收回cDNA第一链,再以互补的oligo(dG)作引物,引导第二链cDNA合成,可避免发夹环结构和使用S1核酸酶引起的克隆序列部分缺失。

②载体引导合成法

因第一链cDNA由参入到载体分子的oligo (dT)作引物引导合成而得名。

制备3′-末端具有oligo(dT)质粒引物, 进行反转录合成cDNA第一链, 并在3′-端生成oligo(dG);降解mRNA,富集全长DNA分子,变性;另制备3′-末端具有oligo(dC)质粒DNA,变性后与前者混合退火,经聚合酶作用后转化E.coli 细胞。

③置换合成法

是有效的全长cDNA合成法,分三步:

第一步:制备质粒引物(plasmid primer)和具有oligo(dG)尾巴的接头DNA (adaptor DNA)

第二步:构建质粒cDNA重组体分子

第三步:去除mRNA分子,合成第二链cDNA

(5)cDNA文库生成

用载体(质粒/噬菌体)将双链cDNA重组,将重组体DNA转入寄主细胞,获得重组体细胞群体。

cDNA片段与载体DNA连接方式:

粘末端法

平末端法

末端加尾法

人工合成接头法,等。

菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的克隆

甜菜碱是植物渗调剂之一,在植物处于干旱和盐渍的灾害环境下能保护细胞质免受损害,在植物抗盐抗旱基因工程研究中受到重视。

甜菜碱是由胆碱经两步酶促反应合成,最后起关键作用的一步是由甜菜碱醛脱氢酶所催化。此前,对BADH已有许多研究:1990年Hanson从菠菜中克隆了BADH cDNA;1992年又从甜菜中克隆了BADH cDNA。

二、RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)

RT-PCR是指在mRNA反转录之后进行的PCR,以扩增特定mRNA之DNA片段为目标。

用于mRNA之cDNA 克隆及测定用模板DNA 的制备等。还常用于RNA分子的检测、分析不同组织,或相同组织不同发育阶段mRNA表达状况。

通常情况下,细胞中某种mRNA的数量是其编码基因活性的反映。某mRNA的数量随不同时空状态下编码基因表达活性大小而不同:即存在有高丰度、中丰度及低丰度mRNA RT-PCR对于研究低丰度mRNA具有较好的敏感性,解决了常规方法中用Northern杂交才能分析检测的问题

RT-PCR反应分两步:

第一步:以RNA为模板,在逆转录酶的催化下合成与RNA互补的cDNA

第二步:以cDNA为模板,像一般的PCR一样对靶序列进行扩增

在逆转录反应系统中,除了RNA样品、PCR 缓冲液和4×dNTP外,还包括RNA酶抑制剂(RNasin),单引物和逆转录酶

引物:一般为随机6 聚寡核苷酸(random hexamer oligonucleotides);也可用下游引物(downstream primer) 或寡聚dT(oligo dT)

常用的逆转录酶有两种:

①禽类成髓细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶

②莫洛尼鼠类白血病病毒(MO-MLV)逆转录酶

模板RNA分子:必须是完整的,不能含有DNA、蛋白质和其它杂质。含有微量的DNA,经PCR后可能会出现非特异性扩增产物。有RNA酶污染,会使模板RNA降解

逆转录反应混合物:在42℃下温育30-60 min,结束后,反应管在95℃水浴中加热5-10 min,使RNA/ cDNA双链变性,并灭活逆转录酶MO-MLV 逆转录酶为37℃,AMV逆转录酶最适温度是72℃然后快速冰上冷却,再向反应管中加入适量的PCR缓冲液,上游和下游引物、Taq DNA Pol.,接着,以在逆转录反应中合成的cDNA单链为模板,进行PCR循环该方法可以检出在单个细胞中少于10个拷贝的特异mRNA,广泛应用于从细胞或组织克隆功能蛋

白的编码序列

RT-PCR法克隆真菌漆酶

Potential application of laccase

?Delignification: Biopulping, Kraft lignin bleaching

?Bioremediation: Transformation or degradation of

poly-chlorophenols, alkenes, herbicides, dyes, et al.

?Biosensor

?Drug analysis

?Wine clarification

?Ethanol production

?Biocell

N-terminal amino acid sequence

The sole sequence of protein sample was determined by Edman method.

The sequence of first 15 residues at the amino terminus was

引物合成

Sense primer(30 bp):

5′-AAA GAA TTC GC(A/C) AT(A/T) GG(A/G) CC(C/T) ACC GCT GA-3′

(Eco RI) 1 2 3 4 5 6 7 aa

Antisense primer:

(1)oligo dT(寡聚dT) (18 bp)

(2)相似性比较分析设计(36 bp)

5'- TTT GGATCC CTG GTC GTT GAC ATC GAG CGC GTC -3'

(Bam HI) 1 2 3 4 5

6 7 8 aa

三、cDNA末端快速扩增法(RACE)

在进行文库筛选或使用简并引物进行PCR反应时,常获得不完整的cDNA序列。为得到cDNA的全长,需要克隆出其余部分,可以采用cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA,RACE)。

cDNA末端快速扩增法只需知道mRNA内部一段序列,即可扩增出其cDNA的5′端(5 ′-RACE)或cDNA的3 ′端(3 ′-RACE)。

cDNA的5 ′-末端的快速扩增( 5 ′-RACE )

存在于cDNA基因文库中的部分克隆,由于反转录酶未能沿全长mRNA模板延伸完全,合成的cDNA第一链往往在5′-端不完整。

起始mRNA模板过长,二级结构含量过高,都会造成反转录合成的cDNA 5 ′-端不完整。

5 ′-RACE 法可以快速扩增cDNA 的5′- 端。

5′-RACE小结

5 ′-RACE技术要求对靶mRNA或cDNA的部分克隆的少量序列是已知的。包括三个连续的酶促反应:反转录、同聚物加尾和PCR扩增。

主要特征:就是利用根据已知序列设计的特异性引物(序列特异性引物1 和接头引物2 ),和一条与加至cDNA第一链3′-端的同聚尾互补的通用引物(接头引物1 TTTTTT)扩增得到5′-端序列。

cDNA的3′末端的快速扩增(3′-RACE )

在用oligo (dT)引物构建的cDNA文库中,偶尔发生部分cDNA克隆缺失了与靶mRNA 3′-末端互补的序列(这部分序列如何缺失尚不清楚,可能是第一链cDNA的随机断裂,在合成第二链cDNA的过程中DNA聚合酶不能抵达模板链的末端等),可以采用3′-RACE 反应得到3′- 末端未知的序列。

3 ′-RACE小结

3′-RACE技术要求对靶mRNA或cDNA的部分克隆的少量序列是已知的。包括了二个连续的酶促反应:反转录和PCR扩增

主要特征:用3′-末端的oligo(dT)接头引物(TTTTT接头引物1 ) ,把mRNA反转录成cDNA。反转录后进行PCR反应。应用基因特异性引物特异性接头引物2与oligo(dT)接头引物1引导

如有必要,可用第一步的PCR产物作为模板进行第二次嵌套式PCR。

转录分析

是基因功能分析不可缺少的实验技术

Northern印迹、点印迹,RNase保护、RT-PCR,等

Northern印迹

用于分析目标基因mRNA的大小、转录部位和转录量,等

转录分析

RNase A降解单链RNA,待测的RNA若与标记的RNA探针杂交,形成RNA-RNA杂交体则被保护起来,经电泳可被检查。

广泛应用于转录定量、起始位点、终止位点的结构分析,以及突变位点和多态位点的检测等。

基本操作-------DNA

一、实验方案的确定

1、明确实验目的

基因操作实验的主要目的有三个:①分离目的基因,获取DNA序列信息;②研究基因体内功能;③研究和应用基因表达产物。

2.实验方法的选择和实验流程的设计

在设计实验方法时应考虑以下几点:①能否达到实验目的;②是否符合实验室现状;③

是否符合自己的喜好。

试验流程设计:首先,应确定使用怎样的实验方法;其次,根据试验规模和研究室情况;最后,根据研究人员生活规律确定试验时间。

3.实验遵循的原则:①忠于实验流程②关注实验要点③准备充足的实验材料④设平行对照实验⑤准确的试剂用量⑥数据整理

二、实验过程中的注意事项

⑴第一次实验成功,第二次实验马虎。

⑵实验精度:①必须严格按照实验流程进行的操作;②较严格的实验操作,允许5%的变动;

③允许20%变动的实验操作;④不需要特别注意的实验操作。

⑶酶促反应不顺利时,若加入更多的酶或DNA,结果会越来越糟。

⑷不设平行对照实验往往是实验失败的原因。

⑸样本标记的零乱也往往是实验失败的重要原因。

三、获得实验材料方法及途径:购买、利用公共服务机构、接受馈赠

写求助信要注意:

①你需要什么?②及时、真实的将相关信息告诉对方,不能隐瞒。③通常向论文通讯作者寻求帮助。④写信的稿纸是印有单位标志、名称、电话号码等信息的公函纸。

四、实验室规则与安全

⒈实验室规则:⑴保持肃静⑵保持整洁⑶严格操作⑷注意节约⑸保证安全

⒉实验室常识

⑴使用贵重仪器如分析天平、分光光度剂、离心机等倍加爱护,使用前熟知使用方法,使用时严格遵守操作规程,发生故障时,立即关机。

⑵凡挥发性、有烟雾、有毒和有气味的实验,均应在通风柜内进行。

⑶配制试剂时,应对试剂纯度、结构式、分子质量等特性熟悉,做到“有的放矢”。

⑷量瓶是量器,不要用量瓶做容器。

⑸洗净器皿应倒置架上,使其自然风干。

⒊实验室安全

⑴《实验室生物安全通用要求》(中华人民共和国国家标准GB 19489—2004 )

⑵了解电闸、水阀煤气总阀门所在处,离开实验室检查是否关好。

⑶使用电器设备时严防触电。

⑷使用高温高压锅灭菌时不得离人。

⑸使用可燃物,特别是易燃物,应特别小心。

⑹凡使用腐蚀性试剂,必须谨慎操作,防止溅出。

⑺废液特别是强酸强碱,应稀释后倒入水池。

⑻有毒物品应按照实验室规定办理审批手续后方可领取,使用时严格操作,用后妥善处理。

⒋实验室急救

⑴触电

①关闭电源;②用干木棍将导线与被害者分开;③将被害者移至木板上,与地面分离;

④急救者必须做好触电安全措施,手脚必须绝缘。

⑵火灾隔绝氧气

①起火物与水相容:水、湿布、沙土、灭火器等②起火物与水不相容:不可用水

⑶烫伤乙醇消毒,涂2%苦味酸或5%鞣酸,防感染

⑷玻璃割伤或其他器械损伤清理伤口,硼酸水洗净,涂碘酒,包扎

⑸灼伤皮肤

①强碱:大量清水稀释,涂5%硼酸或2%乙酸②强酸、溴:大量清水稀释,5% NaHCO3或

5%氨水

⑹煤气中毒呼吸新鲜空气

思考题:

1、如何获得你需要的实验材料(特别是未商品化的材料)?答案

2、什么是《实验室生物安全通用要求》(GB 19489-2004)?据此生物学实验室可分几级?答案

3、实验室发生火灾时该如何处理?烫伤、灼伤时该如何处理?答案

4、如何处理对环境有污染的试剂?答案

第二章仪器操作与溶液配制

(1)台式高速离心机、微型离心机

用于固液分离(沉淀细胞碎片、分离DNA、蛋白质等);

离心甩干(使附着于管壁的液体沉入管底)。

(2)冷冻离心机

分离制备基因组DNA或蛋白等发酵产物

恒温水浴锅、恒温金属浴

多用于酶切、连接酶促反应,将Eppendrof管放置水浴或金属浴加热仪器中进行反应。

紫外线可分为短波、中波、长波等类型,短波光线强(200-280nm),对DNA损伤大。实验室一般使用中波(280-315nm),使用时应戴上防护眼镜。因灯管和过滤板有使用寿命,用完后及时关闭。

1、实验用水

水的纯化方法:有蒸馏法、离子交换、反渗透、活性炭吸附、微孔过滤等方法。

蒸馏水:蒸馏法纯化,根据蒸馏次数可分为单蒸、双蒸和多次蒸馏水。蒸馏水可以满足普通分析实验室的用水要求。由于很难排除二氧化碳的溶入。所以水的电阻率是很低的,达不到MΩ级。不能满足许多新技术的需要。

单蒸和多次蒸馏可分别制取国家三级和二级标准水,分别可用于配置普通培养基、一般溶液和生化、组织培养实验。

去离子水:离子交换法纯化,可获得十几MΩ的去离子水,却无法有效的去除大部分的有机物或微生物。而微生物可附着在树脂上,并以树脂作为培养基,使得微生物可快速生长并产生热源。

离子交换法可制得国家二级标准水,可用于实验室中的简单清洗与配制普通溶液和培养基。现在实验室多用结合反渗透膜、离子交换、活性炭吸附等技术的纯水装置(如Milli-Q纯水器)制成的纯净水。

超纯水:反渗透(RO)法是可达到90%~99%杂质去除率中最经济的方法。RO膜的滤孔结构致密,能去除无机盐、有机物(分子量>500)、细菌、热源、病毒、悬浊物(粒径>0.1μm)等。反渗透法结合离子交换、过滤等其他方法,可获得国家一级标准水(18MΩ超纯水),如Milli-Q水。18MΩ超纯水常用于基因操作,0.22μm微孔滤膜过滤后可用作HPLC分析用水。

2、储液

实验室中配置的溶液分为储液(保存用)和工作液。如:TAE缓冲液,储液配成10×浓度,工作液为1 ×浓度。

3、试剂称量精度

一般称量精度为3位有效数字。

如:配置500mL 5 ×TBE,需称取27.0 g Tris,13.8 g 硼酸,1.86 g Na2-EDTA。

4、试剂灭菌

实验室常采用高压蒸汽灭菌法处理一般培养基、生理盐水、枪头及其他耐湿耐高温物品,通常压力在103.4kPa,器内温度可达121.3℃,维持15-30min,可杀灭包括芽孢在内的所有微生物。

不可高温高压灭菌的试剂,有些需采用微孔滤膜过滤除菌:

①遇热不稳定试剂,如抗生素、丙烯酰胺、DTT、β-巯基乙醇、IPTG等;

②易挥发的试剂,如乙酸铵等;

③有机溶剂不需要高压灭菌,如氯仿、无水乙醇、异丙醇等抽提核酸的有机试剂无需灭菌;

④腐蚀性、刺激性强的试剂。

问题:

1、如何正确使用微量移液器?使用中应特别注意哪些事项?答案

2、配制培养基时,通常使用哪种级别的水?为什么?

答案

3、哪些试剂需要高温高压灭菌?哪些试剂不能采用高温高压灭菌?对于不能采用高温高压方式灭菌的试剂如何灭菌?灭菌后试剂如何保存?是否需要分装?答案

第三章大肠杆菌培养与保存

第一节培养前准备

1、大肠杆菌菌株

常用菌株

JM109:该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时进行蓝白筛选。

DH5α:常用于质粒克隆,能进行蓝白筛选,转化率高

BL21(DE3):蛋白酶活性低,用于高效表达用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因,可进行蓝白筛选。

TOP10:适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

接种工具

●接种环:用于液体培养基的接种及平板划线。

●小木棒:用于从平板向液体转接细菌。

●牙签:用于从平板菌落中挑选需要的单菌落。

●涂布棒:用于向平板上涂布液体菌体。

接种操作环境及物品的消毒灭菌

●高温高压灭菌(培养基、试剂、枪头、小木棒、牙签等)

●过滤除菌(0.22μm微孔滤膜)(抗生素)

●干热灭菌(平板等玻璃器皿及金属器皿)

●火焰灭菌(试管瓶口、接种环等)

●紫外线灭菌(器械及超净台、塑料器皿)

●70%乙醇灭菌(操作台、实验人员手、微量取液器、涂布棒、塑料器皿)

培养基种类

1)液体培养基:盛于试管或三角瓶,用于大量繁殖菌株以提取质粒DNA或表达目的蛋白质。

2)固体培养基:用于平板培养、穿刺培养等,目的是使菌落增殖到一定大小,以获取分离出单菌落或保存。

3)抗生素

质粒载体中常含有抗生素抗性基因作为微生物选择标记。抗生素可提供选择压力,同时

还可防止杂菌生长。无菌水或乙醇溶解抗生素,过滤除菌后,在接种前加入到液体培养基中,或固体培养基灭菌冷却至60℃后加入。抗生素易失活,加入抗生素的培养基应在数周内使用。

大肠杆菌培养

◆无菌操作前用70%乙醇消毒台面,并用紫外灯照射10min以上。

◆离酒精灯较近距离进行无菌操作。

◆开盖前和开盖后用酒精灯灼烧瓶口2至3次。

◆瓶口倾斜,不得垂直向上。

◆使用平皿时尽量去除凝结在盖子上的水珠,并不

得混淆盖子。

生长监测

①分光光度计测定600nm波长下的菌液吸光值,对照是未接菌的培养基。

②A600 =0.2~1.0时为对数生长期,A600>1.0为平台期。A600=1.0为108 个/mL。

③37℃下,对数期生长的大肠杆菌约每20-30min增值一倍。

平板划线培养

平板涂布培养

大肠杆菌菌株保存

简易传代保藏)

1、普通琼脂斜面保存

2、半固体穿刺保存

八年级生物下册第7单元第2章现代生物技术单元综合测试新版济南版

第7单元第2章现代生物技术 一、选择题 1. 下列应用实例与必须采用的生物技术,搭配错误的是应用实例生物技术 A. 培养无病毒植株组织培养 B. 制作酸奶发酵技术 C. 培育能产生人生长激素的大肠杆菌基因工程 D. “试管婴儿”的诞生克隆技术 2. 在克隆哺乳动物的过程中,常用到() A.发酵技术B.胚胎移植技术 C.人工授精技术D.转基因技术 3. 科学家成功地把人的抗病毒干扰素基因连接到烟草细胞的DNA分子上,使烟草获得了抗病毒能力。这项技术称为() A.克隆技术 B.嫁接技术 C.组织培养 D.转基因技术 4. 以下有关基因工程的叙述,正确的是() A.基因工程是细胞水平上的生物工程 B.基因工程的产物对人类都是有益的 C.基因工程产生的变异属于人工诱导变异 D.基因工程育种的优点之一是目的性强 5. 实施基因工程的最终目的是() A.定向提取生物的DNA B.在生物体外对DNA进行改造 C.定向分离DNA D.定向地改造生物的遗传性状 6. 可以生产转基因食品的生物是一类() A.提供外源基因的生物 B.转基因动植物 C.获得外源基因的生物 D.转基因微生物 应用实例生物技术 A. 培养无病毒植株组织培养 B. 制作酸奶发酵技术 C. 培育能产生人生长激素的大肠杆菌基因工程 D. “试管婴儿”的诞生克隆技术 8. 下列生物均是在现代生物技术作用下形成的,其中利用的技术与其他不同的是()A.巨型小鼠B.抗虫棉花 C.多利羊D.抗虫烟草 9. 可以创造出地球上原先不存在的生物的技术是 A.无性繁殖 B. 克隆 C .基因工程 D 组织培养. 10. “试管婴儿”技术在生物学上依据的原理是( ) 。A.有性生殖B.无性生殖C.克隆技术 D.基因工程 11. 人奶营养成分的优越性是牛奶永远无法比拟的。最近中国工程院院士李宁教授率领的科研团队将人乳基因导入奶牛中,使之产生人乳化的牛奶。这种生物技术称为A.发酵技术 B.克隆技术 C.转基因技术 D.仿生技术 12. 生物的生殖方式分为有性生殖和无性生殖,下列个体的产生是通过有性生殖形成的是() A.克隆绵羊B.组织培养的小麦幼苗 C.嫁接的柑橘D.试管婴儿 13. 据英国《每日邮报》 2010年12月26日报道,一位英国妇女在1998年通过试管婴儿技术受孕后,于次年产下两女,并将其余受精卵冷冻保存;11年后,她和丈夫成功利用当初保存的受精卵再获一个千金。“试管婴儿”技术在生物学上依据的原理是()。

现代生物学实验技术实验报告

现代生物学实验技术实验报告 实验一、超薄切片 一、实验目的 学习掌握常规生物样品前处理技术及样品包埋块的制备技术。 二、实验材料 植物幼嫩叶片、小鼠肝脏细胞 三、实验试剂 2.5%戊二醛、PBS、1%锇酸、30%丙酮、100%丙酮、 Epon812包埋液、蜡油 四、实验器材 离心管、玻璃棒、滴管、移液枪、刀片、镊子、牙签、烘箱、切片机、 五、实验步骤 1、取材固定:从植株上取叶片或者取小鼠肝脏细胞,切取 1mm3左右大小的组织块,立即放入PBS(pH7.2)配制 的2.5%戊二醛中固定1小时。 2、用0.1molPBS缓冲液冲洗三次每次3~5分钟。 3、1%锇酸固定1小时,然后用缓冲液冲洗三次每次3~5 分钟。 4、丙酮脱水:30%-50%-70%-80%-90%-100%- 100%每级5~10分钟

5、浸透:脱水剂:包埋剂=3:1 1小时 脱水剂:包埋剂=1:3 过夜 6、聚合:45 ℃12h 60 ℃24h 磷酸缓冲液0.2molL-1 PBS 配制 A液:Na2HPO4 .2H2O 35.61g 加DDW 至1000ml B液:NaH2PO4 .H2O 27.6g 加DDW 至1000ml 不同pH磷酸缓冲液的配制 pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 A液(ml) 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5 B液(ml) 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.5 Epon812包埋液的配制 Epon812树脂20ml DDSA 4.6ml MNA 15.3ml DMP-30 0.8ml

2、支持膜的制备 将一个干净的载玻片垂直放入含有0.3~0.5%氯仿配制的聚乙烯醇缩甲醛制模剂中,放置两三秒后将载玻片垂直取出。用刀片在含有膜的载玻片上划出所需要的正方形,然后将载玻片45度倾斜放入水溶液中,使膜飘在水面上,选取厚薄合适的膜,将膜放在载网上,以备后面用。 3、切片 首先制刀,将玻璃片制成梯形的刀片,以备切片时使用。将包埋块置于显微镜下进行修整,将其修为最上端为正方体。在切片机上进行切片操作,使切下来的样品片漂浮在水槽中。对切下来的样品块进行染色并观察。 六、注意事项 1、取材的时候动作要迅速,组织离体后应将其快速放入 固定液中。并且要尽量减少损伤,减少牵拉或挤压组 织。组织块的大小一般为1mm3。 2、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面,应通过抽真 空的方法让样品沉入溶液中。 3、饿酸为剧毒、极易挥发的试剂,使用时要注意安全。 4、脱水时要逐级脱水,而不能急剧脱水,更换液体时动 作要快,不要让组织离开溶液,否则会在组织内外产 生气泡。

华中农业大学《生物化学实验》试卷

华中农业大学本科生课程考试试卷 考试课程与试卷类型:植物生理学实验原理与技术(A)姓名: 学年学期:2008-2009-1 学号: 考试时间:2009--班级: 一、名词解释 ( 每题 4 分 , 共 12分 ) 1. 聚丙烯酰胺凝胶 2. 离心技术 3.可见光分光光度法/反相纸层析 二、填空题 ( 每空 2 分 , 共 42分 ) 1. 反相纸层析法分离油菜不饱和脂肪酸的实验中 ,分离后的不饱和脂肪酸经红氨酸溶液显色后 , 其最终产物颜色是(1),从点样端起层析谱带所对应的脂肪酸依次是 (2) 、(3)、(4)、(5)、(6)。 2. 圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶的实验中 , 电泳时上槽接电源(7)极 ,下槽接电源 (8) 极 , 电泳开始电流应调节至每管(9)mA, 十分钟后电流调节至每管 (10) mA; 在上槽或样品中加入溴酚蓝是起(11)的作用。 3. 核酸提取过程中 , 将含有 DNA 的溶液置72℃处理 3 分钟,其目的是(12);在淀粉酶活性测定过程中将淀粉酶液置于 70℃下处理 15 分钟的目的是(13)。 4.在微量凯氏定氮法测定植物组织中的总氮和蛋白氮,有三个主要的实验阶段,它们分别是(14)、(15)和(16)。在第二阶段,若收集三角瓶中的溶液颜色由_(17)变为(18),表明反应完全。第三阶段所用的标准浓度的滴定溶液名称是(19)。 5. DNA 提取研磨时加入的研磨缓冲液的NaCl浓度是(20),研磨时加入SDS的作用是(21)

三、是非判断题 (判断对错,对的标T,错的标F,每题 2 分,共 10 分 ) 1.萌发的小麦种子中含有很高活性的淀粉酶,其中α-淀粉酶不耐热,在70℃迅速钝化。() 2.本学期测定还原性糖和可溶性蛋白含量时都用到了斐林试剂,这两个实验中所用的斐林试剂的配方是相同的。() 3.DNA提取中,加入冷乙醇是为了使DNA分子复性变粗。() 4.离心机使用中,要求同一台离心机所用的离心管都有相同的重量。()5.油菜种子硫甙葡萄糖苷的快速分析法中,反应的实质是测定水解硫苷产生的葡萄糖的数量。() 四、问答题(共36分) 1.试述维生素C测定的基本原理及其实验过程中的注意事项(12分) 2.简述凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。为什么一些不法商人要在蛋白质制品中加入三聚氰胺?(12分) 3.凝胶电泳法测定同工酶的原理是什么?为什么本学期所作的胶条染色后显示的谱带就是过氧化物同工酶带?(12分)

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数:又称分配系数,是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析:确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志,分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶:指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交:在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭,用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR:是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达:外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除:是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因,从分子水平上设计实验,将该基因从动物的原基因组中去除,或用其它无功能的DNA片断取代,然后从整体观察实验动物表型,推测相应基因的功能。 8.物理图谱:人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”,以碱基对(bp,kb,Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图:不同质荷比的离子经质量分析器分开后,到检测器被检测并记录下来,经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光:激光束照射细胞时,光以90度角散射的讯号,用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析:是以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解:从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移:用电泳技术将凝胶中的蛋白质,DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物,形成印迹。 15.多重PCR:是在一次反应中加入多对引物,同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签(Tag),表达产物为融合蛋白(有分N端或者C端融合表达),方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组:发生在DNA同源序列之间,有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map),它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”,以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子:广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光:激光束照射细胞时,光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

生物化学实验理论考试题答案

生物化学实验理论考试题答案 1.醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端,为什么? 答;电泳时点样端应靠近负极,因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电,根据同性相吸,异性相斥原理,点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时,设置空白对照管的作用,为什么? 答;空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度,但是作为溶剂也能吸收,反射和透射一部分的光,因此必须以相同的溶剂设置对照,排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜的电泳原理? 答;血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动,而各种蛋白质等电点不同,且在PH为8.6时所带电荷不同,分子大小不等,形状各有差异,所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.何谓Rf值?影响Rf值的因素? 答;Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度有关,对同一种物质来讲Rf是一个常量。 5.什么是盐析?盐析会引起蛋白质的变性吗?一般用什么试剂? 答;盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时,蛋白质的溶解度下降,当中性盐的浓度达到一定程度的时候,蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性,因为蛋白质的结构并未发生改变,去掉引起盐析的因素蛋白质仍能溶解;一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析 6.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理? 答;还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸,而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比,用分光光度计测出溶液的吸光度,通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度,从而得出还原糖的浓度。 7.影响蛋白质沉淀的因素是什么?沉淀和变性有什么联系? 答;水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶

医学微生物学考试试卷(附答案)

医学微生物学考试试卷( A ) (临床医学本科、影像医学本科、中医药学本科、实验技术本科、预防医学本科)班级学号姓名 注意事项: 1.在试卷上写上姓名、班级。在答题卡上填上学号,将相应的数字涂黑,并写上班级、姓名和试卷类型( A 卷 /B 卷)。交卷时必须将答题卡与试卷一起上交,否则以零分计算! 2.本份试卷由基础知识题和病例分析题组成,共150 个选择题,请按题目要求,在备选答案中选择一个最佳答案,并在答题卡上将相应的字母涂黑,做在试卷上无效。 3.考试时请严格遵守考场纪律,原则上不允许上厕所。 第一部分、A型选择题 (由一题干和5个备选答案组成,请选出一个最佳答案。共90 个选择题) 1. 哪种疾病的病原体属于非细胞型微生物: A. 疯牛病C. 结核病E.体癣 B.梅毒D.沙眼 2. 细菌属于原核细胞型微生物的主要依据是: A. 单细胞 C.对抗生素敏感B.二分裂方式繁殖 D.有由肽聚糖组成的细胞壁 E.仅有原始核结构,无核膜 3. 革兰阳性菌细胞壁: A. 肽聚糖含量少C.对溶菌酶敏感 B.缺乏五肽交联桥 D.所含脂多糖与致病性有关 E.有蛋白糖脂外膜 4. 青霉素杀菌机制是: A. 干扰细胞壁的合成C. 影响核酸复制E.损伤细胞膜 B.与核糖体 D.与核糖体 50S 亚基结合,干扰蛋白质合成 30S 亚基结合,干扰蛋白质合成 5.有关“细菌鞭毛”的叙述,哪一项是错误的: A.与细菌的运动能力有关 B.许多革兰阳性菌和阴性菌均有鞭毛 C.在普通光学显微镜下不能直接观察到 D.可用于细菌的鉴定 E.将细菌接种在固体培养中有助于鉴别细菌有无鞭毛(半固体 ) 6.有关“芽胞”的叙述,错误的是 : A. 革兰阳性菌和阴性菌均可产生(都是阳性) B. 不直接引起疾病 C. 对热有强大的抵抗力 D.代谢不活跃 7.E.通常在细菌处于不利环境下形成 :用普通光学显微镜油镜观察细菌形态时,总放大倍数为 A.10 倍 B.100 倍 C.400 倍 D.900~ 1000 倍 E.10000 倍 8.脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌经结晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脱色后,菌体分别呈 : A. 红色和紫色 B.紫色和紫色 C. 紫色和无色 D.无色和无色 E.无色和紫色

生物化学实验题目

实验一胆固醇的提取2012-11-15 16:20:00 生物师范班题目 1.比色法测定样品的理论基础是什么? 被测样品必须要有颜色。 2. 胆固醇含量在多少范围时,与值呈良好的线性关系? 在400mg/ml范围内。 3.在提取胆固醇的过程中,为什么要加无水乙醇? 促使蛋白质沉淀。 4.在试管中加入1ml磷硫铁试剂,会产生什么现象?(至少写2点) 产生紫红色化合物。产生热量。 5.在无水乙醇中加磷硫铁试剂时,正确的加法是什么?将产生什么现象?请准确描述 该现象。 沿管壁慢慢加入。溶液分层。上层是无水乙醇,下层是磷硫铁试剂。 1. 胆固醇提取过程中,无水乙醇为什么要分两次加入? 目的是使蛋白质以分散很细的沉淀颗粒析出。 2.我们用比色法测定胆固醇含量的仪器名称是什么? 分光光度计 3. P-S-Fe试剂配置时,能用稀硫酸吗?为什么? 不能。因为FeCl3本身是亲水性物质,稀硫酸中含有水,会降低P-S-Fe试剂的浓度,从而导致反应不能发生。 4.请简述移液枪的使用步骤。 根据所要吸取的溶液的体积选定合适量程的移液枪。 调好量程。 插枪头。 吸取液体。 将移液枪的量程调至最大。 5. 请简述0.08mg/ml胆固醇标准溶液的配置方法。 准确称取胆固醇80mg,溶于无水乙醇,定容至100ml 将贮液用无水乙醇准确稀释10倍既得。

实验二总糖和还原糖测定2012-11-15 16:20:00 生物师范班 1. 请写出还愿糖与非还原糖结构的不同之处 拥有自由的醛基和酮基 2. 对没有还原性的糖,用什么方法进行糖含量的测定? 酸水解的方法将非还原性的糖降解呈还原糖。 3. DNS之所以能和还原糖反应,是因为其结构中含有__________? 硝基 4. 如果将DNS和其与还原糖反应的产物同时进行比色,谁的A值更大?为什么? 产物的更大,因为产物生成棕红色,颜色越深,吸光度越高。 5. 还原糖提取过程中,为什么要离心两次? 因为这样可以更好地将还原糖全部提取出来。第二次洗涤沉淀。 海洋技术班 1.单糖都是还原糖吗?为什么? 是的,因为有自由醛基和酮基 2.为什么能用比色法测定还原糖的量? 因为还原糖的量与光吸收值呈线性关系。 3.DNS的全称是? 3,5-二硝基水杨酸 4.总糖提取过程中,碘液的作用是什么? 确认淀粉水解完全。 5.请简述标准曲线的作用。 通过标准曲线来算出未知样品的浓度。

生物化学实验习题及参考答案完整版

生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI; 2、层析; 3、透析; 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳; 5、蛋白质变性; 6、复性; 7、Tm 值; 8、同工酶; 9、Km值; 10、DNA变性;11、退火;12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量,哪一种方法需要完整的肽键( ) A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的() A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口(Sakaguchi)反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是() A、苯异硫氰酸 B、2,4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收() A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中,哪一种在280nm具有最大的光吸收() A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质() A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后,可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净,你选用下列哪一种试剂检查() A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于() A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有() A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为()

生物化学实验重点试题

一、解词 1、总氮量水中各种形态无机和有机氮的总量 2、酶的抑制作用是指在某个酶促反应系统中,某种低相对分子质量的物质加入后,导致酶活力降低的过程。 3、酶的最适温度酶催化活性最高时的温度 4、蛋白质的等电点每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点 5、盐析增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象 6、蛋白质变性蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变,从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失6、酶的专一性酶对底物及其催化反应的严格选择性通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应 7、激活剂能提高酶活性的物质大部分是离子或简单的有机化合物 8、抑制剂凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 9、酶催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体 二、填空 1、球蛋白可在半饱和中性硫酸铵溶液中析出,清蛋白可在高盐浓度溶液中析出。 2、在PH3.0、和9.5时的电场中,卵清蛋白(PI4.6)移动方向分别为负移 动,正移动。 3、唾液淀粉酶的最适温度是37 4、还原糖与本乃狄试剂共热现象生成生成砖红色沉淀。 5、维生素C也称抗坏血酸,它具有很强还原性 6、用苔黑酚浓盐酸溶液可以鉴定核糖核酸 7、当溶液的PH低于蛋白质等电点时,蛋白质分子带正电荷;当溶液的 PH大于蛋白质等电点时,蛋白质分子带负电荷; 10.凯氏定氮法测定蛋白质含量消化终点颜色为清澈的蓝紫色色。 11.蛋白质变性的实质是空间结构被破坏。 12.常用的RNA提取方法有苯酚法、、高盐法等。 13、维持蛋白质亲水胶体稳定的因素是蛋白质颗粒表面的电荷层 和水化膜、 14、蛋白质在等电点时,主要以两性离子离子形式存在;当溶液的P H>PI 时,蛋白质分子以负离子形式存在;当溶液的P H<PI时,蛋白质分子带正离子形式存在。 15、蛋白质分子中氮的平均含量为 5.16% ,样品中的蛋白质含量常以测 氮量乘以 6.25 、即 6 。 三、选择 1、盐析法沉淀蛋白质的原理( ) A 与蛋白质结合成不溶性蛋白盐 B 次级键断裂蛋白质的构象改变 C 中和电荷,破坏水化膜 D 调节蛋白质溶液的等电点 2、以下哪项不是酶的特性() A 酶是生物催化剂,催化效率极高 B 易受Ph,温度等外界因素的影响 C 能加速化学反应但不改变反应平衡点 D 有高度特异性 3、RNA和DNA的最大紫外吸收值是在() A 280nm B 260nm C 510nm D 620nm 4、.凯氏定氮法使用的混合催化剂硫酸钾-硫酸铜配比为() A 1:3 B 5:1 C 3:1 D 1:1

医学微生物学实验指导

医学微生物学实验指导 西安交通大学医学院 微生物学教研室

第一次实验课内容 实验内容1. 实验目的与要求 实验内容2. 实验室规则 实验内容3. 细菌形态学观察技术 实验内容4. 染色标本的制备—革蓝染色 实验目的与要求 医学微生物学实验课是该专业课程的重要组成部分,指导学生上好实验课是教学过程中的重要环节,学习实验课的目的是: 1. 使学生加深理解并巩固理论知识,学习和掌握有关的实验操作技术,为以后的医学专业课学习打好基础: 2. 在实验中,培养学生观察、思考和分析问题的能力,主动参与实验的动手能力及独立工作的能力。训练学生严格的科学作风、严肃白的科学态度和严密的工作方法。 3. 培养学生在集体工作环境中互帮互让,团结协作,共同完成好实验的精神品德。 为了达到上述目的,提高实验课的教学效果,特提出以下要求: 1. 实验课前做好预习,明确本次实验课的内容及其原理、方法及注意事项; 2. 实验中要仔细认真,注意分工与协作,操作实验要按操作步骤进行。学会正确操作手法、准确记录实验结果。示教实验要注意观察,并记录好相关内容; 3. 详细讨论实验结果,提倡同学之间互帮互学,并紧密联系理论课内容。要注意不论实验结果与理论符合与否,都有讨论的价值,并分析其原因,有可能的话还应重复实验; 4. 严格遵守实验室规则,在微生物学实验课上,要树立“有菌观点”,严格掌握和不断完善无菌操作技术。

实验室规则 一、进入实验室须穿工作服、戴工作帽。除必要的书籍文具外,其它个人物品一律不得带入实验室。 二、在实验室内,禁止饮食、吸烟及与学习无关的其它活动,不得大声喧哗或嘻戏。 三、未经老师许可,不得擅自搬动实验器材及示教物品,不准随意摆弄和旋转实验仪器上的开关及旋扭等。 四、按照实验要求,在老师的指导下,主动安排要进行的实验,认真进行实验操作,严格遵守无菌操作规程,争取顺利地完成实验。 五、实验中使用完毕的器材和试剂,必须放回规定的位置。废弃物必须按规定进行处理或归放于指定的容器内,不能随便乱丢乱放。 六、实验中万一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情况,应及时报告老师进行处理,切勿自作主张不按规定处理。 七、爱护实验室内一切设备、挂图、仪器。注意节约使用消耗材料及药品试剂,注意用电安全及节约水电。 八、实验结束,要清理桌面,将实验器材放回原处。值日同学要搞好实验室的清洁卫生,保持室内整齐,离开实验室前要关好门窗、水、电,并将手洗干净。 九、未经许可,不得将实验室内任何物品带出实验室。

现代生物技术与人类生活

现代生物技术与人类生活 摘要:现代生物技术是在传统生物技术基础上发展起来的,以DNA重组技术的建立为标志,以现代生物学研究成果为基础,以基因或基因组为核心,生物技术产业以基因产业为核心,并辐射到各个生物科技领域。通过了解现代生物技术的基本概念和主要领域,以及对这些领域中产业的发展现状的分析,人们研究出针对这些问题的一些对策,得出现代生物技术对人类生存和生活带来的影响和结论,并对生物技术未来的发展做一定的展望和预期。 关键词:基因,领域,应用,展望 引言: 现代生物技术是当今世界发展最快、潜力最大、影响最深远的一项高新技术。被视为是 21世纪人类彻底解决人口、资源、环境三大危机,实现可持续发展的有效途径之一。所以世界各国都将生物技术确定为增强国力和经济实力的关键技术之一。我国也十分重视生物技术,并组织力量追踪和攻关。现代生物技术为什么会引起世界各国如此普遍的关注和重视呢?首先,生物技术是解决全球经济问题的关键技术,在迎接人口、资源、能源、食物和环境五大危机的挑战中将大显身手。其次,生物技术将广泛地应用于医药卫生、农林畜牧、轻工、食品、化工、能源和环境等领域,促使传统产业的改造和新兴产业的形成,对人类社会将产生深远的影响。所以生物技术是现实生产力,也是具有巨大经济效益的潜在生产力;是 21 世纪高新技术的核心。 1 现代生物技术在食品工业中的应用 1.1改良微生物的苗种性能 生物技术已用于啤酒酵母的改造,如将α-乙酰乳酸脱羧酚基因克隆到啤酒酵母中进行表达,可降低啤酒双乙酰含量而改善啤酒风味,日本生物技术专家还将霉菌的淀粉酶基因转入酵母中使其能直接利用淀粉生产酒精,省掉了高温蒸煮工序,可节约60%的能源,生产周期大为缩短。 1.2应用于食品酶制剂的生产

《环境生物学及现代生物技术实验》教案

实验六、植物种群自疏的内因和外因效应 一、目的 通过阅读文献材料,学习验证型实验设计、结果表达和分析的方法。掌握通过测定不同栽培密度和不同盐度的因子作用下,影响植物种群生长自疏效应的内因和外因的表达方式和强度。 二、原理 生态系统的结构与功能受到来自系统内部和外部的调节与控制,如森林植被过密时会产生自疏作用,间伐后的疏林会很快重新郁闭;生态系统中各营养级间生物的数量关系常常相对稳定等。这类受控的稳态是生态系统借助生物与环境的相互作用,达到稳态的作用结果。 种群在一定的生境条件下,种群数量会增长,但是并不是无限制的增长,会受到种群最大容量的制约,种群内部个体间的竞争会产生自疏作用使种群维持在一定的水平。自疏作用为种内斗争和资源供给状况的综合反映,森林植物、藤壶等是自疏效应的明显例子。 本实验将开展经济作物红麻(Kenaf,Hibiscus cannabinus)的模拟栽培试验。通过设定不同栽培密度,对其进行短时间的栽培试验记录,评价种群密度(内因)对种群自疏效应的影响。 三、材料与仪器: 实验材料:实验室将提供统一购置的红麻种子。种植所需土壤在校区内采集。 仪器:塑料盆4个/组、电子天平、烘箱、标签纸、记号笔等。 试剂: 海盐。 四、实验内容 4.1 试验设计 每个组自行设定不同的幼苗种植株行距处理3组,进行栽培和浇灌。

4.2 观察记录 八周内,每周固定时间对每盆内的作物幼苗进行观察,记录每棵植株的叶片数,以及每个处理的存活株数,每次每个处理需拍照记录1张。 4.3 生物量的测定 第八周将所有植株个体收获,小心地洗净,去除叶片、根上的砂粒泥土,放入烘箱烘干24h后,分成地上部和根部,进行称重。 4.4 分析数据,撰写报告 记录描述不同时间、不同处理的作物幼苗个体叶片数、存活率,以及八周内的生物量积累情况。

临床生物化学实验原理方法及检测介绍

临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术 中国中医研究院广安门医院临床检测中心 生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。 一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。 一、实验反应原理及分析方法(理论依据) 二、实验检测技术(手段)生化仪的分析技术。 三、质量控制程序(质量保证)室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。 四、临床意义(目的)咨询服务、异常结果的解释。 实验反应原理及分析方法(理论依据) 一个生物化学实验的反应原理设计,首先要找出所检测的化学特性,如测定体液(首先是血液)中酶的含量血液中除少数酶(如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等)含量较多外,血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克(Pg)水平,要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量(不论其有无活性)而用化学方法测定只能测定酶的催化活性,间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性,在临床上已普遍应用测定酶蛋白,同时还可以测定三大代谢的产物,如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比,因此只有当酶反应为一级反应时,才能准确测定底物含量,(如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等)。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。 临床化学方法的分类 特别是自动生化仪方法的特点 以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定,这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点,特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。 在一般比色法中,手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度,但由于很难控制测定时间和反应温度,很难准确记录反应过程中吸光度变化,因此,毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法,都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时,吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。 但自从自动生化仪出现后,从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术,人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率,这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间,大大提高了工作效率,还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速 度(V o )等等。测酶初速度(V o )只能用分光光度法。 因此,用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。 生化自动分析仪特点: 1 精确测定反应的动态过程; 2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率; 3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。 分析方法的分类

医学微生物学考试试卷(A)(附答案)

医学微生物学考试试卷(A)(附答案) (临床医学本科、影像医学本科、中医药学本科、实验技术本科、预防医学本科)班级学号姓名 注意事项: 1.在试卷上写上姓名、班级。在答题卡上填上学号,将相应的数字涂黑,并写上班级、姓名和试卷类型(A卷/B卷)。交卷时必须将答题卡与试卷一起上交,否则以零分计算! 2.本份试卷由基础知识题和病例分析题组成,共150个选择题,请按题目要求,在备选答案中选择一个最佳答案,并在答题卡上将相应的字母涂黑,做在试卷上无效。 3.考试时请严格遵守考场纪律,原则上不允许上厕所。 第一部分、A型选择题 (由一题干和5个备选答案组成,请选出一个最佳答案。共90个选择题) 1.哪种疾病的病原体属于非细胞型微生物: A.疯牛病 B.梅毒 C.结核病 D.沙眼 E.体癣 2.细菌属于原核细胞型微生物的主要依据是: A.单细胞 B.二分裂方式繁殖

C.对抗生素敏感 D.有由肽聚糖组成的细胞壁 E.仅有原始核结构,无核膜 3.革兰阳性菌细胞壁: A.肽聚糖含量少 B.缺乏五肽交联桥 C.对溶菌酶敏感 D.所含脂多糖与致病性有关 E.有蛋白糖脂外膜 4.青霉素杀菌机制是: A.干扰细胞壁的合成 B.与核糖体50S 亚基结合,干扰蛋白质合成 C.影响核酸复制 D.与核糖体30S亚基结合,干扰蛋白质合成 E.损伤细胞膜 5.有关“细菌鞭毛”的叙述,哪一项是错误的: A.与细菌的运动能力有关 B.许多革兰阳性菌和阴性菌均有鞭毛 C.在普通光学显微镜下不能直接观察到 D.可用于细菌的鉴定

E.将细菌接种在固体培养中有助于鉴别细菌有无鞭毛 6.有关“芽胞”的叙述,错误的是: A.革兰阳性菌和阴性菌均可产生 B.不直接引起疾病 C.对热有强大的抵抗力 D.代谢不活跃 E.通常在细菌处于不利环境下形成 7.用普通光学显微镜油镜观察细菌形态时,总放大倍数为: 倍倍 倍~1000倍 倍 8.脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌经结晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脱色后,菌体分别呈: A.红色和紫色 B.紫色和紫色 C.紫色和无色 D.无色和无色 E.无色和紫色 9.革兰染色法是最常用的一种染色法,其实际意义不包括: A.鉴别细菌 B.初选抗菌药物 C.了解细菌致病性 D.了解细菌的染色性

现代生物技术考题

江苏省南通市2009届高三生物最后冲刺之三 专题三现代生物科技专题 一、选择题 1.以下说法正确的是() ①发酵工程获得优良菌种的方法有:诱变育种、杂交育种、细胞工程等 ②吞噬细胞和效应B细胞都能识别抗原 ③紫茉莉遗传物质的载体是染色体、线粒体、叶绿体 ④发生过敏反应时,往往会使细胞损伤、破坏和引起支气管痉挛等 A.①②③④B.③④C.②④D.③ 2.如图,在一定时间内使某种动物细胞吸收放射性同 位素标记的氨基酸依次先后出现在图中1、2、3、4、 5部位。在这一过程中分泌蛋白通过的生物膜磷脂分 子层数是() A.4层 B.3层 C.2层 D.0层 3.下面对生物工程的应用成果说法正确的是() ①用白血病患者细胞中分离出的癌基因制备DNA探针可检测肝炎 ②鸡蛋白基因可在大肠杆菌或酵母菌中表达出卵清蛋白 ③在单抗上连接抗癌药物可制成定向消灭癌细胞的“生物导弹” ④利用发酵工程可获得大量微生物的代谢产物即单细胞蛋白 A.①②B.③④C.②③D.①④ 4.运用下列各种细胞工程技术培育生物新品种,操作过程中能形成愈伤组织的是() ①植物组织培养②植物体细胞杂交⑧动物细胞培养④转基因植物的培育 A.①②⑧ B.①②④ C.①⑧④ D.①②⑧④ 5.原核生物中某一基因的编码区起始端插入了一个碱基对。在插入位点的附近,再发生下列哪种情况有可能对其编码的蛋白质结构影响最小() A.置换单个碱基对 B.增加4个碱基对 C.缺失3个碱基对 D.缺失4个碱基对 6.某同学在学习“细胞工程”时,列表比较了动植物细胞工程的有关内容,你认为错误的 7.有三个盛放葡萄糖液的密封瓶,已知一瓶混有酵母菌,一瓶混有乳酸菌,一瓶只有葡萄糖,

生物化学实验内容

《生物化学》实验教学大纲 课程类别:专业基础 适用专业:本科临床学专业 课程总学时:实验学时:32 实验指导书:生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称:生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科,也是一门重要的实验性较强的基础医学课程.随着医学的发展,该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分,它与理论教学既有联系,又是相对独立的组成部分,有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求,开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化,使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念,培养学生的基本技能和科学思维的形成,提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识,加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察,逐步培养学生学会观察,比较,分析和综合各种现象的科学方法,培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结,培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练,使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书: 1.揭克敏主编:生物化学与分子生物学实验教程(第2版)。科学出版社,2010 参考资料: 1..袁道强主编:生物化学实验(第1版)。化学工业出版社,2011 五、实验项目数据表

2)要求:0:必修1选修 3)类型:0:演示1:验证2:综合3:设计 4)每组人数:指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识; 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 (一)蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后,可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同,用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性,加水稀释降低盐浓度,能使沉淀的蛋白质重新溶解,并保持其生物活性。因此,利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5%鸡蛋清溶液20滴,饱和硫酸铵溶液20滴,充分摇匀后静置5min,记录结果。

医学微生物学实验考试word精品

1 测量细菌大小用以表示的单位是_________ 。_ 2. 在消毒灭菌时应以杀死 ________ 作_ 为判断灭菌效果的指标。 3. 细菌的形态鉴别染色法最常用的是 _________ ,_ 其次是______ 。 4. 根据细菌的外形,可分为 _________ 、_ ______ 、_________ 。_ 5. 细菌群体生长繁殖分为 、 6. _________________________________ 人工培养基按功能或用途分为、_ _______ 、_ _____________ 、、_ _________________________________ 5类培 养基。 7. 根据细菌代谢时对氧气的需求与否分为 _____ 、_________ 、_ _______ 、 ________。_ 8. 细菌生长繁殖的条件是 ________ 、 _______ 、_ ______ 、 _________ 。_ 9. ______________________________ 人工培养基按物理性状分为、_ 、_ 3类培养基。 10. 高压蒸汽灭菌的温度是 _______ ,压力是_________ ,时间持续 ________ 。 11. 半固体培养基主要用于 _______ ,斜面培养基________,_ 平板培养基主要用于________ 。_ 12. __________________________ 光学显微镜观察细菌应用 _ 镜观察,它的放大倍率是倍。 13. ____________________________________________ 抗酸染色把细菌分成两类,阳性菌呈___色,阴性菌呈_____________________________________________________色。 14. 细菌的色素分为 ________ 和_ __________ 2种 15.SS培养基多用于____________ 的分离培养。 16. 热力灭菌分为__________ 和_ ___________ 灭_ 菌。 17. 湿热灭菌分为___________ 、_______ 、 ________ 、 _______ 、 ______ 。 18. 紫外线杀菌的机理主要是破坏细菌__________ 。_ 19. 对于毒素、血清、抗生素不耐高温灭菌的制物制品应采用的灭菌方法是____________ 。_ 20. 化学消毒剂杀菌的机理是 ____________ 、 ________ 、_ ____________ 。_ 21. 致病菌的检验程序主要有 _________ 、_ ______ 、_________ 、_ _______ 等_ 。 22. 根据葡萄球菌在血琼脂平板培养基中产生的色素不同,将葡萄球菌分为 ________ 、________ 、_______ 三种。其中致病力最强的葡萄球菌为_________ ,产生的色素为 ___________ 。 23. 根据链球菌在血琼脂平板培养基中生长后菌落周围溶血现象的不同,可将链球菌分为 _______ 、_ _______ 、_ __________ 三大类。 24. 鉴别肺炎链球菌与甲型溶血性链球菌实验是 ________ 、 _______ 。_ 25. 人工培养脑膜炎双球菌、淋球菌常用的培养基是 ________ 或 ______ 。 26. 伤寒杆菌分离培养,在病程早期第一周应取 _______ 标本;发病第2、3 周应取_________ 标本,其阳性率高。 27. 大多数志贺菌不分解乳糖,只有 ________ 志贺菌能 _______ 分解乳糖。 28. 霍乱弧菌耐 ________不耐酸,常用的人工培养基是 _____ 或_ _________ 。 29. 白喉棒状杆菌在亚碲酸钾血平板生长时,其菌落呈 ______ 。 30. 培养白喉棒状杆菌常选用的培养基是 ______ 。 31. 毒力鉴定是鉴别白喉棒状杆菌与其他棒状杆菌的重要试验。体外法可用 ______ ,体内法可用 ________ 。 32. 结核分枝杆菌常用 _____ 染色,呈现_________ 色。 33. 结核分枝杆菌对湿热敏感,经 _____ C ________ m ir即可被杀死。 34. 结核菌素试验所用的试剂有 ___ 、_________ 两种。 35. 幽门螺杆菌形态呈 ______ 、_______ 或______ 状。目前认为与人类的 _______ 、 ________ 疾病有关。 36. 绿脓杆菌在生长繁殖过程中能产 ______ 色素。

高中生物现代生物技术专题及经典例题解析

现代生物技术专题及经典例题解析 二、考点解读: 本讲知识属于现代生物科技及能够联系并应用于生产、生活实际中的技术。近几年的江苏、上海、广东各地的高考题中多次涉及本知识点的考题。概念题的题型一般多为选择题,与生产紧密相关的题及实验设计题多以非选择题形式出现。 生物工程也叫生物技术,是生物科学与工程技术有机结合而兴起的一门综合性科学技术。包括基因工程、细胞工程、胚胎工程等一系列的现代生物技术,关于基因工程、细胞工程、胚胎工程的材料题是近年来高考的热门知识点。通过对近2年江苏高考题的分析,本部分内容2007年约占26分,2008年约占33分,由此可以看出,本部分属于高考的重点内容之一。复习时要重视生物新技术在生产生活实践中的应用,重视各工程之间的相互关系,这既是科技发展热点课题之一,也是考试命题热点之一。利用已学过的基因工程、细胞工程、胚胎工程知识,对三大生物工程的联系加以融会贯通,提高分析综合与解决实际问题的能力。建议在复习过程中通过案例探究的方法,来提高学生的能力,可以选择现代生物科技的热点信息作为载体,将生物工程问题及必修中的相关知识融为一体,编制成简答题让学生进行训练,从而达到关注社会热点、激发兴趣、巩固知识、提升能力的目的。 三、主干知识整合 (一)基因工程知识小结 1、基因工程的工具 (1)限制性内切酶:生物体内有一类酶,它们能将外来的DNA切断,即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(限制酶)。限制性内切酶是基因工程中最常用的切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶,其中一类可

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