中文摘要
目的
前列腺癌的发病率近年来有上升趋势，在治疗过程中肿瘤细胞可以转变为雄激素菲依赖型，给治疗带来困难。因此，有必要探讨新的治疗方法。
流行病学、临床、动物及体外实验研究表明，二十烷酸（ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ）代谢途径的产物在肿瘤的发生发展中起重要作用。环氧合酶（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ｃｏｘ）是二十烷酸代谢生成前列腺素类物质（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，ＰＧｓ）的限速酶。ＣＯＸ具有两种同分异构体的形式，即ＣＯＸ．１和ＣＯＸ－２。ＣＯＸ—ｌ为组成性基因，ＣＯＸ－２是诱导型基因，受细胞因子、生长因子、癌基因、及肿瘤促进剂的刺激，ＣＯＸ－２表达上调，使其产生对各种炎症做出反应的前列腺素类物质（ＰＧｓ）。近年来的研究表明ＣＯＸ－２在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，它的产物ＰＧＥ：能够刺激肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤细胞的凋亡。抑制ＣＯＸ能减少ＰＧＥ：的产生，从而，抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡。还有研究认为，ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ的表达受ＭＡＰＫ激活的调节，ＭｃＧｉｎｔｙＡ等的研究提示ＣＯＸ－２在受细胞因子、生长因子、紧张刺激、丝裂原等因素的激活而表达上调，这些因素激活的共同位点又能激活一种或多种ＭＡＰＫ途径。说明ＣＯＸ－２途径可能受ＭＡＰＫ途径的激活．因此，选择性地减少诱导性ＰＧｓ的产生，对预防肿瘤的发生、发展及其转归具有重要的作用。非甾体类抗炎药物（ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｎｄ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇｓ，ＮＳＡＩＤｓ）是ＣＯＸ的阻滞剂，根据ＮＳＡＩＤｓ对ＣＯＸ异构体ＣＯＸ一１和ＣＯＸ－２的抑制作用不同，可将其分为三类：０）ｃｏｘ一１选择性抑制剂，＠ｃｏｘ－２选择性抑制剂，③ＣＯＸ非选择性抑制剂。研究发现，ＮＳＡＩＤｓ具有抗肿瘤的作用，它对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。尽管ＮＳＡＩＤｓ抗肿瘤的确切机制尚不十分清楚，但大量的研究表明，ＮＳＡＩＤｓ的抗肿瘤作用可能通过不同的信号传导途径，抑制细胞周期，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管发生，抑制肿瘤细胞的浸润和转移。
ＮＳ３９８是ＣＯＸ－２选择性抑制剂，它既能通过ＣＯＸ－２途径达到抑制肿瘤的目的，又避免了非ＣＯＸ选择性抑制剂的毒副反应这一缺点，因此具有良
好的应用前景。我们采用体外研究的方法，探讨ＣＯＸ－２选择性抑制剂ＮＳ３９８对人前列腺癌细胞系ＰＣ－３的抑制途径，为ＮＳ３９８治疗前列腺癌提供实验依据。
方法
１．ＲＴ－ＰＣＲ实验：观察人前列腺癌细胞系ＰＣ－３的ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ表达情况及ＮＳ３９８作用后ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ量的变化。
２．细胞生长抑制实验（ＭＴｒ法）：观察ＮＳ３９８作用下的ＰＣ－３细胞的增殖抑制情况。
３．流式细胞仪ＤＮＡ含量分析：观察ＮＳ３９８对ＰＣ－３细胞周期及凋亡的影响。
４．ＤＮＡ梯形电泳：观察ＮＳ３９８作用下ＰＣ－３的细胞凋亡情况。
５．透射电镜：观察ＮＳ３９８作用下ＰＣ－３的细胞凋亡情况。
６．Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ实验：观察ＮＳ３９８对ＰＣ－３细胞的ＣＯＸ－２、ｃｙｃｌｉｎＤ，、ｃｙ．ｃｌｉｎＥ、ｂｃｌ－２、ｂａｘ、ＥＲＫ、ＥＲＫ—Ｐ蛋白表达的影响。
７．放射免疫实验：观察ＮＳ３９８对ＰＣ－３细胞的ＰＧＥ：释放的影响
８．统计学分析：应用ＳＰＳ￥ｆｏｒｗｉｎｄｏｗｓｌ０．０软件包分析数据。ＮＳ３９８对人前列腺癌细胞系ＰＣ－３的作用结果以ｘ土ｓ表示，显著性检验采用单因素方差分析Ｄｕｎｎｅｔｔｔ检验。
结果
１．人前列腺癌细胞系ＰＣ－３ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ及１ＣＯＸ－２蛋白表达均为阳性。随着ＮＳ３９８浓度的增加，ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ及蛋白的表达量逐渐下降。表现出剂量依赖的方式。
２．ＭＴｒ实验结果显示，随着ＮＳ３９８浓度的增加和作用时间的延长，细胞的增殖抑制越来越明显。在７２ｈ、９６ｈ时，随着药物浓度的增加抑制率逐渐增加。与对照组（ＮＳ３９８为０ｔｕｎｏｌ／Ｌ）比较，２５ｔｕｎｏｌ／Ｌ、５０ｔｕｎｏｌ／Ｌ和１００ｔＬｍｏｌ／Ｌ组的７２ｈ、９６ｈ的细胞增殖抑制显著（Ｐ＜０．０５）。表现出良好的时间依赖性和剂量依赖性。
３．流式细胞仪ＤＮＡ含量分析结果显示，ＰＣ－３细胞经１００ｔｕｎｏｌ／Ｌ的
ＮＳ３９８作用７２ｈ后，Ｇ０／Ｇ。期的细胞数明显增加（Ｐ＜Ｏ．０５），并伴随着Ｓ期和Ｇ’／Ｍ期细胞数的减少（Ｐ＞０．０５）和含亚二倍体ＤＮＡ的细胞数增ＪＪｇ（Ｐ＞０?０５）。提示，ＰＣ－３细胞经ＮＳ３９８作用后细胞周期发生了Ｇｏ／Ｇ，期阻滞，同时诱导了ＰＣ－３细胞的凋亡。
４．ＤＮＡ梯形电泳显示，１００１ｘｍｏｌ／ＬＮＳ３９８作用７２ｈ的ＰＣ－３细胞ＤＮＡ电泳显示特征性梯形谱带。
５．透射电镜镜下所见：细胞核膜完整；染色质聚集成块，边集；胞浆内可见“空泡”及“凋亡小体”；细胞膜完整，其表面微绒毛消失。
６．Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ蛋白半定量分析结果显示，人前列腺癌细胞系ＰＣ－３经
１００１ｘｍｏｌ／ＬＮＳ３９８作用７２ｈ后与对照组比较，细胞信号传导ＭＡＰＫ途径的重要激酶ＥＲＫ表达下降，磷酸化水平降低（Ｐ＜０．０５），提示，ＮＳ３９８对ＰＣ－３的抑制，不仅通过ＣＯＸ－２途径，还通过了ＭＡＰＫ途径。细胞周期调节蛋白ｃｙｃｌｉｎＤ。表达明显减低（Ｐ＜０．０５），ｃｙｃｌｉｎＥ无明显变化；细胞凋亡相关蛋白ｂｃｌ－２表达明显减低（Ｐ＜０．０５），ｂａｘ增高（Ｐ＞０．０５）。
７．放免结果显示，随着ＮＳ３９８浓度的增加，ＰＧＥ：的释放量明显下降。
与对照组比较差异显著（Ｐ＜０．０５），提示ＣＯＸ－２活性受到抑制。
结论
１．ＣＯＸ－２选择性抑制剂ＮＳ３９８对人前列腺癌细胞系ＰＣ－３具有增殖抑
制作用。
２．ＮＳ３９８对ＰＣ－３的抑制机制是多途径。它可以通过抑制ＣＯＸ－２和
ＭＡＰＫ双重途径来实现，从而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。
３．选择性ＣＯＸ＿２抑制剂ＮＳ３９８可能首先通过对ＰＣ．３细胞ＥＲＫ的抑
制从而抑制细胞增殖的重要途径一ＭＡＰＫ途径，继而抑制ＣＯＸ－２ｍＲ．ＮＡ转
录，使ＣＯＸ－２产物ＰＧＥ：减少，细胞周期发生了以ｃｙｃｌｉｎＤ。下调为机制的Ｇ。期阻滞和以下调ｂｃｌ－２，上调ｂａｘ为机制的细胞凋亡。
关键词：前列腺癌；环氧合酶－２抑制剂；细胞周期；凋亡
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＮＳ３９８ＯｉｌＨｕｍａｎ
ＰｒｏｓｔａｔｅＡｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＰＣ－３
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｐｒｏｓｔａｔｅａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｈａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．Ａｌｔｈｏｕｇｈｍｏｓｔｐａｔｅｎｔｒｅｓｐｏｎｄｉｎｉｔｉａｌｌｙｔｏａｎｄｒｏｇｅｎ—ａｂｌａｔｉｖｅｔｈｅｒａｐｉｅｓ，ｔｈｅｐｒｏｓ－
ｔａｔｅａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅＵｓｅｖｅｎｔｕａｌｌｙａｎｄｉｎｅｖｉｔａｂｌｙｌｏｓｅｔｈｅｉｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏａｎ—
ｄｒｏｇｅｎ．Ｐｒｅｓｅｎｔｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｆｏｒａｄｖａｎｃｅｄ，ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｓｔａｔｅａａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａａｒｅｏｎｌｙｍａｒｇｉｎａｌｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｒｅｉｓｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ
ｕｒｇｅｎｃｙｔｏｄｅｖｅｌｏｐｎｅｗａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｔｏｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｔｒｅａｔｐｒｏｓｔａｔｅａｄｅ—ｎｏｃｉｎｏｍａ．
Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｃｌｉｎｉｃａｌ，ａｎｉｍａｌａｎｄｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅａｌｌｐｒｏｖｉｄｅｄｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓａｎｄｏｔｈｅｒｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓｉｎｔｈｅｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｇｒｏｗｔｈ．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ｃｏｘ），ａｌｓｏｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏａｓｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ｉｓｔｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅｉｎｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄ（ＡＡ）ｔｏｐｒｏｓ—
ｉｓｏｆｏｒｍｓｏｆＣＯＸｈａｖｅｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｔａｇｌａｎｄｉｎｓａｎｄｏｔｈｅｒｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ．Ｔｗｏ
ａｎｄＣＯＸ－２．ＣＯＸ一１ｉｓｔｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｇｅｎｅ，ｗｈｅｒｅａｓＣＯＸ－２ｉｓｎａｍｅｌｙＣＯＸ－１
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｇｅｎｅ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄｔｕｍｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｓｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄｔｏｉｎｄｕｃｅＣＯＸ－２ｕｐ??ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｄｕｃｅｐｒｏｓｔａｇｌａｎ－－ｄｉｎｓ（ＰＧｓ）ｆｏｒｖａｒｉｏｕｓｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．ＲｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄｅｄｔｈａｔＣＯＸ－２ｐｌａｙｅｄａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｄｒｉｖｉｎｇｔｕｍｏｕｒｉｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｇｒｏｗｔｈ．ＰＧＥ２，ａｍａｊｏｒＣＯＸ－２ｄｅｒｉｖｅｄｐｒｏｄｕｃｔ，ｈａｓｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｔｕｍｏｒｃｅｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅｒｅａｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅｒｅａｓｏｎｓｔｏｈｅ＇ｅｖｅｔｈａｔｉｔｃｏｕｌｄｂｅｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＰＧｓｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＣＯＸｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｔｕｍｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰＧｓｉｎｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇ－ｎｏｓｉｓ．Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇｓ（ＮＳＡＩＤｓ）ａｒｅＣＯＸｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｗｈｉｃｈＣａｌｌｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｃａｔｅｇｏｒｉｅｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒｏｌｅｉｎ
ＣＯＸ：①ＣＯＸ．１ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，②ＣＯＸ－２ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，③ＣＯＸ
ｎｏｎ—ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＳｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｔｈｅＮＳＡＩＤｓｆｏｒａｎｔｉａｄｅｎｏｃｉｎｏｍａａｌｔｈｏｕｇｈｔｈｅｐｒｅｃｉｓｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｆｏｒｔｈｅａｎｔｉａｄｃｎｏｃｉｎｏｍａｅｆｆｅｃｔｓｏｆＮＳＡＩＤｓａｒｅｕｎｋｎｏｗｎ，ｂｕｔｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｓｅｄｒａｇｓｔｏｉｎｄｕｃｅｃｅｌｌｃｙ—
ｃｌｅａｒｒｅｓｔａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｔｏｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｔｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｎｄｍｅ。ｔａｓｔａｓｉｓｈａｓｒｅｃｅｉｖｅｄｍｕｃｈａｔｔｅｎｔｉｏｎｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．
ＮＳ３９８ｉｓａＮＳＡＩＤｔｈａｔｉｓｈｉｇｈｌｙｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｆｏｒＣＯＸ－２，ｉｔＣａｎｉｎ—ＭｂｉｔｔｈｅｅａｒｅｉｎｏｇｅｎｓｉｓａｎｄｇｒｏｗｔｈｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＣＯＸ－２ｗｉｔｈｌｏｗｅｒｓｉｄｅｅｆｆｅｃｔｓ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｉｔｍａｙｂｅｈａｖｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｆｏｒｐｒｏｓｔａｔｅａｄ—
ｅｎｏｃｉｎｏｍａ．ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｆＮＳ３９８ｅａｒｌｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｔｕｒａｏｒｃｅｉｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅ
ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄａｔａｆｏｒｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔ－ｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ
ｍｅｎｔｏｆｐｒｏｓｔａｔｅａｄｅｎｏｃｉｎｏｍａ，ｗｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＮＳ３９８ｏｎｈｕｍａｎｐｒｏｓ－
ｒａｔｅａｄｅｎｏｃｉｎｏｍａｃｅｉｌｌｉｎｅ。ＰＣ－３，ｉｎｖｉｔｒｏ。
１．ＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙ：ＲＴ—ＰＣＲａｓｓａｙＷａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ－２ｍＲＮＡｂｅｆｏｒｅｏｒａｆｔｅｒＮＳ３９８ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
２．ＭＴＴａｓｓａｙ：ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＣ－３ｃｅｌｌｕｎｄｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉ也ＮＳ３９８．
３．ＦＣＭＡｓｓａｙｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅ．
４．ＤＮＡＬａｄｄｅｒｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｆｏｒＡｐｏｐｔｏｔｉｅＣｅｌｌｓ．
５．ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｆｏｒＡｐｏｐｔｏｔｉｃＣｅｌｌｓ．
６．Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔａｓｓａｙｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｏｆＣＯＸ－２、ｃｙｃｌｉｎＤｌ、ｃｙｃｌｉｎＥ、
ａｎｄａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＮ５３９８．
ｂｃｌ－２、ｂａｘ、ｅｒｋ、ｅｒｋ－Ｐｂｅｆｏｒｅ
７．ＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｆｏｒＰＧＥ２ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．
８．ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ．
ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＳＰＳ￥ｆｏｒｗｉｎｄｏｗｓ１０．０ｓｏｆｔｗａｒｅ．
ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｅａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＰＣ－３ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＮＳ３９８Ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄａ８ｍｅａｎ土ｓ．Ａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｏｆｍｅａｎ８ｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｏｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ－Ｄｕｎｎｅｔｔｔｔｅｓｔ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈａｖａｌｕｅｏｆＰ＜０．０５ｗｅｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ。
Ｒｅｓｕｌｔｓ
１．－１１ｌｅｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｅａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ，ＰＣ－３，ｅｘｐｒｅｓｓＣＯＸ－２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＣＯＸ－２ｍＲＮＡ．ＷｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＮＳ３９８，ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣＯＸ－２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＣＯＸ－２ｍＲＮＡｄｅｃｒｅａｓｅｄ．２．ｎｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＭＴｒ
ａｓｓａｙｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＮＳ３９８ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｇｒｏｗｔｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｎＰＣ－３ｃｅｌｌｌｉｎｅｉｎａｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．Ａｔ７２、９６ｈｏｕｒｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆＮＳ３９８ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｒａｔｅｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｉｎｃｏｎｔｒａｓｔｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ（０ｐｊｍｏｌ／Ｌ），ｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ２５ｐ。ｍｏ］／Ｌ，５０ｐ，ｍｏｌ／Ｌａｎｄ１００１山ｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐａｔ７２，９６ｈｏｕｒｓｗａｓｖｅｒｙｓｉｇｎｉｆ－ｉｅａｎｔ（Ｐ＜０．０５）．
３．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＦＣＭＡｓｓａｙｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｅｒ－ｃｅｎｔａｇｅｏｆｅｅＵｓｉｎＧｏ／ＧｌｐｈａｓｅＷａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｆｏｌｌｏｗｉｎｇ７２ｈｏｕｒｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｌｌＮＳ３９８（Ｐ＜０．０５）ｅｏｍｐａｎｙｉｎｇ埘ｔ１１ｔｈｅｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓｉｎＳ，Ｇ２／Ｍｐｈａｓｅａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｈｙｐｏｄｉｐｌｏｉｄｃｅｌｌｓ．ＴｈｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅＧｏ／ＧｌａｒｒｅｓｔａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＮＳ３９８ａｎｄｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
４．ＤＮＡｌａｄｄｅｒｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔ｝ｌｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｌａｄ—ｄｅｒｂａｎｄｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇ７２ｈｏｕｒｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｌｌＮＳ３９８（１００ｔｒｍ／Ｌ）．５．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｗｉｔｌｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ｔｈｅｍｅｍ－ｂｒａｎｅｏｆｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒｗａｓｉｎｔａｃｔ，ａｎｄｅｈｒｏｍａｔｉｎｃｏｎｇｒｅｇａｔｅｄｉｎｔｏｍａｓｓａｎｄｃｏｌ—ｌｅｃｔｅｄａｌｏｎｇｓｉｄｅ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｉｎｔａｃｔｃｅｌｌｕｌａｒｏｒｇａｎｓｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍ．ｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｃｅｌｌｗａｓｗｈｏｌｅ，ａｎｄｔｈｅｂｕｌｂｏｆｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｏｒａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｏｄｙｗａｓａｂｌｅｔｏｂｅｆｏｕｎｄ．
６．弧ｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＥｒｋｐｒｏｔｅｉｎｉｎＰＣ一３ｃｅｌｌｌｉｎｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｏｌｌｏｗｉｎｇ７２ｈｏｕｒｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＮＳ３９８（１００ｔｔｍｏｌ／Ｌ）ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ａｎｄＳＯｄｉｄｉｔｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．７ｎｌｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＣ－３ｅｅＵｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＮＳ３９８ｎｏｔｏｎｌｙｔｈｒｏｕｇｈＣＯＸ－２ｂｕｔａｌｓｏｔｈ删曲ＭＡＰＫｃａｓｃｓｄｅ．ｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｙｅｌｉｎＤｌｄｅ?ｃｒｅｓｅｄａｎｄｔｈｉｓＷａｓｎｏｔａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄｂｙｃｙｃｌｉｎＥ；ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｂｃｌ－２ｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｎｉｅｄｂｙｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｂａｘ．
７．ＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｆｏｒＰＧＥ２ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ：ＰＧＥ２ｗａｓｍｅａｓｌ．Ｌｒｅｄｂｙｒａｄｉｏ－ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＰＧＥ２ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｃｏｎｔｒａｓｔｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＮＳ３９８（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＯＸ－２Ｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．
Ｃｏｎｃｌｕｔｉｏｎｓ
Ｉ．ＮＳ３９８，ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅＣＯＸ－２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．ＣａｎｉｎｈｉｂｉｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｃ＿３ｃｅＵｓ，ａｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｅａｄｅｎｏｅａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ．
２．ｎｅｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅａｃｔｉｏｎｏｆＮＳ３９８ＷａｓａｃｃｏｍＤｌｉｓｈｅｄｔｈｒｏｕｇｈｖａｒｉｏｔｌＳ
ｐａｔｈ．ｗａｙｓ，ｗｈｉｃｈｉｎｃｌｕｄｅＣＯＸ－２ａｎｄＭＡＰＫ．弧ｅｒｅｂｙ．ｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓＷａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｎｄ出ｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｃｅｌｌｓｗａｓｉｎｄｕｅｅｄｂｙｔｈｅｍ．
３．ＮＳ３９８，ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅＣＯＸ－２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｍａｙｆｉｒｓｔｉｎｈｉｂｉｔＥＲＫ．ｗｈｉｃｈｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｋｉｎａｓｅｏｆＭＡＰＫ．ＭＡＰＫｃａｓｅａｄｅｓｉｓａｌｌｉｍｐｏｒｔａｎｔｗａｙｏｆｃｅｌｌＤｒｏｌｌｆｅｒ．ａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｓｅｑｕｅｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅｌｅｖｅｌｓｏｆＣＯＸ－２ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏ．ｔｅｉｎ，ａｎｄｔ｝ｌｅＰＧＥ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＴｈｅｃｙｃｌｅｏｆｃｅｌｌｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｉｎｐａｒａｌｌｅｌｔｏｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｃｙｃｌｉｎＤｌａｎｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｃｅｌｌｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｉｎｐａｒａｌｌｅｌｔｏｔｈｅｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｃｌ－２ａｎｄｔ１１ｅｕｐ．ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂａｘ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｒｏｓｔａｔｅａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＣＯＸ．２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：Ｃｙｃｌｅｏｆｃｅｌｌ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
英文缩略语
英文缩写英文全称中文全称
ＮＳＡＩＤｓＮｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌＡｎｔｉ—Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇｓ非甾体类抗炎药
ＣＯＸｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ环氧合酶
眦ｒｒ３一（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｌｌｉａｚｏｌ－２一ｙ１）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｒ＝ｏ。四甲基偶氮唑蓝ｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ
ＦＢＳＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ胎牛血清
ＡＡＡｒａｃｈｉｄｏｎｉｃＡｃｉｄ花生四烯酸
ＰＧｓＰｒｏｓｔａｇｌａＩｌｄｉｎｓ前列腺素类物质
ＮＳ３９８Ｎ－１：２－（．ｃｙｄｏｈｅ哪０ｘｙ）４’ｈｉ缸印ｈｅｎｙ］－ｍｅ‘“ａｎ。对甲磺基硝基苯．环乙醚ＳｕⅡｏｎａ．ｍｌｄｅ
环氧合酶．２抑制剂ＮＳ３９８对人前列腺癌
细胞系ＰＣ．３的抑制机制
刖置
前列腺癌的发病率在近年来有上升的趋势，在治疗过程中肿瘤细胞可以转变为雄激素非依赖型，给治疗带来困难，因此，有必要探讨新的治疗方法。
近年来的研究表明，ｃｏｘ－２在肿瘤的发生发展中起着重要作用。人们对ｃｏｘ－２可能作为抗肿瘤的靶点这一兴趣的产生源于流行病学调查和两次动物实验。流行病学的研究发现，口服阿司匹林等非甾体类抗炎药物能降低结肠癌发病危险的４０－５０％¨ｏ；Ｋａｗａｍｏｒｉ等口１发现在偶氮甲烷所致的鼠大肠癌的模型中，ＣＯＸ－２选择性抑制剂Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ可使大肠癌的发生率和数量分别减少９３％和９７％；Ｏｓｈｉｍａ口。制成ＡＰＣ基因突变鼠模型ＡＰＣａ７”，使ＡＰＣａ７１６鼠编码的ＣＯＸ－２基因（Ｐｔｇｓ２）突变失活，形成复合突变鼠，结果该鼠发生息肉的数量及大小明显降低。研究发现ＣＯＸ－２在许多种人类肿瘤，如结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、头颈部等肿瘤中表达上调，而ＣＯＸ．１表达变化不大Ｈ“ｏ。多种类型的肿瘤与其来源的正常组织相比较ＰＧｓ明显升高归“…。提示ＣＯＸ－２与其产物ＰＧｓ在肿瘤的发生、发展中起重要作用。
肿瘤表现为细胞增殖过度，凋亡受阻的病理过程。ＭＡＰＫ细胞信号传导途径是细胞增殖的重要途径。生长因子（如表皮生长因子ＥＧＦ等）与其受体结合激活受体酪氨酸激酶，从而激活一系列包括ＭＡＰＫ在内的具有催化活性的胞浆蛋白激酶，它们把信号传递到细胞核，进而使某些与增殖有关的基因开始表达。ＥＲＫ２是ＭＡＰＫ家族的亚家族成员，负责细胞的增殖与分化。Ｈｕｓａｉｎ等¨ｕ采用ＮＳ３９８抑制胃癌细胞的增殖，同时检测ＭＡＰＫ的活性，结果显示，ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）的活性受到抑制，提示ＮＳ３９８对胃癌细胞系的抑制作用可通过抑制ＭＡＰＫ信号途径来实现。Ｐａｉ等［１２３也证明ＰＧＥ，可通过转激活ＥＧＦ－Ｒ从而激活ＭＡＰＫ信号传导途径，ＮＳ３９８可以通过抑制ＥＧＦ－Ｒ激酶而抑制该途径的传导，从而抑制细胞的增殖。基于以上的研
究，我们不禁要问：ＣＯＸ－２途径和ＭＡＰＫ途径是两条独立的途径吗？它们是否存在着某种联系呢？ＣＯＸ－２选择性抑制剂ＮＳ３９８是否可以通过ＭＡＰＫ途径抑制人前列腺癌细胞系ＰＣ－３的生长呢？为了回答这些问题，我们采用体外研究的方法，探讨ＣＯＸ－２选择性抑制剂ＮＳ３９８对前列腺癌细胞系ＰＣ－３的抑制途径，为ＮＳ３９８治疗前列腺癌提供实验依据。
实验材料
１细胞系：人前列腺腺癌细胞系ＰＣ－３，来源于６２岁的ＩＶ期前列腺腺癌患者，由中国科学院上海细胞生物研究所提供。
２．试剂：
ＮＳ３９８为美国Ｃａｙｍａｎ公司产品；
Ｈａｍ’ｓＦｌ２培养基为美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司产品；
胰蛋白酶为ＤＩＦＣＯ产品；
胎牛血清为天津血液研究所产品；
四甲基偶氮唑蓝（ＭＴｒ）、二甲基亚枫（ＤＭＳＯ）为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；
ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ及内对照引物由北京奥科生物有限责任公司合成；
ＴＲＩｚｏｌ试剂由美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司提供；
逆转录试剂盒由大连宝生物公司（ＴａｋａＲａ公司产品）提供；
ｔｐＸｌ７４－ＨｉｎｃｌＩＤＮＡＭａｒｋｅｒ和Ｔａｑ酶、电泳用琼脂糖由沈阳联星生物技术有限公司提供；
ＲＴ－ＰＣＲ常规试剂由中国医科大学第二临床学院卫生部先天畸形实验室提供；
ＣＯＸ－２单抗购自武汉博士德生物工程有限公司；
磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２、非磷酸化ＥＲＫＩ／ＥＲＫ２单抗及碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗购自北京中山生物技术有限公司；
ｗｅｓｔｅｒｎ常规试剂由中国医科大学生物化学教研室提供；
”Ｉ－ＰＧＥ：放射免疫药盒购自苏州医学院血栓病研究所。
３．实验仪器
仪器名称型号
（１）ＣＯ：恒温培养箱５４１０
（２）电热恒温水浴箱ＨＥＴＷ２１６００公司及产地
ＮＡＰＣ０
上海跃进医疗器械厂
（４）高压灭菌器ＬＳ３０２０
（５）倒置相差显微镜ＴＭＳ－Ｆ
（６）普通光学显微镜ＣＨＳ
（７）普通低速离心机Ｌｍ－２Ａ
（８）酶联免疫检测仪Ｓｕｎｒｉｓｅ
（９）９６孔细胞培养板
（１０）Ｔ２５ｃｍ２细胞培养瓶
（１１）一７０℃深冻冰箱ＦｏｒｍａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（１２）普通电冰箱ＢＣＤ．１８１Ａ
（１３）ＰＣＲ扩增仪ＰＴＣ．１００ＴＭ
（１４）紫外透射仪ＤＹＹ－Ｈ１３１Ａ型（１５）超声粉碎仪ＵＰ５０Ｈ
（１６）低温台式离心机ＳＴ－２１型
（１７）紫外分光光度计ＵＶ－２００型
（１８）电泳仪、转印槽ＤＹＹ．ＩＩｌ５型
（１９）电泳凝胶成像自动分析系统
（２０）１计数仪ＫＯＮＴＲＯＮＧＡＭＭＡｍａｆｉｃＩＩ型
实验方法
ＳａｎＹｏ（日本）
ＮＩＫＯＮ（日本）
Ｏｌｙｍｐｕｓ（日本）
北京医用离心机厂
ＴＡＣＡＮ（奥地利）
Ｎｕｎｃ（丹麦）
Ｎｕｎｃ（丹麦）
美国
Ｈａｉｒｅ（中国）
美国
北京
ＨＥＩＤＯＬＰＨ（德国）
ＳＯＲＶＡＬＬＳＵＰＥＲ（德国）岛津（日本）
美国
Ｏｌｙｍｐｕｓ（日本）
瑞士
１．细胞培养
人前列腺癌细胞系ＰＣＨ贴壁生长在含１０％热灭活胎牛血清（ＦｅｔａｌＢｏ．ｖｉｎｅＳｅｒｕｍＦＢＳ）的Ｈａｍ’ｓＦｌ２培养基中，于３７。Ｃ、５％Ｃ０２、饱和湿度的恒温密闭培养箱内传代培养，０．２５％胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ）消化，每３４天消化一次，收集细胞。
２．细胞处理
２．１药液的配制：
ＮＳ３９８溶解在１００％ＤＭＳＯ溶剂中，配成１００ｍｍｏｌ／Ｌ的倍液。实验时，于当日用含１０％ＦＢＳ的Ｈａｍ７ｓＦｌ２培养液稀释，使得ＤＭＳＯ的浓度在Ｏ．１％及以下。
２．２实验分组
ａ：空白组：培养液
ｂ：对照组：培养液＋细胞，
Ｃ：实验组：培养液＋细胞＋不同浓度的ＮＳ３９８
３．细胞增殖抑制实验～ＭＴｒ实验
将ＰＣ－３细胞以５×１０３个细胞／孔接种于９６孔板中，在３７℃、５％ＣＯ：及饱和湿度的条件下恒温密闭培养２４小时。更换实验用培养液（含０／．ｇｎｏｌ／Ｌ、２５９。ｍｏｌ／Ｌ、５０肛ｍｏｌ／Ｌ、１００肛ｍｏｌ／ＬＮＳ３９８的培养液）。分别在加药后的２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ倾去培养液，每孔加人ＭＴＦ溶液（Ｓｍｇ／ｍ１）２０出，继续孵育４ｈ，每孔加入１５０止ＤＭＳＯ，振荡１０分钟，用酶联免疫检测仪读取每孔的吸光度Ａ值（入＝５７０ｎｍ），绘制细胞生长曲线。按公式：［（ｂ—ａ）一（Ｃ—ａ）］／（ｂ—ａ）ｘ１００％计算细胞的增殖抑制率。以上实验重复３次，每次、每浓度、每时段均设３孔。
４．ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ的半定量分析（ＲＴ－ＰＣＲ实验）
４．１选择指数生长期的ＰＣ－３细胞以５×１０５个细胞／瓶接种于Ｔ２５ｅｍ２培养瓶中，在３７℃、５％ＣＯ：及饱和湿度的条件下恒温密闭培养２４ｈ，更换实验用培养液（含０｝上ｍｏｌ／Ｌ、５０ｉ比ｍｏｌ／Ｌ、１００斗ｍｏｌ／ＬＮＳ３９８的培养液）。在加药后７２ｈ，收集细胞。ＰＢＳ冲洗２次加入Ｔｒｉ－Ｚｏｌ试剂ｌｍｌ，待细胞脱落后将该细胞悬液吸入ｅｐｐｅｎｄ！ｏｒｆ管中，用７号针头反复抽吸；加入２００出氯仿混匀，１３０００ｒｐｍ、４℃、离心１５ｍｉｎ，取上清加入５００?止异丙醇，混匀，冰上静置１ｈ，离心同上；弃上清，加入７５％乙醇２００出洗涤一次，再行上述离心，弃上清。加入５０肛ｌＤＥＰＣ双蒸水，置－２０℃备用。ＲＮＡ纯度采用紫外分光光度计测定其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值，按０Ｄ２６０值计算ＲＮＡ样品浓度，公式：ＲＮＡ样品浓度＝０Ｄ２６０Ｘ核酸稀释倍数×４０／１０００（斗∥山）。
４．２将上述所得的ＲＮＡ２１ｚｇ加入ｅＤＮＡ合成反应体系：２×ｂｕｆｆｅｒ５斗ｌ，ＭｇＳ０４（２５ｍＭ）２恤１，ｄＮＴＰＳ（１０ｎｌＭ）０．５山，Ｂｅａ－ＢＥＳＴＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．５肛１，ｏｌｉｇｏ—ａＴ（１５）０．５弘１，ＲＮａｓｅ抑制剂０．２５山，ｄｄＨ２０和ＲＮＡ样品体积１．２５阻ｌ。反应的总体积为１０一。以６５℃ｌｍｉｎ、３０℃５ｒａｉｎ、６５℃３０ｍｉｎ、９８℃５ｒａｉｎ、５℃５ｍｉｎ的条件逆转录合成ｅＤＮＡ。
４．３取ｅＤＮＡ３一加入ＰｃＲ反应体系：ｄｄＨ２０１７．１山，１０×ｂｕｆｆｅｒ．２，．５出，ｄ．ＮＴＰｓ２一，Ｔａｑ酶０．２斗ｌ，ＣＯＸ－２一Ｕ（１：２０）ｏ．１出，ＣＯＸ－２－Ｌ（１：２０）０．１止，Ｂ－ａｃｔ．ｉｎ—Ｕ（１：１０）０．１山，Ｂ?ａｃｔｉｎ－Ｌ（１：１０）０．１止。ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ及Ｂ．ａｃｔｉｎｍＲ．ＮＡ的引物序列及扩增片段见表ｌ。９５℃９０ｓ预变性，９４％４５ｓ变性，５５。Ｃ４５ｓ退火，７２。Ｃ９０ｓ复性，进行４５个循环后，７２ｃＣｌＯｍｉｎ延伸，反应体系中Ｂ．ａｃｔｉｎ
为内对照。
４．４将ＰＣＲ扩增产物１０止用２％的琼脂糖凝胶电泳检测，电压ＩＯＯＶ、ｌｈ，溴乙啶（ＥＢ）染色分析，紫外灯下拍照，采用电泳凝胶成像及自动分析系统摄像、打印。ｔｐＸｌ７４一Ｈ沁ⅡＤＮＡＭａｒｋｅｒ作为分子量的标准，在３０３ｂｐ处出现条带者为ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ，在５９０ｂｐ处显示条带者为Ｂ－ａｅｔｉｎｍＲＮＡ。分别测定ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ和［３－ａｃｔｉｎｍＲＮＡ的灰度值，用［３－ａｃｔｉｎｍＲＮＡ的灰度值标化ＣＯＸ－２ｍＲ＿ＮＡ，得到ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ的相对含量。
表１寡核苷酸引物
５．ＣＯＸ－２、磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２、非磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２蛋白的半定量检测（ｗｅｓｔｅＹｌｌ—ｂｌｏｔ实验）
将指数生长期的ＰＣ－３细胞以５×１０’个细胞／瓶接种于Ｔ２５ｃｍ２培养瓶中，在３７℃、５％ＣＯ：及饱和湿度的条件下恒温密闭培养２４ｈ。更换实验用培养液（含Ｏｌｘｍｏｌ／Ｌ、５０ｐ，ｍｏｌ／Ｌ、１００１ｘｍｏｌ／ＬＮＳ３９８的培养液）。在加药后７２ｈ，刮取细胞。准确计量其离心后的培养液，一２０℃冰冻保存，待行ＰＧＥ：检测。沉淀的细胞用ＰＢＳ洗一次，离心。去上清，加入裂解缓冲液０．５ｍｌ在冰上用超声粉碎仪粉碎，４℃、１２０００ｒｐｍ，离心ｌｈ后，取上清液２５ｍ，行考马斯亮蓝法蛋白定量。按最小蛋白浓度用双蒸水将样品稀释成相同浓度后，加入５倍样品缓冲液５０出煮沸５ｒａｉｎ。采用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶平板电泳，分离胶浓度为１２％。将上述处理好的样品，上样至多功能电泳仪，电压１５０Ｖ、电流１００ｍＡ，电泳１．５ｈ。将分离胶与硝酸纤维素膜（Ｗｅｓｔｅｒｎ转印缓冲液浸泡）相贴做夹心抗体，置入转印仪、Ｗｅｓｔｅｒｎ转印缓冲液中电转印，４０Ｖ、１７０ｍＡ、ｔ５０ｍｉｎ。用ＴＢＳ反复冲洗转印膜，封闭液封闭９０ｍｉｎ。以订．ＢＳ反复冲洗，与一抗——兔抗人ＣＯＸ－２、磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２、非磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２单克隆抗体（工作浓度１：２００）４℃下孵育过夜。ＴＢＳ、ＴｒＢｓ反
复冲洗转印膜后与二抗——碱性磷酸酶标记的山羊抗兔抗体室温下孵育２ｈ。碱性磷酸酶染色液染色１５．３０ｒａｉｎ。采用凝胶成像及分析系统对ＣＯＸ－２、磷酸化ＥＲＫＩ／ＥＲＫ２、非磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２的蛋白含量进行半定量分析，并打印。
６．ＰＧＥ２测定
６．１将指数生长期的ＰＣ－３细胞以５×１０５个细胞／瓶接种于Ｔ２５ｅｍ‘培养瓶中，在３７℃、５％ＣＯ：及饱和湿度的条件下恒温密闭培养２４ｈ。更换实验用培养液（含０Ｉｘｍｏｌ／Ｌ、５０／ＬＬｍｏｌ／Ｌ、１００１山ｍｏｌ／ＬＮＳ３９８的培养液）。在加药后７２ｈ，刮取细胞。准确计量其离心后的培养液，一２０。Ｅ冰冻保存，待行ＰＧＥ２检测。
６．２测定程序按放免药盒说明书进行。
①取试管７支，编号ＳＩ－７，加ＰＧＥ２标准品（１６０ｐｇ／Ｏ．１ｍ１）从Ｓ７至ｓ１倍比稀释成８０ｐｇ／０．１ｍｌ一１．２５ｐｇ／０．１ｍｌ的７个标准管。做两套标准管。
②双管放免测定加液程序如表２：
表２ＰＧＥ：放免测定加液程序（１１１１）
从第三管起３０００ｒｐｍ３０ｍｉｎ离心，吸弃上清后，在叮计数仪上测定沉淀的放射性。
表４不同浓度ＮＳ３９８作用下的ＰＣ－３细胞的增殖抑制率
图１不同浓度ＮＳ３９８作用下的ＰＣ一３细胞生长曲线图２不同浓度ＮＳ３９８作用下的ＰＣ一３抑制
蛊
２．ＮＳ３９８对ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ的影响
ＮＳ３９８对ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ的影响见图３。以０ｌｚｍｏｌ／Ｌ组的ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ表达相对含量作标准，其它浓度的ＣＯＸ－２ｍＲＮＡ表达相对含量与之相比较，计算相对的百分含量，作图。结果显示，随着ＮＳ３９８浓度的增加，ＣＯＸ一２ｍＲＮＡ表达的量逐渐下降（Ｐ＜Ｏ．０５）。提示ＮＳ３９８抑制了ＣＯＸ－２的转录。
罩１２０
至１００
耋８０
蓍童６０
圭４０
鎏２０
蜷０
０５０１００
７／５３９８（ｕｍｏｌ／Ｌ）图３Ｌ１：ＭａｒｋｅｒＬ２：０肛ｍｏｌ／Ｌ、１．３：５０ｐ．ｍｏｌ／Ｌ、１．４：１００／．Ｌｍｏｌ／Ｌ、１５：１３－ａｅｄｎ
?１６?
３．ＮＳ３９８对ＣＯＸ－２蛋白的影响
ＮＳ３９８对ＣＯＸ－２蛋白的影响见图４。以０１．，ｍａｏＶＬ组的ＣＯＸ－２蛋白相对含量作标准，其它浓度的ＣＯＸ－２蛋白相对含量与之相比较，计算相对的百分含量，作图。结果显示，随着ＮＳ３９８浓度的增加，ＣＯＸ－２蛋白表达的量逐渐下降（Ｐ＜０．０５）。提示ＮＳ３９８抑制了ＣＯＸ－２蛋白的表达。
Ｏ＂Ｈ５０¨Ｍ１１３０Ｕ孙图４ＮＳ３９８对ＣＯＸ一２蛋白表达的
影响ｌ｜｜ｍ
４．ＮＳ３９８对ＣＯＸ－２活性的影响
通过对ＣＯＸ－２产物ＰＧＥ２的检测，观察ＮＳ３９８对ＣＯＸ－２活性的影响结果见图５。计算各组细胞每毫克蛋白在每毫升培养液中所产生的ＰＧＥ：的量（ｐｇ／ｍｌ／ｍｇ），作图。结果显示，随着ＮＳ３９８浓度的增加，ＰＧＥ：的量明显下降。与对照组比较差异显著（Ｐ＜０．００１），提示ＣＯＸ－２活性受到抑制。
图５ＲＳ３９８对ＰＣ一３细胞ＰＧＥ２
释放的影响
一３５１）
普３００
∑２５０
｛２０１）
兰１５（Ｉ
ｉ１００
基与。
山
Ｏ
０５０１００
ＮＳ３９８（ｕｍｏｌ／Ｌ）
５．ＮＳ３９８对磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２、非磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２的影响
ＮＳ３９８对磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２、非磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２的影响见图６。分别以０ｐａｎｏｌ／Ｌ组的磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２、非磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２蛋白相对含量作标准，其它浓度的磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２、非磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２蛋白
?１７?
相对含量与之相比较，计算相对的百分含量，作图。结果显示，经ＮＳ３９８作
用后ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２蛋白表达量下降，磷酸化ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２也同时下降，提
示，ＮＳ３９８不仅抑制ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２的表达，也抑制ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２的磷酸化，即
ＥＲＫｌ／ＥＲＫ２的活性。
０ｐＨ５０“Ｍｉ００Ｕ日
日豇，ｎ站ｐ－！踊／耻
讨论
图６．１ＮＳ３９８对ＥＲＫＩ／ＥＲＫ２的影响
强
型；芒捌三如
羞智
錾罩兰正
监ｍ
ｏ５０ｉ００
ＮＳ３９８（ｕｍｏｉ／Ｌ）
１５１６—２ＮＳ３９８对ＰＣ一３细胞Ｐ—
ＥＲＫ］。／ＥＲＫ２的影响
０５０１００
ＮＳ３９８（ｕｍ０１）
环氧合酶（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅＣＯＸ）又称为前列腺素内过氧化物合酶（ｐｒｏｓ．
ｔａｇｌａｎｄｉｎｅｎｄｏｐｅｍｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ），它是催化花生四烯酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄ
ＡＡ）转化成前列腺素（ＰＧｓ）和其它二十烷酸类物质（ｅｉｃｏｓａｎｏ［ｄｓ）的关键酶。
它催化两个反应：（１）环氧化反应：ＡＡ结合氧分子形成中间代谢产物
ＰＧＧ：，（２）过氧化反应：ＰＧＧ：结合两个电子被还原成ＰＧＨ：，ＰＧＨ：作为各种
前列腺素的共同中间体，在不同的组织和细胞中继续代谢生成不同的终末
产物，如：ＰＧＥ：、前列环素（ＰＧｌ２）、血栓烷素Ａ：（ＴＸＡ：）等。伴随着这两个反
应，产生代谢的副产物氧自由基、丝裂原（如丙醛）等，这两种剐产物能直接
?１８．
ｏ
ｉ一｝一型姐专Ｌ三ｍ
０
使ＰＣ－３细胞的增殖抑制。对细胞系ＰＣ－３而言，ＣＯＸ－２途径和ＭＡＰＫ途径存在怎样的联系，有待于迸一步的研究。
结论
ＣＯＸ一２选择性抑制剂ＮＳ３９８抑制人前列腺癌细胞系ＰＣ－３的增殖，它可以通过抑制ＣＯＸ－２和ＭＡＰＫ双重途径来实现。
选择性环氧合酶-2抑制剂的研究进展 [摘要]选择性环氧合酶-2抑制剂具有较理想的抗炎镇痛作用，而且其不良反应较非选择性NSAIDs明显减少，被广泛应用于治疗关节炎的疼痛和其他疼痛的治疗。综述了选择性COX-2抑制剂的构效关系及其目前研究开发的现状和最新进展。 [关键词]选择性环氧合酶-2抑制剂；非甾体抗炎药；构效关系Advances in selective COX-2 inhibitors [Abstract]Theselectivecyelooxygenase-2inhibitorhasgoodanti-inflammatory and analgesic effect． and the adverse effects significantly diminish compared with non-selective NSAIDs．Therefore，it is widely usedtotreat thearthritic pain or otherkindsof pain．Inthis paper，the molecular basis，structure-activityrelationships as wellas the advancesin R&D ofselective COX-2inhibitorswere reviewed． [Keywords] selective COX-2 inhibitors nonsteroidalanti-inflammatory drugs(NSAIDs) structure-activityrelationships 非甾体抗炎药(Nodsteroidalanti-innammatoryagents，NSAIDs)一直是世界上处方量最大的药物之一，广泛地用于治疗各种急性和慢
环氧合酶与血管发生 血管发生，血管发生是新血管形成的过程，在人体正常的生长发育以及许多疾病的发生、发展中发挥重要作用。在胚胎发育过程中，血管发生是必不可少的，成人则在伤口愈合及其生殖过程中存在。但是，成人持续存在的血管发生通常意味着疾病的发生，包括：肿瘤、炎症性疾病、糖尿病视网膜病变等[1,2]。参与这些疾病发生的信号路径和分子调节是共通的。血管的发生受到拮抗和促进两种因素的共同调节，两种因素不平衡导致的任何微小变化都可引起血管发生行为的变化[3]。关于环氧合酶，前列腺素类（前列腺素、血栓素）和血管发生因子在血管发生相关疾病中的作用已经被广泛研究，越来越多的证据显示COX-2（环氧合酶-2）参与炎症和肿瘤的血管发生[4]，提示靶向COX-2及其相关信号转导途径的制剂可能用于抗血管发生治疗。 一．COX-2促进血管发生 肿瘤诱导的血管发生是血管发生因子表达增加，抗血管发生因子表达下降或二者共同作用的结果。例如：结肠癌中，恶性细胞，基质成纤维细胞和内皮细胞均显示COX-2高表达；多种肿瘤组织中，VEGF ，TGF-β与COX-2共表达，新血管在表达COX-2的肿瘤区域增殖，高VEGF 和COX-2表达与肿瘤微血管密度增加密切相关。而且高MVD 预示乳腺癌，宫颈癌的预后较差。乳腺癌，前列腺癌组织及其细胞系VEGF 和COX-2表达均增高。体外，PGE 2诱导VEGF 的表达，培养的乳腺癌，前列腺癌，鳞状细胞癌细胞上清包含VEGF 和COX-2，诱导体外血管发生。选择性COX-2抑制剂，NS-398恢复肿瘤细胞凋亡，降低微血管密度，减缓肿瘤细胞裸鼠移植瘤的生长。无论肿瘤细胞还是临近宿主组织产生的COX-2均能促进微血管的形成，可以解释在肿瘤COX-2基因已经被甲基化静默后，选择性COX-2抑制剂仍然可以减缓肿瘤的生长。 环氧合酶催化花生四烯酸生成前列腺素H 2(PGH 2) ，然后又通过特异性的酶催化生成其 图1. 前列腺素类物质的生物合成
.专业整理. .学习帮手. 前列腺癌诊疗规 前列腺癌一．临床诊断【一】症状前列腺癌在早期阶段可完全没有症状，当肿瘤发展使前列腺增大到一定体积，以及膀胱颈部发生梗阻时才出现症状。 此时的梗阻症状与前列腺增生无明显差别，表现为尿频、尿急、尿流缓慢、排尿困难、排尿不尽，甚至发生尿潴留等症状。 但在症状的变化过程中，值得注意的是前列腺癌病情进展较快，而前列腺增生很缓慢。 前列腺癌血尿不常见，一般仅见于前列腺导管癌或移行细胞癌。 在临床工作中，前列腺癌病人往往是因其他部位转移灶引起的不适而就诊，在体格检查或特殊检查时确诊的。 其症状因转移的部位不同而不同。 当肿瘤压迫或发生周围淋巴结转移造成淋巴管阻塞或压迫血管时；或因癌相关性血液高凝状态而发生下肢深静脉血栓时，可出现下肢水肿。 骨转移可为多发性的，一般以腰骶部和骨盆多见，表现为持续性骨痛、下肢活动障碍、易疲劳，严重者可出现下肢瘫痪。 当肿瘤侵犯或压迫周围神经或脊髓时，可出现局部神经疼痛如会阴部疼痛或神经功能障碍。 有肺转移时可有气短等肺部症状。 直肠受累时可有大便困难、肛门坠胀感。 其他还有贫血等。
【二】体格检查 1．直肠指检前列腺直肠指检是诊断前列腺癌的主要方法之一，若结合前列腺穿刺活检，60％左右的病人可获得诊断。 因病灶多发生于前列腺的后叶及两侧叶的移行区，质地坚硬，直肠指检时常能触及硬结。 检查时应注意前列腺的大小、质地、有无硬结或呈结节样改变、中间沟以及精囊情况。 早期前列腺癌虽无临床症状，但直肠指诊可以发现较小病灶。 据报道直肠指检时前列腺部触及硬结，在 50 岁以上者 50％为癌；如硬结延及精囊，前列腺边缘分界不清者 70％为癌。 也有报道前列腺癌直肠指检可漏诊 40％以上的局限性癌灶。 前列腺癌直肠指检对于前列腺癌的分期有一定帮助，直肠指检可初步检出前列腺外的浸润情况，但常常估计过低。 2．其他对于所有的癌症病人均应进行全面、仔细的体格检查，包括浅表淋巴结的触诊。 当病人诉有骨痛时应对触痛点进行仔细的骨骼检查。 检查时还需与前列腺结石、非特异性肉芽肿性前列腺炎、局灶性前列腺结核以及良性前列腺增生症相鉴别。 【三】实验室检查 1．细胞黏附抑制试验前列腺癌病人白细胞黏附抑制试验的阳性率可达 77％一 89％。 最常用的方法有白细胞计数板法、试管法和
常用选择性环氧合酶_2抑制剂的临床研究进展 摘要:选择性环氧合酶-2抑制剂具有较理想的抗炎镇痛作用,而且其不良反应较非选择性NSAID S[1]明显减少,被广泛应用于治疗关节炎的疼痛和其他疼痛的治疗。本文对选择性环氧合酶-2抑制剂如美洛昔康、尼美舒利、塞来昔布和帕瑞昔布等临床应用及不良反应进行评价。 关键词:环氧化酶COX-2抑制剂；临床评价；安全 Abstract: selective cyclooxygenase -2 inhibitor has anti-inflammatory and analgesic effects of ideal, and the adverse reactions were nonselective NSAIDS[1] significantly reduced, the treatment is widely used in the treatment of the pain of arthritis and other painful. In this paper, the selective cyclooxygenase -2 inhibitor, nimesulide, such as meloxicam and celecoxib and parecoxib, clinical application and adverse reactions were evaluated. Keywords:cyclooxygenase COX-2 inhibitor; clinical evaluation; safety 1 COX-2的生物学特性 1.1 COX的作用机制 在30年前就已经发现COX的作用机制[2]，但1988年才首次克隆出COX-1基因，而COX-2在1992年才被发现。人类COX-2基因于1995年被克隆，长约8.3 kb，位于染色体的1q25.2～q25.3，包含10个外显子，由5′端0.8 kb的转录起始位点上游区、6 kb的蛋白质编码区和3′端的非编码区组成。人类COX-2 mRNA编码含604个氨基酸，相对分子质量为72 kD的COX-2蛋白。COX-1是结构型酶，在机体大多数细胞和血小板中表达，COX-1诱导血小板产生TXA2，可导致血小板黏附聚集及血管强烈收缩。而COX-2是诱导型酶，在正常生理情况下几乎不表达，但在许多病理条件下，由于内外环境的各种刺激，可使COX-2呈过度表达。 1.2 COX-2抑制剂的代表药物 20世纪90年代，有关研究人员提出COX存在两种类型(即COX-1和COX-2)的假说，并通过实验证实了这两种同工酶的存在[3]。传统
环氧化酶 环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)又称前列腺素内氧化酶还原酶,是一种双功能酶,具有环氧化酶和过氧化氢酶活性,是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶。目前发现环氧化酶有两种COX-1和COX-2同工酶，前者为结构型，主要存在于血管、胃、肾等组织中，参与血管舒缩、血小板聚集、胃粘膜血流、胃黏液分泌及肾功能等的调节，其功能与保护胃肠黏膜、调节血小板聚集、调节外周血管的阻力和调节肾血流量分布有。后者为诱导型，各种损伤性化学、物理和生物因子激活磷脂酶A2水解细胞膜磷脂，生成花生四烯酸，后者经COX-2催化加氧生成前列腺素。 COX-2的生物学性质 COX是花生四烯酸代谢过程中前列腺素（prostaglandins，PGs）合成的限速酶。传统观念认为，COX 有两种结构亚型，即结构型COX-1和诱导型COX-2。近期，COX的第三种同工酶——COX-3，在神经系统组织内被发现。COX-1主要存在于正常的组织细胞中，催化产生维持正常生理功能的PGs。COX-2是一种膜结合蛋白。研究证实，在巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和单核细胞中COX-2均可被诱导表达。生理状态下绝大部分组织细胞不表达COX-2；而在炎症、肿瘤等病理状态下受炎性刺激物、损伤、有丝分裂原和致癌物质等促炎介质诱导后，呈表达增高趋势，参与多种病理生理过程，具体是细胞膜磷脂通过磷脂酶A2途径被水解释放出花生四烯酸，在COX-2的催化下，合成前列腺素E2（PGE2），最后产生系列炎症介质，并通过瀑布式级联反应参与机体各生理、病理过程。人类COX-2基因位于1号染色体q 25.2～q 25.3，长8.3 kb，含有10个外显子和9个内含子，编码604个氨基酸，含有17个氨基酸残基的信号肽。 COX-2与糖尿病 Pickup研究发现，炎症细胞因子、氧化应激等在2型糖尿病中具有重要作用，首次将2型糖尿病和亚临床炎症联系起来。COX-2作为重要的炎症介质，参与糖尿病的发病机制以通过诱导合成PGs类衍生物来实现。PGE2作为COX-2的产物之一，能抑制葡萄糖刺激胰岛素分泌，导致糖耐量减低。COX-2抑制剂能增加β细胞胰岛素的合成，且呈剂量依赖形式。同时，COX-2作为炎性反应的介质，能降低人体对胰岛素的敏感性。相关动物实验显示，NOD小鼠和BALB/C小鼠进展为糖尿病前，COX-2仅仅表达于胰腺内分泌细胞，糖尿病时期主要表达于胰腺巨噬细胞和树突状细胞，并且COX-2和胰岛素在胰腺的不同细胞群中表达。提示了COX-2病理表达会影响胰岛素分泌，并在胰岛β细胞的病理生理过程中发挥重要作用。通过Heitmeier等的研究也证实，在1型糖尿病患者的胰岛细胞中，一些细胞因子如IL-1、IFN-γ、TNF-α通过诱导刺激COX-2表达，使PGE2合成增加，造成胰岛β细胞功能障碍和退化。在高葡萄糖浓度的刺激下，1型和2型糖尿病患者的胰岛细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞及其离体培养的单核细胞中COX-2的表达均会增加。表明高血糖的刺激或炎性因子诱导都能使COX-2异常表达，造成胰岛细胞损害。 COX-2与DN
环氧合酶的研究进展* 朱辉1,2杨增明1(1东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030;2哈尔滨医科大学生理学教研室,哈尔滨150086) 摘要环氧合酶(C OX)是由花生四烯酸合成前列腺素的关键酶。COX-1和COX-2结构相似,但在反应底物、抑制剂,以及细胞内定位都有明显不同。C OX-1和COX-2催化产生的各种前列腺素可调节机体的生理和病理活动。本文主要就C OX-1和C OX-2两种同工酶在生化结构、基因表达的调节,以及生理和病理功能等方面的进展作一简要介绍。 关键词环氧合酶;前列腺素;环氧合酶抑制剂 中图分类号Q492 环氧合酶(cyclooxygenase,COX)是合成各种前列腺素(prostaglandins,PGs)的关键酶。细胞膜中的磷脂在磷脂酶A2催化下释放出花生四烯酸,后者在COX催化下形成PGH2。PGH2又分别在相应PG异构酶作用下合成PGE、PGF、PGD、PGI等。COX有两种同工酶,即组成型酶C OX-1和诱导型酶C OX-2。 一、C OX-1和COX-2的生化特性 (一)基因结构C OX-1和C OX-2分别由位于不同染色体上的独立基因编码。人类COX-1基因位于9号染色体q32-q33.3,长22kb,由11个外显子和10个内含子构成,mRNA长2.8kb(Inoue等.1995)。COX-1基因启动子第-111/-105和-610/-604两个位点存在Sp1顺式调节元件,无论哪个位点缺失都会导致转录减少50%,而两个都缺失则减少大约75%。人类C OX-2基因位于1号染色体q25.2~ q25.3,长8.3kb,含有10个外显子和9个内含子, mRNA长4.0kb(Masferrer等.1994)。C OX-2在其翻译起始位点上游5.侧翼区有一个30bp保守的TATA盒,而C OX-1在同一区域无此结构。COX-2基因包含许多调节位点,如c AMP反应元件、IL-6反应元件、CC AAT/EBP、AP-2、NF-J B、Sp-1、GATA-1和糖皮质激素反应元件(Wu等.1995)。 (二)蛋白结构C OX-1和COX-2均为71kD的膜结合蛋白,而且长度几乎相同,约600个氨基酸。同一种属的COX-1和COX-2间有60%~65%同源性,而不同种属间每种酶有85%~90%同源性。X-射线晶体结构分析表明,COX是以同源二聚体形式存在,每个单体都包含三个独立的结构域:N末端类表皮生长因子区、膜结合区和C末端一个较大的球状催化区。COX酶的整个空间结构中有一长的疏水通道,可允许花生四烯酸从膜直接进入。两种同工酶在疏水通道间的氨基酸组成略有差异,COX-1在434和523位是异亮氨酸,而C OX-2在这两个位点是缬氨酸,仅仅由于这两个氨基酸的差异使COX-2具有更大的活性位点,可接受更广范围的脂肪酸作为底物,也比C OX-1多大约25%的抑制剂结合位点(Kurumbail等.1996)。在C末端,COX-2有一段18个氨基酸的序列,而COX-1中则没有。缺失此段基因对COX-2的催化活性没有影响,但此序列很可能与COX-2蛋白的快速降解有关。 二、COX-1和COX-2的基因表达与调节 COX-1在多数成年哺乳动物中表达水平没有太大变化,因此很难对它的转录水平调节进行研究。COX-2为诱导型酶,生理情况下,在大多数组织和细胞中检测不到。离体情况下,许多刺激物如生长因子、炎性细胞因子(IL-1、IL-2、I L-6、TNF-A)、细菌脂多糖、人绒毛膜促性腺激素、肿瘤诱导剂等可刺激细胞的COX-2表达,而抗炎细胞因子如I L-4、IL-10、IL-13及糖皮质激素则可抑制C OX-2产生。内源性调节因素如5-羟色胺、花生四烯酸、血小板激活因子、甲状旁腺激素等也可诱导COX-2的局部表达增加。COX-2的局部表达增加与炎症、类风湿性关节炎、癫痫发作等有关。 三、COX-1和COX-2的生理与病理功能 (一)炎症传统的观念认为C OX-2主要与炎症发生有关。然而,最近的一些研究显示C OX-2在炎症的开始和治疗阶段均有作用。Gilroy报道[1]在大鼠角叉菜胶(carrageenan)所诱导的胸膜炎过程的早期COX-2表达和PGE2水平瞬时增加,在反应的后期,COX-2可被再次诱导达更高的水平,并产生抗炎性PGs如PGD2,但是炎性PGE2水平很低。因此,在炎症过程中COX-2有两个明显作用,即早期启动炎症反应而后期有助于炎症恢复。 *国家自然科学基金资助课题(30200196)
第九章细胞增殖与分化的分子机制?细胞的增殖（proliferation）与分化（differentiation）是生物体整个生命活 动中的两个重要事件，与生物体的生长、发育、衰老以及疾病密切相关。 第一节细胞增殖的分子基础 ?（一）概念: ?细胞增殖（cellproliferation）：指细胞通过生长和分裂使细胞数目增加，子细胞获得和母细胞相同遗传特性的过程，是细胞生命活动的重要体现。 ?生物体生长包括细胞数目增多、细胞体积增大和细胞外基质的合成。细胞的增多就是细胞增殖的过程。 ?(二）细胞增殖的意义： ?1、生命的延续、繁衍依靠细胞增殖。 ?低等的单细胞生物依靠细胞增殖分裂繁殖，高等生物依靠细胞减数分裂产生生殖细胞。 ?2、生物体生长发育依赖细胞增殖。 ?3、补充生命活动中衰老和死亡的细胞。 ?4、创伤的修复。 ?（三）细胞增殖的方式 ?无丝分裂：没有纺锤体形成，无核膜核仁的消失和重建。 ?减数分裂：有性生殖中生殖细胞形成过程中发生，连续两次分裂DNA只复制一次。?有丝分裂：有纺锤丝形成，细胞核先分裂再发生胞质分裂，是真核细胞的主要增殖方式。 二、细胞周期 ?细胞周期（cellcycle）：是指细胞从上一次分裂结束开始到下一次分裂结束为止所经历的整个过程。 细胞周期的划分 ?一个细胞周期可以分为间期（interphase）和分裂期（metaphaseM期）两个大阶段。 ?间期可以分为G1期、S期和G2期。 ?细胞周期各期主要特征 ?G1期：从有丝分裂完成到DNA复制之前的一段时期。特点：大量RNA和蛋白质合成，蛋白质磷酸化，细胞膜转运功能加强。 ?G1期的后期细胞的自身监控机制可以根据内外环境是否适于细胞增殖而决定是否进入下一阶段S期。这一特定时期在酵母细胞中称为起始点，哺乳动物细胞中称为限制点（R点）。 ?如环境适于细胞增殖则进入S期，不适合细胞增殖则细胞可能延迟通过G1期或者进入休眠状态。进入休眠状态的细胞蛋白质合成急剧下降（仅有正常的20%），这期细胞。 种细胞称为G
环氧合酶（cyclooxygenase ，COX ），又称前列腺素内过氧化物合成酶（PGHs ），有COX-1和COX-2两种同工酶，是前列腺素合成的关键限速酶，可催化花生四烯酸生成各种前列腺素和血栓素A 2（TX-A 2），从而产生种种生理病理作用。自从1976年COX 被发现，人们对它的认识不断更新，对COX 的研究和COX 抑制剂的开发都取得了辉煌的成果，为人类在解热、镇痛、抗炎等领域做出了重要贡献。本文对环氧合酶及其抑制剂的研究概况作一简要阐述。1环氧合酶 英国的John Vane 等（1971）首次阐明了NSAIDs 的作用机制：各种NSAIDs 起治疗作用的共同基础是通过抑制花生四烯酸代谢过程中的COX 活性，使前列腺素(PGs)合成减少，从而产生治疗作用[1]。Hemler 等（1976）分离得到具有催化活性的COX ，分子量为71kDa ，在细胞内质网内大量存在，后来的研究证实，这实际上就是COX-1。Needle-man 等（1990）发现，COX 的活性在人体单核细胞和大鼠巨噬细胞中的细菌样内毒素的刺激下大大增强，于是推测可能存在一种新的COX 蛋白质。Xie 等（1991）分离得到这种新的蛋白质，标记为COX-2。有研究发现COX-1存在一种变异型，标记为COX-3，主要存在于大脑皮质、心脏、主动脉，但它在人体内的作用机制与前两种同工酶不同，并不参与炎症过程，可能与血液中的NO 浓度有关[2,3]。 环氧合酶及其抑制剂的研究进展 陈君，罗永煌* （西南大学药学院重庆400715） 摘 要：环氧合酶的两种同工酶COX-1和COX-2既是结构酶又是诱导酶，都参与了机体的某些生 理和病理作用。目前已开发的环氧合酶抑制剂虽然有较好的解热镇痛等作用，但存在胃肠道或心血管等方面的不良反应，临床需根据病情合理用药。关键词：非甾体抗炎药；环氧合酶；抑制剂 Research Progress in Cyclooxygenase and its Inhibitors Abstract:Two isoenzymes of cyclooxygense COX-1and COX-2are both the constitutively expressed enzyme and inducible enzyme,involved in some physiological and pathophysiological responses in the body.Although the present COX inhibitors have good effectives in antipyretic and analgesic,there are adverse reactions of gastrointestinal or cardiovascular,we need to balance the individual risk-benefit.Key w ords:nonsteroidal antiinflammatory drug ；cyclooxygenase ；inhibitor Chen J un ，Luo Yonghuang * （College of Pharmaceutical Sciences,Southwest University,Chongqing,400715） 基金项目：重庆市科技创新能力建设（CSTC ，2009CB1010）作者简介：陈君，男，硕士研究生，专业方向：药理及毒理学。*通讯作者：罗永煌，男，教授，研究生导师，研究方向：新药 研发。
人前列腺癌细胞；LNCaP贴壁培养 细胞名称：人前列腺癌细胞；LNCaP 形态特性：上皮样；梭形 生长特性：贴壁生长 培养条件：RPMI1640(w/o Hepes)+10%FBS 传代方法：1:3~1:6传代；5~7天1次 冻存条件：细胞冻存液 特征特性： 该细胞由Horoszewicz JS于1977年从一名50岁的明确诊断为转移性前列腺癌的白人男性患者的左锁骨上淋巴结细针穿刺的活体组织中分离建立的。5-α-双氢睾酮可影响该细胞的生长和酸性磷酸酶的产生。该细胞不形成均一的单层而是成簇生长，所以传代的时候要反复吹打形成单个细胞；该细胞贴壁不牢，达不到汇合状态，而且会使培养基迅速变酸；传代后48h内一定要保持培养瓶静止。如果此时挪动培养瓶，会使大部分细胞从瓶底脱落。如果出现此种情况，需要重新孵育24~48h使细胞重新贴壁，细胞贴壁后可更换培养基。 细胞处理方法： 1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超 净台中操作。 2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5% 的CO2的温箱中继续培养。细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。 3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞 完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。 特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。 2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。 3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
环氧合酶 常用选择性环氧合酶一2抑制剂的临床研究进展 【摘要】选择性环氧合酶一2抑制剂具有较理想的抗炎镇痛作用，而且其不良反应较非选择性 NSAIDs明显减少，被广泛应用于治疗关节炎的疼痛和其他疼痛的治疗。本文对选择性环氧合酶一2 抑制剂如美洛昔康、尼美舒利、塞来昔布和帕瑞昔布等临床应用及不良反应进行评价。【关键词】环氧化酶～2抑制剂；临床评价；安全 Progression of clinical study on the selective cyclooxygenase一2 inhibitor GUO Li--zhi，REN Jin 1，li行．Department of Pharmacy．The Second Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000，China [Abstract]The selective cyelooxygenase。。2 inhibitor has good anti—。inflammatory and analgesic effect．and the adverse effects significantly diminish compared with non—selective NSAIDs．Therefore，it is widely used to treat the arthritic pain or other kinds of pain．In this paper， the clinical application and adverse drug reaction of such selective cyclooxygenase一2 inhibitors as meloxicam，nimesulide，eelecoxib and parecoxib were eval uated respectively． [Key word] Cyclooxygenase一2 inhibitor；Clinical Evaluation；Safety 非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是不含类固醇的甾体结构而具有抗 炎止痛和解热作用的药物，被广泛应用于治疗关节 炎的疼痛和其他疼痛的治疗，尤其对骨关节炎和风 湿关节炎有较好的疗效。其中的选择性环氧合酶一2 (cyclooxygenase一2，COX一2)抑制剂不仅具有理想 的抗炎镇痛作用，而且其不良反应较非选择性 NSAIDs明显减少，从而丰富了临床治疗的手段。 但个别COX一2抑制剂如万洛(Vioxx)在使用过程 中曾出现严重的心血管等不良反应，因此COX一2抑 制剂在临床应用时，应加强其上市后特别是不良反 应等安全性再评价口]。本文据此对该类药物的临床 研究进展进行综述，为临床用药提供参考。 作用机理 在病理条件下，各种组织细胞受到刺激后释放 花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，AA经由CoX 及脂氧酶(1ipoxidase，LOX)催化产生前列腺素 (prostaglandins，PGs)、血栓素(thromboxane， TXA)、白三烯(1eukotrienes，LTs)等生物活性物质
第十二章细胞增殖及其调控 主要内容 ●细胞增殖(cell proliferation)的意义 ●细胞周期与细胞分裂 ●细胞周期调控 细胞增殖(cell proliferation)的意义 ◆细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，是生物繁育的基础。 ◆单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。 ◆多细胞生物由一个单细胞(受精卵)分裂发育而来，细胞增殖是多细胞生物繁殖基础。 ◆成体生物仍然需要细胞增殖，主要取代衰老死亡的细胞，维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。 ◆机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等，都要依赖细胞增殖。 ◆细胞增殖受到严密的调控。 第一节细胞周期与细胞分裂 ●细胞周期(cell cycle)概述 ●有丝分裂(mitosis) ●胞质分裂(Cytokinesis) ●减数分裂(Meiosis) 细胞周期调控的主要研究内容 一、寻找与细胞周期调控密切相关的基因及其表达蛋白，研究它们在细胞周期中的动态变化及相互作用的规律。 二、这些基因和蛋白如何启动和影响细胞周期各时相发生的分子事件，进而影响细胞周期的表型。 三、内外环境因素是怎样通过细胞内信号传递系统影响细胞周期的。 第二节细胞周期的调控(Cell-Cycle Control) ●细胞周期调控系统的主要作用 ●细胞周期检验点(Cell Cycle Checkpoint) ●MPF ●Cyclin-Cdk复合物的多样性及细胞周期运转 ●细胞周期运转的阻遏(细胞周期运转的负调控) 一、细胞周期(cell cycle)概述 ●细胞周期 ●细胞周期中各个不同时相及其主要事件 ●细胞周期长短测定 ●细胞周期同步化 ●特异的细胞周期 二、有丝分裂(mitosis) ●前期(prophase) ●前中期(prometaphase) ●中期(metaphase) ●后期(anaphase) ●末期(telophase)
环氧酶2的药理作用 炎症： 各种损伤性化学、物理和生物因子激活磷脂酶A2，水解细胞膜磷脂，生成花生四烯酸，COX-2催化加氧其生成前列腺素（PG）。损伤因子诱导多种细胞因子合成，如IL-1、IL-6、IL-8等，这些细胞因子又能诱导COX-2表达，增加PG 合成。PG是炎症反应中一类活性较强的炎症介质，可扩张小血管，增加微血管通透性致组织水肿，与缓激肽等协同产生致炎作用，还可募集中性粒细胞，致热。而环氧酶2抑制剂通过抑制COX活性而减少局部组织前列腺素的合成，同时抑制某些炎症关键因子的的表达，达到抗炎的作用。 神经系统： 环氧酶 2 除参与外周炎症反应外，还可表达与内皮质、海马、杏仁核、下丘脑和脊髓等部位。它参与神经系统的许多生理和病理过程，如兴奋性神经元的突触传递、炎性过程、痛觉过敏和各种脑损伤(创伤性脑损伤、脑血管病和癫痫)过程，也参与神经交性病如阿尔茨海默病和帕金森病的病理过程等。其机制可能涉及增加前列腺素释放、增加氧化应激损伤、增强神经炎性反应、加重兴奋性氨基酸毒性,从而促进细胞凋亡。 肿瘤： COX-2具有环氧化和过氧化酶活性,它通过过氧化反应,激活环境及食物中的多种前致癌物,从而直接激活癌基因或引起抑癌基因突变而导致肿瘤的发生刺激肿瘤细胞的增殖与分化,促进肿瘤的发生。前列腺素对于肿瘤的新生毛细血管的形成及血管依赖性的实体肿瘤的生长和转移起重要作用，而环氧酶一2抑制药可阻断它，抑制血管生成。再者环氧酶一2的过高表达可抑制肿瘤细胞的凋亡，而环氧酶一2抑制药通过抑制环氧酶一2的过度表达，降低肿瘤组织中的BCL-2蛋白含量而诱导细胞凋亡。最后环氧酶．2抑制药可通过破坏白介素一10和白介素一12的平衡，对肿瘤的起到免疫抑制作用。 糖尿病： PGE2作为COX-2的产物之一，能抑制葡萄糖刺激胰岛素分泌，导致糖耐量减低；同时，COX-2作为炎性反应的介质，能降低人体对胰岛素的敏感性，造成胰岛β细胞功能障碍和退化。 肾脏： 前列腺素对肾功能的稳定具有重要的调节作用，COX-2及其mRNA的表达其部位涉及近曲小管、致密斑、髓拌升支厚壁、集合管及髓质问质细胞，其功能主要为钠的再摄取、肾素释放、血管紧张素Ⅱ的形成。而COX-2抑制剂可引发低肾素血症、低醛固酮血症和高血钾，其程度一般较轻，但严重时可致心脏停搏。胃肠道： 前列腺素作为局部激素对胃肠道具有保护作用，若COX-2受抑制，PG下降，则胃肠上皮粘液、重碳酸分泌、粘膜血流和上皮增殖均受到抑制，使粘膜对损伤的抵抗力下降，最终导致胃肠道粘膜损伤、溃疡、出血等。 干细胞： 促进干细胞分化。
细胞增殖调控基因水平cdc 基因① 蛋白水平周期蛋白结构 周期蛋白框：用于与CDK 结合 破坏框：参与泛素依赖性的cyclinA 和B 的降解 功能 核心部件几种周期蛋白CyclinD(D 1、D 2、D 3) 在G 1期起作用CyclinE 在G 1/S 过度起作用 CyclinA 在S 期起作用 降解：泛素和蛋白依赖途径被蛋白酶体降解 CyclinB 在M 期起作用 积累：G 1晚期开始合成，G 2期含量达到最大 降解：泛素和蛋白依赖途径被蛋白酶体降解 CDK(周期蛋白依赖性蛋白激酶)结构 PSTAIRE 序列：用于与周期蛋白框结合功能与周期蛋白结合，磷酸化各种底物，在G 2期进入M 期的中期起重要作用 活性调节抑制作用的酶weel/mik1激酶 活化作用的酶 CDK 活化酶(CDK1-activating kinase)过程（图①） 几种CDK 介绍CDK1与CyclinB 结合在G 2晚期达到最大值，磷酸化多种底物蛋 白，促进染色质浓缩，核纤层解聚，核仁解体 APC(后期促进复合物)功能 促进驱动蛋白在极微管上的结合，是细胞周期由分裂中期向后期转换的关键 APC 活化，导致M 期蛋白降解，M-CDK 活性丧失 活性调节正调控因子 cdc20位于染色体动粒上，是姐妹染色单体分离所必须的 M 期CDK 激酶 负调控因子：Emi1、Emi2、Mad2、BubR1 与cdc20结合，抑制其活性，从而抑制APC 的活化，Mad2消失后才解除抑制 MPF(卵细胞成熟促进因子) 周期蛋白p45与CDKp32结合的蛋白，促进细胞分裂G 1/S 期转化(下图) S/G 2/M 器转换与DNA 复制检验点（略）
新型选择性环氧合酶-2抑制剂的研究 摘要：目的探究新型选择性环氧合酶-2抑制剂的应用。方法随机选取在2015 年1月至12月期间，我院收治的需要使用环氧合酶-2抑制剂药物的患者作为研 究对象，通过对患者进行用药频度（DDDs）、日均费用（DDC）等方法进行研究，从而对新型选择性环氧合酶-2抑制剂的应用进行研究和分析。结果在2015年1 月至12月期间，我院环氧合酶-2抑制剂的使用数量和销售金额处于逐渐上升的 趋势，并且新型选择性环氧合酶-2抑制剂的使用量大幅度增加，占有主导地位。 关键词：环氧合酶-2抑制剂；用药分析；用药研究 环氧合酶-2抑制剂是一种非甾体抗炎药物（NSAID），具有抗炎、镇痛、解热、抗风湿的作用，其主要的作用方式是通过抑制炎症细胞的花生四烯酸代谢物 环氧合酶，从而降低体内炎症介质—前列腺素、血栓素等的含量，达到抗炎、镇痛、解热的作用。环氧合酶- 2抑制剂的镇痛作用良好，并且不会产生胃肠道反应，所以在临床应用中取得了良好的效果。本篇文章的主要目的是探究新型选择性环 氧合酶-2抑制剂的应用，选择在2015年1月至12月期间，我院收治的需要使用 环氧合酶-2抑制剂药物的患者作为研究对象，并通过基础实验的方法对环氧合酶- 2抑制剂的使用情况进行统计和分析，从而为临床合理用药提供有价值的依据。 1、资料与方法 1.1资料来源 随机选取在2015年1月至12月期间，我院收治的需要使用环氧合酶-2抑制 剂药物的患者作为研究对象，通过对患者进行用药频度（DDDs）、日均费用（DDC）等方法进行研究，主要包括患者使用的药物名称、规格、包装、单价、 应用数量和销售金额等等，我院使用的环氧合酶-2抑制剂药物主要包括美洛昔康片、双氯芬酸钠双释放肠溶胶囊、双氯芬酸钠缓释片、塞来昔布胶囊，从而对新 型选择性环氧合酶-2抑制剂的应用进行研究和分析。 1.2实验方法 通过金额排序和限定日剂量（DDD值）分析法对患者进行用药频度（DDDs）、日均费用（DDC）等方法进行研究，将采集的数据通过Excel进行分类、合并、统计、排序，从而进行进一步的分析。 1.3统计学分析 运用SPSS14.0软件对数据进行处理。将实验结果的检验标准设置为0.05，也 就是当P＜0.05时，说明实验结果具有统计学意义差异。对于计量数据使用t检 验方法进行验证，对于计数资料，采用卡方检验进行统计。 2、结果 在2015年1月至12月期间，我院环氧合酶-2抑制剂的使用数量和销售金额 处于逐渐上升的趋势，并且新型选择性环氧合酶-2抑制剂的使用量大幅度增加， 并占有主导地位。 3、讨论 3.1环氧合酶-2抑制剂药物 随着现代社会发展速度的加快，不规律的生活导致人们出现肿瘤、炎症、免 疫力下降等疾病的几率在不断提升，另外环氧合酶-2抑制剂有镇痛、抗炎、解热、抗风湿和抗动脉粥样硬化以及治疗阿尔茨海默病的作用。
问答题 1.细胞分裂间期的各时期发生有哪些主要事件？ 期调控中的作用机制与意义。 2.请简述P53蛋白在G １ 3.简述基因表达的调控机制。 4.试述细胞进入M期的调控。 5.细胞增殖的调控因素有哪些？它们是如何调控细胞增殖的。 6.细胞周期调控蛋白有哪几种？它们在细胞周期调控中是如何发挥其功能的？ 7.简述Cyclin-Cdk的组成与作用? 8.什么是成熟促进因子MPF，有何作用？ 9.细胞周期中有哪些主要检查点？细胞周期检查点的生理作用是什么？ 10.何谓细胞周期检查点？它有何作用？ 11.简述分化细胞的特点。 12.为什么说细胞分化是基因选择性表达的结果？ 13.什么是基因的差别表达？在细胞分化中有什么作用？ 14.什么是细胞决定？与细胞分化的关系如何? 15.以血细胞为例，简要说明细胞分化潜能的变化。
参考答案 二、问答题 1.细胞分裂间期的各时期发生有哪些主要事件？ 细胞增殖周期是细胞从一次分裂结束开始，到下一次分裂终了所经历的全过程，可分为间期和分裂期。与分裂期细胞的急剧而明显的形态变化相比，间期细胞的形态变化不明显，但其间进行着比较复杂的化学变化。间期细胞最显著的特征就是进行DNA的复制，其次就是进行RNA和蛋白质的合成。根据DNA的合成情况，又可把间期分为DNA合成前期(G l 期)、DNA 合成期(S期)、DNA合成后期(G 2 期)。 其中G l 期非常重要，G l 期的限制点(R点)是控制细胞增殖的关键，决定了细胞的3种不 同命运：①继续增殖细胞，细胞通过R点，连续进行增殖，始终保持旺盛的增殖活性，能量代谢和物质代谢水平高，对外界信号高度敏感，分化程度低，周期时间较为恒定；②暂不增殖细胞，细胞长时间地停留在G l 期，合成大量特异性的RNA和蛋白质，在结构和功能上发 生分化。随后，代谢活性下降，处于细胞增殖的静止状态(G 期)，但并没有丧失增殖的能力，在适宜的条件下被激活成增殖状态；③不再增殖细胞，细胞丧失了增殖能力，始终停留在 G l 期，结构和功能上发生高度分化，直至衰老死亡。细胞越过R点后，就加速合成DNA复制所必须的各种前体物质和酶，同时，DNA解旋酶和DNA合成启动因子也急剧增加，为进入S 期DNA复制作准备。 S期最主要的特点是DNA复制和组蛋白、非组蛋白等染色体组成蛋白质的合成，通过DNA 复制精确地将遗传物质传递给M期分裂的子细胞，保证遗传性状的稳定性。因此，S期是整个细胞周期中最关键的阶段。 G 2 期中加速合成RNA和蛋白质，其中最主要的是合成有丝分裂因子和微管蛋白等有丝分裂器的组分，另外细胞成分如磷脂的合成增加并进行ATP能量的积累，为有丝分裂进行物质和能量准备。 总而言之，有丝分裂间期主要是细胞积累物质的生长过程，只有缓慢的体积增加，形态上看不到明显的变化，但其间进行着旺盛的细胞代谢反应，进行DNA的复制、RNA和蛋白质的合成，为有丝分裂作准备。 2.请简述p53蛋白在G１期调控中的作用机制与意义。 G1期是从分裂完成到DNA复制前的时期，又叫合成前期。合成rRNA、蛋白质、脂类和 糖类。在末期，DNA合成酶活性增加。G l 期非常重要，存在于G1晚期的G1/S检查点是控制细胞增殖的关键，在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？ 在G1期检查点监视到DNA损伤时，损伤修复机制使p53蛋白被磷酸化而激活，活化
环氧合酶-2与肿瘤关系的研究进展（作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：贾志勇王家宏王莹赵艳飞 【关键词】环氧合酶-2 肿瘤研究进展 环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是参与花生四烯酸的环氧酶代谢途径中的限速酶,可催化花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandins,PGs)。过去认为哺乳动物的COX有两种异构酶COX-1和COX-2。COX-1是一种结构型酶,在正常组织中表达;COX-2是诱导型酶，正常生理状态下表达甚少，而在各种刺激因子存在时表达增加。近年来研究显示，COX-2在一些肿瘤中存在过度表达现象，提示COX-2可能与肿瘤的发生发展密切相关。现就COX-2的结构与生物学功能及与肿瘤发生发展的相关性研究进展综述如下。 1 环氧化酶的种类 环氧化酶(cyclooxygenase,COX) 是一种完整的膜结合蛋白,它是参与花生四烯酸(AA)转化为各种内源性前列腺素(PGs)过程中重要的限速酶。过去认为COX有两种亚型,即COX-1 、COX-2，最近研究表明还存在COX-3，它是新发现的COX-1的同工酶，在细胞中以诱导的方式表达，是中枢神经系统和其他组织中COX-IRNA的剪接变体
[1]，其作用还有待于进一步研究。 2 COX-2的生物学特性与功能 2.1 COX-2的生物学特性 COX-2是一种诱导酶，在正常状态下，在大多数组织中不表达，COX-2 表达的因素可存在细胞内外,如各种因子(EGF、PDGF、TGF), 细胞因子(IL-1 、TNF-α)、内毒素、高脂饮食、致癌剂、癌基因、病毒癌基因产物以及紫外线等。一般情况下，当刺激作用于细胞，30 min后即可测到COX-2 mRNA的表达，诱导产生的COX-2的量随细胞类型不同而改变，随着COX-2 mRNA的产生，有大量的COX-2蛋白及其代谢产物合成。生理状态下，COX-2蛋白在大多数组织中测不到，仅在肾和脑的部分组织中可见。 各种刺激因素有各自不同的胞内信号传导系统且具有组织特异性,如紫外线可以通过激活P38MAPK使COX-2过表达,5-HT可通过PKC 途径以及钙依赖性激酶诱导COX-2的表达[2],COX-2促进炎症细胞PG 的合成，与蛋白酶及其他炎症介质一起引起炎症反应，并参与肿瘤的发生、发展。 2.2 COX-2的功能 COX-2具有两种酶的活性:一是环氧化酶的作用,将花生四烯酸转化为前列腺素G2(prostaglandin G2,PGG2);二是过氧化物酶的活性, 将PGG2 转化为前列腺H2(prostaglandin H2,PGH2)。研究发现COX-2还具有其他功能,COX-2水平上调伴有NF-κB激活,NF-κB激活后移位于细胞核内,诱导基因进行转录[3]。 3 环氧合酶和前列腺素 COX-2是前列腺素合成过程中的一个关键限速酶,其过度表达可