11-3 身引法合cDNA 链
片段I
(转载)BAC文库构建技巧 (2011-07-21 09:39:20) 基因组DNA文库构建实验技巧 基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DNA（gDNA） 毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA 的纯度。 二、处理基因组DNA 根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA 片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。 构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。 需要注意： （1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。 （2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA 会显著降低克隆效率。解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号， 然后以此为参考定位所需的片段。 （3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。 三、载体的选择
基因工程中为什么要建立基因文库？基因文库是如何建立的？ 基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 目的：当我们要对某一基因结构和功能进行研究时，首先要获得此基因，最简便的方法就是直接从基因文库中获取。 构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到载体中，从而获得含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组文库。 打个比方让你建图书馆，你就得把所有书分门别类放，以便于找。这么多书你一个人又搞不定，所以你得找一群人，一个人负责一部分，各自干各自的，然后最后一汇总就行了。 基因组文库和cDNA文库 一.基因组文库 用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。这样的一套克隆便称作基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库(genomic library)。 二.cNDA 文库的构建及应用 cDNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码
序列的一群克隆。与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA 为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低。 随着分子克隆研究在理论和技术上的进步，cDNA 基因文库的构建不仅是分离基因的重要手段，也是当前真核分子生物学研究的强有力工具。首先，在基因工程的操作中，以cDNA为探针可从基因组文库中分离出相应的特异基因；其次，cDNA序列只与基因中的编码序列有关，有助于对真核生物mRNA结构和功能的认识；再者，cDNA 克隆还可以有效地分析真核基因的结构和功能。 cDNA文库（cDNA library)：指只包括在特定组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的所有的基因序列。 基因组文库(genomic DNA library)：指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA所有的序列。
基因组DNA测序文库构建 1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含 RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。 对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。 对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。 2.用Qubit检测DNA样品浓度。 3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间， 体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。 4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。 6.修平和磷酸化 100ul体系
DNA 1ug 5 X T4 polymerase buffer 20ul BSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm) 1ul dNTP（10mm）10ul T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul Klenow（10U/ul）1ul T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul 22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 7.加‘A’ 100ul体系 DNA 0.5-2.5ug 10 X klenow buffer 10ul dATP(10mm) 1-3ul Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul 37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 8.连接头 200ul体系 10 X T4 DNA ligase buffer 20ul PEG4000 30ul ATP(100mm) 2ul DNA X 接头 Y T4 DNA ligase 1.5-2ul 加水至 200ul DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。 9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。 10.PCR扩增 10 X TagE buffer 5ul Mg2+ 4ul dNTP(10mm) 1ul lib-PCR-F 0.5ul
一. 基因组文库的构建和应用研究进展 随着后基因组学时代来临，克隆、研究并利用生物的重要基因、研究它们的结构、功能和进化已经成为遗传学领域的热点之一。和原核生物相比，真核生物基因组结构复杂，研究起来较为困难。随着大片断DNA克隆技术的发展核完善，构建真核生物大片断DNA的基因组文库，并以之为平台进行基因组序列测定、物理作图、基因分离、以及基因结构核功能的分析等研究，已经成为真核生物基因组研究中行之有效的方法[1]。 基因组文库是指含有某种生物全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。这个文库象是一个贮存有基因组全部序列的信息库，故称为基因组文库（genomic library），又称为人工构建的基因“活期储蓄所”（genomic bank）。人们既可以通过基因组文库的构建、贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，同时又能够在必需时从基因组文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因[2]。 1 基因组文库的产生和发展 克隆载体作为基因组文库构建的重要媒介，提高其容纳量一直是重要发展方向之一。自1973年Cohen构建了第一个质粒载体pS101以来，越来越多的克隆载体相继出现，使得克隆载体的整体结构和克隆效率有了很大改善。载体的发展大致经过三个阶段：第一代是以λ噬菌体和粘粒为代表的载体；第二代的代表为YAC （yeast artificial chromosome）、BAC（bacterial artificial chromosome ）及PAC （P1-derived artificial chromosome）；第三代为BIBAC（binary BAC）及TAC （transformation –competent artificial chromosome）为代表的新型文库载体，不仅具有第二代载体的所有特征，而且具备了植物的转化功能[3]。 1.1 第一代载体 λ噬菌体是最早使用的克隆载体，其插入片断仅20 kb左右[4]。1979年Royal 等确定了在粘粒（Cosmid）载体中克隆大片断的可能性[5]。此后粘粒载体用于构建果蝇、小鼠、人等基因组文库，并从这些文库中成功分离得到基因。肺炎支原体基因组全序列的测定就是粘粒文库的基础上完成的[6~8]。粘粒是用包含λ噬菌体cos位点的质粒。载体长4～6 kb，平均插入一般为40 kb左右。重组的粘粒可承载
基因组DNA文库构建的基本流程 日期：2013-03-07 来源：网络标签：载体DNA文库文库构建 摘要: 基因组DNA文库构建的基本流程是什么？基因组DNA文库构建有哪些步骤？基因组DNA文库构建有哪些实验必备技巧？基因组DNA文库构建有哪些注意事项？相信一下内容给你个清楚的解答。 基因组DNA 文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DNA(gDNA) 毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。 二、处理基因组DNA 根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体(比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM)，合适的片段长度大约为40kb;对于BAC载体(比如Ep ICE ntre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM)，平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。 构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA;接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率;然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的dna片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶(常用EcoR I、BamH I或者Hind III)来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段(比如100kb-150kb)，随后透析回收DNA。 需要注意： (1)电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。 (2)电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA会显著降低克隆效率。解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，然后以此为参考定位所需的片段。 (3)回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。 三、载体的选择 目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体(P1人工染色体)、BAC 载体(细菌人工染色体)和YAC载体(酵母人工染色体)。选用何种载体可以参考如下几个因素： 1.目标区域的大小 如果基因组的目标区域很小(小于50kb)，那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。 如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。
cDNA基因文库的构建 2009-10-11 17:56:18| 分类：生命科学|举报|字号订阅 一、cDNA文库的特征和发展： cDNA (complementary DNA):以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的DNA链(单链cDNA，反义链)，以单链cDNA为模板还可以合成 其反向互补链(取代mRNA的DNA链，正义链)，得到双链cDNA。 将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合 成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。 1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。 2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。 3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。 4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。 二、cDNA文库的构建： 1、RNA的分离 mRNA是构建cDNA文库的起始材料。总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪，平均为2%，mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。1）根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件，用于提取RNA。 2）保持mRNA的完整性，是构建全长cDNA文库的核心。 3）选取合适的提取方法，除完整性外，mRNA还要求纯度高、DNA污染少， 最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。