评述与进展
蛋白质分子荧光探针研究及其应用新进展
陈蓁蓁 张宁 张文申 唐波*
(山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250014)
摘 要 人体中多达10万种以上的蛋白质结构,功能千差万别,形成了生命的多样性和复杂性。在分子水平
上分析和识别蛋白质对生命科学研究具有重要的理论和实践意义。本文综述了各种蛋白质分子荧光探针在
蛋白质分析方面的应用,并展望了此类荧光探针的发展趋势和应用前景。引用文献60篇。
关键词 蛋白质,荧光探针,综述
2006202220收稿;2006204229接受
本文系国家自然科学基金项目(20335030,20575036)、教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET 20420651)及山东省自然科学基金重点项目(Z2003B01)资助
1 引 言
对蛋白质进行定量分析和特异识别探讨生命机理是十分重要的。蛋白质溶液构象、蛋白质与小分子或生物大分子相互作用等结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制,对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。
蛋白质的分子光谱分析方法按仪器原理的不同,可以分为分光光度法、荧光分析法、化学发光法和光散射分析法等,其中荧光分析法因其具有灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境的优点而在蛋白质分析中应用广泛。荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究溶液中蛋白质高灵敏度的分析方法[1]。
蛋白质分子荧光探针按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外荧光探针。紫外可见区的荧光探针如香豆素、荧光素、罗丹明类分子等因具有较高的量子产率而常被用于制备荧光底
物[2~4]。近年来以菁类、口恶嗪类为代表的近红外荧光探针[5,6]发展迅速,其优点在于散射光弱、背景干扰
低,低激发能量减小了光漂白,使用近红外激光器提高了灵敏度,因而特别适合用于生物样品的测定。按探针与蛋白质的结合方式可分为共价键结合式和非共价键嵌入式,共价键结合的标记物比由非共价嵌入式所得复合物更稳定。按探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent)和荧光生成试剂(fluori 2genic)。为了降低检出限,提高检测灵敏度,常用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对蛋白质进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的物质。此外,荧光共振能量转移(FRET)探针也在蛋白质结构、功能研究中得到广泛应用。本文主要就近年来以上常见蛋白质分子荧光探针的结构特性和与蛋白质的作用方式及其在蛋白质分析方面的应用进展作简要综述,并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。2 紫外可见区的荧光探针
紫外区的分子荧光探针在蛋白质的结构和功能研究中应用较少。因短波长激发光能量较大,易对被标记生物分子造成光损伤。当用紫外光激发时,许多细胞及组织产生背景光吸收和自身荧光(autofl u orescence),会对探针荧光产生干扰。但是,对于包含免疫荧光、核酸及蛋白质芯片等多波长荧光分析应用来讲,短波长蓝光能够提供对比色,使得能较容易从其它长波发射的荧光探针中分辨出来。可见区的荧光探针具有较高的摩尔吸光系数和荧光量子产率,结合光漂白后荧光恢复(FRAP)、荧光偏振(FP)、荧光相关光谱(FCS)、荧光共振能量转移(FRET )等技术使得它们成为蛋白质构象、结构性能以及蛋白质相互作用研究的极佳探针。
第34卷
2006年9月 分析化学(FENX IHUAXUE) 评述与进展
Ch i nese Journa l of Ana l yti ca l Chem istry 第9期
1341~1347
1342分析化学第34卷
2.1香豆素类
大多数的香豆素荧光染料为黄色,产生绿色荧光。但香豆素的母体结构是无色的,且无荧光。取代后的香豆素衍生物,特别是给电子基团的取代,将增加其荧光量子产率。常见的取代基是7位上的羟基、烷基、烷氧基及烷氨基。实验证明,在3位和4位上引入吸电子基团,将导致吸收和发射光谱向长波方向移动。
N aka mura等[7]合成了9种42氨甲基272烷氧基香豆素衍生物(K ex=390nm,K em=480nm),并用作人体肝脏微粒体重组细胞色素P4502D6的荧光探针,P4502D6是参与人体药物代谢的末端氧化酶,在该酶的脱烷作用下,荧光底物会通过反应产生具有强荧光的72羟基香豆素,从而建立了快速、高通量检测细胞色素P4502D6的分析方法。Photocagi n g荧光探针分子已逐渐成为重要的研究手段[8,9]。探针分子本身无荧光或荧光很弱,在紫外可见光照或有酶的作用下保护基团离去,使得发色团本体结构恢复,伴有荧光成百倍的增长。近来香豆素也较多的被用来设计成此类探针分子[10],经光转换后荧光增强200倍,较好地克服了光漂白问题,并成功用于H ela细胞的荧光成像。
2.2芘类
芘是一种研究介质极性的荧光探针,其I3/I1(荧光发射第三谱带与第一谱带强度之比)与介质极性有较好的相关性。由于芘的激发单线态可以和基态芘分子碰撞形成激基二聚体,此二聚体在480nm 处有较强的荧光[11],常用来测定蛋白质溶液的构象变化。
陈凯等[12]采用时间分辨荧光光谱等手段研究了手性探针分子L2[42(12芘基)]丁酰基苯丙氨酸(PLP)与溶菌酶(Lys)、血清白蛋白的结合过程及机理。结果表明,PLP与血清白蛋白的结合方式是芘基端包埋在血清白蛋白内部的疏水空腔中,使结合后的PL P分子中的芘基由水相包围转移到疏水空腔中;而PLP与溶菌酶的结合方式是其中的芘基结合在溶菌酶分子表面的疏水部分,使结合后的PLP仍然被周围的水相所包围。
在某些条件下蛋白质可能发生聚集,蛋白质聚集对细胞往往是有害的,甚至引发疾病。因此,蛋白质聚集的固有性质和其危害性成为蛋白质研究的一个热点。牛血清蛋白(BS A)与人血清蛋白(H S A)结构类似,在胁迫条件下有聚集趋向。Brahma等[13]用马来酰胺衍生化芘试剂作探针研究了BS A的二聚行为,发现cys234残基位于0.6n m深的缝隙中,此区域对蛋白质二聚起着至关重要的作用。
2.3萘类
2.3.1萘磺酸类维持蛋白质的三级结构最重要的作用力是疏水基的相互作用,疏水作用对蛋白质的稳定性、构象和蛋白质功能具有重要意义。82苯胺基212萘磺酸(ANS)是所用疏水探针中应用最广泛的探针,它通过非共价结合到蛋白质分子的非极性区域中时,荧光强度大为加强,最大吸收/发射在375/500nm,在一定范围内,荧光强度与蛋白质的浓度呈线性关系。有研究表明,ANS在人血红蛋白中心空腔2DPG2结合位点与蛋白质非共价结合[14];W illi a m[15]比较了其同系物12苯胺基萘和12氨基282萘磺酸与小肠型脂肪酸结合蛋白I2FABP非共价作用后荧光光谱的异同,探讨了探针与蛋白质的结合机理。其它疏水探针如22P2甲苯胺基萘262磺酸(T NS)[16,17]、双82苯胺基212萘磺酸(b is2ANS)[18,19]的荧光性能较ANS稍弱。但利用其对周围介质极性敏感的特性,在蛋白质结构研究中也有所应用。
Zhang等[20]将52{[((22碘代乙酰)氨)乙基]氨基}萘212磺酸(I A ED ANS)标记在腺苷酸激酶AK的活性位点上以修饰Cys225,修饰后酶活性大大减弱,可检测到活性位点失活后构象变化;修饰后AK与其单克隆抗体Mc Ab3D3的结合能力不变,但标记物荧光猝灭。将修饰后AK与其确定构象的单克隆抗体结合有助于AK的折叠动力学研究。
2.3.2萘的衍生物苯磺酸类荧光探针属于阴离子型荧光探针,在蛋白质疏水性测定中无法避免静电作用的干扰。A liz adeh2Phsdar等[21]采用了不带电荷的溶剂敏感性探针62丙酰基222(N,N2二甲胺基)萘(PROD AN)来测定蛋白质表面疏水性,从而避免了静电作用对疏水性测定的影响。PRODAN作为荧光探针的优点还在于它可以用于测定p H值范围广泛的蛋白质表面疏水性[22]。22(N,N2二甲胺基)62萘酰基242反环己酸(D ANC A)与PROD AN结构类似,具有较大而明确的激发态偶极距。Lasagna等[23]用PROD AN和DA NC A作荧光探针研究了辣根过氧化物酶的血红素结合部位。
2.4 荧光素类
荧光素的量子产率高,最大吸收/发射在492/525nm,由于量子产率高,大量的荧光素衍生物被合
成并用作荧光检测试剂[24]。将荧光素共价连接到药物、蛋白质及其它生物活性分子上来合成探针,可
用于蛋白质、酶的检测及药物筛选等研究领域。基于蛋白质构象改变以合理设计生物传感器近年来成为蛋白质研究热点[25]。Chan 等[26]改变了传统选择异构酶构筑生物传感器的方法,用荧光素衍生试剂标记在E166C 突变株的166位半胱氨酸残基上,被标记的E166C 在中性水溶液中荧光极弱,随抗生素浓度变化荧光强度逐渐增大,从而建立了利用酶传感器灵敏检测抗生素的方法。
临床发现许多癌细胞对化学疗法(Che motherapy)有很好的天然防御系统,主要原因是肿瘤细胞对药物的耐受,产生耐药性的肿瘤细胞不仅对使用过的抗肿瘤药物产生耐受,而且对多种未曾使用过的结
构和作用机制不同的药物也产生耐受,这种现象称为多药耐药性。Corbin 等[27]用荧光素衍生化试剂
2c ,7c 2二(22羧乙基)25(6)2羧基荧光素(BCECF)作为探针研究了细胞表面多药耐药基因MD R 的表达产物)))P 2蛋白(P 2gp)、多药耐药相关蛋白MRP 及乳腺癌耐药蛋白BCRP 的耐药机制,对新型抗癌药物的开发研制具有一定的理论指导作用。
蛋白质活性等细胞内分子表达活动对深入细致地理解生物活体活动过程具有至关重要的意义。Pellois 等[28]以荧光素和偶氮类荧光猝灭试剂Dabcyl(Dab)构筑了S mad2荧光猝灭体系,笼型体系的光解导致蛋白活性和荧光的同时恢复并以荧光强度表达蛋白质活性;可用于研究信号转导分子S m ad2及其转化生长因子T GF 2B 的动态行为和信号传导动力学。
2.5 罗丹明类
罗丹明类最大吸收/发射在496/520nm,与荧光素类衍生物相比具有更强的光稳定性,更高的荧光量子产率以及更低的p H 敏感性。罗丹明类荧光探针极为适合于标记寡核甘酸,因为蛋白质会引起大多数罗丹明类荧光猝灭,故大多数不适宜用于标记蛋白。但近年以罗丹明类作为底物研究蛋白质、酶类引起了广泛关注。
溶酶体中包含大量的蛋白酶,G l u nde 等[29]合成了一种用于活体或体外无创标记溶酶体的荧光探针)))6c 2O 2丽丝胺2罗丹明B 2葡萄糖胺,该探针对细胞无毒性,与溶酶体中蛋白酶作用表现强荧光。研究不仅有助于理解溶酶体在细胞内的作用,而且对溶酶体类疾病机理探究如溶小体储积症也有所帮助。
当浓度高达一定程度时,罗丹明会在溶液中形成二聚体而导致荧光猝灭,这是罗丹明类探针特有的性质[30]。此特性在肽酶活性的研究中被充分利用,Black m an 等[31]在包含10个氨基酸残基的短肽的C c 和N c 各标记上四甲基罗丹明探针分子,当有酶原存在时,肽链被选择性切断,罗丹明荧光恢复,从而特异性识别酶原Pf S UB 21,并可用于高通量筛选分析酶原抑制剂。
利用酶对荧光底物的特异性识别并作用产生强荧光这一特性,Chandran 等[32]设计了结构巧妙的罗丹明110衍生荧光探针底物。罗丹明3c 及6c 位上的氨基被邻羟基肉桂酸基取代形成内酯结构导致荧光猝灭,在酯酶的作用下,酯基发生水解,取代基形成稳定的内酯形式,罗丹明110荧光恢复。探针与同为检测酯酶的荧光素二乙酯相比,具有较强的稳定性并可用于H e la 细胞中具有高酯酶活性的脂质体、胞液等亚细胞区的观测。
2.6 BO DIPY 类
BODI PY (dipyrr o m et h eneboron difl u ori d e ,氟化硼络合二吡咯甲川类化合物)在荧光光谱区域内T 2T 吸收弱,具有摩尔吸光系数大(l g E max >4.8(mol/L)-1c m -1),p H 值、溶剂对荧光影响小,光稳定性强以及发射波谱窄的优点。B OD I PY 类染料已被广泛用于核酸、脂肪酸、磷脂、蛋白质以及各种受体研究,还可用于荧光共振能量转移探针。
用荧光标记的探针进行活细胞成像目前已发展成为生物学研究最重要的技术之一,在选择位点有效标记蛋白质是该技术应用中的瓶颈。生物荧光蛋白是此类研究的有力工具,但存在荧光蛋白分子量大,立体位阻大以及蛋白质2蛋白质相互作用会产生干扰等问题。Kuh l m ann 等[33,34]
合成了BODI PY 2TR 及BODIP Y 2FL 标记的鼠肉瘤/半合成0蛋白质(se m isynthetic ras 2prote i n ),在蛋白质的注射浓度仅有10L mol/L 时也能得到PC12细胞清晰的荧光镜像,该技术在医药化学研究领域具有潜在用途。1343第9期陈蓁蓁等:蛋白质分子荧光探针研究及其应用新进展
1344分析化学第34卷
蛋白质的折叠是研究的热点之一,但关键问题是缺乏有效的方法将探针标记在生物大分子的确定位点处。Duan等[35]利用D ixon转氨反应,将蛋白质的N2端修饰成邻二羰基,并与BODI PY2FL偶联,对蛋白质N2端进行了特异性标记。利用这种标记方法结合D DE M荧光检测技术,研究了具有分子伴侣活性的DsbC二聚体蛋白在变性条件下的解折叠行为。这一工作为其它二聚体蛋白分子的N2末端构象变化研究提供了一种新的分析方法,拓宽了荧光光谱学的应用范围。
3近红外区的荧光探针
在近红外(K e m>600n m)光区,生物体自吸收或荧光强度很小;由于散射光强度与波长的四次方成反比,近红外区的散射干扰也大为减少;近红外荧光染料摩尔吸光系数大,Stokes位移显著,热力学、光化学稳定性强,耐猝灭。近年来,以结构紧凑、稳定性好、价格低廉的二极管激光器为基础发展起来的近红外荧光标记及检测技术的灵敏度得到较大提高,已用于免疫分析中荧光法检测生物活性物质等方面;近红外光还可以穿透皮肤和肌体组织,在药物筛选、临床诊断中也有使用价值。随着激光荧光、传感器、免疫检测装置的建立,近红外荧光染料在蛋白质等生物分析中显示出其优越性。
3.1花菁类染料
花菁染料的摩尔吸收系数大,荧光发射波长范围宽,一般在600~1000nm的近红外区。与半导体激光器匹配,可用于聚合酶链反应(PCR)检测及抗体免疫分析等。近红外花菁染料共价标记具有特异性、标记更稳定、贮存期长的优点,在生物成像等生物技术及医药研究中应用广泛[36,37]。
Caspase21(白介素21B转换酶)属于半胱氨酸蛋白酶,是引起细胞凋亡的关键酶,一旦被信号途径激活,能将细胞内的蛋白质降解,使细胞不可逆的走向死亡。Messerli等[38]合成了N端为Cy5.5修饰的肽底物荧光探针,并将该探针通过C端的半胱氨酸残基共价结合在生物兼容性较好的聚2L2赖氨酸上。当Caspase21作用于该探针的时候,天冬氨酸2谷氨酸酰氨键断裂,荧光恢复。探针对Caspase21选择性好,可用于生物活体Caspase21活性检测,从而进行细胞凋亡的预测。
水溶性花菁类荧光探针在生物活体不同生理条件下仍具有较高的量子产率和稳定性,Pha m等[39]将磺酸基引入花菁结构以提高其水溶性,避免了羧基的存在而引起的蛋白质/肽链的交联;Ye等[40]合成了系列多共轭端基为羧基的花菁染料。由于近红外荧光发射避免了生物基体的背景干扰,以上探针均被成功用于小鼠活体癌病灶荧光成像检测。
3.2方酸菁类
方酸菁染料是由方酸和一些电子给体化合物发生缩合反应生成的一类1,3双取代衍生物[41]。取代衍生物通常是吡咯、吲哚、苯胺等基团,其结构类似于花菁染料,不同的是它的分子结构中心由方酸连接。方酸菁上存在的方酸环残基使其最大吸收波长和发射波长向长波方向移动,并可增加其富电子性,稳定方酸菁结构。对称或不对称型方酸菁与血清蛋白、乳球蛋白、胰蛋白酶原以非共价结合后,荧光量子产率和荧光寿命都有显著增加[42],表明此类方酸菁染料是很好的蛋白标记物。以噻吩或芘作为间隔链合成的双方酸菁探针[43]与BS A、H S A可形成1B1复合物,荧光强度大大提高。
3.3噻嗪和口恶嗪类染料
目前常用的噻嗪和口恶嗪类染料探针主要有亚甲基蓝(methylene b l u e,MB)、尼罗红(n ile red)和尼罗蓝(N ile b l u e)及其类似物等。亚甲基蓝是一种具有平面结构的碱性生物荧光探针,在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史。口恶嗪类染料在水中溶解度较小,最近出现了一种新型可溶性口恶嗪类荧光探针,9位上的胺基末端为两个磺酸基,使尼罗蓝衍生物水溶性大大提高;荧光波长发生红移(K e m=680n m),荧光强度是尼罗蓝的10倍。3位氨基共价键合氨基酸后,可检测胰岛素酶、亮氨酸氨肽酶等水解蛋白酶的活性[44]。尼罗红类荧光探针受溶液极性影响较大[45],如尼罗红衍生物氨基吩口恶嗪马来酰胺(AP M)就被检测蛋白质中氨基酸残基微环境的变化[46],并可望用于钾离子通道构象变化研究。
3.4其他近红外荧光探针
发射波长在可见区的荧光素、罗丹明、B OD I PY等探针都有其近红外荧光发射衍生物。近年来,科学家们在利用此类探针进行蛋白质构象、酶的活性分析研究中取得一定成果。萘荧光素荧光激发发射
峰分别位于595和660nm 处,Yeo 等[47]将萘荧光素修饰后标记于蛋白质N 端半胱氨酸上,酯化的萘荧
光素进入细胞后被酯酶水解能产生强荧光。罗丹明类染料中常用作近红外探针的化合物是罗丹明
800、德克萨斯红。M iller 等[48]利用新型探针德克萨斯红2甲氨蝶呤非共价标记蛋白,通过全内反射荧光
成像手段研究了该探针与活细胞中二氢叶酸还原酶的结合作用。罗丹明800在蛋白质检测中也有应用[49,50]。Zhao 等[51]合成了一种荧光发射波长在751nm 的BOD I PY 荧光探针,具有量子产率高、激发发射谱带窄、光化学物理稳定性高的优点而有望用于生物传感技术研究中。
4 荧光共振能量转移(FR ET)探针
荧光共振能量转移(FRET )是比较分子间距离与分子直径的有效工具。FRET 对距离和荧光基团的空间取向有高度敏感性,可以通过荧光能量转移效率的测量,观察生物分子间相互作用的改变情况,研究各种涉及分子间距离变化的生物现象,在蛋白质2蛋白质相互作用研究、酶活性分析等方面有很重要的应用。FRET 发生的基本条件是:供体D 和受体A 的距离必须达到一定的数量级(1~10nm );受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠;供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似平行。此外,对
于合适的供2受体对在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有要求[52]。
4.1 研究蛋白质的折叠
蛋白质折叠涉及到通过一定途径将无数去折叠构象连接成为唯一的天然构象。FRET 能够测量自由状态的单分子蛋白折叠的表面自由能特征,这些数据在分子集合是难以得到的。Schuler 等[53]将供体A lexa488和受体A lexa594连接在冷休克蛋白(CspT m )的半胱氨酸残基上。如果一个折叠好的CspT m 被激光照射,被激发的供体染料将能量快速传递给受体染料,大部分光子由受体发出。当加入化学变性剂后蛋白去折叠,供体和受体的平均距离变大,能量转移变小,荧光强度减弱。G r oll 等[54]也利用A lexa 546/A lexa 647FRET 供受体对研究了固载于生物功能化、超薄聚环氧乙烷上蛋白质的可逆性折叠行为。
4.2 研究蛋白质2蛋白质相互作用
蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位[55]。由于细胞内各种组分极其复杂,一些传统研究蛋白质2蛋白质间相互作用的方法无法正确地反映当时活细胞生理条件下蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET 为在活细胞生理条件下对蛋白质间相互作用进行实时的动态研究,提供了便利的条件。
Rho 家族的小G 蛋白通过调节肌动蛋白的多聚化调控着重要的生理功能。象其他信号分子一样,
这些GTPase 的效应在时间和空间上都非常集中,K raynov 等[56]将P AK1能结合并激活Rac2GTP 的
do ma i n PDB 与荧光染料A lexa 标记,微注射入表达GFP 与Rac 融合蛋白的细胞中。当R ac 与PDB 相互作用时,GFP 和A lexa 就会足够接近并发生FRET 。该方法可以实时检测活体细胞中R ac 的定位改变与Rac 激活之间的关系。
4.3 酶活性检测
Takakusa 等[57~59]近几年在利用小分子FRET 荧光探针检测酶活性方面取得了一些进展。香豆素荧光发射与荧光素荧光激发光谱有重叠,可以设计为能量供2受体对。他们组合成了一系列香豆素2磷酸二酯2荧光素FRET 探针分子,通过控制间隔链的长度和种类研究能量转移效率,供受体荧光强度的比值与酶活性相关。此外,该研究组还将荧光素磷酸酯化,利用香豆素2荧光素供受体对检测了蛋白质酪氨酸磷酸酶的活性[60]。
5 结论与展望
在生物体中,蛋白质是必不可少的生命活性物质。有关蛋白质的各类研究是目前生命科学、化学和医学科学中共同关注的课题。近年来在特定蛋白质的光学标记方面,尤其是分子小、量子效率高、荧光探针分子设计与应用方面的研究取得了较大进展。但仍存在着许多有待解决的问题,如小分子标记对于细胞内存在的各种复杂情形而言,其标记的特异性目前仍旧具有挑战性;尚未在真正意义上实现运用多种参数对生物活体内各类蛋白质进行实时观测、动态研究。可以预计今后相关研究将会侧重于以下1345第9期陈蓁蓁等:蛋白质分子荧光探针研究及其应用新进展
1346分析化学第34卷
几个方面:(1)合成新型分子荧光探针,提高灵敏度,增强光稳定性,降低合成成本,开发出更多针对生物活体内不同种类蛋白质分析检测的特异性荧光探针。(2)深入研究荧光探针与蛋白质的作用方式,对蛋白质进行定量分析和特异识别来探讨生命机理,加深对生命过程机理的理解。(3)利用激光共聚焦等荧光成像技术实现对一些生物过程运用多种方法、多种参数进行多层面实时观测、动态研究,开发新的、灵敏的、能进行活体追踪和检测的分析测试方法。(4)蛋白质表达的变化或异常会造成疾病的发生,通过蛋白质标记物研究疾病机理,对疾病进行预警,防患于未然,实现对疾病的早期发现、早期治疗和早期诊断,同时开发针对各种疾病机理的高效药物。总之,在生物学、医学等学科的有力推动与渗透下,随着新型、性能优异的荧光探针的不断开发与应用,人类将能够实现对生命特质的结构与功能的探讨,进而解释生命的奥秘,极大地推动并促进生命科学、分析化学与医学的发展。
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Chen Zhenzhen ,Zhang N i ng ,ZhangW enshen ,Tang Bo
*(College of Che m istry,Che m ica l Engineer ing a nd M a ter i a ls Science ,Sha ndo ng Norma l Univ ersity ,J ina n 250014)
Abstr act The recent progresses and app lications in t h e fie l d of the protein fl u orescent probes were revie wed w it h 60re f erences .Parti c u larl y ,the research situation ,the develop i n g trends and pr ospects in the f uture were also d iscussed .
K eyword s Prote i n ,fl u orescent probe ,revie w
(Recei ved 20February 2006;accepted 29Ap ril 2006)1347第9期陈蓁蓁等:蛋白质分子荧光探针研究及其应用新进展
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学 号014010110349 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月
目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)
绿色荧光蛋白GFP的研究与应用 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。 关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用 1 引言 发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。 2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。 2 GFP的理化性质 从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。 GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。 3 GFP的荧光原理
《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波 徐 洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门 361005) 摘要 自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词 荧光探针 分子信标探针 荧光PCR 1 常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2 分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析 姓名：韩吉梅学号：2013107001 专业：作物栽培学与耕作学 摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中,经IPTG诱导产生大量融合蛋白,用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。 关键字：绿色荧光蛋白SDS-PAGE 原核表达 1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[1-2]。采用GFP作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有
效的手段[3-4]。同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。 2 材料与方法 2.1 材料 30%分离胶贮液分离胶缓冲液（Tris-HC l缓冲液pH8.9）浓缩胶贮液浓缩胶缓冲液10%SDS 20%过硫酸铵（AP）染色液脱色液1×SDS上样缓冲液1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液四甲基乙二
绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测 王媛0811142 南开大学生命科学学院生物技术08级 一、摘要： 本实验利用酶切方法检测载体中所含GFP片段后，通过转化的方法把绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌进行表达，通过免疫印记杂交方法（western blotting）分析GFP在大肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。 关键词：绿色荧光蛋白免疫印记杂交 二、引言： 绿色荧光蛋白是一种源于水母(Aequorea Victoria)等海洋无脊椎动物的蛋白，分子量为26.9KD。GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发色基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。GFP能在不同的细胞内稳定表达，无种属、组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法简单，将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。 免疫印记又称蛋白质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极，从而将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上。 三、实验材料、仪器及方法： 3.1 实验材料 3.1.1 菌种 E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21 (pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株 3.1.2 试剂与材料 LB培养基（自己配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液（5*）上扬缓冲液（5*）转移缓冲液PBS 1.5% A.P.S 质粒小量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸 3.1.3 仪器 紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转移系统等。3.2 实验方法 1、配置LB培养基，包括液体、固体培养基后灭菌；分别接种pETH-GFP/DH 5α（LA 4ml）一支，pETH/DH 5α(LA 4ml)一支，BL21（LB 4ml）四支 2、按照protocal,利用tiangen质粒提取试剂盒分别提取pETH-GFP/DH 5α、pETH/DH 5α质粒后，按照酶切体系混匀后，至于37℃温箱酶切2h。 3、制备0.8%琼脂糖凝胶，20ml每块，加入适量EB，按照点样顺序点样后，60V恒压电泳，约0.5~1h.后，凝胶自显影拍照（胶图见后面实验结果） 4、取40μlBL21菌液接种于4mlLB，37℃，200rpm，约2.5h,此时OD600=0.3~0.5，利用氯化钙法制备感受态细胞，制备完成至于冰上备用。 5、铺制平板，1块LB，4块LA，冷却凝固后于37℃倒置烘干备用。其中两块LA平板上面涂布IPTG（100μl+100μl水），正置备用。 6、按照阴性对照、空白对照、GFP基因转化表达、GFP基因的转化四组分别进行转化，涂板，37℃倒置过夜培养，紫外灯下观察，呈绿色荧光的单菌落即为转化子。记录各板菌落数
绿色荧光蛋白的研究现状与应用 【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。 【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因 2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。 1 绿色荧光蛋白的理论研究 1.1绿色荧光蛋白的发现 绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。 1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理 1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。溶液中，395nm激发的荧光发射峰在508nm，375nm激发的荧光发射峰在503nm。 1.3绿色荧光蛋白的优点 绿色荧光蛋白的独特之处即它的优点很多，主要有：荧光反应不需要底物和任何其他辅助因子，只需要在蓝光和紫外光下照射，利用荧光显微镜甚至是直接用肉眼就可以观察，易于检测且灵敏度高；荧光性质稳定，对光漂白有较强的耐受性；无毒害，转化后细胞仍可连续传代；通用性好，无种属特异性；分子量小，易于构建载体；不受假阳性干扰，结果真实可靠；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。 2 绿色荧光蛋白的应用 1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP 应用研究的先河。也正是由于绿色荧光蛋白的许多优点，使得其应用十分广泛。 2.1作为报告基因 GFP通常用作报告基因，可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP最显著的优势是荧光反应不需要底物和其他辅助因子。有利必有弊，
有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。
第46卷第7期2018年4月广 州 化 工 Guangzhou Chemical Industry Vol.46No.7Apr.2018 谷胱甘肽荧光探针的研究进展 * 石 磊1,2,黄 玲3,龚盛昭1,2 (1广东轻工职业技术学院轻化工技术学院,广东 广州 510300;2广东省绿色日用化工工程技术研究中心,广东 广州 510300;3佛山市安安美容保健品有限公司,广东 佛山 528099) 摘 要:谷胱甘肽在生物体的许多生理过程中发挥着重要作用,所以细胞内谷胱甘肽含量的检测对细胞功能研究和病理分 析都具有重要的意义三以荧光探针为基础的荧光分析法因其操作简便二灵敏度高和专一性强等优点而备受大家关注,并且有机小分子荧光探针还可以应用于活体细胞和生物体的成像技术三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的研究现状,并按照谷胱甘肽与探针识别基团的识别机理分类阐述,同时对谷胱甘肽荧光探针的未来发展趋势进行了展望三 关键词:谷胱甘肽二荧光探针二识别机理二检测 中图分类号:O657.3 文献标志码:A 文章编号:1001-9677(2018)07-0023-06 * 基金项目:广东轻工职业技术学院人才类项目(项目编号:KYRC2017-0031)三第一作者:石磊(1985-),男,博士,讲师,主要从事荧光探针的合成与应用三通讯作者:龚盛昭三 Research Progress on Fluorescent Probes for Glutathione * SHI Lei 1,2,HUANG Ling 3,GONG Sheng -zhao 1,2 (1School of Chemical Engineering and Technology,Guangdong Industry Polytechnic,Guangdong Guangzhou 510300;2Guangdong Engineering Technical Research Center for Green Household Chemicals,Guangdong Guangzhou 510300; 3Foshan Anan beauty &Health products Co,Ltd,Guangdong Foshan 528099,China)Abstract :Glutathione plays an important role in many physiological processes of life system,and the detection of glutathione in cell is significant for the research of cell function and pathological analysis.Fluorometric analysis based on fluorescent probes has attracted much attention due to its advantages,such as simple operation,high sensitivity and specificity.Moreover,the organic fluorescent probes could also be applied to bioimaging technology for living cells and organisms.The research progress on glutathione fluorescent probes was introduced and classified according to the recognition mechanism between glutathione and recognition groups of probes,and the developing trends of fluorescent probes for glutathione were prospected. Key words :glutathione;fluorescence probe;recognition mechanism;detection 谷胱甘肽(Glutathione,缩写GSH)是一种含有巯基二氨基和γ-酰胺键的三肽,主要由谷氨酸二半胱氨酸和甘氨酸组成三谷胱甘肽是细胞内一种重要的调节代谢物质;它不仅能够清除体内的过氧化物及其他自由基,促进肝脏酶活性二解毒和维持红细胞膜完整性等作用,同时还具有维持DNA 的生物合成和细胞免疫等多种生理功能[1-2]因此,检测生物体中的GSH 含量对于一些疾病的预防二研究和治疗都具有十分重要的作用,故而引起了诸多科研工作者的高度关注[3-4]三 相比于分光光度法二色谱法二毛细管电泳法二电化学法等传统检测方法,以荧光探针为基础的荧光分析法具有测试简单二选择性高二响应时间短等优点三更重要的是,荧光探针还能应用于生物体内的实时监测和生物成像研究,故而被广泛应用于生物医学二分析化学和化学生物学等诸多领域[5-6]三 近年来,基于谷胱甘肽的荧光探针得到了迅猛发展;若按照谷胱甘肽与荧光探针识别基团的识别机理进行分类,可以将 其分为加成反应取代反应和还原反应三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的设计合成与应用进展,并分类阐述如下三 1 加成反应 加成反应是利用GSH 中具有亲核性的巯基与不饱和双键(主要是碳碳双键)发生加成反应,使得探针的荧光发射光谱发生变化,从而实现对检测对象的识别与检测三 1.1 马来酰亚胺类 自Kanaoka [7]首次报道了以马来酰亚胺作为生物硫醇识别基团的荧光探针以来,基于马来酰亚胺的香豆素二BODIPY二喹啉二萘酐等[8-10]荧光探针陆续涌现出来,并成功应用于生物体内GSH 的选择性识别(图1)三然而,按此原理构建的大部分荧光探针对半胱氨酸(Cys)二同型半胱氨酸(Hcy)和GSH 均有响应,很难对这三者进行区分;仅少许报道是例外三其中,
对绿色荧光蛋白的了解及应用 学院：生命科学学院 姓名：马宗英 年级：2011 学号：2011012923
前言 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。 【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用 一、绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。 野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。 生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。图2为生色团的形成机制。 图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列 图2生色团的形成机制 目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机
制也有很大差异。 二、GFP在生命科学中的应用 1、作为蛋白质标签（protein tagging） 利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。由于GFP只有238个氨基酸，相对较小，所以将其与其它蛋白质融合后并不影响自身的发光功能。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更为详尽的观察的新方法。如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等过程的研究均是借助绿色荧光蛋白进行标记。 GFP作为蛋白质标签除用于特定蛋白质的标记定位外，还大量用于各种细胞成分的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。曾经有人将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境监测以及探测信号转导过程等等，以上都可以为传统生物学研究提供新思路和新方法。 2、药物筛选 利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪,可以分离与纯化特殊类型的细胞;同时还可利用不同颜色GFP衍生物标记相关蛋白质,来观察在单细胞内相互作用的靶细胞,再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细胞,从而可方便地用于大规模筛选新的药物。 另一方面，利用GFP来进行药物筛选由于必须与迁移的信号分子相偶联的限制，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。 3、用于免疫学 可采用基因工程的方法生产GFP标记抗体，以取代传统的免疫学标记方法，建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。相比于一般的标记物，GFP对光稳定、对抗体的标记率可达100%，而且因为GFP是直接与抗体结合，所以无需添加任何底物，可以避免非抗原抗体结合的背景干扰等。 线粒体中表达的GFP是研究比较成功的一种小分子抗体，因为它可以在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构架抗体融合蛋白。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。 在制备抗体时，为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His 序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题，由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体，若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。 除了以上应用之外，绿色荧光蛋白还普遍应用于跟踪观察微生物、发育机理研究、细胞筛选以及生物传感器等许多生命科学研究中。 三、GFP的突变及其应用 GFP作为一种新型标记物，正受到科学界的广泛关注，而且野生型的GFP也不断地在被改造，著名的生物学家钱永健所完成的单点突变(S65T) 显著提高了GFP的光谱性质,其荧
石河子大学 分子生物学实验结课论文 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析 学生姓名 学号 专业 年级、班级 指导教师 所在学院 中国·新疆·石河子 2016年1月 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析
摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。 关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达 1 前言 1.1实验目的 掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。 1.2实验背景 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种
第13卷 第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用 Ξ王守业 余华明 张祖德 刘清亮 (中国科技大学化学系 合肥230026) 大学化学 摘要 荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。利用它可以测定蛋白 质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。 一、 引言 荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离 子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ )等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。 二、 荧光探针的某些光物理和光化学特征 1. 有机荧光探针的某些特征 最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3 N θH θθSO -3N H θ H 3C θθS O O Cl N H 3C CH 3 1,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl 图1 1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构 这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极 Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。
DOI：CNKI:50-1068/S.20120208.1744.051 网络出版时间：2012-02-08 17:44 网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/f011584294.html,/kcms/detail/50.1068.S.20120208.1744.051.html 绿色荧光蛋白及其应用 四川攀枝花学院生物与化学工程学院韩洪波 摘要：作为一种报告基因，由于其自身独特的发光机制，GFP在分子生物学的研 究中得到越来越广泛深入的应用，如用于特定蛋白的标记定位，活体内的肿瘤检 测、药物筛选等等。GFP的运用，为传统生物学研究提供了新思路和新方法。 关键词：绿色荧光蛋白；性质；应用 1962年，Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequorea victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白（aequorin），并观察到一个在紫外光下发出非常 明亮，浅绿色荧光的副产物。[1]1974年，Shimomura等纯化得到了这种自发荧光 的蛋白。1985年Prasher 等构建维多利亚多管水母的cDNA文库，用于克隆水 母蛋白的编码基因，并得到含有GFP片段的蛋白。[2]1992年Prasher 等克隆到 编码全长GFP 的cDNA但直到此时人们对GFP的应用前景还不甚了解。1994 年，Chalfie 等首次在原核的大肠杆菌和真核的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中表达了具有荧光性GFP，证明GFP 的荧光产生不需要水母中特异组 分的参与，钱永健及其同事提出GFP中Ser65-Tyr66-Gly67 氨基酸残基形成4- 对羟基苯甲基-5-咪唑啉酮生色团发光的机制，并表明生色团的形成不需要任何 酶或辅助因子的参与，而只需分子氧的存在此后对GFP的研究进入了高潮，并 在1996 年解析了其晶体结构基于已有知识和晶体结构，人们通过突变的方法得 到许多不同荧光性质的GFP同时，受GFP启发，人们开始在其它生物中寻找类 似的荧光蛋白，并相继在珊瑚、海葵、水螅甲壳类动物甚至低等脊索动物中发现 了GFP样蛋白荧光谱覆盖蓝色到远红光，使得荧光蛋白的使用范围不断扩大， 极大地促进了生命科学和医药科学的发展。2008年，诺贝尔化学奖授予Osamu Shimomura，MartinChalfie 和Roger Tsien以表彰他们因发现和发展了绿色荧光 蛋白所做的巨大贡献。[3] 一、GFP的分子结构和发光机制
医药化工化 工 设 计 通 讯 Pharmaceutical and Chemical Chemical Engineering Design Communications ·204· 第44卷第6期2018年6月香豆素又名苯并-α-吡喃酮，广泛存在于自然界中，并且 在许多植物中也存在大量的香豆素类衍生物[1]。香豆素类化合 物不仅在抗肿瘤药物的开发方面进行研究，并且以香豆素为骨架的基团也常作为荧光探针中最优的荧光团之一，其具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与修饰、良 好的荧光量子产率和好的光稳定性等特点。本文通过以香豆素为骨架的荧光探针对待测物的选择性不同进行分类，对近几年报道的香豆素类荧光探针进行了概述。 1 二氧化硫衍生物荧光探针 二氧化硫溶于水中，形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐之间的 平衡[2]。高浓度的亚硫酸盐会导致过敏反应、哮喘、胃肠疾病及皮肤过敏等疾病[3]。因此，用荧光探针技术来检测细胞中HSO 3-/SO 32-具有重要意义。Zhao 等将香豆素和苯并咪唑通过C —C 双键连接得到荧光探针1[2]，亚硫酸盐与该探针的α，β-不饱和酮之间的发生迈克尔加成反应，导致π共轭被阻断，荧光发生改变。该探针利用单光子荧光成像技术成功的实现了对活细胞中亚硫酸盐的检测。Feng 课题组以氮杂香豆素-半花菁偶联物为母核，设计合成比率型近红外荧光探针2[4]。该探针在条件温和的水溶液中对HSO 3-有好的选择性和高的灵敏度，成功应用于活 细胞中内源性和外源性亚硫酸氢盐的荧光成像研究。Li 课题组设计合成了以香豆素-丙二腈衍生物为骨架，以缺电子的C —C 双键为HSO 3-的反应位点的比率型荧光探针3[5]。该探针对 HSO 3-有高的选择性和敏感性，并且成功应用于对MCF-7细胞中HSO 3-荧光成像的研究。2 活性氧荧光探针活性氧（Reactive Oxygen Species ，ROS ）包括了超氧阴离子（O 2-）、过氧化氢（H 2O 2）、羟基自由基（·OH ）、次氯酸（HOCl ）以及一氧化氮等，这些物质的活性较高，在人类健康和疾病中有着重要的作用[6]。Liu 等以双光子可激发的香 豆素基团为荧光团，苯偶酰为荧光淬灭和H 2O 2的特异性识别基团设计了荧光探针[7]。该探针在H 2O 2的存在下，苯偶酰基团可以通过Baeyer-Villiger 反应转化为苯甲酸酐，然后苯甲酸酐水解得到苯甲酸，并释放荧光团。该探针成功运用单光子和双光子进行了实验，表现出对H 2O 2的选择性要高于其他活性氧分子，具有高灵敏度。运用单光子显微镜和双光子显微镜实现了其在MKN-45细胞中对H 2O 2的成像研究。Yoon 等以香豆素-半花菁染料为骨架，通过C —C 双键连接设计合成了荧光探针[8]。荧光探针中的双键被ONOO -氧化，大的共轭被阻断，从而导致ICT 过程被破坏，并成功应用于细胞中内源性和外源性ONOO -的检测。Zhao 课题组基于FRET 机理以香豆素-苯乙烯基-苯并噻吩为母核设计合成了靶向于线粒体基团的荧光探针[9]。并且该探针可靶向于细胞的 线粒体，成功应用于RAW264.7细胞中内源性和外源性ClO -的检测。Lin 等以苯并吡喃-香豆素为骨架设计合成了选择性检测ClO -的荧光探针[10]。次氯酸盐与该探针的α，β-不饱 和羰基发生反应导致π共轭体系中断从而产生香豆素基团的荧光性质，该探针具有低的细胞毒性及成功应用于Hela 细胞中次氯酸盐的荧光成像研究。3 硫醇化合物荧光探针硫醇类化合物与人类的生活、健康和疾病有着密切的联系。例如，半胱氨酸（Cys ）、高半胱氨酸（Hcy ）和谷胱甘肽（GSH ）等生物小分子硫醇在维持氧化还原稳定、生物催化、结合金属和翻译后的修饰中起着重要的作用[11]；硫化氢（H 2S ）是一氧化氮（NO ）和一氧化碳（CO ）之后的第三种气体信号分子[12]。在血管舒张、血管生成、细胞凋亡、炎症、神经调节和保护缺血再灌注的损伤等生理过程中起重要作用[13]。因此，在生理条件下硫醇化合物进行检测具有重要的意义。 Feng 等以香豆素-TCF 骨架为荧光团，丙烯酸酯为反应基团得到荧光探针[14]，在GSH/Hcy 存在下该探针也可特异性的检测Cys ，该探针的细胞毒性较低且成功用于对HeLa 细胞中 Cys 的检测和荧光成像研究。Guo 等设计了含有氯基团的香豆素-半花青素荧光探针[15]，该探针基于不同的发射波长来检测Cys 和GSH 。Zhang 等以N ，N-二乙基香豆素为荧光团，2，4-二硝基苯磺酰胺为苯硫酚的识别基团和荧光淬灭基团设计 合成了荧光探针10[16]。该结构可以阻断N ，N-二乙氨基的扭曲来增加荧光团的荧光。 4 其他类型荧光探针以香豆素衍生物为骨架的荧光探针在N 2H 4、H +、溶剂极性及金属离子等检测方面也被广泛应用。Y u 等设计了第一个用于 实时监测线粒体pH 的比率型型荧光探针[17]。该探针的酚羟基 是一个pH 敏感的基团，在酸性或中性条件下，羟基是弱的供 电子基团；在碱性条件下羟基去质子化得到O -，是强的供电子基团。因此，酚羟基的质子化和去质子化可导致发射波长的变化。5 结语 以香豆素为骨架的基团作为荧光探针中最优的荧光团之 一，具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与 修饰、好的荧光量子产率和好的光稳定性。荧光探针对基础 生物学研究以及对疾病的诊断和治疗都具有重要的作用，为 “可视化”提供了可能，因此，对荧光探针的研究受到了越来越多的关注。然而，在荧光探针的研究中也面临着更多的挑战。首先，开发真正高选择性和敏感性的探针仍具有挑战性，例如，摘 要：香豆素类化合物不仅具有广发的生物活性，同时香豆素类化合物具有荧光强度高、溶解性和细胞渗透性好及易于合成的优点。因此，香豆素类化合物也是优良的荧光团之一。综述了近几年利用香豆素片段为荧光团，对待测物进行荧光成像研究的荧光探针，同时对这些荧光探针的设计、机理及特点进行了概述。 关键词：香豆素；荧光探针；荧光成像 中图分类号：O631.3 文献标志码：A 文章编号：1003–6490（2018）06–0204–02 Research Progress of Coumarin Fluorescent Probes Qiu Yang ，Wen Kai ，Wang Zheng-long ，Zhou Xiang Abstract ：Coumarin compounds not only have broad biological activity ，but also have the advantages of high fluorescence intensity ，good solubility and cell permeability ，and easy synthesis.Therefore ，coumarin compounds are also one of the excellent fluorophores.In this paper ，fluorescence probes for fluorescence imaging of analytes using coumarin fragments as fluorophores are reviewed.The design ，mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized. Key words ：coumarin ；fluorescent probe ；fluorescence imaging 香豆素类荧光探针研究进展 邱?洋，温?锴，王郑龙，周?湘 （中国药科大学有机化学教研室，江苏南京?210009） 收稿日期：2018–04–10 作者简介： 邱洋（1992—），男，山东淄博人，硕士研究生，主要研 究方向为靶向抗肿瘤小分子药物的设计及合成。