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嘌呤霉素Puromycin
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作用机制：嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，嘌呤霉素Puromycin通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。嘌呤霉素Puromycin某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。嘌呤霉素Puromycin作为氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。但是嘌呤霉素同A
位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
嘌呤霉素Puromycin抗性基因：对嘌呤霉素的抗性取决于编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)的 Pac基因，遗传工程研究使用的Pac基因分离自嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger。
嘌呤霉素Puromycin最普遍应用：1）嘌呤霉素如今普遍应用于筛选和维持培养含Pac基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。2）在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。化学特性：化学名称：3 (a -Amino-p-methoxyhydro cinnamamido)- 3–deoxy- N,N–dimethyladenosine·2HClCAS No.：58-58.2，分子式：C22 H29 N7 O5 .2HCl，分子量：544.43 g/mol纯度：＞98%（HPLC）,易溶于水5-50mg/mL，-20度保存。
嘌呤霉素Puromycin应用浓度：哺乳动物细胞的推荐使用浓度为1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH 值调节，而且受宿主细胞本身的影响。
嘌呤霉素Puromycin使用步骤：（哺乳动物细胞筛选）
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?嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）
嘌呤霉素Puromycin为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线（kill curve）。（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；
（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；
（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；
（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
?嘌呤霉素Puromycin筛选稳定转染细胞
（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；
（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；
（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
嘌呤霉素Puromycin储存方法和稳定性：
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嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。
嘌呤霉素Puromycin应用文献：
1.为了说明Parp1基因和ADP核糖多聚体位于Dnmt1启动子上和说明Parp1能够保护自己的非甲基化状态，向培养基中加入2μg/mL的嘌呤霉素筛选稳转株，质粒为 pBabe-puro（Addgene公司）；
2.为了研究生化信号通路能够在嘈杂的分子环境下传递信息，采用6ug/mL的puromycin进行细胞筛选。
3.为了研究IRP2（离子调控蛋白2）特定的73个氨基酸插入与该蛋白致瘤特性的关系，采用2μg/ml 的嘌呤霉素筛选稳定转染的人H1299肺癌细胞系。
4.为了证实在p53缺失的细胞中，被O-GlcNAc修饰的IKKβ的催化活性有所增强，使用了1μg/ml的嘌呤霉素来筛选感染腺病毒（载体为pBabe HA-IKKβ wild type）的细胞。
5.为研究跨膜交互作用在KAI1/CD82介导的对癌症侵入和转移的抑制作用中所发挥的角色，使用2μg/ml的嘌呤霉素用于筛选稳定的Du145-sh2和-sh3转导子，并用1μg/ml的嘌呤霉素维持培养（pSIREN-RetroQ 逆转录病毒转染）。
6.为了研究Per1在调节肝脏对四氯二苯并-p-二恶英反应中的作用，使用了4μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定感染腺病毒的 Hepa1c1c7细胞，腺病毒载体为 pSilencer 5.1-U6 Retro Vector (Applied Biosystems/Ambion)。
7.为了证实蛋白激酶PKR可以诱导细胞凋亡和抑制缺乏C蛋白的麻疹病毒亚型的生长，使用 1μg/ml 嘌呤霉素来筛选稳定转染的HeLa细胞，载体为pSUPER.retro.puro Vector。
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不同缓冲液的缓冲范围 pH缓冲液 六十一秒的常用缓冲溶液的配制&缓冲溶液原理（2007年6月16日更新）（一）甘氨酸-盐酸缓冲液（0.05 mol/L） 甘氨酸分子量＝75.07。 0.2 mol/L甘氨酸溶液含15.01 g/L。 （二）邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（0.05 mol/L） 邻苯二甲酸氢钾分子量＝204.23。0.2 mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液含40.85 g/L。（三）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 Na2HPO4分子量＝141.98；0.2 mol/L溶液为28.40 g/L。 Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05；0.2 mol/L溶液为35.61 g/L。 Na2HPO4·12H2O分子量＝358.22；0.2 mol/L溶液为71.64 g/L。
C6H8O7·H2O分子量＝210.14；0.1 mol/L溶液为21.01 g/L。 ①使用时可以每升中加入1克酚，若最后pH值有变化，再用少量50％氢氧化钠溶液或浓盐酸调节，冰箱保存。 柠檬酸钠：Na3C6H5O7·2H2O分子量＝294.12 ；0.1 mol/L溶液为29.41 g/L。 （六）醋酸-醋酸钠缓冲液（0.2 mol/L） NaAc·3H2O分子量＝136.09；0.2 mol/L溶液为27.22 g/L。冰乙酸11.8 mL稀释至1 L（需标定）。 （七）磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（0.05 mol/L） X 毫升0.2 mol/L KH2PO4+Y毫升0.2 mol/L NaOH 加水稀释至20毫升。
（八）磷酸盐缓冲液磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2 mol/L） Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05；0.2 mol/L溶液为35.61 g/L。 Na2HPO4·12H2O分子量＝358.22；0.2 mol/L溶液为71.64 g/L。 NaH2PO4·H2O分子量＝138.01；0.2 mol/L溶液为27.6 g/L。 NaH2PO4·2H2O分子量＝156.03；0.2 mol/L溶液为31.21 g/L。 （九）巴比妥纳-盐酸缓冲液 巴比妥钠分子量＝206.18；0.04 mol/L溶液为8.25 g/L。 （十）Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L） 50毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与X毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100
常见缓冲溶液的配制 缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。PH缓冲系统对维持生物的正常pH 值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。 在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH 值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。 由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。 柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。 磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。 三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力很差。 缓冲液的pH值由哪些因素决定？ 设缓冲系统的弱酸的电离常数为K（平衡常数），平衡时弱酸的浓度为[酸]，弱酸盐的浓度为[盐]，则由弱酸的电离平衡式可得下式： 根据此式可得出下列几点结论： （1）缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数K及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的pH值。当酸和盐浓度相等时，溶液的pH值与PK值相同。 （2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的pH值不便。 （3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为PK±1pH。 从上述可知，只要知道缓冲对的PK值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出[盐]和[酸]的量。这样算涉及到对数的换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。 经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。 所以500ml 0.1M磷酸缓冲液需要Na2HPO4量为: 需Na2HPO4量为 : 计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。 各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH等 常用体系 1.甘氨酸-盐酸缓冲液（0.05M） X ml 0.2M甘氨酸 +Y ml 0.2M盐酸再加水稀释至200ml pH X/ml Y/ml pH X/ml Y/ml 2.2 50 44.0 3.0 50 11.4 2.4 50 32.4 3.2 50 8.2 2.6 50 24.2 3.4 50 6.4 2.8 50 16.8 3.6 50 5.0
嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。 嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。 使用方法 1.建议使用浓度 哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定； 大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 2.溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。 3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例） 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。 1） Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜；
实验一 缓冲溶液的配制和性质、溶液pH 值测定 【实验目的】 1. 学习缓冲溶液及常用等渗磷酸盐缓冲溶液的配制方法。 2. 加深对缓冲溶液性质的理解。 3. 强化吸量管的使用方法。 4. 学习使用pHS-2C 型酸度计。 5. 培养环境保护意识。 【预习作业】 1. 一般性溶液与缓冲溶液有什么不同？ 2. 缓冲溶液的性质有哪些？ 3. 如何衡量缓冲溶液的缓冲能力大小？缓冲溶液的缓冲能力与什么因素有关？ 4. 实验是如何设计以验证缓冲溶液所具有的性质及缓冲容量的影响因素的，设计时有哪些注意事项？ 5. 该如何检测缓冲溶液的pH 值是否发生改变？是否均需要用pH 计？ 6. 本实验属定量测定还是定性测定或半定量测定？ 【实验原理】 普通溶液不具备抗酸、抗碱、抗稀释作用。 缓冲溶液通常是由足够浓度的弱酸及其共轭碱、弱碱及其共轭酸或多元酸的酸式盐及其次级盐组成的，具有抵抗外加的少量强酸或强碱、或适当稀释而保持溶液pH 值基本不变的作用。 本实验通过将普通溶液和配制成的缓冲溶液对加入酸、碱或适当稀释前后pH 数值的变化来探讨缓冲溶液的性质。 根据缓冲溶液中共轭酸碱对所存在的质子转移平衡： HB ? B － +H 3O + 缓冲溶液pH 值的计算公式为： 缓冲比lg a p ] 共轭酸[] 共轭碱[lg a p [HB]][B lg p pH －+=+=+=K K K a 式中p K a 为共轭酸解离常数的负对数。此式表明：缓冲溶液的pH 值主要取决于弱酸的p K a 值，其次决定于其缓冲比。 需注意的是，由上述公式算得的pH 值是近似的，准确的计算应该用活度而不应该用浓度。要配制准确pH 值的缓冲溶液，可参考有关手册和参考书上的配方，它们的pH 值是由精确的实验方法确定的。 缓冲容量（β）是衡量缓冲能力大小的尺度。缓冲容量（β）的大小与缓冲溶液总浓度、
缓冲溶液的配制和性质 实验目的 1．掌握缓冲溶液的配制方法，加深对其性质的理解。 2．掌握刻度吸管、滴管的使用方法。 3．了解pH 计测定溶液pH 的原理，学会使用pH 计。 实验原理 缓冲溶液是由弱酸及其盐或弱碱及其盐组成。对于由弱酸及其盐组成的缓冲体系，其pH 值可用下式表示： ][] [1p pH 酸盐g K a += 因此，缓冲溶液的pH 值除主要决定于p K a 外，还随盐和酸的浓度比而变。只要按不同的浓度比配制溶液，就可得到不同pH 的缓冲溶液。必须指出，由上述公式算得的pH 是近似值，精确的计算应用活度而不应用浓度。 缓冲溶液中具有抗酸及抗碱成分，所以加入少量酸或碱其pH 变化不大。当稀释缓冲溶液时，酸和盐的浓度比不变，故适当稀释对pH 影响不大。缓冲容量是衡量缓冲能力大小的尺度。它的大小与缓冲剂浓度、缓冲组分比值有关。缓冲剂浓度越大，缓冲容量越大；缓冲组分比值为1∶1时，缓冲容量最大。 pH 计测定溶液的pH 值是一种比较精确而又快速的方法(电位法)。pH 计的指示电极(常用玻璃电级)和参比电极(常用甘汞电极)与待测溶液组成一原电池： 玻璃电极∣待测溶液(pH x )‖甘汞电极 甘汞电极的电极电势稳定不变，而玻璃电极的电极电势与待测液的pH 有关，因此通过测定电池的电动势便可求得待测液的pH 。 E x = ?甘 -( ?玻? - 0.059pH x ) 因?玻?不确定，故先用已知pH 的标准液代替待测液测定电池电动势以求算?玻?，这称为定位或校正。 E s = ?甘 -( ?玻? - 0.059pH s ) 两式相减便可求得pH x 。 0.059由2.303F RT 换算所得，该数值随温度而变。在pH 计上可通过温度补偿器加以校准。 器材和药品 1．器材 pH 计、刻度吸管、50mL 烧杯、试管。 2．药品 HAc （0.1mol ·L -1）， NaAc （0.1mol ·L -1）， NH 3·H 2O （0.1mol ·L -1），pH=10的NaOH ， NaOH （0.1mol ·L -1），NH 4Cl （0.1mol ·L -1），HCl （0.1mol ·L -1 ），pH=5的HCl ，pH 广泛 试纸，邻苯二甲酸氢钾(0.05mol ·L -1 ，pH=4.01)，硼酸 (0.01mol ·L -1，pH=9.18)。 实验方法 一、配制缓冲溶液 通过计算，把配制下列四种缓冲溶液所需各组分的体积填入下表(总体积为30mL)。 按表中用量分别配制四种缓冲溶液，然后分别用pH 试纸和pH 计测定它们的pH 值，
常见缓冲溶液配制方法 乙醇－醋酸铵缓冲液(pH3.7)：取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml和水20ml，用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)：取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800ml，搅拌溶解，并稀释至1000ml，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)：?取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)：?取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，氯化钠5.8g，乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000ml，调节pH值至9.0。 乌洛托品缓冲液：取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml，再用水稀释至250ml。 巴比妥缓冲液(pH7.4)：取巴比妥钠4.42g，加水使溶解并稀释至400ml，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过。 巴比妥缓冲液(pH8.6)：取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g，加水使溶解成2000ml。 巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8)：取巴比妥钠5.05g，加氯化钠3.7g及水适量使溶解，另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml。 甲酸钠缓冲液(pH3.3)：取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至3.25～3.30。 邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6)：?取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6，加水稀释至1000ml，混匀。 枸橼酸盐缓冲液：取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20％乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20％乙醇稀释至100ml。 枸橼酸盐缓冲液(pH6.2)：取2.1％枸橼酸水溶液，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至6.2。 枸橼酸－磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)：甲液：取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml，置冰箱内保存。乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。?取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml混合，摇匀。 氨－氯化铵缓冲液(pH8.0)：取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml，再加稀氨溶液(1→30)调节pH值至8.0。 氨－氯化铵缓冲液(pH10.0)：取氯化铵5.4g，加水20ml溶解后，加浓氯溶液35ml，再加水稀释至100ml。 硼砂－氯化钙缓冲液(pH8.0)：取硼砂0.572g与氯化钙2.94g，加水约800ml溶解后,用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0，加水稀释至1000ml。 硼砂－碳酸钠缓冲液(pH10.8～11.2)：取无水碳酸钠5.30g,加水使溶解成1000ml；另取硼砂1.91g，加水使溶解成100ml。临用前取碳酸钠溶液973ml与硼砂溶液27ml，混匀。 硼酸－氯化钾缓冲液(pH9.0)：取硼酸3.09g,加0.1mol/L氯化钾溶液500ml使溶解，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液210ml。 醋酸盐缓冲液(pH3.5)：取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5(电位法指示)，用水稀释至100ml，即得。 醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)：取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH值至3.0，再加水稀释至1000ml。
常见缓冲溶液配制方法公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
常见缓冲溶液配制方法乙醇－醋酸铵缓冲液(pH3.7)：取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml和水20ml，用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)：取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800ml，搅拌溶解，并稀释至1000ml，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)：?取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)：?取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，氯化钠5.8g，乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000ml，调节pH 值至9.0。 乌洛托品缓冲液：取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml，再用水稀释至250ml。 巴比妥缓冲液(pH7.4)：取巴比妥钠4.42g，加水使溶解并稀释至400ml，用 2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过。 巴比妥缓冲液(pH8.6)：取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g，加水使溶解成 2000ml。 巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8)：取巴比妥钠5.05g，加氯化钠3.7g及水适量使溶解，另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml。 甲酸钠缓冲液(pH3.3)：取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用 2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH 值至3.25～3.30。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考） （1）24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）； （3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基； （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 （6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 （1）day0：24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基； （3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。） （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜； （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 （6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基； （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性： 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放； 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。 Starttoselectonpuromycin(2ug/mlfinalconcentration)3-4daysposttransfection.Massivecelldeathwillbeevi dentafter36-48hoursselectiononpuromycin.Dependentonthetransfectionefficiency,mosttransfectionwon' testablishsomepuromycin-resistantcoloniesexceptthattheretrovirus-producingcelllinesareusedforgener atingviralvector.Ifthefirstgenerationlentiviralvectorisusedinthetransfection,trytouseMo-MLVenvelopexpre ssingvector,ratherthanVSV/Gexpressingvectorforpackagingviralvectors.Thestablecolonies(trytopoolthe differentpuromycin-resistantcellcoloniestogehter,don'tmakesinglecolonyclone)willbeamplifiedafter10-14 daysselectiononpuromycin.
常用缓冲溶液的配制方法 磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液 24Na 2HPO 4·2H 2O 分子量 = 178.05，0.2 mol/L 溶液含35.01克/ 升。 C 4H 2O 7·H 2O 分子量 = 210.14，0.1 mol/L 溶液为21.01克/升。 pH 4.0 20mL ：Na2HPO4 0.219g + C4H2O7·H2O 0.258g 柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L ） 6872柠檬酸钠Na 3 C 6H 5O 7·2H 2O ：分子量294.12，0.1 mol/L 溶液为29.41克/毫升。 pH 4.0 20mL ： C4H2O7·H2O 0.275g + Na3 C6H5O7·2H2O 0.203g
乙酸–乙酸钠缓冲液（0.2 mol/L ） Na 2Ac·3H 2O 分子量 = 136.09，0.2 mol/L 溶液为27.22克/升。 pH 4.0 20mL ：NaAc 0.098g + HAc 0.282mL 甘氨酸–氢氧化钠缓冲液（0.05M ） 甘氨酸分子量=75.07; 0.2M 溶液含15.01克/升。 pH 10.0 20mL ：甘氨酸0.075g + NaOH 0.013g 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（0.1M ） 2+2+ 无水Na 2CO 2分子量=105.99;0.1M 溶液为10.60克/升。 Na 2CO 2·10H 2O 分子量=286.2;0.1M 溶液为28.62克/升。 Na 2HCO 3分子量=84.0;0.1M 溶液为8.40克/升。 pH 10.0 20mL ：无水碳酸钠 0.127g +碳酸氢钠0.067g
说明：蛋白质合成抑制剂。抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。 嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。 嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。 使用方法 1.建议使用浓度 哺乳动物细胞：1-10μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定； 大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为 125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 2.溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50mg/ml的母液，经0.22μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10mg/ml的储存液。 3.嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例） 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。 1）Day1：24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜；
缓冲溶液 缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。 缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，而且受到氢离子浓度的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的pH值： 7.1 基本概念 ⑴Br?nsted-Lowry酸碱理论（又称酸碱质子理论）。1923年由
丹麦化学家J.N.Br ?nsted 和英国化学家T.M.Lowry 同时提出了酸碱质子学说，发展了酸碱理论，被后人称为酸碱质子理论或Br ?nsted-Lowry 酸碱理论。他们认为凡能释放质子的分子或离子（如：H 2O ，HCl ，NH 4+，HSO 4— 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H 2O ，NH 3，Cl —等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。 A —H ＋ B — A ＋ B —H 酸1 碱2 碱1 酸2 酸1 是 碱1的共轭酸， 碱2 是 酸2 的共轭碱。 如盐酸在水中的解离： HCl Cl — ＋ H + HCl 是酸，Cl —是它的共轭碱。 ⑵ 缓冲体系的设计： 强电解质溶于水几乎全部解离为正负离子，弱电解质溶于水时，则不完全解离，只有部分的分子解离出正负离子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA ）及其盐溶于水时，只有部分HA 解离为 H + 和 A —离子，其平衡方程式如下： K 1 HA A — ＋ H + (1-1) K2 ][]][[HA A H K a -+= ∴ ][] [][-+=A HA K H a (1-2) (1-2)式两边取负对数： ][] [lg lg ]lg[HA A K H a -+ =＋－－ (1-3) (1-3)式中： [HA] — 为弱酸的浓度 [H +] — 为HA 解离出的氢离子浓度 [A —] — 为HA 的共轭碱的离子浓度 K 1 — 为酸解离的速度常数 K 2 — 为A —与H + 缔合的速度常数
精品文档 说明：蛋白质合成抑制剂。抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。 嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。 嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。 使用方法 1.建议使用浓度 哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定； 大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为 125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 2.溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。 3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例） 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。 1）Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜； 精品文档
常见缓冲液配制大全 缓冲液 乙醇－醋酸铵缓冲液(pH3.7) 取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml和水20ml,用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml，即得。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0) 取三羟甲基氨基甲烷12.14g,加水800ml,搅拌溶解，并稀释至1000ml,用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0,即得。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1) 取氯化钙0.294g,加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml，即得。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0) 取三羟甲基氨基甲烷6.06g,加盐酸赖氨酸 3.65g、氯化钠5.8g、乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000ml，调节pH值至9.0，即得。 乌洛托品缓冲液 取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml，再用水稀释至250ml,即得。 巴比妥缓冲液(pH7.4) 取巴比妥钠4.42g,加水使溶解并稀释至400ml，用 2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过，即得。 巴比妥缓冲液(pH8.6) 取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g,加水使溶解成 2000ml，即得。 巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8) 取巴比妥钠5.05g,加氯化钠3.7g及水适量使溶解,另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L 盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml，即得。 甲酸钠缓冲液(pH3.3) 取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L 氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH 值至3.25～3.30,即得。 邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6) 取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6,加水稀释至1000ml，混匀，即得。 枸橼酸盐缓冲液 取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20％乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20％乙醇稀释至100ml，即得。
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常见缓冲溶液配制方法 乙醇－醋酸铵缓冲液(pH3.7)：取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml 和水20ml，用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)：取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800ml，搅拌溶解，并稀释至1000ml，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)：?取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)：?取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，氯化钠5.8g，乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成 1000ml，调节pH值至9.0。 乌洛托品缓冲液：取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml，再用水稀释至250ml。 巴比妥缓冲液(pH7.4)：取巴比妥钠4.42g，加水使溶解并稀释至400ml，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过。 巴比妥缓冲液(pH8.6)：取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g，加水使溶解成2000ml。 巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8)：取巴比妥钠5.05g，加氯化钠3.7g及水适量使溶解，另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml。
甲酸钠缓冲液(pH3.3)：取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至3.25～3.30。 邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6)：?取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6，加水稀释至1000ml，混匀。 枸橼酸盐缓冲液：取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20％乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20％乙醇稀释至100ml。 枸橼酸盐缓冲液(pH6.2)：取2.1％枸橼酸水溶液，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至6.2。 枸橼酸－磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)：甲液：取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml，置冰箱内保存。乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。?取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml混合，摇匀。 氨－氯化铵缓冲液(pH8.0)：取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml，再加稀氨溶液(1→30)调节pH值至8.0。 氨－氯化铵缓冲液(pH10.0)：取氯化铵5.4g，加水20ml溶解后，加浓氯溶液35ml，再加水稀释至100ml。 硼砂－氯化钙缓冲液(pH8.0)：取硼砂0.572g与氯化钙2.94g，加水约800ml溶解后,用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0，加水稀释至1000ml。
1、选择合适的缓冲对：原则是所选缓冲对弱酸的pKa尽量接近于所需pH，并尽量在缓冲对的 缓冲范围内（pH= pKa±1）。二是所选缓冲对不能与溶液中主物质发生作用。 2、缓冲溶液的总浓度要适当，一般0.1-0.5 mol·L-1之间 3、计算所需缓冲对的量，为方便计算和配制，常用相同浓度的共轭酸、碱溶液，分别取不同体 积混合即可 4、校正，实际pH值与计算pH值常有出入，用pH计或精密pH纸校正。 表1. 常用pH缓冲溶液的配制和pH值 Preparation and pH Values of Common pH Buffer Solutions
表2. pH标准缓冲溶液Standard pH Buffer Solutions
表3. 标准缓冲液pH值与温度对照表
表4。常用缓冲溶液的配制方法1．甘氨酸–盐酸缓冲液（0.05mol/L） 2．邻苯二甲酸–盐酸缓冲液（0.05 mol/L） 24 Na2HPO4-2H2O分子量= 178.05，0.2 mol/L溶液含35.01克/升。 C4H2O7·H2O分子量= 210.14，0.1 mol/L溶液为21.01克/升。
溶液或浓盐酸调节，冰箱保存。 6872柠檬酸钠Na 3 C 6H 5O 7·2H 2O ：分子量294.12，0.1 mol/L 溶液为29.41克/毫升。 22
7．磷酸盐缓冲液 242 Na2HPO4·2H2O分子量= 358.22，0.2 mol/L溶液为71.64克/升。 Na2HPO4·2H2O分子量= 156.03，0.2 mol/L溶液为31.21克/升。 242 KH2PO4分子量= 136.09，1/15M溶液为9.078克/升。 8．磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液（0.05M） X毫升0.2M K2PO4 + Y毫升0.2N NaOH加水稀释至29毫升
磷酸盐缓冲液 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M） pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml 5.8 8.0 92.0 5.9 10.0 90 .0 6.0 12.3 87.7 6.1 15.0 85.0 6.2 18.5 81.5 6.3 22.5 77.5 6.4 26.5 73.5 6.5 31.5 68.5 6.6 3 7.5 62.5 6.7 43.5 56.5 6.8 49.5 50. 5 6.9 55.0 45.0 7.0 61.0 39.0 7.1 67.0 33.0 7.2 72.0 28.0 7.3 77.0 23.0
7.4 81.0 19.0 7.5 84.0 16.0 7.6 87.0 13.0 7.7 89.5 10.5 7.8 91.5 8.5 7.9 93.0 7.0 8.0 94.7 5.3 Na2HPO4?2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/L Na2HPO4?12 H2O分子量＝358.22 0.2M溶液含71.64g/L NaH2PO4?H2O分子量＝138.01 0.2M溶液含27.6g/L NaH2PO4?2H2O分子量＝156.03 0.2M溶液含31.21g/L 磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钠38.0g，与磷酸氢二钠5.04g,加水使成1000ml,即得。 磷酸盐缓冲液(pH2.0) 甲液:取磷酸16.6ml，加水至1000ml，摇匀。乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液72.5ml与乙液27.5ml混合，摇匀，即得。 磷酸盐缓冲液(pH2.5) 取磷酸二氢钾100g，加水800ml，用盐酸调节pH至2.5,用水稀释至1000ml。磷酸盐缓冲液(pH5.0) 取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量,用氢氧化钠试液调节pH值至5.0，即得。磷酸盐缓冲液(pH5.8) 取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml，即得。 磷酸盐缓冲液(pH6.5) 取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即得。 磷酸盐缓冲液(pH6.6)
常用缓冲溶液的配制 （一）甘氨酸-盐酸缓冲液（0.05 mol/L） X毫升0.2 mol/L甘氨酸＋Y毫升0.2 mol/L HCl，再加水稀释至200毫升。 甘氨酸分子量＝75.07。 0.2 mol/L甘氨酸溶液含15.01 g/L。 （二）邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（0.05 mol/L） X毫升0.2 mol/L邻苯二甲酸氢钾＋Y毫升0.2 mol/L HCl，再加水稀释至20毫升。 邻苯二甲酸氢钾分子量＝204.23。 0.2 mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液含40.85 g/L。 （三）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液
Na 2HPO 4分子量＝141.98；0.2 mol/L 溶液为28.40 g/L 。 Na 2HPO 4·2H 2O 分子量＝178.05；0.2 mol/L 溶液为35.61 g/L 。 Na 2HPO 4·12H 2O 分子量＝358.22；0.2 mol/L 溶液为71.64 g/L 。 C 6H 8O 7·H 2O 分子量＝210.14；0.1 mol/L 溶液为21.01 g/L 。 （四）柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液
①使用时可以每升中加入1克酚，若最后pH值有变化，再用少量50％氢氧化钠溶液或浓盐酸调节，冰箱保存。（五）柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L） 柠檬酸：C6H8O7·H2O分子量＝210.14 ；0.1 mol/L溶液为21.01 g/L。 柠檬酸钠：Na3C6H5O7·2H2O分子量＝294.12 ；0.1 mol/L溶液为29.41 g/L。 （六）醋酸-醋酸钠缓冲液（0.2 mol/L） NaAc·3H2O分子量＝136.09；0.2 mol/L溶液为27.22 g/L。
嘌呤霉素筛选程序 一、杀伤曲线 1. 在24 孔板内接种细胞，约3x104/孔，共11孔，培养过夜。 2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%。稀释嘌呤霉素(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μg/ml)至培养基, 每孔加入0.75m l培养基。 3. 每隔2天观察细胞的存活情况（贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准），每隔2天更换0.75m l含相应浓度嘌呤霉素的培养基。 4. 筛选4-7天内使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为杀伤浓度（筛选浓度）； 二、细胞筛选 1.转染（24孔板进行）或电转后培养24小时，按10%密度传代（传至35mm 平皿），继续培养24小时，待细胞密度增至20％～25％汇合时； 2.去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度（杀伤曲线实验确定）配制 好的嘌呤霉素筛选培养基2-3ml。 3.根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔2天更换一次筛选培养基(培养 基用量为2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在3-4天内出现细胞大量或少量死亡情况（如果转染效率或电转效率高，则死亡少； 如果转染效率或电转效率低，则死亡多；如果筛选浓度偏低，筛选培养基用量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆）。如果筛选第一周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周；如果
筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按10%密度传代（传至35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃），利用筛选培养基进行筛选一周； 4.筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释（10ul培养基中含1 个细胞，用筛选培养基），把上述10ul细胞悬液加入96孔板中（提前加入40ul 筛选培养基），一共加24孔，4小时后观察每个孔的情况，记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃； 5.根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为80% 时，将其传代至24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至6孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至T25瓶（一传3）中增殖, 每隔3天换液。 6.细胞大量扩增后，一瓶用于提取总RNA进行QPCR检测，一瓶用于总蛋白 进行WB检测，另一瓶用于保种，根据QPCR和WB结果取舍阳性克隆；