DOI ：10．13602/j．cnki．jcls．2014．09．01
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作者简介：张濛，1982年生，男，助理研究员，博士，主要从事肿瘤个体化诊断研究。通信作者：徐国宾，研究员，博士研究生导师，
E-mail ：bdyyjyk@vip．sina．com 。新一代测序技术在肿瘤临床中的应用
张濛，张青云，徐国宾（北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所检验科，恶性肿瘤发病机制及转化研究
教育部重点实验室，
北京100142）摘要：随着测序技术的不断发展，成本低、速度快、通量高的新一代测序（NGS ）技术在肿瘤临床领域显现出很高的应用价值。本文对NGS 在肿瘤临床中的应用和研究进行了综述，主要包括检测胚系突变和单核苷酸多态性用于肿瘤预测预防，检测血浆中循环肿瘤DNA （ctDNA ）用于肿瘤的早期诊断，基于NGS 的单细胞测序技术检测体细胞突变用于指导个体化、靶向治疗及疗效预测。同时也简要介绍了NGS 技术在临床应用中面临的挑战，为其更好地服务于临床提供思路。关键词：测序；新一代测序；高通量测序；肿瘤；基因；临床应用中图分类号：Ｒ730
文献标志码：A
新一代测序（next-generation sequencing ，NGS ）又称二代测序、高通量测序（high-throughput sequen-cing ）或大规模平行测序（massively parallel signature sequencing ，MPSS ），是相对于第一代测序———桑格测序（Sanger sequencing ）而言的。本文简要介绍NGS 技术，并对该技术近年在肿瘤临床领域中的应用做一综述。1
NGS 技术简介
2005年，Ｒoche 公司首先推出了第一台高通量测序仪。目前，高通量测序平台主要有3类：Ｒoche 公司的GS FLX 测序系统，
Illumina 公司的Solexa 基因组分析仪和ABI 公司的SOLiD 测序仪。3类测序平台原理各异。Illumina 公司利用桥式PCＲ扩增的方法，将DNA 片段固定到流动池（flow cell ）中，每次加入不同荧光素标记的4种碱基中的一种，边合成边测序，用高分辨率CCD （charge-coupled device ）采集数据，将荧光颜色信号转换为DNA 序列。Ｒoche 公司利用磁珠吸附DNA 分子，再乳化成微滴进行PCＲ扩增，连接着扩增产物的磁珠被加入到PTP 板（Pico Titer Plate ）中，测序开始后每次反应加入4种碱基中的一种，当配对的碱基合成到引物上时，释放焦磷酸分子，将荧光素氧化发出荧光，通过检测荧光信号的有无达到测序的目的。ABI 公司的SOLiD 测序仪采用的则是连接测序法，
DNA 片段被固定到磁珠表面，随后形成油包水的微滴进行PCＲ扩增，扩增结束后磁珠共价结合到SOLiD 玻片表面，随后加入4种荧光染料标记的8种碱基单链探针，每次反应向引物上连接一种探针，仪器记录下该探针的荧
光信号后，
酶切掉后面的3个碱基和荧光基团，为下一个探针的掺入做好准备。由于SOLiD 采用了“双碱基编码技术”
，在测序过程中对每个碱基都检测了两遍，从而提高了原始数据的质量。3个系统的详细实验流程及优缺点比较可参看文献［1］。2
NGS 技术在肿瘤风险预测及预防中的应用NGS 技术可使肿瘤防治措施前移至预防阶段。大量研究证明某些肿瘤的发生与个别关键基因突变相关。乳腺癌相关基因见表1
［2］
，其中一些基因突
变除与乳腺癌相关外，还与其他肿瘤发生有关。
乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene ，BＲCA ）变异最早被发现与女性的乳腺癌和卵巢癌发病有密切的关系。BＲCA1/2属于抑癌基因，正常细胞中，
BＲCA1/2可以帮助修复DNA 损伤并维持DNA 稳定性，防止细胞恶变。但当BＲCA1/2基因发生变异后，细胞失去了这一保护作用，发生癌变的概率将大大增加。BＲCA2基因变异与男性乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌发生同样关系密切。著名影星安吉丽娜·朱莉自称已接受预防性双侧乳腺切除术，因她本人通过基因检测发现自己携带有BＲCA1突变基因，且她母亲在56岁时死于乳腺癌，医生估计她患上乳腺癌的风险高达87%，患上卵巢癌的风险高达50%，而切除术后，她患上乳腺癌的风险已降至5%。今后，有与安吉丽娜·朱莉一样有癌症家族史的女性可以借助NGS 技术进行BＲCA 检测，提早采取措施或增加体检次数来预防。但NGS 技术用于普通人群的癌症基因筛查，其临床意义还有待商榷。
表1与乳腺癌发病相关的基因［2］
外显率基因名称终身患乳腺癌风险（%）其他部位相关肿瘤
高BＲCA140 80卵巢癌
BＲCA240 80卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，男性乳腺癌
CDH130 50弥漫型胃癌
LKB132 54卵巢生殖索肿瘤，宫颈恶性腺瘤，子宫、睾丸、小肠、胰腺、结肠、胃癌PTEN25 50甲状腺、子宫内膜癌
TP5356 90肉瘤，白血病，脑、肾上腺皮质肿瘤
中ATM20 30胰腺癌
BＲIP115 30
CHEK220 30
PALB220 40胰腺癌
对于遗传性乳腺癌、卵巢癌和其他癌症，2014版美国国立综合癌症网络（NCCN）指南中明确指出可利用NGS技术检测相关的基因突变。这些基因被推荐用于BＲCA1/2基因阴性且家族史有一种或多种高危综合征的患者（如CDH1基因突变引起的遗传性弥漫型胃癌综合征，STK11/LKB1基因突变引起的黑斑息肉综合征，错配修复基因突变或EPCAM基因缺失引起的林奇综合征）。这类基因有21个：ATM、BAＲD1、BＲIP、CDH1、CHEK1、CHEK2、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、MＲE11A、NBN、PALB2、PMS2、PTEN、ＲAD50、ＲAD51B、ＲAD51C、ＲAD51D、STK11、TP53［3］。
除上述关键基因外，肿瘤易感性还与基因多态性相关。基因多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种基因型（genotype）或等位基因（allele），也称遗传多态性（genetic polymor-phism）。它决定人与人之间的个体差异，也决定了某些人患某种疾病的风险。这些多态性位点为数众多，大约占人类基因组的1%，对人类疾病易感性的影响也异常复杂。以乳腺癌为例，与乳腺癌易感性相关的单核苷酸多态性（SNP）位点就包括rs11571833、rs11552449、rs9790517、rs2046210、rs2236007、rs2588809、rs941764等。目前，国内外一些测序公司通过检测某些疾病相关基因（包括有热点突变的基因和多态性位点），对一些常见病风险进行评估，计算出患某病的百分比。但这些测序服务存在诸多问题。首先，测序公司所选取的基因除少数临床意义较明确外，大多数都缺乏多中心、大样本的临床数据支持和基础实验验证，以此推算出的患病风险并不一定准确；另外，各个公司在预测某项疾病时所选取的多态性位点也千差万别，预测结果经常互相矛盾；最后，测序公司直接向不具备专业知识的普通大众提供检测结果，致使对结果的解释异常混乱。正是基于以上原因，2013年底美国食品药品监督管理局（FDA）叫停了“23andMe”公司提供的基因测序服务。但此次叫停的仅仅是“23andMe”公司直接面向用户的基因检测服务，其他医疗机构（结果并不直接面对患者而是面对医生）及科研机构中的测序服务并不在此次叫停之列。
3NGS用于肿瘤诊断
NGS能对血浆中的循环肿瘤DNA（ctDNA）进行高敏感性、高特异性的检测。ctDNA是一种具备广泛应用前景的肿瘤标志物，与组织学检测相比，具有取材方便、无创、患者依从性好、可连续监测等优点。2014年4月6日在《Nature Medicine》发表的一篇文章指出，将NGS技术应用于血浆ctDNA检测，具有惊人的高敏感性和高特异性。作者将此法命名为CAPP-Seq（深度测序肿瘤个体化建档法，cancer personalized profiling by deep sequencing）［4］。研究者对不同级别的肺癌患者进行了CAPP-Seq验证，发现对Ⅱ Ⅳ期的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）检测敏感性达100%，Ⅰ期的NSCLC中敏感性为50%；对各期肺癌的特异性均为96%。在Ⅱ Ⅳ期和所有分期的肺癌中，ＲOC曲线下面积分别为0．99和0．95。研究还表明，当ctDNA 比例低至0．019%的时候仍能够被CAPP-Seq检测到。与传统活组织检查法在筛查基因型（EGFＲ和KＲAS）的对比时发现，分别对10例样本（7例阳性和3例阴性）进行活检和CAPP-Seq检测，结果显示CAPP-Seq并不比金标准肿瘤活检的诊断效能差，能够准确测定肺癌的基因型。
NGS较第一代测序在肿瘤诊断方面表现出超高的敏感性和特异性，原因主要有两个。首先，对于肿瘤这种复杂的多基因病来说，希望靠单基因突变就试图对其诊断和分型是非常困难的，传统的第一代测序只能一个基因、一个基因地进行检测，而NGS技术能对多个基因同时进行检测，多基因组合
大大提高了对肿瘤诊断的敏感性和特异性。其次，NGS技术本身检测基因突变的灵敏度就高于第一代测序。目前公认的第一代测序检测突变的灵敏度大约在20%，即对于那些突变比例低于15% 20%的肿瘤标本，第一代测序很难发现。而NGS技术由于引入了测序深度（sequencing depth）这一概念，使其可以检测到低于0．5%的突变。测序深度是指测序得到的碱基总量（bp）与目的基因组（genome）大小的比值，是评价测序量的指标之一。测序深度越深，对突变检测的灵敏度也越高。
NGS还能检测血浆中ctDNA的甲基化状态和拷贝数变异（copy number variation，CNV）。对于非转移性的肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、平滑肌肉瘤和神经内分泌肿瘤的诊断而言，检测血浆ctDNA 甲基化的敏感性和特异性可达74%和94%。同时，检测血浆ctDNA的甲基化还可用来监测肝细胞癌患者的术后复发。联合检测ctDNA的甲基化和CNV诊断肿瘤的敏感性和特异性可达到87%和88%。
NGS技术在肿瘤诊断中的另一个例子是刚刚兴起的单细胞测序技术。2011年，《Nature Meth-ods》将其列为年度最值得期待的技术之一［5］，2012年该技术又被《Science》列为年度最值得关注的六大领域之首［6］。由于常规测序样品的来源均是多细胞混合DNA，这种方法得到的全基因组序列信息是一群细胞基因信息的平均值，或其中占优势数量的细胞信息，而单个细胞的特性则被忽视。单细胞组测序技术是将分离的单个细胞中微量的全基因组DNA进行无选择性地扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后再通过NGS技术对其进行测序，从而揭示细胞个体间差异。但由于PCＲ扩增时存在偏倚，常导致测序结果的基因组覆盖度很低。哈佛大学谢晓亮团队开发出的多重退火和成环循环扩增技术（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）能有效降低PCＲ扩增过程中的偏倚，该技术利用一组包含8个碱基可变区和27个碱基共同序列的随机引物进行扩增，使得前5个PCＲ循环的产物能自身成环，在进入指数扩增时将所有环状产物打开，同时进行扩增，从而有效降低了扩增偏倚，使得MALBAC扩增的DNA基因组覆盖度达到93%［7］。2012年，华大基因同样利用单细胞测序技术分析了单个肾癌细胞的单核苷酸突变特征，从而在更高的分辨能力上为评价基因改变的复杂性提供了更为优化的方法［8］。2014年，他们又用该方法在结肠癌中发现了一个新的癌基因SLC12A5［9］。单细胞测序技术不仅为肿瘤分子分型和个体化治疗提供指导，还将有助于我们理解肿瘤内部的异质性和肿瘤的演进［10-11］。单细胞测序技术还能与循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）筛选技术相结合，检测外周血CTCs单核苷酸变异（single-nucleo-tide variations，SNV）、CNV或外显子组插入/缺失突变，为肿瘤诊断及个体化治疗提供一种非侵入性检测手段［12］。
4NGS指导靶向治疗、预测疗效和预后
基因突变的检测早在一代测序仪时就已经开展，如BＲCA1/2基因。但一代测序耗时长、成本高，乳腺癌初诊患者往往在治疗开始后数周才能拿到结果。而NGS技术由于其通量高的特点，使得基因检测成本降低，速度也变得更快，基因检测结果报告的时间为1周左右，使医生能在治疗前知道患者是否携带BＲCA1/2突变基因，参照基因检测结果确定治疗方案，包括是否采用乳腺癌根治术或保乳术、单侧还是双侧切除等。
基因检测在肿瘤治疗中的另一个主要应用是指导靶向药物的使用。靶向药物作用于肿瘤细胞中特定的分子靶点从而阻止癌细胞的生长。如果患者携带某个突变基因，便可以使用对应的靶向药。但如果患者不携带靶向药物针对的突变基因，那么应用靶向药物不但起不到治疗作用，还给患者带来副作用和经济负担。以晚期NSCLC为例，目前临床常用的靶向治疗药物易瑞沙、特罗凯、凯美纳等均是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFＲ）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）。研究显示，当NSCLC患者EGFＲ基因发生19号外显子缺失、21号外显子L858Ｒ、L861突变和18号外显子G719X、G719突变时，对TKIs靶向治疗敏感，但当20号外显子770-775位发生插入突变后，提示发生TKIs耐药。KＲAS是EGFＲ下游的靶分子，EGFＲ生长信号需经KＲAS蛋白传递，携带KＲAS基因突变的患者TKIs治疗无效。因此TKIs 治疗前必须对KＲAS基因进行检测。临床其他常用于检测的基因突变及融合基因详见表2和表3。但这些靶基因检测所用到的方法多是Sanger测序、AＲMS（amplification refractory mutation system）PCＲ或变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC），而真正应用NGS技术技术检测基因突变用于指导治疗及评价疗效、预
后，国内外鲜见文献报道。目前国外已有肿瘤突变基因检测试剂盒，一次运行可检测十几种甚至几十种突变的靶基因。不同试剂盒针对靶基因的富集方法不同，各种富集方法的性能尚待进一步的评价。最近研究还发现癌症可以遵循基因检测结果而不再依靠原发器官来划分，由相同基因突变造成的肿瘤，可以用相同的靶向药物来治疗。如KIT基因突变引起的胃肠间质瘤和急性髓系白血病都可以用格列卫进行靶向治疗。
表2肿瘤相关基因突变检测及其临床应用［13］
基因突变临床应用肿瘤类型参考文献AKT1E17K预后乳腺，结直肠，肺和卵巢癌［14-15］
BＲAF V600E预测威罗菲尼、达拉菲非霍奇金淋巴瘤，结直肠癌，恶性淋巴瘤，甲状腺癌，NSCLC，肺［14，16-18］
尼疗效腺癌和黑色素瘤
EGFＲExons18-21预测EGFＲTKIs疗效NSCLC［19］
FLT3D835预后急性髓系白血病［20］
JAK2Exon12，v617F预后骨髓增生性疾病，慢性粒细胞白血病［21-22］
KIT Exons8、9、11、17预测伊马替尼/格列卫胃肠间质瘤，急性髓系白血病［20，23］
疗效
KＲAS Codons12、13、61预测埃罗替尼疗效肺腺癌，黏液性腺癌，胰腺导管癌，结直肠癌［16，24-27］MPL Exon10预后骨髓增殖性疾病，慢性粒细胞白血病，真性红细胞增多症［28］
NPM1Codons288、290，Exon12预后急性髓系白血病［20，29］
PIK3CA Exons9、20预后结直肠癌，恶性黑色素瘤，甲状腺癌，NSCLC，乳腺癌，宫颈癌、［14，24］
肺腺癌
TP53体细胞突变预后头颈部鳞癌，白血病，乳腺癌［30-31］
表3肿瘤相关染色体异常及其临床应用
基因染色体异常类型临床应用相关肿瘤参考文献BCＲ-ABL1染色体易位诊断，预测多重激酶抑制剂如伊马替尼和慢性粒细胞性白血病，急性淋巴细［32］
尼罗替尼的疗效胞白细胞
EML4-ALK基因融合ALK特异性酪氨酸激酶抑制剂作用靶点NSCLC［33］TMPＲSS2-EＲG基因融合诊断、预后前列腺癌［34］MAST激酶和Notch基因家族融合基因融合γ分泌酶抑制剂潜在作用靶点乳腺癌［35］
KIF5B-ＲET基因融合ＲET酪氨酸激酶抑制剂作用靶点肺腺癌［36-37］
1p和19q缺失诊断少突神经胶质瘤［38］
9p21缺失诊断淋巴细胞性白血病，肺癌，食管癌，［39］
神经胶质瘤，黑色素瘤
17q12扩增预测曲妥珠单抗和蒽环类辅助治疗效果乳腺癌［40］
11q13扩增预后乳腺癌
8q24扩增预后多种肿瘤
20q13．2扩增预后乳腺癌
5NGS在临床应用中面临的挑战
NGS作为一种快速崛起的新技术，目前尚缺乏明确的行业标准和质量控制规则。最近，美国病理学家协会（College of American Pathologists，CAP）更新了他们的分子病理学认证程序清单，用专门一章来分析NGS技术，同时还更新了他们的主活动菜单，将NGS技术的具体测试/活动编码收入其中。清单中提供了一个NGS技术管理的框架流程，包括试验记录、样品制备、测序、生物信息学分析/序列比对算法、突变基因的注解和识别，但其中并未纳入ＲNA测序和DNA拷贝数变异。美国临床试验工作小组与美国疾病预防控制中心也已经采取行动，在其联手推出的指南中对NGS技术流程中的每一个元素进行定义，以保证试验分析的有效性且遵守现行的监管及专业质量标准［41］。这一指南提出4个医疗质量管理主题：试验验证；检测过程中质量控制（quality control，QC）以保证检测结果的可靠；通过能力验证（proficiency testing，PT）和替代方案对试验能力进行独立评估；标准物质（reference materials，ＲMs）。这些建议将使NGS技术流程更稳定，结果更可靠，为NGS的临床应用奠定了很好的基础。
NGS技术应用于肿瘤临床，除了需要完备的质量控制和系统的临床样本对比外，还需重新审视现有临床意义明确的基因的临床指导价值。由于NGS技术的高灵敏度使得肿瘤中微小的基因突变或少数异质性细胞均能被检测到，针对这一微小变
异的治疗方案是否对整个肿瘤起作用以及起多大作用目前都是未知，还需要通过业界整体的反复积累与验证。NGS技术用于临床所要面对的另一个挑战是数据的储存和处理。一台NGS设备每次运行试验都有上百GB的数据产出，完全超出了医疗机构现有数据处理设备的能力。想要对测序结果进行分析则需要大量的计算机资源，而医疗单位构建自己的大规模计算机集群将耗费巨大的资金。目前，处理测序结果通用的方法是云计算，医疗机构或测序公司通过租用云，能在几天内完成对海量原始数据的分析［41］，而自己需要提供的仅是畅通的网络。
另外，全基因组分析对患者个人隐私和信息安全也是一个挑战。首先，大多数医疗机构无法提供计算机集群，测序结果需上传至云端计算。如何保护云端的个人医疗信息（personal medical informa-tion，PMI）不被泄露还需要很多努力。其次，全基因组测序对患者及其家庭的影响也不容忽视。除了肿瘤序列外，NGS技术还能得到患者全部基因组信息，由此而产生的对患者的偏见或歧视在开展NGS 技术检查前都应仔细考虑［42］。
NGS技术不仅对检测设备的硬件、软件有较高的要求，对人员素质的要求也非常高。即便有现代生物信息做支撑，对测试结果的解释仍需要我们同时具备分子生物学、生物统计学、生物伦理学和临床医学等知识。未来的肿瘤学学生不仅要学习临床医学和基础医学，还须接受高维数据分析的培训。相信不久，“分子肿瘤学家”的时代即将到来。
作为一项新兴技术，尽管NGS技术在肿瘤临床应用中还存在诸多问题，但它已显示出巨大的应用潜力。我们有理由相信随着周边硬件、软件产品的不断发展和临床、实验经验的不断积累，质量控制、数据处理、伦理、人员培训等问题都将迎刃而解，NGS 技术会逐渐成为肿瘤主要的、常规的检查项目。
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（收稿日期：2014-06-03，修回日期：2014-07-02）
（本文编辑：王海燕，陈维忠）
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《临床检验杂志》编辑部
２０１０年第１０期杨晓玲等：新一代测序技术的发展及应用前景 等交叉学科的迅猛发展。 １．１第二代测序——高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不再需要大肠杆菌进行体内扩增，而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序¨】。根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序和连接酶合成测序。１．１．１聚合酶合成测序法Ｒｏｃｈｅ公司推出的４５４技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Ｓａｎｇｃｒ测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因此一经推出，便受到了国际上基因组学专家的广泛关注。４５４采用焦磷酸合成测序法ＨＪ，避免了传统测序进行荧光标记以及跑胶等繁琐步骤，同时利用乳胶系统对ＤＮＡ分子进行扩增，实现了大规模并行测序。截止到２０１０年４月，已有７００多篇文献是采用了４５４测序技术（ｈｔｔｐ：／／４５４．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｎｄ—ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｓｐ），对该技术是一个极大的肯定。 Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司推出的Ｓｏｌｅｘａ遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的ＤＮＡ单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大改善。同时Ｓｏｌｅｘａ公司提出的可逆终止子”１也是该技术获得认可的原因之一。与４５４相比。Ｓｏｌｅｘａ拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种来说，Ｓｏｌｅｘａ理所当然成为第二代测序技术的首选。２００８年以来，利用该技术开展的研究大幅度上升，报道文献达４００多篇（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ／ｇｅｎｏｍｅ—ａｎａｌｙｚｅｒ＿ｉｉｘ．ｉｌｍｎ）ｏ １．１．２连接酶合成测序法２００７年ＡＢＩ公司在Ｃｈｕｒｃｈ小组拍１研究成果的基础上推出了ＳＯＬＩＤ测序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码…的应用，即每个碱基被阅读两次，因此大大减少了测序带来的错误率，同时可以方便的区分ＳＮＰ和测序错误。在测序过程中，仪器自动加入４种荧光标记的寡核苷酸探针，探针与引物发生连接反应，通过激发末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。目前ＳＯＬＩＤ３．０测序通量可达２０Ｇ，而测序片段仅有３５—５０ｂｐ，这使得该技术与Ｓｏｌｅｘａ相比，应用范围还不够广泛。ＡＢＩ公司正加快研发进度，争取在片段长度方面做出重大突破。 ＤａｎａｈｅｒＭｏｔｉｏｎ公司推出Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ¨１测序仪同样也是基于Ｃｈｕｒｃｈ小组的研究成果，但是该设备的成本要低很多，同时用户在使用时可以根据自己的研究目的设置不同的测序条件。而ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅ—ｎｏｍｉｃｓ公司推出的ＤＮＡ纳米阵列与组合探针锚定连接测序法＂１则具有更高的容错能力，试剂的消耗也进一步减少，目前已顺利完成３个个体基因组的测序工作。 １．２第三代测序——单分子长片段有望实现第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突破，但是仍然建立在ＰＣＲ扩增的基础上。为了避免ＰＣＲ扩增带来的偏差，科学家目前正在研制对ＤＮＡ单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的包括Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ单分子测序仪，单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。 Ｈｅｌｉｃｏｓ技术仍然是基于合成测序原理¨…，它采用了一种新的荧光类似物和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ公司研发的单分子实时合成测序法充分利用了ＤＮＡ聚合酶的特性，可以形象的描述为通过显微镜实时观测ＤＮＡ聚合酶，并记录ＤＮＡ合成的整个过程。纳米孔测序技术［１１’１２１则是利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍有不同，或者不同碱基通过小孔的能力各有差异，来加以区分不同的碱基信号。 ２应用与实践 Ｋａｈｖｅｊｉａｎ在２００８年的一篇综述中提到¨“：“如果你可以随心所欲地测序，你会开展哪些研究？”。人类基因组计划的完成和近年来高通量测序的兴起，使越来越多的科研工作者认识到，我们对于生物界的认识才刚刚起步。基因图谱的绘制并不意味着所有遗传密码的破解，癌症基因组的开展也没有解决所有的医学难题。ＤＮＡ变异的模式和进化机制，基因调控网络的结构和相互作用方式，复杂性状及疾病的分子遗传基础等，仍是困扰生物学家和医学家的难题，而高通量测序的广泛应用，也许可以让我们知道的更多。 ２．１ＤＮＡ水平的应用 ２．１．１全基因组测序新一代测序技术极大地推
各种肿瘤标志物及其临床意义为方便大家学习记忆肿瘤标志物的参考意义现总结归纳如下：甲胎蛋白(AFP):60%~70%原发性肝癌患者甲胎蛋白可升高,为肝癌的早期诊断提供重要依据特别是有乙肝、肝硬化的患者应定期监测。 癌胚抗原(CEA):胃肠道肿瘤,特别是肠癌,癌胚抗原会升高。癌胚抗原对手术后监测有重要意义,肠癌患者经过治疗癌胚抗原可下降或恢复正常,如果手术后癌胚抗原持续升高,就要考虑复发转移的可能,所以应定期监测。 前列腺特异抗原(PSA):广泛应用于前列腺癌的肿瘤标志物,65岁以上老年男性特别要注意,前列腺癌与前列腺肥大症状相似,两者都有尿频、尿急、排尿困难、夜尿增多等表现,如果出现这些症状,务必检测前列腺特异抗原,以排除是否患有前列腺癌。 糖类抗原19-9(CA19-9):对于诊断胰腺癌的临床应用价值较高,高敏性为91.7%,特异性为85% 糖类抗原125(CA-125):80%~90%女性卵巢癌患者糖类抗原125可升高。但也有不少非卵巢癌的恶性肿瘤可升高,如胰腺癌、肝癌、胃肠癌、乳腺癌。 化验患者血液或体液中的肿瘤标志物,可在肿瘤普查中早期发现肿瘤,并观察肿瘤治疗的疗效以及判断患者预后。目前临床上常用的肿瘤标志物有:
1)甲胎蛋白(AFP)为原发性肝癌、睾丸癌、卵巢癌等肿瘤的标志物; 2)癌胚抗原(CEA)为消化系统肿瘤、肺癌、乳腺癌等肿瘤的标志物; 3)糖类抗原125(CA125)为卵巢癌等肿瘤的标志物; 4）糖类抗原153(CA153)为乳腺癌等肿瘤的标忐物; 5)糖类抗原19-9(CA19-9)为消化系统肿瘤的标志物; 6)糖类抗原724(CA724)为胃癌、卵巢癌等肿瘤的标志物 7)糖类抗原242(CA242)为消化系统肿瘤的标志物; 8)糖类抗原50(CA50)为消化系统肿瘤、乳癌、肺癌等肿瘤的标志物; 9) CYFRA21-1(cy211)为非小细胞肺癌等肿瘤的标志物; 10）神经元特异性烯醇化酶(NSE)为小细胞肺、神经内分泌肿瘤等肿瘤的标志物; 11）前列腺特异性抗原(PSA)为前列腺癌的肿瘤标志物; 12）人绒毛膜促性腺激素(HCG)为胚胎细胞癌、滋养层肿瘤(绒癌、葡萄胎)等肿瘤的标志物: 13）甲状腺球蛋白(TG)为甲状腺癌的标志物 14）铁蛋白 (SF)为消化系统肿蜜、肝癌、乳腺、肺癌等肿瘤的标志物: 15）B2微球蛋白(B2MG)在慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肺癌、甲状腺癌、鼻咽等患者体液中升高; 16）鱗状细胞抗原(SCC)为宫颈瘟、肺鳞癌、食管癌等肿瘤标志物。目前临床上检测的肿瘤标志物绝大多数不仅存在于恶性肿瘤中,也存在于良性肿瘤、胚胎组织甚至正常组织中。因此,肿瘤标志物有动态
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用
随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不
肿瘤标志物及其临床应用 肿瘤标志物概念 肿瘤标志物是癌细胞在发生过程中产生的一种或几种正常细胞所没有的或含量很低的“特异性”物质，或者是宿主细胞对癌细胞入侵反应所产生的正常细胞成分，但在量或质上与正常细胞或良性疾病相比有显著差异 肿瘤标志物很重要，但目前尚无统一的分类和命名 分类： 细胞肿瘤标志物（cellular Tumor Marker) 主要是指肿瘤组织或肿瘤细胞膜上表达的标志如生长因子、激素受体、癌基因以及抗癌基因表达产物P53等 体液肿瘤标志物（humoral Tumor Marker） 是指由肿瘤组织分泌到外周血和尿等体液物质中中的标志，其浓度高于正常生理水平，如肿瘤相关抗原（CEA、AFP和CA系列抗原）以及肿瘤诱导产生的物质（如CRP） 根据肿瘤标志物的来源、分布、增殖程度 及其与肿瘤的关系，有可分为5类： ⑴原位性肿瘤相关物质：在同类的正常细胞中含量甚微，但当细胞癌变时迅速增加，如一些细胞蛋白、各种细胞的酶。特异性不强。 ⑵异位性肿瘤相关物质：是由突变的肿瘤细胞产生，不是同类正常细胞的组分，如异位性激素、脑癌血ACTH可明显升高。小细胞肺癌时血，NSE明显增加，这类物质表达的特异性较强 ⑶胎盘和胎儿性肿瘤相关物质：在胎儿过程中可升高，当胎儿成长后开始消失，而在成人组织细胞癌变时，这类物质又再次产生或表达；癌胚性物质如CEA、AFP、碱性胎儿蛋白(BFP）
和组织多肽抗原(TPA）；癌胎盘性物质，如妊娠蛋白（SP）；激素如HCG、酶和同工酶。 ⑷病毒性肿瘤相关物质：可引起人或动物肿瘤生成或细胞恶性转化病毒，分为DNA和RNA 病毒两种，如HTC-1病毒（成人T细胞白血病）；EB病毒（伯基特化淋巴瘤），HS病毒（宫颈癌与皮肤癌），HB病毒（肝癌）和人巨细胞病毒等 ⑸癌基因、抗癌基因及其产物：癌基因激活和抗癌基因失活及其产物表达异常，是肿瘤发生和发展的重要标志，如CD117阳性表达，是确诊胃肠间质瘤（GIST）的依据。 综上所述，人体的细胞、组织、血液或体液中有许多物质可作为肿瘤标志物，如酶、激素、抗原、多肽和蛋白质等，广义的肿瘤标志物还 包括肿瘤相关抗原，肿瘤相关基因及其产物等 肿瘤标志物的临床用途 ㈠肿瘤筛查应是一份方便简易的方法，但由于大多数肿瘤标志物同时存在于健康人组、良性疾病组和恶性肿瘤组的循环血液中，而且浓度水平有较大的重叠，其特异性不足以用于癌症普查的过筛试验，只在肿瘤的高发区或有肿瘤家族史的高危人群中作为过筛试验。 ㈡临床诊断：由于大多数肿瘤标志物的特异性和灵敏度尚不够高，难以准确区别恶性肿瘤和良性疾病。标志物浓度轻度升高，可能属于正常范围内的变异，也可见于非恶性疾病。因此，不能单纯依靠某一肿瘤标志物的测定诊断癌症。但作为肿瘤的辅助诊断，特别是肿瘤标志物联合检测，可提高肿瘤诊断的特异性，取得非常成功。 联合检测 一般选择细胞类型相同的肿瘤所共同表达的标志物，有助于鉴定癌的原发部位。 以上皮细胞癌检测盘为例，乳腺癌、卵巢癌肠癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌等来自上皮细胞都含有类似的遗传组分，但由于各种细胞的细胞分化不同，标志物的表达水平有差别，即
肿瘤标志物的临床解析 全网发布：2011-06-23 21:59 发表者：曹水江(访问人次：4326) 肿瘤标志物（tumor marker)定义 1978年NCI提出 1979年确认并开始使用 由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织本身，或分泌至血液或其他体液，或因肿瘤组织刺激，由宿主细胞产生而含量明显高于正常参考值的一类物质。 应当具备：特异性强；敏感性好 肿瘤标志物常用检测技术 免疫学检测技术 酶免疫测定技术, 荧光免疫测定技术, 放射免疫测定技术（RIA), 免疫组织化学技术 分子生物学检测技术 DNA提取技术, DNA杂交技术, 限制性内切酶片段长度多态分析（RFLP）,PCR技术 肿瘤标志物分类 蛋白质类肿瘤标志物 甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）β 2微球蛋白本-周蛋白铁蛋白前列腺特异性抗原甲状腺球蛋白SCC-Ag CYFRA21-1，组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen，TPA） 糖类肿瘤标志物 CA19-9 CA50 CA242 CA72-4 CA125 CA15-3(CA-27-29) 酶类肿瘤标记物 α-L-岩藻糖苷酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶乳酸脱氢酶神经元特异性烯醇化酶 激素类肿瘤标志物 促肾上腺皮质激素降钙素儿茶酚胺类人绒毛膜促性腺激素 多胺类肿瘤标志物 5-羟色胺 蛋白质类肿瘤标志物(9) 甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）β 2微球蛋白本-周蛋白铁蛋白前列腺特异性抗原甲状腺球蛋白SCC-Ag CYFRA21-1 甲胎蛋白（AFP） 1956年在人胎儿血清中发现,单链糖蛋白590aa, MW70000, 胎儿6周开始合成，12-15周高峰，出生后1-2年降至成人水平, 正常妊娠中期达90-500ng/ml, 正常参考值：＜10ug/L AFP临床意义 （1）原发肝癌 80% AFP>400ng/ml, 原发肝癌近20% AFP正常 （2）病毒性肝炎、肝硬化绝大部分AFP<400ng/ml (3）内胚层癌、畸胎瘤、睾丸癌、卵巢癌、胃癌与其伴肝转移者AFP可升高 （4）妇女妊娠3个月后，AFP开始升高，7-8个月时达高峰，一般在400ng/ml以下，分娩后3周恢复正常
新一代测序法简介 新一代测序方法是一种直接测序法，它既可以分析基因和DNA的组成(定性分析)，也可以测定同一类型基因在表达过程中产生的数量（定量分析），以及不同类型基因或DNA 之间的差别所在（交叉对比分析）。自2004年，454测序技术发展以来，已经出现的测序产品超过六种之多。这些产品的技术特点见下表： 产家名称产品技术特点优缺点 化学反应测序方法误读率样品准备高通量程度 Roche (454 Life Science) 焦磷酸标记的链 反应 焦磷酸基 标记 <1% 较复杂，需PCR 中等 Illumina（Solexa）四色可逆终止码合成法1%—3% 较复杂，需PCR 中—高ABI(SOLID) 双色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高Helicos Bioscience 单色可逆终止码合成法2%—8% 简单，无需PCR 高—超高Intelligent Biosystm 四色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高 Pacific Bioscience 四色焦磷酸基标 记焦磷酸基 标记 3%—8% 简单，无需PCR 高 VisiGen 焦磷酸基标记 FRET 焦磷酸基 标记 3%—8% 简单，无需PCR 高 在这些技术中，从所分析的样本在测序前是否需要扩增，大致可以分为两类，即克隆扩增型和单分子测序型。两种类型在测序技术上区别并不大，但对结果的影响却有不小的差别。主要体现在两个方面：（1）单分子测序更能反应细胞或组织内分子的真实情况，尤其是在需要定量分析的情况下。而克隆扩增型中的PCR反应使得样品中DNA分子的扩增机会并不完全均等，这会对基因表达的定量分析造成影响；（2）单分子测序具有通量更高的优势。克隆扩增使得同一类型的分子数目急剧上升，在提高同类型分在在固相表面出现的几率同时，也降低了不同类型分子出现的机会。 面重点介绍Pacific Biosciences公司推出的Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing（单分子实时DNA测序）。 首先，在这一测序技术中有主要有两个关键的技术： 一、荧光标记的脱氧核苷酸避免了碱基的空间位阻效应。显微镜现在也无法实现实时看到“单分子”，但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA 链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样； 二、纳米微孔（Zero-mode waveguide (ZMW)）。因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景，这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有10nm的纳米孔，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学
高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望 对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1 测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（single molecule realtime，SMRT）DNA测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBio RS II每次运行能够产生60 000×16条序列，每条序列的平均长度达8 500 bp。 一般来说，以上每种测序仪在序列读段长度、准确性、测序通量、价格等多个方面存在一定的差异。焦磷酸测序平台测序读段较长，测序通量较低，成本相对较高；Illumina系列平台产生的读段相对较短，测序费用相对较低，应用比较广泛；SOLiD测序平台在通量和准确性方面相对以上2种类型的测序平台有明显改善，但是测序长度更短；半导体测序平台以及SMRT测序平台相比其他测序平台运行时间较短，另外单分子测序平台减少了测序前的扩增准备工作，测序读段较长，但是测序成本和错误率都相对较高[8-10]。一些常用的测序仪的测序原理和性能见表1。
作者：尹银亮、陈会平、毛良伟译来源：生物谷 原文刊登于《分析化学》综述Analytical Chemistry 原文标题：Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies 索引信息：https://www.doczj.com/doc/f79955861.html,/10.1021/ac2010857 | Anal. Chem. 2011, 83, 4327–4341 原文作者：Thomas P. Niedringhaus, Denitsa Milanova, Matthew B. Kerby, Michael P. Snyder,and Annelise E. Barro 译者资料： 尹银亮，香港华大基因研发中心有限公司email：stevenyinbio@https://www.doczj.com/doc/f79955861.html, 陈会平，毛良伟，武汉华大基因科技有限公司 【内容】 第二代测序 第二代测序成本 第三代测序技术 单分子测序法 边连接边测序法 边合成边测序法 纳米孔测序技术 蛋白质纳米孔测序法 固态纳米孔测序法 长距离阅读DNA的扩展方法 总结性评论 DNA测序正处在技术上天翻地覆剧变的阵痛之中，其突出特点是，测序通量（测序数据量）的大幅增长，原始数据中每个碱基的测序成本急剧下跌，并伴随着以巨资购买仪器以引进新技术的需求。以前看似高不可攀的奢侈性研究活动（如个人基因组测序，宏基因组学研究，以及对大量重要物种的测序），在短短几年之间，正以急速的步伐而变得越来越切实可行了。本篇综述将集中讨论在第三，第四代测序方法背后的故事：它们所面临的挑战；各种方法的局限性；以及它们带给我们的充满诱惑的前景。 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌 体X174的，全长5375个碱基。其测序方法和历史过程以前已做过详细回顾。 后来的四色荧光桑格测序法（每一种荧光代表四种碱基中的一种）被用在自动毛细管电泳测序系统中，此系统由应用生物系统有限公司（Applied Biosystems Inc.）推上市场，后来该公司被整合入生命技术公司(Life Technologies)和贝克曼.考尔特公司(Beckman Coulter inc.)（见表1）。发表于2001年的第一个人类基因组
(1) AFP：甲胎蛋白： (2)CEA：癌胚抗原 (3)CA199：糖类抗原199 (4)CA125：癌抗原125 (5)CA153：肿瘤抗原153 (6)CA50：癌抗原50 (7)CA242：糖类抗原242 (8)β2—MG：β2—微球蛋白 (9)Fe Pro：血清铁蛋白： (10)NSE：神经元特异性烯醇化酶 (11)HCG：人绒毛膜促性腺激素 (12)TNF：肿瘤坏死因子 AFP：甲胎蛋白： 甲胎蛋白是一种糖蛋白，英文缩写AFP。正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克／升。但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。 检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于500微克／升、且持续４周者，或甲胎蛋白在200～500微克／升、持续８周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。不过，正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25～200微克／升之间，一般在２个月内随病情的好转而下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。如果甲胎蛋白浓度在 500 微克／升以上，虽有转氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。 甲胎蛋白在肝癌出现症状之前的8个月就已经升高，此时大多数肝癌病人仍无明显症状，肿瘤也较小，这部分患者经过手术治疗后，预后可得到明显改善，故肝硬化、慢性肝炎病人、家族中有肝癌患者的人应半年检测一次。 CEA：癌胚抗原 CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，15％～53％的病人血清CEA也会升高，所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。此外，血清CEA水平与大肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，CEA浓度越高。 97％的健康成人血清CEA浓度在2．5ng／mI以下。
干货：肿瘤标志物的临床应用、问题及思考题及思考 来源：检验医学网 作者：李金明，研究员，医学博士。系卫生部临床检验中心副主任 肿瘤标志物（Tumormarker，TM）是指存在于血液、体液和组织中可检测到的与肿瘤的发生、发展有关的物质，其或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织中的含量，其存在或量变可提示肿瘤的性质，从而了解肿瘤的发生、细胞分化及功能，在肿瘤的诊断、分类、预后和复发判断及指导临床治疗中起辅助作用。TM通常包括蛋白质（上皮粘蛋白、胚胎蛋白、糖蛋白等）、激素、酶、糖 决定簇、病毒和肿瘤相关基因及其结构改变等。最早的肿瘤标志物可以追溯到1846年在多发性骨髓瘤患者尿中发现的一种特殊蛋白，后以发现者的名字命名 为本-周（Bence-Jones）蛋白，用于多发性骨髓的辅助诊断。1928年后，众多 的激素类、蛋白类肿瘤标志物相继被发现，并用于临床检测，如人绒毛膜促性腺 激素（hCG）；促肾上腺皮质激素（ACTH）；甲胎蛋白（AFP）；癌胚抗原（CEA）；糖蛋白（CA125）和鳞状细胞癌相关抗原（SCC）等；糖决定簇包括CA19-9、CA50和CA72-4等；酶类包括前列腺特异抗原（PSA）、神经元特异性烯醇化 酶（NSE）、前列腺碱性磷酸酶（PAP）和前列腺酸性磷酸酶（PACP）等；上皮粘蛋白如CA15-3、CA549和BR27.29等；病毒如人乳头瘤病毒（HPV）、EB病毒和乙型肝炎病毒（HBV）等；基因如BRCA1/BRCA2遗传性乳腺癌相关 基因、APC基因（家族性腺瘤样息肉病筛查）和微卫星不稳定性（MSI，用于遗传性非息肉性结肠癌筛查）；基因结构变化如kRAS和上皮生长因子受体（EGFR）基因突变与结直肠癌和非小细胞肺癌靶向治疗药物使用；外周血游离DNA的量等。此外，新的肿瘤标志仍在不断发现。如此众多的肿瘤标志物，再加上肿瘤标 志物通常在正常和良性疾病情况下也有不同程度表达，表现在体液中有量的变化，因此，肿瘤标志物对特定的肿瘤通常缺乏特异性。临床实践中，如何正确而又有 效地使用肿瘤标志物，在国际上，一些学会或组织制定了一些指南，如美国国家 临床生化学会（NACB）、美国癌症学会（ACS）、美国内科医师协会（ACP）、美国临床肿瘤学会（ASCO）和欧洲肿瘤标志物专家组（EGTM）等。但由于长 期以来所形成的观念和人们对肿瘤的恐惧心理，肿瘤标志物的临床应用仍存在诸
(1) AFP：甲胎蛋白： 令狐采学 (2)CEA：癌胚抗原 (3)CA199：糖类抗原199 (4)CA125：癌抗原125 (5)CA153：肿瘤抗原153 (6)CA50：癌抗原50 (7)CA242：糖类抗原242 (8)β2—MG：β2—微球蛋白 (9)Fe Pro：血清铁蛋白： (10)NSE：神经元特异性烯醇化酶 (11)HCG：人绒毛膜促性腺激素 (12)TNF：肿瘤坏死因子 AFP：甲胎蛋白： 甲胎蛋白是一种糖蛋白，英文缩写AFP。正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克／升。但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。
检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于500微克／升、且持续４周者，或甲胎蛋白在200～500微克／升、持续８周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。不过，正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25～200微克／升之间，一般在２个月内随病情的好转而下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。如果甲胎蛋白浓度在 500 微克／升以上，虽有转氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。 甲胎蛋白在肝癌出现症状之前的8个月就已经升高，此时大多数肝癌病人仍无明显症状，肿瘤也较小，这部分患者经过手术治疗后，预后可得到明显改善，故肝硬化、慢性肝炎病人、家族中有肝癌患者的人应半年检测一次。 CEA：癌胚抗原 CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。CEA 升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用 发布时间:2014-07-19 来源:毕业论文网 随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005 年，以Illumina 公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和Walter Gibert 发明了Sanger 测序法，并在此后的10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当DNA 链加入分子ddNTP，延伸便终止。每一次DNA 测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA 片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如，临床上采用Sanger 直接测序FGFR 2 基因证实单基因Apert 综合征和直接测序TCOF1 基因可以检出多达90% 的与Treacher Collins 综合征相关的突变。值得注意的是，Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 直接扩增测序。
下一代测序技术 摘要：DNA测序技术对生物学的发展有着最根本的意义。Sanger法测序经过了30年的应用和发展，而在过去三年中，以454, solexa, SOLiD为代表的高通量测序平台已经大幅度降低了测序成本，提高了测序速度，成为基因组测序市场的主流。在此基础上，各种下一代测序技术正在快速研发，将使基因组测序和重测序的通量和成本更加平民化，为基因组学、遗传学、生物医学和健康科学等领域的发展创造更加广阔的前景。本文将对所有新的测序技术的原理、优势和应用进行总结和展望。 1977年Maxim、Gilbert发明的化学降解法测序技术和Sanger发明的双脱氧末端终止法测序技术不仅为他们赢得了诺贝尔奖，也使得从DNA序列层面研究分子遗传学成为可能。特别是后者，从最开始的凝胶电泳到越来越高通量的毛细管电泳，从开始的手工操作到越来越多自动测序仪的出现，各种改进的Sanger 测序技术统治了DNA测序领域三十年，至今仍在长片段测序，大片段文库测序方面有广泛的应用。人类基因组计划（HGP）的完成就是靠Sanger测序法。 在耗费了庞大成本的人类基因组计划宣布完成之后，越来越多的物种基因组测序工作对测序成本和通量提出了更高的要求，新一代测序技术（也被称为第二代测序技术）开始登上历史舞台。2005年454 life science公司率先推出了焦磷酸测序技术，使测序成本较Sanger法降低了100倍，速度快了（提高）100倍，人类基因组测序逐步进入了100，000美元时代。如今，454 FLX测序仪（Roche Applied Science）、基于“边合成边测序”的Solexa测序仪(Illumina Inc.)和使用“边连接边测序”的SOLiD测序仪(Applied Biosystems)已经成为基因组测序市场的主流机型。除此之外，2008年一年内又有HeliScope单分子测序仪（Helicos）和Polonator(Dover/Harvard)两种测序机型商品化。 在NHGRI（美国人类基因组研究中心）的支持和推动下，未来几年内测序成本将在目前基础上再下降100倍，最终使个人基因组测序成本降至1000美元，人类将革命性的进入个人基因组时代。高通量和低成本的测序技术将进入到普通实验室，基因组测序的简单化将使分子生物学飞跃发展，个人基因组测序产业化也将对健康医学等领域产生革命性的影响。本文将首先对目前已经商品化的新一代测序技术（454、Solexa、SOLiD、HeliScope）做一介绍和比较，再对正在研发中的各种下一代测序方法（第三代测序技术）的原理和应用做一详细的介绍和展望。 1. Roche 454测序技术 2005年454生命科学公司在《自然》杂志发表论文，介绍了一种区别于传统Sanger法的全新高通量测序方法，将测序成本降低了100倍以上，开创了第二代测序技术的先河，454测序仪也成为最先商品化的第二代测序仪。正是在此基础上，其它如Solexa、SOLiD等第二代测序仪才相继问世。454测序技术的原理在于首先使用乳液PCR（emulsion PCR）技术（图一a）扩增已经连接上接头的基因组文库片段，扩增子结合在28 μm的磁珠表面，将乳液破坏后用变性剂处理磁珠，再将含有扩增子的磁珠富集到芯片表面，用测序引物进行测序。在测序过程中，454使用了一种“焦磷酸测序技术”（Pyrosequencing），即在合成DNA 互补链的过程中，每加入一种单核苷酸（dNTP），如与模板链配对结合，就会释放出一个焦磷酸，与底物腺苷-5’-磷酸硫酸（APS）在A TP硫酸化酶作用下合成A TP，与荧光素（Luciferin）一起在荧光素酶(Luciferase)的作用下，会发出一个光信号，由芯片背后连接的电荷耦合装置（CCD，Charge Coupled Device）捕捉。454测序技术合成DNA链使用的是普通单核苷酸，没有任何标记，合成中也没有切割基团等生化反应，因此读长可以达到300-400bp。但没有阻断（block）和去阻断（de-block）过程也意味着对连续重复单核苷酸的阅读只能根据信号强度来判断，容易对其中插入和缺失碱基阅读错误。454测序技术相比较其他第二代测序技术如Solexa和SOLiD, 在读长上有着巨大的优势，但是目前成本要略高。总体而言，高读长使得454技术比较利于De Novo拼接和测序。
肿瘤标志物的临床应用 肿瘤标志物的临床应用如东县人民医院肿瘤诊治中心徐然*概念肿瘤标志物（TumorMarkerTM）指在肿瘤的发生和增殖过程中由肿瘤细胞本身合成、释放所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的一类生化物质。 它表示肿瘤的存在并反映其一定的生物特性。 *辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价。 发展史发现：年BenceJones发现本周蛋白。 推广应用：年Abelev发现AFP与肝癌的关系。 Gold等发现CEA在消化系统肿瘤中的应用价值。 放免技术的诞生和应用。 发展：年单克隆抗体技术的建立。 糖类肿瘤抗原的涌现。 理想中的肿瘤标志物特异性好疗效监测监测复发预测预后灵敏度高具有器官特异性与肿瘤类型(大小分期)相关TM的分类、胚胎抗原类标志物（AFP、CEA）、蛋白类标志物（?MG、SF）、糖链抗原标志物（CA、CA）、酶类标志物（γGT、PAP）、激素类标志物（?hCG、ACTH）、基因类标志物（ras基因、bcl基因）*按肿瘤标记物本身的性质分类、从肝癌、结肠癌的组织中发现的而胚胎时期的肝、胃肠管组织也能合成并存在于胎儿的血清中因此称为胚胎抗原。 、蛋白类标记物：β微球蛋白铁蛋白等在肿瘤发生时会升高多发性骨髓瘤时本周蛋白阳性是临床常用的肿瘤标志物。
、糖类标记物：是用各种肿瘤细胞株制备单克隆抗体来识别的肿瘤相关抗原大多是糖蛋白或粘蛋白如CACACA等。 、酶类标记物：当机体某个部位发生肿瘤时,肿瘤细胞代谢异常使某些酶或同工酶合成增加或由于肿瘤组织的压迫和浸润导致某些酶的排泄受阻使肿瘤患者血清中酶活性异常升高。 酶是较早发现并用于临床诊断的一类肿瘤标志物如患肝癌时γGT升高患前列腺癌时PAP（前列腺酸性磷酸酶）升高等。 、激素类标记物：正常情况下不产生激素的某些组织在发生恶变时能产生和释放一些肽类激素（异位内分泌激素）并导致相应的征候群因此这些异位内分泌激素升高也可作为肿瘤相关的标志物如小细胞肺癌可分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）患甲状腺髓样癌时降钙素升高患绒毛膜上皮细胞癌时hCG明显升高。 、基因类标记物：癌基因的激活和抑癌基因的变异可使正常细胞发生恶变导致肿瘤的发生。 因此癌基因表达的蛋白可作为肿瘤标志物如ras基因蛋白myc基因蛋白p抑癌基因蛋白等。 胚胎抗原类肿瘤标志物常见肿瘤标志物⑴甲胎蛋白（αfetoproteinAFP）AFP是一种肝细胞和生殖细胞（非精原细胞）恶性肿瘤的标志物分子量为kD的糖蛋白。 主要由胚胎肝、卵黄囊、胃肠上皮细胞产生。 成人由肝脏产生。
1．甲胎蛋白（AFP） AFP是早期诊断原发性肝癌最敏感、最特异的指标，适用于大规模普查，如果成人血AFP值升高，则表示有患肝癌的可能。 AFP含量显著升高一般提示原发性肝细胞癌，70~95%患者的AFP升高，越是晚期，AFP含量越高，但阴性并不能排除原发性肝癌。AFP 水平在一定程度上反应肿瘤的大小，其动态变化与病情有一定的关系，是显示治疗效果和预后判断的一项敏感指标。AFP值异常高者一般提示预后不佳，其含量上升则提示病情恶化。通常手术切除肝癌后二个月，AFP值应降至20ng/ml以下，若降的不多或降而复升，提示切除不彻底或有复发、转移的可能。在转移性肝癌中，AFP值一般低于350-400ng/ml。 妇产科的生殖腺胚胎癌、卵巢内胚窦癌AFP也会明显升高。AFP中度升高也常见于酒精性肝硬化、急性肝炎以及HBsAg携带者。某些消化道癌也会出现AFP升高现象。孕妇血清或羊水AFP升高提示胎儿脊柱裂、无脑症、食管atresia或多胎，AFP降低(结合孕妇年龄)提示未出生的婴儿有Down’s综合征的危险性。 正常参考值：0～15 ng/ml 2．癌胚抗原（CEA） 在正常成人的血液中CEA很难测出。CEA是一种重要的肿瘤相关抗原，70-90%的结肠腺癌患者CEA高度阳性，在其它恶性肿瘤中的阳性率顺序为胃癌（60-90％）、胰腺癌（70-80％）、小肠腺癌（60-83％）、肺癌（56-80％）、肝癌（62-75％）、乳腺癌（40-68％）、
泌尿系癌肿（31-46％）。胃液（胃癌）、唾液（口腔癌、鼻咽癌）以及胸腹水（肺癌、肝癌）中CEA的阳性检测率更高，因为这些肿瘤“浸泡液”中的CEA可先于血中存在。CEA含量与肿瘤大小、有无转移存在一定关系，当发生肝转移时，CEA的升高尤为明显。 CEA测定主要用于指导各种肿瘤的治疗及随访，对肿瘤患者血液或其他体液中的CEA浓度进行连续观察，能对病情判断、预后及疗效观察提供重要的依据。CEA的检测对肿瘤术后复发的敏感度极高，可达80%以上，往往早于临床、病理检查及X光检查。 大量临床实践证实，术前或治疗前CEA浓度能明确预示肿瘤的状态、存活期及有无手术指征等。术前CEA浓度越低，说明病期越早，肿瘤转移、复发的可能越小，其生存时间越长；反之，术前CEA浓度越高说明病期较晚，难于切除，预后差。 在对恶性肿瘤进行手术切除时，连续测定CEA将有助于疗效观察。手术完全切除者，一般术后6周CEA回复正常；术后有残留或微转移者，可见下降，但不恢复正常；无法切除而作姑息手术者，一般呈持续上升。CEA浓度的检测也能较好地反映放疗和化疗疗效。其疗效不一定与肿瘤体积成正比，只要CEA浓度能随治疗而下降，则说明有效；若经治疗其浓度不变，甚至上升，则须更换治疗方案。 CEA检测还可对经手术或其他方法治疗使CEA恢复正常的病人，进行长期随访，监测其复发和转移。通常采用以下方案：术后第六周一次；术后三年内，每月一次；3-5年每三月一次；5-7年每半年一次；7年后一年一次。若发现升高，两周后再测一次，两次都升高则提示