在正常发育过程中，大脑通过程序性细胞死亡或凋亡这一生理现象消除多余的神经元。未成熟大脑调节该细胞删减过程的机制尚未完全阐明。然而，越来越多的体外和体内实验［１－３］证据表明，对Ｎ－甲基－Ｄ－天冬氨酸受体（ＮＭＤＡ）的适量刺激对未成熟神经细胞的存活至关重要。ＮＭＤＡ受体，它是中枢神经系统中谷氨酸兴奋性氨基酸受体的主要亚型，并已证实其与神经元的毒性和可塑性有关。不少研究报道［４－５］，ＮＭＤＡ受体的过度刺激，即兴奋性神经毒性，在某些病理条件下会加剧神经元的损伤，而对ＮＭＤＡ受体的刺激减弱则会引发中枢神经系统未成熟神经细胞凋亡。给予非竞争性ＮＭＤＡ受体拮抗剂氯胺酮或更为强效、半衰期更长的（＋）ＭＫ鄄８０１可以药物阻断ＮＭＤＡ受体。Ｉｋｏｎｏｍｉｄｏｕ等［６］研究发现，长时间给予ＭＫ鄄８０１或氯胺酮于首次给药的２４ｈ后显著增加大鼠未成熟大脑的神经元的凋亡。
氯胺酮是临床广泛使用的麻醉剂，因此，
Ｉｋｏｍｏｍｉｄｏｕ等人的报道提出了新生儿使用氯胺酮
的安全问题。虽然长时间使用氯胺酮会产生神经元凋亡，仍需要弄清是否短时间的ＮＭＤＡ受体阻滞也会产生相似的促凋亡的影响。鉴于氯胺酮在体内半衰期短，主要用于麻醉诱导，因此，有必要研究氯胺酮在体内对未成熟大脑的神经元凋亡的
短期影响。本研究用于探讨氯胺酮给药的剂量和时间对大鼠未成熟脑组织的神经元凋亡的影响。１材料与方法
１．１
实验动物经广东省医学实验动物中心实验动物照护及使用委员会审查同意，选取７日龄ＳＤ大鼠与其母鼠用于本实验。所有注射入大鼠体内的药物容量均为以生理盐水稀释氯胺酮药液达到１０ｍＬ／ｋｇ。１．２实验方法
实验分为两步：第一步是检测单
次注射氯胺酮对神经元凋亡的影响，７日龄ＳＤ大鼠随机分为４组（每组６只）腹腔内注射：生理盐
水（对照组）；氯胺酮２５ｍｇ／ｋｇ（Ｋ２５）；氯胺酮５０ｍｇ／ｋｇ（Ｋ５０）和氯胺酮７５ｍｇ／ｋｇ（Ｋ７５）。第二步是检测多次注射氯胺酮对神经元凋亡的影响，７日龄
ＳＤ大鼠随机分为两组（每组８只）在９ｈ内以９０ｍｉｎ为间隔重复腹腔内注射生理盐水或氯胺酮。此
外，比较禁食对体重增长的影响，四组仔鼠在注射盐水或氯胺酮后回到母鼠身边继续哺乳或与母鼠分开并禁食进行了对比研究。仔鼠均于首次注射后２４ｈ再次称重。
首次注射２４ｈ后，大鼠幼仔在异氟醚麻醉下灌注含４％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液并取大脑。经过４℃的４％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液固定后，用３０％的蔗糖溶液低温保护大脑组织，并用冰冻切片机在－２２℃下以７０μｍ厚度行连续横切片，然后固定在４％多聚甲醛溶液中。
１．３细胞凋亡的检测以原位末端标记法染色法检测细胞凋亡，采用罗氏公司的原位凋亡检测试剂盒，并按试剂盒说明书进行染色［７］。每只动物计数每个脑区２００μｍ间隔的三个连续区域的显微照片，并计算１．００ｍｍ２区域的原位末端标记法染
氯胺酮用药剂量和时间对大鼠未成熟脑组织
神经元凋亡的影响
倪锦
古妙宁钟志勇孙侠
摘要
目的：探讨氯胺酮多次用药的剂量和时间对大鼠未成熟脑组织神经元凋亡的影响。方法：７日龄
ＳＤ大鼠腹腔注射氯胺酮（非竞争性的Ｎ－甲基－Ｄ－天冬氨酸受体拮抗剂），采用原位末端标记法检测不同脑区的凋亡。结果：与生理盐水对照组比较，单剂量氯胺酮（２５、５０和７５ｍｇ／ｋｇ）神经元凋亡数的变化无统计学意义。而以９０ｍｉｎ为间隔多次注射氯胺酮（２５ｍｇ／ｋｇ）达９ｈ在大脑的１０个脑区中有７个脑区的神经元的
凋亡显著性增加。结论：氯胺酮给药时间的增加与大鼠未成熟脑组织的神经元凋亡密切相关。
关键词
神经元；
氯胺酮；
剂量；
时间；
未成熟脑；
凋亡
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６鄄５７２５.201１.１３.0１４
基金项目：广州市医药卫生科技项目（编号：２００７鄄ＹＢ鄄０６０）；广州市中医药科研项目（编号：２００９鄄Ａ鄄２６）
作者单位：５１０５１５广州市，南方医科大学南方医院麻醉科（倪锦，古妙宁）；５１０１８０广州市，广东省医学实验动物中心（钟
志勇，孙侠）
组别盐水盐水＋禁食氯胺酮氯胺酮＋禁食
基础体重
１８．７±１．９１８．５±１．８１８．９±２．０１８．６±１．９
注药后２４ｈ体重
２１．８±２．３２０．９±１．３２０．０±２．６１９．６±１．６
体重变化
３．１±１．０２．４±０．７１．１±０．６鄢＃１．０±０．９鄢＃
色阳性细胞。１．４统计学方法
所有实验数据均采用ＳＰＳＳ１０．０
进行方差分析，计算数据均采用均数±标准差表示。
２结果
单次注射氯胺酮后对大鼠的翻正反射的抑制呈剂量依赖性（表１），单次注射氯胺酮时的体重与２４ｈ之后的体重四组间差异无显著性。而首次注射药物后２４ｈ内，重复注射７次氯胺酮的大鼠体重增长较盐水禁食组和正常饮食组为慢（表２，Ｐ＜
０．０５）。用原位末端标记法记数凋亡细胞，结果显示，单次注射药物的４组间在１０个脑区内差异均无显著性。与对照组相比，重复注射７次氯胺酮组的１０个脑区中的７个脑区（颞叶皮层区、海马区、
齿状回区、丘脑背外侧区、丘脑背内侧区、丘脑腹正中区和杏仁基底正中区）凋亡细胞数显著增加，其余３个脑区（压后皮层区、顶叶皮层区和腹内侧下丘脑区）差异均无显著性。
３
讨论
单次注射氯胺酮对７日龄大鼠脑神经元凋亡的影响与多次注射氯胺酮的长期暴露者鲜明的对
比，表明ＮＭＤＡ受体阻滞时间似乎是引发神经元凋亡的一个关键因素。不过，由于种属间存在差异，啮齿类动物在体实验模型可能无法真正代表人类的病理生理过程。目前已取得共识是，在脑的爆发式增长时期，此期突触高度活跃，也是大脑发育最容易受到损伤的时期［８］。同样，在此期亦较易出现ＮＭＤＡ受体阻断剂诱导的神经元凋亡，未成熟大脑对ＮＭＤＡ受体阻断较为敏感的时间窗在大鼠和人类之间可能是不同的。大鼠的大脑爆发生长期始于产后而终止于产后２５ｄ，对于人类来说，它开始于怀孕中期（怀孕１８周），直到２岁或２岁
以上［８］。因此，人类较为敏感的时间窗可能从胎儿延续到出生后某个时点。在敏感期，对大脑的损害的时点和强度及其持续时间可能是决定神经元凋亡总数的另一个因素。在人类，要达到对大鼠
ＮＭＤＡ受体阻滞同等效应可能需要一个持续时间
较长的阻滞时间。而且人类大脑弥补神经元凋亡的能力可能比大鼠更强。
除了物种间的差异外，在对人类的新生儿和仔鼠进行氯胺酮麻醉时的生理学监测存在明显的差异。我们在进行人类的镇静或麻醉时，会密切监测和调整生理学指标，包括血压、心率、呼吸、血糖和体温，而这些参数却很少在仔鼠得到控制。事实上，大鼠给予多次氯胺酮后与对照组相比体重增长缓慢，可能就是在长时间镇静情况下营养不足的结果。非生理条件下可能阻碍正常的大脑发育，如严重营养不良本身可能引发或加剧ＮＭＤＡ受体阻断剂引起的神经细胞凋亡，本研究的结果也支持以上观点。氯胺酮，通常用于与其他麻醉或镇静药物的组合来达到较深的麻醉状态。氧化亚氮，这是目前已知的一种ＮＭＤＡ受体拮抗剂，经常与氯胺酮伍用。已有研究报道这两种药物的组合对成年大鼠的大脑具有协同的神经毒性。成人似乎比未成熟大鼠对氯胺酮和氧化亚氮的［９－１０］毒性作用更为敏感。此外，具有ＧＡＢＡＡ受体激动作用的麻醉药物（如地西泮和巴比妥）也引发了未成熟大鼠脑组织神经元凋亡［１１］。因此，为了阐明麻醉药和镇静药对大脑的神经毒性，应考虑和进一步研究各种麻醉药物组合的潜在影响。
本实验通过研究氯胺酮对７日龄大鼠脑组织中神经元凋亡的影响，得到的结果提示，氯胺酮诱导神经元凋亡不是氯胺酮药物本身对神经元的直接毒性，而是ＮＭＤＡ受体活性受抑制的结果。但是，仍需进一步研究和排除种属间差异和其他因素的影响，以充分阐明氯胺酮对人脑发育的影响。此外，目前对阻断ＮＭＤＡ受体引起神经元丧失的临床意义以及长期的神经系统的转归仍未明了，需要进一步深入研究。
４
参考文献
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［１］
［２］［３］注：与盐水组比较，鄢Ｐ＜０．０５；与盐水＋禁食组比较，＃Ｐ＜０．０５
表２
氯胺酮对体重增长的影响
ｘ±ｓ，ｇ
氯胺酮剂量（ｍｇ／ｋｇ）
２５５０７５
翻正反射（ｍｉｎ）
１３１±２８２０７±２１鄢２４５±２３＃
注：与２５ｍｇ／ｋｇ组比较，鄢Ｐ＜０．００１，＃Ｐ＜０．０００１
表１
氯胺酮剂量对翻正反射的影响
ｘ±ｓ
近年来，修复设计主导的种植体植入成为普遍接受的种植修复方针。要将种植体植入理想位置，常常需要进行植骨手术［１］。学者们尝试将各种细胞因子应用于植骨手术中，重组人骨形成蛋白－２（ｒｈＢＭＰ鄄２）是研究得较多的一种细胞因子［２］。然而，目前尚缺乏不同载体材料对ｒｈＢＭＰ鄄２骨诱导作用影响的对比研究，同时，选择何种浓度的ｒｈＢＭＰ鄄２，才能达到最佳的促进骨生成的作用，目前亦尚无统
一认识［３－５］。本研究采用两种不同载体材料和两种不同ｒｈＢＭＰ鄄２浓度，比较其对种植体周围骨缺损区内的新骨形成及其与种植体的结合情况的不同作用，以期寻找最佳修复种植体周围骨缺损的方法。１材料与方法
１．１实验动物健康雄性ｂｅａｇｌｅ犬（中山大学实验动物中心提供）８只，体重１２～１４ｋｇ，年龄１２个月。随机编号１～８号。
１．２实验器材和药品ＣＤＩＣＳＣＴⅡ３．８×１０ｍｍ柱状螺纹种植体（四川大学卫生部口腔种植中心）；珊瑚羟基磷灰石人造骨（ＣＨＡ）：北京意华健科贸有限责任公司；医用胶原蛋白海绵（ＡＣＳ）：上海其胜生物制剂有限公司；ｒｈＢＭＰ鄄２：Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，美国。
１．３
手术方法拔除实验犬双侧下颌第１～４前磨牙和第１磨牙。３个月后，行种植体植入。按种植
ｒｅｔｉｎａｌｃｅｌｌｓ：ａｎｅｗｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００６，９７（５）：１４８１－１４９３．ＬａｃＫａｍｐＡ，ＺｈａｎｇＧＣ，ＭａｏＬＭ，ｅｔａｌ．ＬｏｓｓｏｆｓｕｒｆａｃｅＮ鄄ｍｅｔｈｙｌ鄄Ｄ鄄ａｓｐａｒｔａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｍｏｕｓｅｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｅｓｄｕｒｉｎｇａｎａｅｓｔｈｅｓｉａｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｈｌｏｒａｌｈｙｄｒａｔｅｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．ＢｒＪＡｎａｅｓｔｈ，２００９，１０２（４）：５１５－５２２．
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（收稿：２０１１－０１－２１
编辑：王耀东）
［４］
［５］［６］
［７］
［８］［９］
［１０］［１１］ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６鄄５７２５.201１.１３.0１５
基金项目：广东省科技计划项目基金资助（编号：
２００５Ｂ３０９０１０１１）
作者单位：５１０２８０
广州市，南方医科大学附属口腔医院，广
东省口腔医院（黄元瑾，章锦才，刘曙光）；５１０２８２广州市，南方
医科大学珠江医院（蔡德鸿）
通信作者：刘曙光
Ｅ鄄ｍａｉｌ：Ｄｒ．ｌｉｕｓｇ＠１６３．ｃｏｍ
重组人骨形成蛋白－２在种植体周围骨缺损修复中
应用的组织形态计量学分析
黄元瑾
章锦才刘曙光蔡德鸿
摘要
目的：研究重组人骨形成蛋白－２（ｒｈＢＭＰ鄄２）及不同载体在种植体周围骨缺损修复中的应用。
方法：ｂｅａｇｌｅ犬８只，拔除双侧下颌前磨牙和第１磨牙。３个月后，植入种植体，并在颊侧形成骨缺损，分别置入两种不同浓度ｒｈＢＭＰ鄄２的珊瑚羟基磷灰石人造骨（ＣＨＡ）或可吸收胶原海绵（ＡＣＳ）。种植体植入后２、
４、８、１２周，各处死２只实验犬，获取含种植体骨标本，作骨组织形态计量学测量。结果：随时间延长，种植体周围骨缺损区内新生骨高度、新骨面积和骨－种植体结合率均不断增加。ＣＨＡ空白和ＡＣＳ空白组形成的新骨高度、新骨面积和骨－种植体结合率均较低。而４个ｒｈＢＭＰ鄄２组所形成的新骨高度、新骨面积和骨－种植体结合率均较空白组明显增加。空白组与ｒｈＢＭＰ鄄２组之间差异有统计学意义。４个ｒｈＢＭＰ鄄２组之间以及两
个空白组之间差异无统计学意义。结论：ｒｈＢＭＰ鄄２能促进种植体周围骨缺损区内的骨组织再生并与种植体表面较好地结合。ＡＣＳ和ＣＨＡ都能作为ｒｈＢＭＰ鄄２的载体材料。
关键词
ｒｈＢＭＰ鄄２；钛；种植体；骨再生；骨整合
姓名：薛桂凤学号：132015200300 实验报告（二） 一、实验目的： 1.掌握大鼠的抓取和固定。 2.掌握大鼠的编号与标记方法。 3.掌握大鼠的常用实验方法。 4.掌握大鼠的常用麻醉方法。 5.掌握大鼠的安死术。 6.掌握大鼠的釆血方法。 7.了解小鼠的采尿、粪的方法。 8.了解小鼠各种脏器标本的采集方法。 二、实验器材：SD大鼠、电子称、手套、实验托盘、固定板、烧杯、注射器（3支）、 剪刀、镊子、灌胃针头、毛细管、酒精棉球、5%水合氯醛、生理盐水 三、实验内容 1.抓取：两种方法。第一种方法：右手食指和中指夹住大鼠颈部，使其头部固定，右 手拇指及无名指分别在大鼠前爪下抓住大鼠身体。第二种方法类似单手抓取小鼠的 方法，用右手拇指及其余四指并捏住大鼠颈部背部皮肤。 2.称重：小鼠放在烧杯中称重（去除烧杯重量），记录小鼠体重210g。 3.鉴别大鼠性别：观察生殖器雄性大鼠的阴囊非常明显。 4.编号：染色法：逆毛方向涂上有色斑点，顺序由左到右，由上向下，用两种颜色 可标记99只动物。 5.给药： （1）皮下注射小于1ml/100g（俯卧固定，左手拇指和食指捏住皮肤提起，右手持针沿纵轴方向刺入皮肤，阻力消失后回抽无血注入药物，拔针）（2）皮内注射小于0.1ml （麻醉后进行，先备皮）（俯卧固定，与皮肤平行刺入捏起的皮肤，阻力大，注射药物局部有皮丘后停留片刻后拔针）（3）腹腔注射0.01-0.02ml/g（仰面固定，在腹正中线两侧腹股沟平行的位置30-45°进针，挑起皮肤和肌肉，回抽无血，注药） （4）灌胃1-2ml/100g （大鼠固定身体呈一条直线，灌胃针头顺着上颚插入咽部，先少量注药证明未入气管后继续给药） 6.釆血：尾尖釆血法、眼眶静脉丛釆血法、心脏釆血法(麻醉后) 。 7.大鼠的采尿、粪的方法 （1）少量采集：在抓取固定时受到刺激排出少量尿液和粪便 （2）长期大量采集：使用代谢笼 8.麻醉：根据大鼠体重计算麻醉药物用量5%水合氯醛按300mg/kg，给药，计算药 量为 1.26ml，ip 麻醉小鼠，观察小鼠麻醉期。 (1)全身麻醉的第一期（随意兴奋期）：出现运动和运动失调；35秒 (2)全身麻醉的第二期（不随意兴奋期）：是由意识完全丧失至深而规则的自动 呼吸开始时止;2分30秒 (3)全身麻醉的第三期：角膜反射由迟钝渐趋消失，翻正反射消失，疼痛反射 消失； 9.安死术：颈椎脱臼法：用左手按住动物的头部于实验台上，右手抓住尾根部，快速、 不间断地向后、略向上使劲拉，以致脊椎脱臼，脊髓与脑干断离而死亡。 10.解剖：观察大鼠的脏器解剖结构
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
姓名：薛桂凤学号： 实验报告（二） 一、实验目的： 1.掌握大鼠的抓取和固定。 2.掌握大鼠的编号与标记方法。 3.掌握大鼠的常用实验方法。 4.掌握大鼠的常用麻醉方法。 5.掌握大鼠的安死术。 6.掌握大鼠的釆血方法。 7.了解小鼠的采尿、粪的方法。 8.了解小鼠各种脏器标本的采集方法。 二、实验器材：SD大鼠、电子称、手套、实验托盘、固定板、烧杯、注射器（3支）、 剪刀、镊子、灌胃针头、毛细管、酒精棉球、5%水合氯醛、生理盐水 三、实验内容 1.抓取：两种方法。第一种方法：右手食指和中指夹住大鼠颈部，使其头部固定，右 手拇指及无名指分别在大鼠前爪下抓住大鼠身体。第二种方法类似单手抓取小鼠的 方法，用右手拇指及其余四指并捏住大鼠颈部背部皮肤。 2.称重：小鼠放在烧杯中称重（去除烧杯重量），记录小鼠体重210g。 3.鉴别大鼠性别：观察生殖器雄性大鼠的阴囊非常明显。 4.编号：染色法：逆毛方向涂上有色斑点，顺序由左到右，由上向下，用两种颜色 可标记99只动物。 5.给药： （1）皮下注射小于1ml/100g（俯卧固定，左手拇指和食指捏住皮肤提起，右手持针沿纵轴方向刺入皮肤，阻力消失后回抽无血注入药物，拔针）（2）皮内注射小于（麻醉后进行，先备皮）（俯卧固定，与皮肤平行刺入捏起的皮肤，阻力大，注射药物局部有皮丘后停留片刻后拔针） （3）腹腔注射（仰面固定，在腹正中线两侧腹股沟平行的位置30-45°进针，挑起皮肤和肌肉，回抽无血，注药） （4）灌胃1-2ml/100g （大鼠固定身体呈一条直线，灌胃针头顺着上颚插入咽部，先少量注药证明未入气管后继续给药） 6.釆血：尾尖釆血法、眼眶静脉丛釆血法、心脏釆血法(麻醉后) 。 7.大鼠的采尿、粪的方法 （1）少量采集：在抓取固定时受到刺激排出少量尿液和粪便 （2）长期大量采集：使用代谢笼 8.麻醉：根据大鼠体重计算麻醉药物用量5%水合氯醛按300mg/kg，给药，计算药 量为，ip 麻醉小鼠，观察小鼠麻醉期。 (1)全身麻醉的第一期（随意兴奋期）：出现运动和运动失调；35秒 (2)全身麻醉的第二期（不随意兴奋期）：是由意识完全丧失至深而规则的自动 呼吸开始时止;2分30秒 (3)全身麻醉的第三期：角膜反射由迟钝渐趋消失，翻正反射消失，疼痛反射 消失； 9.安死术：颈椎脱臼法：用左手按住动物的头部于实验台上，右手抓住尾根部，快速、 不间断地向后、略向上使劲拉，以致脊椎脱臼，脊髓与脑干断离而死亡。 10.解剖：观察大鼠的脏器解剖结构
第二十二章周围神经损伤的康复 周围神经损伤是临床常见损伤之一，可导致严重的运动、感觉和自主神经功能障碍。本章阐述了周围神经损伤的原因、分类、预后、常见康复问题、康复分期和适应证、康复治疗原理、特殊评定方法及康复治疗方案。 一．概述 周围神经损伤（peripheral nerve injuries，PNI）是指周围神经干或其分支受到外界直接或间接力量作用而发生的损伤。周围神经多为混合神经，包括运动神经、感觉神经和自主神经。损伤后的典型表现为运动障碍、感觉障碍和自主神经功能障碍。 （一）损伤原因 1．挤压伤其损伤程度与挤压力的大小、速度和神经受压围等因素有关。轻者可导致神经失用；重者可压断神经。根据挤压因素不同，分为外源性与源性两种。前者是体外挤压因素致伤，如腋杖过高，压伤腋神经；头枕在手臂上睡觉，压伤桡神经和尺神经；下肢石膏固定过紧，压伤腓总神经等。后者是被体组织压伤，如肱骨骨折的骨痂压迫临近的桡神经等。 2．牵拉伤轻者可拉断神经干的神经束和血管，使神经干出血，最后瘢痕化。重者可完全撕断神经干或从神经根部撕脱，治疗比较困难。多见于臂丛神经，常由交通和工伤事故引起。肩关节脱位、锁骨骨折，以及分娩，均可伤及臂丛神经。另外肱骨外上髁骨折引起的肘外翻，可使尺神经常年受反复牵拉，引起迟发性尺神经麻痹。 3．切割伤神经可单独或与周围组织如肌腱、血管等同时被切断。常见于腕部和骨折部位，损伤围比较局限，手术治疗预后较好。 4．注射伤如臀部注射，伤及坐骨神经，腓总神经；上肢注射，伤及桡神经等。 5．手术误伤多见于神经鞘瘤剥离术及骨折固定术等。 （二）损伤分类 1．神经失用（neurapraxia）由于挫伤或压迫使神经的传导功能暂时丧失称为神经失用。此时神经纤维无明显的解剖和形态改变，连续性保持完整，远端神经纤维无华勒变性（Wallerian degeneration）。表现为肌肉瘫痪，但无萎缩；痛
常用细胞凋亡检测方法（图） 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数：951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法
神经系统疾病知识要点 一、基本要求 掌握流行性脑脊髓膜炎、流行性乙型脑炎的病因、发病机制、病理变化及其与临床的联系。 熟悉脊髓灰质炎的传播途径、病因、及病理改变；缺氧与脑血管病的种类、原因及病理改变的特征；胶质细胞瘤、脑膜瘤和神经鞘瘤的病理特点。 了解海绵状脑病、阿尔茨海默病、帕金森病的病因、病理改变的特点及主要临床表现。 二、知识点纲要 (一)流行性脑脊髓膜炎 由脑膜炎双球菌引起的脑脊髓膜的急性化脓性炎。多见于婴幼儿、冬春季发病。临床表现高烧、头痛、呕吐、皮肤淤点及脑膜刺激症状。 1.病理变化 (1)流脑病变肉眼:l)脑脊膜血管高度扩张充血。2)蛛网膜下腔充满灰黄色脓性渗出物，脑沟、脑回结构被覆盖,以脑顶部病变明显。镜下:l)蛛网膜下腔内充满大量变性、坏死、中性白细胞。少量纤维素，革兰氏染色可见细菌。2)近脑膜的脑实质充血、水肿。 (2) 暴发型脑脊膜炎 1)即脑膜炎双球菌败血症(华—弗氏综合征)。2)多见于儿童及青壮年。3)主要表现：周围循环衰竭、休克、全身皮肤粘膜广泛瘀点和瘀斑。两侧肾上腺严重出血。微血栓形成。4)机制;大量内毒素释放→DlC。 2.临床病理联系 l.脑膜刺激症状， 2.颅内压升高症状，3.颅神经麻痹，4.脑脊液的变化，5.全身症状。 (二)流行性乙型脑炎 病变广泛累及中枢神经系统灰质。以大脑皮质、基底核、丘脑最重。病变以脑实质的变质性炎、筛状软化灶为特征。镜下，变质:卫星现象、噬神经现象、软化灶形成镂空筛网状。渗出：脑血管周围炎细胞呈袖套状浸润。增生：小胶质细胞增生、形成胶质结节。临床，嗜睡昏迷，颅内压升高，脑疝形成,压迫生命中枢。 (三) 脊髓灰质炎 镜下，脊髓前角运动神经元变性、坏死;淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润;小胶质细胞增生。导致脊髓前角萎缩，前根萎缩、变细。瘫痪的肌肉萎缩，肌纤维变小。下肢瘫痪，骨骼发育停滞,肌肉萎缩。延髓网状结构受累可导致中枢性呼吸衰竭和循环衰竭而致死。 (四) 海绵状脑病 海绵状脑病是一组慢病毒感染性疾病。可因摄入异常朊蛋白而感染，如疯牛病。皮质内神经毡内出现大量空泡，呈现海绵状外观，可致大脑萎缩。患者可有步态异常，肌阵挛和进行性痴呆等表现。 (五) 缺氧与脑血管病 1.缺血性脑病缺血缺氧4分钟即可造成神经元的死亡。 常见类型 1）层状坏死。 2）海马硬化。 3）边缘带梗死。梗死与血压下降有关;血压持续下降，C形 梗死区向其两侧扩大，并自大脑顶部向颅底发展;大脑缺血性脑病边缘带梗死的极端情况是全大脑的梗死，但脑干的各核团由于对缺血（氧）的敏感性较低仍可存活，该患者生命体征存在，意识丧失，成为植物人。 2.阻塞性脑血管病 （1）血栓性阻塞 粥样斑块好发于颈内动脉与大脑前动脉、中动脉分支处及后交通动脉、基底动脉等处。斑块内出血、血栓形成均可阻塞血管。临床表现为偏瘫、神志不清、失语。此外，来自心脏的血栓常阻塞大脑中动脉。临床症状发生突然，急骤，预后较差。 （2）栓塞性阻塞 病变：1）脑贫血性梗死。2）出血性梗死。3）腔隙状坏死。 3.脑出血 （1）脑内出血（2）蛛网膜下腔出血（3）混合性出血 (六)阿尔茨海默病 肉眼:脑萎缩明显，脑回窄、脑沟宽，病变以额叶、顶叶及颞叶最显著，脑切面可见代偿性脑室扩张。镜下:①老年斑，②神经原纤维缠结，③颗粒空泡变性，④Hirano小体。
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００７，２７（４） ｍｉＲ－２８９与ＣａＭＫⅡ ｍＲＮＡ的ＣａＭＫⅡ ３＇非编码区的序列碱基配对，抑制了ＣａＭＫⅡ ｍＲＮＡ在运输过程中的表达。该抑制作用一直持续到在突触的神经刺激下ＲＩＳＣ组分在蛋白酶体作用下降解。ｍｉＲＮＡ还参与了树突棘发育过程的调控［１７］。一个特定的ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲ－１３４，抑制了Ｌｉｍｋ１蛋白ｍＲＮＡ的表达；Ｌｉｍｋ蛋白可调控树突棘的发育，而ＦＭＲＰ的缺失导致树突棘形态异常，两者的关系目前未明。３． 问题与展望 一直以来，Ｘ脆性综合征的研究重点是了解ＦＭＲＰ的功能。在不同的发育时期、不同的细胞内位置，ＦＭＲＰ执行的功能是不同的。这主要由于与ＦＭＲＰ结合的蛋白质分子及ＲＮＡ分子的不同［６，１０］，其中包括非编码ＲＮＡ。这些非编码ＲＮＡ引起了越来越多研究者的重视，可以预计将有更多的与Ｘ脆性综合征及ＦＭＲＰ相关的非编码ＲＮＡ会被发现。非编码ＲＮＡ与ＦＭＲＰ相互作用机制的问题也有待解决，如ＲＭＲＰ与ｍｉＲＮＡ之间的关系，是ＦＭＲＰ利用ｍｉＲＮＡ作为指向靶ｍＲＮＡ的工具，还是ＦＭＲＰ作为ＲＩＳＣ的组分参与了ｍｉＲＮＡ的翻译抑制，抑或二者都有？另有研究表 明，非编码ＲＮＡ可调控蛋白质功能［２］，我们猜想是否存在能调控ＦＭＲＰ的非编码ＲＮＡ呢？这些问题的解决将加深我们对Ｘ脆性综合征发病机制的理解，进而找出基因治疗的方法。 参 考 文 献 ［１］Ｏ＇ｏｎｎｅｌｌ ＷＴ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，２５： ３１５－３８［２］Ｃａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６，２９： ７７－１０３［３］Ｈａｎｄａ Ｖ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００３，３１（２１）： ６２４３－６２４８［４］Ｖｅｒｄｅｌ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３（３０）： ６７２－６７６［５］Ｊｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００４，６（１１）： １０４８－１０５３［６］Ｂａｇｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００５，６（５）： ３７６－３８７［７］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００３，１１２（３）： ３１７－３２７ ［８］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５，２８０（３９）： ３３４０３－３３４１０［９］Ｇａｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００４，３２（８）： ２１２９－２１３７［１０］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，２００６，１６： ２６５－２６９［１１］Ｗａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，２２： １０２３２－１０２４１［１２］Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００４，１１６（２）： ２８１－２９７ ［１３］Ｃａｕｄｙ ＡＡ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００２，１６（１９）： ２４９１－２４９６［１４］Ｉｓｈｉｚｕｋａ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００２，１６（１９）： ２４９７－２５０８［１５］Ｊｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４，７（２）： １１３－１１７［１６］Ａｓｈｒａｆ ＳＩ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００６，１２４（１）： １９１－２０５［１７］Ｓｃｈｒａｔｔ ＧＭ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４３９（７０７４）： ２８３－２８９ 文章编号： １０００－１３３６（２００７）０４－０３０７－０３ 阿尔茨海默病的脑神经元凋亡机制 杨小慧 戴雪伶 姜招峰１ （ 首都师范大学生命科学学院，北京 １０００３７；１ 北京联合大学应用文理学院，北京 １０００８３ ） 摘要 ：阿尔茨海默病（ＡＤ）是一种中枢神经系统退行性疾病，临床主要表现为认知功能障碍、行为异常及日常生活能力下降，主要神经病理改变有神经元变性、丢失引起的脑萎缩，细胞外的老年斑（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ，ＳＰ）和细胞内的神经元纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅ，ＮＦＴ）。细胞凋亡与ＡＤ有密切的关系，β淀粉样蛋白（Ａβ）在此过程中可能有重要的作用。近年来的研究还指出，细胞周期的异常可能是ＡＤ发生的较早期事件，这种异常的细胞周期也可导致细胞的凋亡，最终引发ＡＤ。该文介绍细胞周期异常和Ａβ介导的细胞凋亡机制作一综述。 关键词：阿尔茨海默病；细胞周期；细胞凋亡；Ａβ；神经元中图分类号：Ｑ５１ 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种中老年常见的中枢神经系统病变，有三大病理特征：淀粉样斑块沉积（ＳＰ）、神经元纤维缠结（ＮＦＴ）和神经元大量丢失。本文重点讨论可能引发神经元丢失的机制。神经细胞的凋亡在神经退行性疾病中起着主导性的作用。神经细胞是一种长期存活、不可复原和已停 收稿日期：２００７－０３－０２ 北京市教委科技发展重点项目和北京市自然科学基金重点项目（ＫＺ２００３１１４１７０１５） 作者简介 ：杨小慧（１９８３－），男，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｘｈ８３８１７＠１６３．ｃｏｍ；戴雪伶（１９８２－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｌｄａｉ２００４＠１２６．ｃｏｍ；姜招峰（１９５６－），男，博士，教授，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｆｅｎｇ＠ｂｕｕ．ｃｏｍ．ｃｎ
大鼠水合氯醛麻醉心得 本人所做的模型需要使用水合氯醛麻醉，所使用的是医院里配制的用于儿科灌肠的10%水合氯醛。在先前的实验中，剂量为0.3mL/100g（这个剂量来自于师姐使用的经验），麻醉完全清醒时间约4h（当初没有记录开始清醒的时间） 现在由于实验方案有所改动，希望麻醉的时间尽量缩短（1~1.5h），而麻醉深度保持不变，这样在侧脑室注射操作后，大鼠能够尽快的恢复清醒状态，便于后续的实验操作。因此，对水合氯醛麻醉的剂量与药效进行了摸索，我把它贴出来，跟大家分享一下。 动物：雄性SD大鼠4只，平均体重356g（这里就不算标准差了），水合氯醛浓度分为4%、7%、10%三个水平。 结果：如下表格所示： 水合氯醛浓度 4% 7% 7% 10% 10% 水合氯醛剂量 0.5mL/100g 0.3mL/100g 0.2mL/100g 0.2 mL/100g 0.3 mL/100g 诱导时间约7min 约4min 约7min 约4min 约4min 麻醉深度浅麻醉水平中度麻醉浅麻醉深度麻醉深度麻醉 麻醉开始清醒时间约90min 约100min 未观察约68min 114min 结论： 1、麻醉的诱导，似乎从4%到（7%、10%），随着浓度的增加，麻醉诱导的时间缩短。但在7%及10%这两个浓度，麻醉时间基本一致。 2、麻醉时间的长度与水合氯醛的总剂量可能成正相关。 3、麻醉的深度跟与水合氯醛的浓度可能成正相关 在之前甲醛《做动物实验前必须给予阿托品吗？》的这篇中，有战友提出“把水合氯醛配成4%的，而不是10%的，这样就拉开了麻醉剂量和致死剂量之间的差距，可安全了”，
我的经验是这样： （1）确实，4%的水合氯醛在实验中比较安全，我们一般用于追加麻醉的时候，4%水合氯醛每次1mL，追加一到两次，安全度颇高。 （2）而水合氯醛的致死剂量，我不是很了解，希望知道的战友能够告知一声。对于10%的水合氯醛，我们用到0.3mL/100g也很安全，应该距离致死剂量还有一段距离，麻醉深度与维持时间也很确切。 （3）据我认识的一位在伦敦大学获得博士学位的解剖学的教授介绍，英国人喜欢用7%的水合氯醛0.5mL/100g，我看过他的博士论文也是用的是这个剂量。 由于样本量太小以及存在动物本身的个体差异，以上结果与结论科学性以及说服力有很大的欠缺。但是，当成实验的心得体会交流，应该也有一定的参考价值。欢迎大家分享关于水合氯醛使用的心得。 我们用5%的0.7ml/100g,感觉还不错。大概在腹腔注射5min之后就进入麻醉状态，麻醉状态可以维持3h左右。 lixiang0526站友所用的方法，使用5%的浓度的话，按照我用4%和7%的经验，麻醉时间是可以维持，但是，恐怕麻醉深度不够。 楼主的剂量偏小，一般水合氯醛的剂量是300~350mg/kg，楼主仅200mg/kg左右，最低140mg/kg。能否达到麻醉效果？值得考虑，当然水合氯醛的质量也有关系，楼主用的水合氯醛的质量、纯度可能很好；也可能是i.v，效果当然好。我们用5%，0.7ml；或3%，1～1.2ml/100g，效果很好，个人推荐3%，1ml/100g，浓度低，相对安全一些。 关于水合氯醛的浓度，3%，4%，5%，7%, 10%都有人用，如果总剂量相同的话，麻醉维持的时间是差不多的，差别就在于麻醉的深度的诱导和维持，我这两天做了3只大鼠水合氯醛麻醉后侧脑室注射，用的是腹腔注射的方法，并非i.v，使用10%，0.3ml/100g （这个剂量应该跟cma1954站友用的3% ，1ml/100g的总剂量相当）才可以保持麻醉的深度，侧脑室注射才可以顺利完成，但在切开皮肤的时候还是有明显的反应，我不知道怎么解释这个现象，真的是总剂量不够？不见得，因为跟cma1954站友推荐的“3%，
脑神经受损可以恢复吗 脑神经是人体一个非常非常重要的神经系统，脑神经如果出现了问题的话神经元就会死亡，无法恢复原来的状态，但是脑神经神经元死掉之后，其他的神经就会出现代偿功能，变得非常活跃，所以脑神经受损在一定程度上是可以恢复的。本文将讲一下脑神经受损可以恢复吗。脑神经受损可以恢复吗 脑神经细胞，不会不断的分裂增殖形成新的细胞，这是为了有效利用已形成的神经元网络，完成机体的高级功能。 脑神经元生后就不再分裂增殖，不能再生。这在脑来讲是有原因的。脑需要进行思考、记忆、表达喜怒哀乐，完成错综复杂的高级功能。为了完成这些功能，伴随着成长，神经元之间会构筑错综复杂的网络，来记忆经理的经验。 然而，如果神经元分裂增殖的话，之前辛辛苦苦形成的神经元网络就不能再利用了，每次都要从零开始构筑新的网络，这是效率非常低下的做法。这样的话，很难完成高级功能。正是因为如此，通常情况下，一旦变性坏死的神经元是不能复活的，坏掉的神经也不能恢复。然而存活的神经元会更加活跃，代偿失去的神经元的功能，甚至使功能恢复。对于脑中风，老年认知障碍的治疗方法，就是以这种代偿性恢复训练为基础的。 近年来，随着脑科学，再生医学的进展，使损伤的脑再生来进行治疗，也变得可能了。帕金森、脑梗塞等脑疾患引起脑神经元不断大量的死亡，在这些脑的损伤部位移植入新的细胞，或注入促神经元再生的神经营养因子，帮助正在死去的神经元恢复，这样的治疗方法也正在研究开发中。将来神经元也可能会再生，就像疗伤一样恢复功能。 脑神经损伤多久具有自我恢复能力 三个月没有恢复，既失去自身修复能力，治疗不当会迟发缺血性脑萎缩导致痉挛性瘫痪，痴呆症等。脑神经损伤后手术减压或药物止血清瘀只是保护生命为神经恢复创造了有利的条件，但它不能恢复神经，其压迫受损麻痹的神经恢复除自身修复外是要靠药物的促进才能得到最佳的恢复状态。如本病在有效的治疗期内得不到最佳恢复，神经就可能因缺血时间过长而发生萎缩软化，变性或坏死，本病恢复无望。故治疗恢复的关键在于早期。 以上讲了脑神经受损后可以恢复吗，也讲了脑神经受损多久具有自我恢复能力。作为一名脑神经受损的患者，你最好是在脑神经受损后的三个月内积极刺激脑细胞活跃起来，如果三个月内无法让脑神经受到刺激恢复原来的功能，那么脑神经就无法再次恢复了。
细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调
亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别
大鼠的麻醉 集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-