第五章：氧的供需与传递：
一．名词解释：
1. 临界氧浓度：微生物的耗氧速率受发酵液浓度的影响，各种微生物对发酵液中溶氧浓度有一个最低要求这一溶氧浓度叫做“临界氧浓度”。
2.氧的满足度：溶解氧浓度与临界氧浓度之比。
二.简答
1.生化反应器通气与搅拌的两个目的:
①使发酵液充分混合，以便形成均匀的微生物悬浮液，促使底物从发酵液向菌体内及代谢产物从菌体内向发酵液的传递。
②供给微生物生长和代谢所需的氧气。
临界氧浓度：微生物的耗氧速率受发酵液浓度的影响，各种微生物对发酵液中溶氧浓度有一个最低要求这一溶氧浓度叫做“临界氧浓度”
2.比生长速率和氧浓度的关系：u=u m*c/(K02+c)
3.饱和溶氧浓度：
在一定温度和压力下，空气中的氧在水中的溶解度。(mol/m3)
例：25℃1×105Pa 0.25mol/m3
影响氧饱和浓度的主要因素:
①温度:温度越高，氧饱和浓度越低
②溶液的性质：溶质含量越高，氧的溶解度越低
③氧分压：p=HC* 氧分压越高氧溶解度越高
4.影响微生物需氧量的因素:
菌种的生理特性、培养基组成、溶氧浓度和发酵工艺条件
5.溶氧对发酵的影响：
①为了正确控制溶解氧浓度，有必要考察每一种发酵产物的（临界溶氧浓度）和（最适溶氧浓度），并使发酵过程保持在最适溶氧浓度。最适溶氧浓度的高低与（菌种特性）和（产物合成的途径）有关。
②需氧发酵并不是溶氧愈高愈好。适当高的溶氧水平有利于菌体生长和产物合成；但溶氧太高有时反而抑制产物的形成。
6.在发酵过程中引起溶氧异常下降可能有下列原因：
①污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，使溶氧在较短时间内下降到零附近，如果杂菌本身耗氧能力不强，溶氧变化就可能不明显；②菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降；③某些设备或工艺控制发生故障或变化，也能引起溶氧下降，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。又如消沫油因自动加油器失灵或人为加量过多，也会引起溶氧迅速下降。其他影响供氧的工艺操作，如停搅拌、闷罐（关闭排气阀）等．都会使溶氧发生异常变化。
7.在发酵过程中引起溶氧异常升高可能有下列原因：
在供氧条件没有发生变化的情况下，耗氧量的显著减少将导致溶氧异常升高。如：
1、菌体代谢出现异常，耗氧能力下降，使溶氧上升。
2、污染烈性噬菌体，影响最为明显，产生菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧就明显上升，菌体破裂后完全失去呼吸能力，溶氧就直线上升
8.耗氧速率：r=Qo2*X
r——耗氧速率（mmolO2/l.h) QO2 ——比耗氧速率（mmolO2/g.h)
X ——菌体浓度（g/l)
耗氧速率随微生物的种类、代谢途径和菌体浓度的不同而不同
9.供氧、耗氧和产物形成的关系通常有三种类型：
（1）产物形成期的氧消耗与菌体生长期的最大需氧量一致；
（2）产物形成期的最大需氧量超过菌体生长期的最大需氧量；
（3）产物形成期的最大需氧量低于菌体生长期的最大需氧量。
10.比耗氧速率：单位菌体浓度的好氧速率，又称呼吸强度
11.氧的传递途径及传质阻力
供氧：空气中的氧从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩散到液体主流中。
耗氧：氧自液体主流通过液膜、菌体丛、细胞膜扩散到细胞内。整个过程必须克服一系列的阻力，才能被微生物利用。
*12供氧方面的阻力：
①气膜阻力1/k1，气体主流与气液界面的气膜阻力1/kG ，与空气情况有关；
②气液界面阻力1/k2 ，也与空气情况相关，只有具备高能量的氧分子才能透到液相中
去，而其余的则折返回气相；
③液膜阻力1/k3 ，气液界面至液体主流间的液膜阻力1/kL ，与发酵液的成分和浓度
有关；
④液流阻力1/k4，也与发酵液的成分和浓度有关，通常这不作为一项重要阻力，因在液
体主流中氧的浓度是假定不变的，当然这只有在适当搅拌的情况下才是这样。
*13.耗氧方面的阻力：
①细胞周围液膜阻力1/k5，与发酵液成分和浓度有关；
②菌丝丛或团内的扩散阻力1/k6：这种阻力与微生物的种类、特性和生理状态等有关。
单细胞的细菌和酵母不存在这种阻力，对于菌丝菌如霉菌等这种阻力最为突出。
③细胞膜阻力1/k7 ，与微生物的生理特性相关；
④细胞内反应阻力1/k8：指氧分子与细胞内呼吸酶系反应时的阻力，与微生物的种类、
生理特性有关。
14.供氧阻力方面液膜阻力1/kL比较显著，是控制因素
15.耗氧方面,细胞周围液膜的阻力1/k5是很小的,主要阻力是细胞膜阻力和菌丝从阻力，
但搅拌可以减少逆向扩散的梯度，因此也降低了这方面的阻力。
细胞内反应阻力，只在以下三种情况下才会产生：
（1）培养基成分与其相应的酶的作用失活；
（2）一些生理条件如温度、pH值等不适于酶的反应；
（3）一些代谢产物积累或不能及时从反应处移去。
16.双膜理论:
①在气泡与包围着气泡的液体之间存在着界面，在界面的两旁具有两层稳定的薄膜，即气泡一侧存在着一层气膜，液体一侧存在着一层液膜
②在气液界面上，空气中氧的分压与溶于液体中的氧浓度处于平衡状态，即界面上不存在氧传递的阻力
③两膜以外的气、液两相主流中，由于流体充分流动，氧的浓度基本上是均匀的，也就无任何传质阻力
17.在稳定传质过程中，传质途径上的各点氧浓度不随时间而变化，故通过两膜的氧传递速率N应相等N=kG(P-Pi)=kL(Ci-C)
一般不采用传质系数kG或kL，而采用包括这两个因素在内的总传质系数KG或KL,,同
时采用总推动力P-P*和C*-C代替传质推动力P-Pi和Ci-C。因此，上式可改写为：N=K G(P-P*)=K L(C*-C)
18.亨利定律：与溶解浓度相平衡的理想气体的分压与该气体所溶解的分子浓度成正比
19.影响传氧速率的因素:
(1)搅拌:
①搅拌能把大的空气气泡打成微小气泡，增加了接触面积，而且小气泡的上升的速度要比大气泡慢，因此接触时间也增长。
②搅拌使液体作涡流运动，使气泡不是直线上升而是做螺旋运动上升，延长了气泡的运动路线，即增加了气液的接触时间。
③搅拌使发酵液呈湍流运动，从而减少了气泡周围液膜的厚度，减少液膜阻力，因而增大了kLa。
④搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递过程中的接触面积增加，使推动力均一。
搅拌器的型式及流型:下组一宜采用圆盘涡轮式搅拌器，上组宜采用平桨式
(2)空气流速:
只有在增大Q的同时也相应提高转速N，使Pg不至过分降低的情况下，才能最有效地提高Kla。
(3)空气分布管:单管、多孔环管及多孔分支环管,发酵工业大多采用单管空气分布器
喷口直径越小，气泡的直径越小，溶氧系数就越大
(4)氧分压:增加空气压力即增大罐压或用含氧较多的空气或纯氧都能增加氧的分压
(5)罐内液柱高度:通风效率是随发酵罐的高径比H/D的增大而增加,H/D=2~3为宜
(6)罐容(7)醪液性质(8)温度
(9)有机物质和表面活性剂
(10)离子强度:电解质溶液的氧传递系数K Lα比水大，而且随电解质浓度的增加，K Lα
也有较大的增加
21.溶氧系数的测定:
(1)亚硫酸盐氧化法
2Na2SO3+ O2→2Na2SO4 Na2SO3+ I2 + H2O →Na2SO4 + 2HI
Na2S2O3+ I2→Na2S4O6 + 2NaI
每滴定消耗1mol Na2S2O3必有1/4mol溶氧。
Nv=V.N/(1000m.t.4)(mol/ml.min) 或Nv=V.N.60/(m.t.4)(mol/L.h)
Nv:溶氧速率
V-----------实际搅拌通气样与空白样各加等量、适量I2液后滴定用标准Na2S2O3体积之差（ml）
N----------- Na2S2O3的标定浓度（mol/L）
m-----------样液的体积（ml）
t-------------两次取样的间隔，即氧化时间（min）
Nv值代入到Nv=kLa(C*-C)，即可算出kLa kLa=Nv/0.21
kd=kLa/H
优点：
氧溶解速度与亚硫酸盐浓度无关，且反应速度快，不需要特殊仪器。
缺点：
不能在真实发酵条件下进行测定发酵液的溶氧，因为亚硫酸盐对微生物的生长有影响，且发酵液的成分、消泡剂、表面张力、黏度、特别是菌体都影响氧的传递
（2）极谱法
取样极谱法和排气极谱法
（3）溶氧电极法：
将电极放入Na2SO3水溶液中，搅拌，此时电流计的指示定为溶氧值0%；然后用水冲洗电极，插入水中，通气搅拌，直至电流响应值达到饱和，定为溶氧值100%。
①稳态法：
正在发酵的醪液中，一方面以一定的溶氧速率Nv向液中供氧，另一方面正在生长的微生物也以一定耗氧速率r消耗溶氧。Nv=kLa(C*-C) r=QO2X
溶氧供需速率相等时，r=Q(C进-C出)/V V-发酵液的体积
Q(C进-C出)/V= kLa(C*-C)
*②动态法
dC/dt=kLa(C*-C)-QO2X
当在某一时刻t=0时暂时停止通风，则上式变为：dC/dt= - QO2.X
时间t1后，恢复通风，溶液中的氧浓度又将逐步上升则：
以(dC/dt + QO2X) 对C作图即得一斜率为-1/kLa的直线，此直线与纵轴的交点即为饱和溶解氧浓度C*。
优点：只需要单一的溶氧电极，可以测得实际发酵系统的kLa值。溶氧电极的响应时间应尽可能短。
kLa值步骤？
22.Kla和溶氧速率Nv的调控
（1）提高传质推动力C*-C
（2) 压力调节(罐压、氧分压)
（3）通风量和搅拌转速调节
（4）高径比调节：
①平均压力增高，传质推动力（C*- C）增大，从而提高溶氧速率；
②高径比大，反应器截面积小，空截面上的空气线速度Vs将增大，从而提高溶氧率
③利于降低单位溶解氧功耗即提高传氧效率
（5）改变发酵液的理化性质：
重复地放出一部分发酵液，补充新鲜灭菌的等体积培养基，这样可以使kLa↑（6）传氧中间介质的加入：
氧载体：血红蛋白、烃类碳氢化合物、含碳化合物
从需氧方面考虑：
(1)养料的丰富程度影响菌的生长
(2)温度的影响
（3）限制性基质的流加控制
第七章：发酵染菌及其防治
一．名词解释：
1.发酵染菌：在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵液，从而使发酵过程失去了真正意义上的纯种培养
2.倒种：当种子受到杂菌污染又无备用种子时，为了保证发酵生产正常进行，从发酵罐内的发酵液中挑取一部分当作种子，接入到新的发酵罐进行发酵生产，叫“倒种”。
3.
二．总结
1.造成发酵染菌的可能途径有哪些
菌种培养过程操作不当
培养基灭菌不彻底
发酵设备（如发酵罐、管道）密封不严
空气除菌不净
2.既然染菌不可避免，哪我们应该怎样做？
要提高生产技术水平，强化生产过程的管理，把握好各个易染菌的环节，尽可能防止发酵染菌的发生；而且一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。
3. 发酵过程危害最大的杂菌种类
青霉素的发酵细短产气杆菌
链霉素的发酵细短杆菌、假单孢杆菌
四环素的发酵双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌
谷氨酸的发酵噬菌体
柠檬酸的发酵青霉菌
4.不同生产阶段染菌对发酵的影响：
种子培养期染菌:对整个发酵过程的危害极大
发酵前期染菌：严重干扰生产菌的生长繁殖
发酵中期染菌：干扰生产菌的代谢，影响产物的生成
发酵后期染菌：影响相对较小
5.不同染菌原因对发酵的影响：
种子带菌：将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重大损失。
空气带菌：使发酵大面积染菌
培养基或设备灭菌不彻底：一般不具延续性，使单个（批）发酵罐发酵失败
设备渗漏：染菌几率较大
6.发酵异常现象及染菌原因分析：
（1）溶解氧的异常变化
当杂菌是好气性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直至接近于零，且在长时间内不能回升；
当杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。
（2）排气的CO2异常变化
如杂菌污染时，糖耗加快，CO2含量含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，CO2含量减少。因此，可根据CO2含量的异常变化判断染菌。
（3）其它异常现象：
如菌体生长不良、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的粘度异常增加等判断染菌。
7.染菌原因分析：
（1）从染菌的规模来分析染菌原因
大批发酵罐染菌：空气系统
部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的
个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象
个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。
（2）从染菌的时间来分析
发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角
中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理
（3）从染菌的类型来分析：
耐热性芽孢杆菌：死角或灭菌不彻底
球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的
浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管或夹套渗漏
霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格
①设备渗漏的原因：当设备渗漏时，往往每批染菌发生的时间逐渐提前
发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀
磨蚀
设备加工不良
②盘管渗漏的防止：
放罐后要认真清洗发酵罐
控制冷却水质量，降低其中氯离子含量
对盘管定期检查、试漏，及时发现漏隙
试漏方法：气压试验水压试验
③空气分布管渗漏的防止
④罐体渗漏的防止
⑤管件的渗漏
隔膜阀
优点：
严密不漏。
无填料。
阀结构为流线型，流量大，阻力小，无死角，无堆积物，在关闭时不会使紧密面轧坏。
检修方便
缺点：
制造不够精密；体积较大，在管道上占用较大的面积和空间。
中心易引起渗漏。
隔膜阀开关费力，需要借助扳手。
如质量不好，帘布与橡胶易脱落，固定隔膜的螺栓也易脱落。
（4）管路的连接：
螺纹连接法兰连接焊接
（5）空气过滤系统方面原因：
原因分析：进风口、生产环境、空气过滤器
染菌特点：空气过滤系统带菌会使发酵罐批批染菌、罐罐染菌，此时就要对空气过滤系统进行无菌样检测
8.染菌的检查和判断
无菌试验方法
①显微镜检查法（镜检法）
②肉汤培养法
③平板划线培养或斜面培养检查法
④发酵过程的异常现象观察法
如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。
9.杂菌污染的挽救及处理：
（1）种子培养期染菌：应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌（2）发酵前期染菌：营养成分消耗不多，应迅速重新灭菌；另处，补充必要的营养成分，重新接种进行发酵。
（3）发酵中、后期染菌：可以加人适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度；产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐。
（4）发酵后对设备的处理：空罐加热灭菌后至120℃以上、30min后，才能使用。也可
用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理
10.杂菌污染的途径和防治：
（1）种子带菌及其防治：
原因分析：种子保存种子培养设备种子换代及接种种子培养基
防治措施：
检查发生污染所用的保藏菌种。
检查发生污染的种子罐接种所用的三角瓶等器皿。
检查对三角瓶、棉花塞、培养基等所进行的灭菌操作。
检查天菌锅的工作情况，校核温度表和压力表。灭菌锅工作时锅内空气务必排尽。
检查无菌室的无菌状况，特别是接种箱。检查接种箱所用的杀菌熏剂。
检查操作人员的操作技术。
对杂菌或噬菌体进行微生物检验。
（2）空气带菌及其防治：
防治措施：
油渗入空气：改用无油润的压缩机。
列管式冷却器穿孔。
过滤介质松动，空气走短路。
过滤介质被水润湿。
过滤介质老化.
（3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治：
设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀电化学腐蚀磨浊摊口金属与原料中的泥沙之间磨损、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
“死角”包括了发酵设备或连接管道的某一部位和培养基或其他物料的某一部分等。
①盘管的渗漏染菌及防治：
原因分析：由于存在温差（内冷却水温、外灭菌温），温度急剧变化，或发酵液的pH 低、化学腐蚀严重等原因。
防治措施：生产上可采取仔细清洗，检查渗漏，或降低冷却水中Cl-1的含量等措施加以防治。
②空气分布管的“死角”染菌及防治：
原因分析：受搅拌与通所的影响，易磨蚀穿孔
防治措施：采取频繁更换空气分布管或认真洗涤等措施
③发酵罐的渗漏染菌及防治：
原因分析：
发生局部化学腐蚀或磨蚀，产生穿孔渗漏。
罐焊接处等的周围容易积集污垢。
发酵罐的制作不良。
发酵罐封头上的各个接口。
发酵罐的修补焊接位置不当。
防治措施：
采取罐内壁涂刷防腐涂料、加强清洗并定期铲除污垢等是有效消除染菌的措施。
采用不锈钢或复合钢可有效克服此弊端并注意清洗是可以避免染菌的。
④管路的安装或管路的配置不合理形成“死角”：
原因分析：
经常将一些管路汇集到一条总的管路上。
管路大多采用法兰连接。
防治措施：
采用单独的排气、排水和排污管可有效防止染菌的发生。
法兰的加工、焊接和安装要符合灭菌的要求尽可能减少或取消连接法兰等措施
⑤管件的渗漏形成染菌及防治：
（4）生产原料灭菌不彻底导致的染菌：
*原因分析：
①淀粉质原料，在升温过快或混合不均匀时容易结块，使团块中心部位“夹生”，蒸汽不易进入将杂菌杀死
②培养基中诸如麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多，在投料时溅到罐壁或罐内的各种支架上，容易形成堆积，这些堆积物在灭菌过程由于传热较慢，一些杂菌也不易被杀灭。
*防治措施：
①升温前先通过搅拌混合均匀，并加人一定量的淀粉酶进行液化；有大颗粒存在时应先经过筛除去，再行灭菌；
②对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多的培养基，采用罐外预先配料，再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效。
*具体措施：
①购进原料应干燥，仓贮原料应保持干燥。
②制各培养基时，粉碎原料先用冷水浸润，调浆罐搅拌要充分防止结块。
③粉碎原料颗粒应足够小，大颗粒会影响杀菌效果。
④假如生产原料被孢子严重污染，制成培养基后，可在30℃保温数小时，待孢子
发芽后再行杀菌。
（5）操作不当造成染菌及其防治：
*原因分析：
①灭菌时由于操作不合理，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示“假压”。
②产生泡沫发泡严重时泡沫可上升至罐顶甚至逃逸，以致泡沫顶罐。
③连续灭菌过程中，培养基灭菌的温度及其停留时间没有符合灭菌的要求。
④探头或元件灭菌方法不当。
*防治措施：
灭菌升温前打开排气阀，排尽冷空气。
加入消泡剂进行消泡处理。
连续灭菌过程中，避免蒸汽压力的波动过大，严格控制灭菌温度。
探头或元件保证灭菌彻底。
（6）噬菌体污染及其防治：
防治措施：
认真保藏好生产菌株，确保其不受污染。
严禁活菌体排放。
强化设备管理。
加强环境卫生工作。
加强对无菌空气，空间杂菌及噬菌体监测工作。
*感染噬菌体后采用的理方法:
①选育抗性菌株。
②轮换使用专一性不同的菌株。
③加化学药物(如谷氨酸发酵可加2~4ppm氯霉素，0.1%三聚磷酸钠，0.6%柠檬
酸钠或铵等)。
④将培养液重新灭菌再接种(噬菌体不耐热，70~80?C经5分钟即可杀死)
⑤其他方法
第十章：发酵过程的代谢控制
一．发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
1..发酵过程的种类：分批培养补料分批培养半连续培养连续培养
2.分批发酵：指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法
（1）特点：
①微生物生长分为：停滞期、对数生长期、稳定期和死亡期
②停滞期细胞特征：菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。接种物的生理状态和浓度是停滞期长短的关键。
③倍增时间：微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间，(td)
td=ln2/u=0.693/u
④稳定期特点：
所有微生物停止生长或细胞增加速度与死亡速率相等。
出现二次或隐性生长
⑤二次或隐性生长：:
由于细胞的溶解作用，一些新的营养物质，诸如细胞内的一些糖类、蛋白质等被释放出来，又作为细胞的营养物质，从而使存活的细胞继续缓慢地生长，出现通常所称的二次或隐性生长。
⑥死亡期特点：
微生物细胞内所储存的能量已经基本耗尽，细胞开始在自身所含的酶的作用下死亡。
细胞死亡速率大于增加速度
此时也是细胞产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物的时期
（2）对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数
生长期后期和稳定期大量合成。
（3）分批培养的优缺点：
优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握
缺点: 产率低，不适于测定动力学数据
3.补料分批培养：
(1)特点：
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加（2）补料分批培养的类型：
单一补料分批培养重复不了分批培养
（3）补料分批培养的优缺点：
优点: 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。
缺点: 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会。
4.连续培养：
（1）特点：
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。
达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。
（2）连续培养的优缺点
优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于μ＝D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学；
缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。
5.发酵过程工艺控制的目的:最大的比生产速率和最大的生产率；
6.发挥菌种的最大生产潜力考虑之点：
菌种本身的代谢特点生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率；
菌代谢与环境的相关性温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等；
7.发酵过程研究的方法和层次
(1)研究方法
单因子实验数理统计学方法
(2)研究的层次:
初级层次的研究:主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。
代谢及工程参数层次研究:溶氧、搅拌营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率, (3)生产规模放大
8.代谢参数按性质分可分三类:
物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等
化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等
生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等.
9.从检测手段分可分为:
直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH 、残糖等
①在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温
度、pH 、搅拌转速；
②离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N 、菌体浓度
间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa 等.
10.CER 表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量:
呼吸熵＝ 摄氧率（OUR ）
RQ 值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料
11.发酵过程的中间分析:
①在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的
条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平
②通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。
12.糖含量
总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。
还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖.
13.氨基氮和氨氮:
①氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N ），单位是 mg/100ml 。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、
花生饼粉中都有有机氮。发酵后期氨基氮回升
②氨氮指无机氨中的氮（NH3-N ）
14.磷含量:
磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP 的组成部分，磷还能促进糖代谢
15.菌浓度和菌形态
一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定
菌浓测定方法: 测粘度 压缩体积法（离心） 静置沉降体积法
光密度测定法 OD600~660 适合于细菌、酵母
16.产物浓度
17. 产物量的测定
(1)产物量的特殊表示法:
抗生素效价的表示:抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U ）
效价表示方法：重量折算法 重量单位 类似重量单位 特殊单位
重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克＝1U
重量单位：规定某些抗生素活性部分1μg=1u 如链霉素、卡那霉素、红霉素等定
义活性部分1μg ＝1u
(2)酶活力的表示法
250C 下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH 诸条件下，
每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。
(3)测量方法：
化学法： 滴定法 比色法 测压法
物理法
生物法：生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，常用的生物法测定抗生素，
采用杯碟法
OUR CER RQ
二．发酵过程的pH控制
1.pH对微生物的影响：
微生物的影响主要是影响微生物活动环境的离子强度、细胞膜的透性及膜上的带电性和氧化-还原电位、酶活性。
2.特点：
①同种微生物的生长最适pH和产物积累pH往往不一致，青霉菌生长的最适pH为6.5～
7.2，而青霉素合成的最适pH为6.2～6.8；
②在产物积累阶段，由于pH值不同，也可能会得到不同的发酵产物，如黑曲霉在酸性（pH2～3）时，进行柠檬酸发酵，而在接近中性时，则进行草酸发酵
③酵母：pH 3.8－6.0 细菌：pH 6.5－7.5 霉菌：pH 4.0－5.8
放线菌：pH 6.5－8.0
④同种微生物对pH变化的反映不同：
pH 3.5－5.0 生长良好，不易染菌
pH >5.0时，易染细菌
pH <3.0时，生长受抑制，易自溶
3发酵过程引起pH变化的原因：
（1）基质代谢
糖代谢：糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。
氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升；NH3利用后pH下降；当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升
生理酸性物质、生理碱性物质：利用后pH会下降或上升
（2）产物形成：
有机酸类产生使pH下降
红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。
（3）菌体自溶，pH上升；发酵后期，pH上升
4.引起发酵液pH值变化的常见因素：
(1)下降
①培养基中C/N不当，有机酸积累；
②消沫油加得过多；
③生理酸性物质过多
(2)上升
①C/N比例不当，N过多，氨基氮释放；
②生理碱性物质过多；
③中间补料时碱性物加入量过大；
5.pH对发酵的影响：
影响菌体的生长pH影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变
pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离pH影响代谢方向
影响产物稳定性
黑曲霉：pH：2－3，柠檬酸发酵pH：7.0，草酸发酵
酿酒酵母：pH：4.5-5.0－3，乙醇发酵pH：8.0，甘油发酵
谷氨酸菌：pH：7－8，GA发酵pH：5.0－5.8，谷氨酰胺发酵
6.pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响：
四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0 。
青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0，产物合成最适
7.pH测量：
取样罐外测量：试纸法（精密级）酸度计法
在线测量：发酵用复合pH电极+ pH显示仪表
8.pH的控制策略：
（1）调节好基础料的初始pH
若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制灭菌后pH在6.0，灭菌前pH往往要调到6.5~6.8。
（2）在基础料中加入维持pH的物质：
CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液
（3）通过补料调节p H：
在补料与调pH没有矛盾时采用补料调节pH。
①调节补糖速率，调节空气流量来调节pH。
②当NH2-N低，pH低时补氨水；
当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4。
通过补料调节pH值既调节了培养液的pH值，又可补充营养，进一步提高发酵产率（4）当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH
（5）应急措施：
改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；
改变温度，以控制微生物代谢速度；
改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量；
改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；
（6）不同调pH方法的影响
(7)发酵的不同阶段采取不同的pH值
9.实际生产中pH控制：
（1）调整培养基组分：适当调整C/N比，使盐类与碳源配比平衡，一般情况：C/N高时（真菌培养基），pH降低；C/N低时（一般细菌），经过发酵后，pH上升。
（2）在发酵过程中进行控制，根据发酵液pH值的变化，进行相应控制，如过酸时，可加入NaOH、Na2CO3等碱性物质进行中和或流加尿素、蛋白质、提高通风量等；过碱时加H2SO4、HCl或流加糖类、乳酸，降低通风量等措施，在生产上，主要的过程控制方法有
①添加CaCO3：当用NH4+盐作为氮源时，可在培养基中加入CaCO3，用于中和NH4+被吸收后剩余的酸.
②氨水流加法：氨水作为一种碱，可以中和发酵中产生的酸，且NH4+可作为氮源，供给菌体营养.
③尿素流加法：味精厂多采用此法，以尿素作为菌体氮源时，尿素→氨，使pH上升，NH4+→有机酸时，pH下降，这时随着尿素的补加，又使发酵液pH上升
10.发酵用复合pH电极要求：
能高温灭菌具有长时间的稳定性要求一定的液络部流通，维持的液接界电位稳定外加不锈钢护套或工程塑料护套
三．温度变化及其控制
1.温度对生长的影响：
嗜冷菌适应于0～260C生长，嗜温菌适应于15～430C生长，嗜热菌适应于37～650C 生长，嗜高温菌适应于650C以上
2.温度对微生物的影响：
酶活性、膜的通透性以及影响细胞内各种反应的速率
3.微生物与温度相关性的原理
(1)微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系
①液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态
由固态转变为液晶态的温度称为熔点，以T1表示；
由液晶态转变为液态的温度称为清亮点，以T2表示。
(2)蛋白质结构:
(3)蛋白质合成
(4)合成冷休克蛋白
4.温度的影响与控制
(1)温度对发酵的影响
酶学方面产物方面菌体特性方面
①温度影响反应速率②温度影响发酵方向
（2）最适温度的选择
①根据菌种及生长阶段选择
发酵前期：稍高的温度中期：中期温度要稍低发酵后期：提高温度
适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在
②根据培养条件选择：
通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。
培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶
根据菌生长情况：
发酵过程引起温度变化的因素：
（1）发酵热Q发酵
①生物热Q生物:菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量,其中以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。
生物热与发酵类型有关，微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多
生物热的产生具有强烈的时间性
如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大
②搅拌热Q搅拌：
③蒸发热Q蒸发
④辐射热Q辐射
Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射
（2）发酵热的测定
①用冷却水进出口温度差计算发酵热
Q发酵＝GCm(T出－T进) Cm——水的比热G——冷却水流量
②根据罐温上升速率来计算
Q发酵=(M1C1+M2C2)*S M1.M2分别为发酵液和发酵罐的重量，C1，C2为发酵液和发酵罐的比热，S温度上升的速度
根据化合物的燃烧值估算发酵过程生物热的近似值
ΔH＝∑（△H）反应物－∑（△H）产物
利用温度控制提高产量
例如：利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量
重组大肠杆菌人Cu/Zn-SOD的高表达：
原因：
乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合成SOD的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都增加。
高温下可能SOD降解速率增加，杂蛋白增加
低温下由于比生长速率低，质粒脱落减少
低温下菌的衰老减缓，死亡率低
三.溶解氧的供需及控制
1. 溶解氧(DO)
纯氧在水、盐或酸中的溶解1.26mmol/L
在28℃氧在发酵液中100％的空气饱和浓度只有0.25 mmol.L-1左右。
2.描述微生物需氧的物理量:
①比耗氧速率或呼吸强度（QO2 ）：单位重量的细胞(干重)在单位时间内所消耗的氧气，mmolO2/(g菌·h)
②摄氧率(r)：单位体积的发酵液在单位时间内所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1 。
r= QO2 .X
3.影响需氧的因素:
(1)遗传因素：不同的微生物呼吸强度是不同的。一般为25～100mmolO2/(L·h)。
(2)菌龄：一般幼龄菌生长旺盛，呼吸强度大；老龄菌生长慢，呼吸强度小。
(3)代谢类型：若产物是通过三羧酸循环(TCA)获取，则呼吸强度高，如Glu、天冬氨酸的生产；若糖酵解途径(EMP)，则呼吸强度低，如苯丙氨酸、亮氨酸的生产
(4)培养基的成分与浓度
培养基成分尤其是碳源对细胞的耗氧量有很大影响。
培养基的浓度也会影响细胞的耗氧速率。营养丰富，菌体生长快，耗氧量大.
内源呼吸：如果外界没有供给能源，而是利用自身内部储存的能源物质进行呼吸
外源呼吸：在正常情况下，微生物利用外界供给的能源进行呼吸
（5）发酵条件：
温度、pH通过对酶活性的影响而影响菌体细胞的耗氧
温度还影响发酵液中的溶氧浓度
有些有害物质的积累，如NH3、CO2会抑制微生物的呼吸
4.溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响
(1)呼吸临界氧浓度: 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。如果对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度
(2)在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。即使是专性好氧菌，过高的溶氧对生长可能不利。氧的有害作用是通过形成新生O，超氧化物基O2-和过氧化物基O22-等破坏细胞体现的。另外，次级代谢产物的生产，控制生长不使过量是必须的，否则产量会减少。
例如：天冬酰胺酶发酵中，前期是好氧培养，后期转为厌氧培养，酶活可大大提高（3）谷氨酸发酵的曲线解说：
前期，产生菌大量繁殖，需氧量不断增加。此时的需氧量超过供氧量，使溶氧明显下降，出现一个低峰，发酵液中的菌浓同时出现一个高峰。过了生长阶段，需氧量有所减少，溶氧经过一段时间的平稳阶段后，就开始形成产物，溶氧也不断上升
（4）引起溶氧异常下降，可能有下列几种原因：
①污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近；
②菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降；
③某些设备或工艺控制发生故障或变化
搅拌功率变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。
消泡剂因自动加油器失灵或人为加量太多，也会引起溶氧迅速下降
（5）引起溶氧异常升高的原因：
供氧条件没有发生变化的情况下，主要是耗氧出现改变，如菌体代谢出现异常，耗氧能
力下降，使溶氧上升。特别是污染烈性噬菌体，影响最为明显
5.反应器中氧的传递：
（1）发酵液中氧的传递方程：
N ：传氧速率 kmol/m2.h kg: 气膜传质系数 kmol/m2.h.atm
kL: 液膜传质系数 m/h
（2）
Na ：体积传氧速率 kmol/m3.h K L a=以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数 h-1
6.影响摇瓶kLa 的因素：
装液量和摇瓶机的种类
7.影响发酵罐中kLa 的因素：
设备参数 操作条件 发酵液的性质
氧载体：液相一般具有比水更高的溶氧能力，且与发酵液互不相溶，称为氧载体 主要:液态烷烃、油酸、甲苯、豆油
8.发酵过程中溶解氧的控制:
溶氧控制的一般策略:
前期大于临界呼吸溶氧浓度有利于菌体生长，中后期满足产物的形成
发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，
所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌
四．发酵过程泡沫的形成与控制
1.发酵过程起泡的利弊：因通气搅拌、产生CO2以及发酵液中糖、蛋白质等稳定泡沫的
物质的存在，使发酵液含有一定量的泡沫，这是正常现象。少量泡沫可增加气液接触面积，
有利于氧的传递，但过多的泡沫是有害的
2.泡沫形成的原因
（1）气液接触：
大致有以下两类情况：
①气体从外部进入液体，如搅拌液体时混入气体
②气体从液体内部产生。气体从液体内部产生时，形成的泡沫一般气泡较小、较稳定。
（2）含助泡剂：
助泡剂就会形成定向吸附层。与液体亲和性弱的一端朝着气泡内部，与液体亲和性强
的一端伸向液相，这样的定向吸附层起到稳定泡沫的作用。
3.起泡速度高于破泡速度
起泡的难易，取决于液体的成分及所经受的条件；破泡的难易取决于气泡和泡破灭后形
成的液滴在表面自由能上的差别
)()(c c k p p k N i L i g -=-=)
*(c c a k Na L -=
体系的起泡程度是起泡难易和泡沫稳定性两个因素的综合效果
4.发酵过程泡沫产生的原因
(1)通气搅拌的强烈程度
(2)培养基配比与原料组成:培养基营养丰富,黏度大,产生泡沫多而持久,前期难开搅拌
(3)菌种、种子质量和接种量
(4)灭菌质量
5.起泡的危害
(1)降低生产能力(2)引起原料浪费
(3)影响菌的呼吸(4)引起染菌
(5)引起菌的过早自溶(6)对发酵工艺和提取纯化造成困难
有利之处：气体分散、增加气液接触面积
6.影响泡沫稳定性的因素:
(1)泡径大小
(2)溶液所含助泡物的类型和浓度：降低表面张力增加泡沫弹性
（3）助泡剂浓度
7.起泡液的粘度：
粘度很高，所产生的泡沫非常稳定
8.其他：pH 表面电荷
9.以霉菌发酵为例，说说发酵过程中泡沫的消长规律：
发酵初期泡沫的高稳定性与发酵液的高表现黏度和低界面张力有关，而随着霉菌产生的蛋白酶、淀粉酶的增多和对营养物质的利用，造成产生泡沫的蛋白质等物质分解，培养液的性质发生改变，黏度降低促使界面张力上升，泡沫减少，当达到发酵的后期，由于微生物细胞的自溶，又使蛋白质的浓度增加，促使发酵过程的泡沫上升。此外，发酵过程中染菌会使发酵液的黏度变大，也会产生大量的泡沫。同时由于微生物的呼吸和发酵产生大量的CO2等气体排放到发酵液中，必然也会引起大量泡沫的产生
10.起泡的方式有5种：
①整个发酵过程中，泡沫保持恒定的水平；
②发酵早期，起泡后稳定地下降，以后保持恒定；
③发酵前期，泡沫稍微降低后又开始回升；
④发酵开始起泡能力低，以后上升；
⑤以上类型的综合方式
11.消泡的方式：
①调整培养基中的成分，或改变某些物理化学参数，或者改变发酵工艺；
②采用机械消沫或消沫剂消沫
从生产菌种本身的特性着手，预防泡沫的形成。
12.消泡剂可分为破泡剂和抑泡剂
破泡剂是加到已形成的泡沫中，使泡沫破灭的添加剂：低级醇、天然油脂
抑泡剂是发泡前预先添加而阻止发泡的添加剂：聚醚及有机硅等属于抑泡剂
13.对消泡剂的要求
（1）在起泡液中不溶或难溶
（2）表面张力低于起泡液
（3）与起泡液有一定程度的亲和性
（4）与起泡液不发生化学反应
（5）挥发性小，作用时间长
14.常用消泡剂的种类和性能
①天然油脂：酒糟榨出液啤酒花油
②聚醚类消泡剂：甘油三羟基聚醚
①聚氧丙烯甘油定名为GP型消泡剂，基础培养基中加入
②GP型消泡剂的聚丙二醇链节末端再加成环氧乙烷，成为链端是亲水
基的聚氧乙烯氧丙烯甘油，也叫GPE型消泡剂（泡敌），在粘稠发酵液中效果较好
③高碳醇
④硅酮类：聚二甲基硅氧烷
15.消泡剂选用依据：
①表面活性剂，具有较低的表面张力（内聚力弱），消泡效果明显。
②对气-液界面的散布系数必须足够大，才能迅速消泡；
③无毒害性，且不影响发酵菌体；
④不干扰各种测量仪表的使用；
⑤在水中的溶解度较小，以保持持久的消泡性能；
⑥来源方便，使用成本低
16.应用：
载体以助其分散：①消泡剂+ 载体；②复合消泡剂；③消泡剂+ 乳化剂
17方式：
机械消泡方式：罐内消泡；罐外消泡
五．中间补料及其控制
1.中间补料的原因
中后期营养不足，菌体过早衰老；
初始培养基营养过于丰富造成菌浓过大而缺氧；
初始培养基中葡萄糖过多引起抑制；
代谢后碳氮源不平衡、微量元素缺乏；
合成产物或中间产物积累的毒性。
2.中间补料的意义及原则：
意义：控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动，延长合成期，推迟菌体自溶。另外，加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。
原则：控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展。
3.中间补料控制
补充微生物所需的能源和碳源物质：抗生素发酵中普遍采用
①添加葡萄糖、液化淀粉、饴糖；作为消泡剂的天然油脂，同时也起到补充碳源的作用
②还原糖水平和总糖水平
③以控制菌体浓度不增或略增为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成
4.补料方式：
补料方式可分为：
连续流加：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。
不连续流加(少量多次、大量少次)
多周期流加
补加营养物成分来看，又有单组分补料和多组分补料
5.酵母菌发酵的四种培养模式比较
（1）分批培养：没有进行补料，到发酵后期由于碳源不够，使得酵母菌的细胞干重和GSH总量都比较低
（2）恒速流加：改善了发酵后期的营养条件，使得细胞干重和GSH总量均↑，前期葡萄糖过量，而后期葡萄糖量又不足，因此，限制了细胞干重和GSH总量的增加（3）指数流加：发酵后期为酵母生成GSH的重要阶段，大量的补糖适合酵母菌的生长，而并不适合GSH的合成
（4）恒pH补料分批培养:当调整至合适的pH时，可确保发酵液中的葡萄糖含量始终保持在较低的水平，因而可获得较高的GSH总产量。
6.补充微生物所需的氮源：
生产上补氮有两种：
补充有机氮源：尿素、酵母粉、蛋白胨、玉米浆，与碳源一起配合补料，工厂称作补混合料。
补充无机氮源：①通氨：补充无机氮源和调节pH，压缩氨气或氨水（20%）
采用少量间歇添加或自动流加
②补硫酸铵：无机氮源和尿素一般采取流加方式
7.补前体：
8.补水、无机盐和微量元素
当发酵液过于粘稠时补水或补稀料可以稀释发酵液，增加氧的溶解度，提高供氧能力。
9.中间补料的优缺点：
优点：推迟菌体自溶期，延长产物分泌期，维持较高的生产速率，提高产量。
缺点：补料使工艺复杂化，而且增加了染菌机会。因此工厂管理十分重要，一定要严格消毒，包括补充料液的消毒和管道消毒
第二章工业微生物基础
1.芽孢：某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体
2.噬菌体：吸附、侵入、增值、成熟、释放
烈性噬菌体：凡是能够引起寄主细胞迅速裂解的噬菌体。
温和噬菌体：在侵染细菌之后，并不迅速增殖，而是以传递遗传信息的方式和寄主的遗传物质紧密结合在一起，随寄主细胞的繁殖而繁殖，在子代细菌中相传，不断延续。
3.工业微生物菌种的分离和选育：
分离：采样→预处理→增殖培养→纯种分离→性能测定
4.体外重组DNA技术育种
目标DNA片段的获得→与载体DNA分子的相连→重组DNA分子导入宿主细胞→
重组子的检出
5.代谢工程育种：
改变微生物的代谢流和代谢途径：
改变代谢途径的措施：1）提高限速途径的反应速度2）改变或阻断分支代谢途径流向3）构建代谢旁路4）改变能量代谢途径
6.工业微生物菌种的保藏：
（1）菌种保藏的基本原理：低温、干燥、缺氧
(2)菌种保藏的具体方法
斜面保藏法和穿刺保藏法干燥保藏法悬液保藏法冷冻干燥保藏法
液氨保藏法低温保藏法
7.菌种的扩大培养:
(1)微生物的培养方法
表面培养:表面培养是将纯种微生物接种在固体或液体培养基的表面的在恒温条件下进行静置培养的方法
固体培养:固体培养法是将纯种微生物接种在固体培养基上
液体深层培养:液体深层培养又叫液体通风培养，菌体在液体培养基中处于悬浮状态，导入培养基中的空气通过气液界面传质进入液相，再扩散进入细胞内部。在发酵罐（2）微生物的扩大培养
菌种扩大培养的目的：就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子种子扩大培养的任务：不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物
种子扩大培养的过程：
斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐
8.种子罐的级数越多好还是越少好？
种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌
的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐最终代谢产物积累的时间，缩短由于种子发芽、
生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率
9.什么叫接种龄？以什么接种龄接种较好
指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常接种龄以菌丝处于生命极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体尚未达到最高峰时较为合适。对于年轻的种子接入发酵罐后往往会出现前期生长缓慢，整个发酵周期延长；过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶
10.什么叫接种量？以什么接种量接种较好
指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。如大多数抗生素发酵的最适接种
量为7%-15%，由棒状杆菌进行谷氨酸发酵的接种量只需用1%
11.菌种退化及其防治
（1）返祖：指变异菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。
（2）指已经退化的菌种中（淘汰）衰退的个体，使其恢复原来优良的特性复壮的措施：
①配合一定的培养条件，对退化菌株进行单菌落或单细胞分离，淘汰退化的个体，纯化菌种；
②将芽孢杆菌的悬液加热至90处理数分钟，杀灭已退化的菌体，保留芽孢；再将芽孢或孢子进行传代，以淘汰退化的个体；
③提供特殊的培养条件，使环境有利于优良性状菌株的生长而不利于退化菌株的生长，从而淘汰已退化的菌株个体；
④将分离后得到的初筛菌株先保藏，再进行复筛考察，从中选出稳定性较好的菌种；
⑤同时应用上述方法的两种或两种以上的方法，会收到更好的复壮效果
（3）提供良好的环境条件
进行合理的传代采用优良的保藏方法定期纯化菌种
（4）保藏方法：斜面冰箱保藏法；石蜡油封藏法；砂土保藏法；冷冻干燥保藏
发酵工业简介 发酵工业是生物工程的重要组成部分，是生物工程产业化的基础。发酵工业指人们利用微生物的发酵作用，运用一些技术手段控制发酵过程，大规模生产发酵产品的一门传统工业。至今，我国已形成了一个品种繁多，门类齐全，具有相当规模的独立工业体系，在国民经济中占有重要地位，其产品应用覆盖医药、卫生、轻工、农业、能源、环保等诸多行业，某些产品如味精、柠檬酸年产量已跃居世界首位。如今，人们把利用生物细胞（指微生物细胞、动物细胞、植物细胞、微藻）在有氧或无氧条件下的生命来大量生产或积累生物细胞、酶类和代谢产物的过程成为发酵。 关键词：发酵工业、历史、现状、展望 很早以前，人们就利用发酵技术来生产产品，直到近代才发现发酵时由微生物一引起的。发酵工业自20世纪60年代以来迅猛发展，所涵盖的产品呢也从原来的抗生素、食品等几个方面渗透到人们生活的各个方面如医药、保健、农业、环境、能源、材料等。发酵工业是一种以高科技含量为特征的新兴工业，近年来特别是20世纪90年代以来，行业的迅速发展已经使其在食品工业中占有重要地位。发酵工业的迅速发展不仅带动了相关行业的发展，而且对节约粮食、增加食品花色品种、提高产品质量及改善环境等发挥了重要作用。 1、发酵工程发展简史 1、1传统发酵技术 人类利用自然发酵现象生产食品已有几千年的历史。你爱过就是最传统的发酵技术之一。大约在9000年前，具有人们用谷物酿造啤酒。在4000年前的龙山文化时期，我国就出现了黄酒酿造技术。都将、醋、豆腐乳、泡菜、奶酪等传统食品的生产也均在2000年以上。这些产品都是数千年来人们凭借智慧和经验，在没有亲眼见到微生物的情况下巧妙地利用微生物所获得的。当时，人们不知道发酵的本质，也就不会人为地控制发酵过程，生产职能凭经验，因此这个时期也成为天然发酵时期。现在，传统发酵技术仍然广泛应用于食品生产。 1、2近代发酵技术 1、2、1微生物纯培养技术期间 1680年，荷兰商人、博物学家列文虎克用自己发明创造的显微镜发现了微
教学基本内容： 氧传递基本理论－双膜理论；体积溶氧系数k L a的三种测定方法；设备参数及操作变数对体积溶氧系数k L a的影响；发酵液流变学性质对体积溶氧系数k L a的影响；提高体积溶氧系数k L a和体积溶氧速率N V的措施。 6.1 双膜理论 6.2 k L a的测定方法 6.3 k L a与设备参数及操作变数之间关系 6.4 发酵液的流变学性质对k L a的影响 6.5 提高k L a和N V的措施 授课重点： 1. 双膜理论。 2. 设备参数及操作变数对体积溶氧系数k L a的影响。 3. 发酵液的流变学性质对k L a的影响。 4. 提高体积溶氧系数k L a和体积溶氧速率N V的措施。 难点： 1. 双膜理论 2 流变学理论 本章主要教学要求： 1. 理解双膜理论。 2. 掌握影响k L a的影响因素，包括设备参数和操作变数，及发酵液流变学性质。 3. 熟悉提高体积溶氧系数k L a和体积溶氧速率N V的主要措施。
微生物只能利用溶解于水中的氧，不能利用气态的氧。而氧是难溶气体，在1atm 下、20oC 时，氧在纯水中的溶解度为0.21mmol/L ，在发酵液中溶解度更低，每升发酵液中菌体数一般为108~109个，耗氧量非常大，如果终止供氧，几秒钟后发酵液中溶氧将降为零。因此，氧常常成为发酵过程的限制性基质，解决好氧传递总是成为发酵过程的关键问题。工业生产中，将除菌后的空气通入发酵液中，使之分散成细小的气泡，尽可能增大气泡接触面积和接触时间，以促进氧的溶解。 氧的溶解实质上是气体吸收过程，是由气相向液相传递的过程。因此这一过程可用气体吸收的基本理论，即双膜理论加以阐明。 6.1双膜理论 这是一个放大的气泡，在气泡与包围着气泡的液体之间存在着界面，在界面的气泡一侧存在着一层气膜，在界面的液体一侧存在着一层液膜。气膜内的气体分子与液膜内的液体分子都处于层流状态，分子间无对流运动，氧的分子只能以扩散方式，即靠浓度并差推动而穿过双膜进入液相主流。另外，气泡内膜以外的气体分子处于湍流状态，称气体主流，主流中的任一点氧分子的浓度相等。液体主流也是如此。在双膜之间的两相界面上，氧的分压强与溶于界面液膜中的氧浓度处于平衡关系。传质过程处于稳定状态，传质途径上各点的氧浓度不随时间而变。 传氧方向 6-1气体吸收双膜理论图解
脑组织氧供需平衡监测的进展 第四军医大学西京医院麻醉科（710032）陈绍洋王强熊利泽 摘要：维持脑氧供需平衡，对脑保护和脑复苏具有重要的意义。脑氧代谢率(CMRO2)、颈内静脉血氧饱和度(S iv O2)、局部脑氧饱和度(S r O2)、脑动脉氧含量差(AVOO2)、脑组织氧分压(P bt O2)和正电子断层扫描等是监测脑组织氧供需平衡较常用的可行的方法。它有助于指导脑损伤和脑复苏的治疗，评估低温、药物和过度通气等各种治疗措施对维持脑氧供需平衡的效果，并为预后的判断提供依据。 关键词：脑保护；脑氧供需平衡；监测；评估 一、脑组织氧供需平衡监测的意义及方法 （一）脑组织氧供需平衡监测的意义 传统上，多依赖临床表现、颅内压(ICP)和脑灌注压(CPP)监测来指导脑复苏病人的治疗。但是，由于ICP和CPP缺乏脑血管阻力的信息，即使ICP正常时，脑循环不一定也正常；CPP正常或升高时，脑循环灌注也不一定是正常的。脑血流量(CBF)测定尽管在反映脑血流动力学方面比CPP准确，但它只是一个单纯的血流动力学参数，不能反映脑代谢状况。脑的缺血与否是相对于脑代谢而言的，即不管CBF多少，只要血液供应能够满足脑代谢需要，则意味着脑循环正常，否则为脑缺血。 事实上，脑中不同部位CBF和脑氧代谢率（CMRO2）并不相同。正常情况下，通过血流代谢耦联(flow--metabolism coupling)以及压力-流量调节(pressure-flow regulation)机制，使CBF和CMRO2之间维持平衡，即CBF/CMRO2之比在15-20，称为脑氧供需平衡。机体正常状态下，氧供(oxygen delivery, DO2)与氧耗(oxygen consumption, VO2)保持动态平衡状态；而在危重特殊脑复苏患者，则可出现病理性氧供依赖性氧耗，即氧耗增加或减少，随氧供的增加或减少而变化，这反映了低氧及氧债的存在，从而有可能导致脑缺血、缺氧，脑组织损害。由于脑氧代谢指标反映脑血液供应与脑代谢所需之间的匹配关系，能够更准确地反映脑循环状态，因此从维持脑氧供需平衡角度监测脑氧合，指导脑保护和脑复苏治疗十分重要。 （二）脑组织氧供需平衡监测的方法 1. 脑氧代谢率（CMRO2）测定 CMRO2=CBF×(CaO2- CjvO2)，需测定CBF、动脉血氧含量(CaO2)和颈内静脉血氧含量(CjvO2)。它反映全脑组织的氧代谢状况，结果可靠，但操作较复杂。CBF测定方法很多，经典的Kety-Schmidt法及Xe清除法均为使用放射性物质的有创性方法，很难常规用于术中监测。阻抗血流图(REG)方法还有待进一步完善。经颅彩色多普勒血流图(TCD)是一种连续无创监测脑血流量的新方法。研究表明, TCD所测定的血流速度与CBF之间有良好相关性(r=0.80-0.93, P<0.01)。但由于个体差异及解剖变异，TCD不能准确测量脑血流量，仅能反映脑血流的动态变化，对局部脑组织的病理改变，则受探头放置的部位影响，不能获得确切结果。 2. 颈内静脉血氧饱和度(SjvO2)监测 SivO2监测是目前较常用的监测脑氧合的方法。由于颈静脉球部血液由大脑直接引流而至，故临床上以监测颈静脉球部血氧饱和度代替脑静脉血氧饱和度。由Fick原理可推得公式：SjvO2=CaO2-CMRO2/CBF。在动脉氧合良好、血红蛋白相对稳定（即CaO2不变）的情况下，SjvO2反映的是CMRO2与CBF的平衡关系，即所为谓的脑氧供需平衡。CBF减少时，脑组织为维持正常代谢需要，从血流中摄取氧的比例相对增多，脑静脉血中氧含量下降；反之，CBF增多超过代谢需要时，脑组织从血流中所摄取氧的比例相对减少，致脑静
1.微生物生长中呼吸强度、摄氧率和临界氧浓度的含义分别是什么？ (1)呼吸强度（比耗氧速率）Q O2： 单位质量干菌体在单位时间内消耗发酵液中溶解氧的量 单位：mmolO2/（kg干菌体·h） (2)摄氧率（耗氧速率OUR）γ： 单位体积培养液（含干菌体质量X）在单位时间内消耗发酵液中溶解氧的量。 单位：mmolO2/(m3·h) （3）临界氧浓度：C cr Q O2受发酵液中CL影响，不同微生物对CL都有最低要求。即不影响其呼吸所允许的最低溶氧浓度，称为临界氧浓度。 2.写出发酵液中体积氧传递方程，并指出其中的各参数的含义。 （1）OTR = n O2?a 单位体积的比表面积a，单位面积的传氧速率n O2 （2）OTR=K L a(C*-C L)=K G a(P-P*)=K L a·1/H(P-P*)
OTR—单位体积培养液中氧的传递速率，kmol/(m3?h) K L a—以浓度差为推动力的体积溶氧系数，h-1,s-1 K G a—以分压差为推动力的体积溶氧系数,kmol/(m3?h?MPa) P*—与液相中氧浓度C相平衡时氧的分压，Pa C*—与气相中氧分压P达平衡时氧的浓度，k mol/m3 C L—液相中和气、液界面处氧的浓度，k mol/m3 3.影响氧传递的因素有哪些，如何影响的？ 两大类主要影响因素： （1）影响推动力（C*-C L）氧浓度差的因素 C*—与气相中氧分压P达平衡时氧的浓度，mol/m3 C L—液相中氧的浓度，mol/m3 ①温度 C w* =14.6/t+31.6 t—温度,℃ t ↑，C w*↓，推动力↓OTR ↓ ②溶质 对于单一电解质 : lgC w*/C e*=K C E
发酵工程习题 1、举出几例微生物大规模表达的产品, 及其产生菌的特点？ 2、工业化菌种的要求？ 3、讨论：生产抗生素的微生物能不能生产氨基酸？ 4、讨论：微生物（包括动、植物）可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产，对于某一种特定的产品，为何只有特定的微生物才具有大量表达的潜力？ 5、自然界分离微生物的一般操作步骤？ 6、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集富集？ 7、菌种选育分子改造的目的？ 8、以目前的研究水平，土壤中能够培养的微生物大概占总数的多少？什么是16sRNA同源性分析？ 9、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？ 10、什么是正突变？什么是负突变？什么是结构类似物？ 11、什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？ 12、什么是基因的重组？什么是基因的直接进化？二者有何区别？ 13、什么是培养基?发酵培养基的特点和要求？ 14、用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？ 15、什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？ 16、常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？ 17、什么是前体？前体添加的方式？ 18、什么是生长因子？生长因子的来源？ 19、什么是产物促进剂？产物促进剂举例？ 20、什么是理论转化率？什么是实际转化率？ 21、培养基设计的一般步骤？ 22、培养基成分选择考虑的问题？ 23、读书报告：举例说明培养基设计的方法与步骤？ 24、讨论：培养基优化在发酵优化控制中的作用与地位？ 25、么是种子的扩大培养？ 26、种子扩大培养的目的与要求？ 27、种子扩大培养的一般步骤？ 28、在大规模发酵的种子制备过程中，实验室阶段和生产车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点？ 29、什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？ 30、什么时发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？ 31、什么是种龄？事宜种龄确定的依据？ 32、读书报告：结合具体的产品理解种子质量控制的方法，以及认识种子质量对发酵的影响？ 33、接种、倒种、双种？ 34、么是菌体的生长比速？产物的形成比速？基质的消耗比速？维持消耗？ 35、什么是Monod方程其使用条件如何？各参数的意义与求解？ 36、什么是初级代谢产物？什么是次级代谢产物？ 37、什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？ 38、什么是连续培养？什么是连续培养的稀释率？ 39、解释连续培养富集微生物的原理？
1.发酵工程的主要内容发酵条件的优化与控制、反应器的设计及产物的分离、提取与精制 2.根据微生物与氧的关系，发酵可分为__需氧发酵_和_厌氧发酵__两大类。 3.在无氧条件下能将丙酮酸分子转变成乙醇分子的微生物是___酵母__。 4.诱发突变的方法分为物理方法和化学方法，物理方法主要是紫外线_，x射线_，B射线_和_激光__；化学诱变剂包括_碱基类似物， _烷化剂__ 和 _吖啶色素_ 。 5.消毒和灭菌的区别在于前者是杀死或除去病原微生物营养体细胞，而后者则指杀死包括芽孢在内的所有微生物。 6.紫外线照射能使 DNA 产生胸腺嘧啶二聚体，从而导致 DNA 复制产生错误；用紫外线诱变微生物应在红灯条件下进行，以防止光复活效应现象的产生。 7.巴斯德效应的本质是能荷调节，表现为呼吸抑制发酵。 8.乳酸发酵一般要在无氧条件下进行,它可分为同型乳酸发酵和异型乳酸发酵_。 1.根据不同的分类原则，工业发酵可分为若干类型。如按发酵形式来区分，有 传统工艺发酵和现代工业发酵；按发酵培养基的物理性状来区分，有固态发酵、半固态发酵和液态发酵；按发酵工艺流程来区分，有分批式发酵、连续式发酵和流加式发酵；按发酵过程中对氧的不同需求来区分，有厌氧发酵和需氧发酵。 2.发酵工业上常用的微生物有细菌（如枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、 乳酸菌、状芽孢杆菌）、酵母菌、霉菌（如根霉、曲霉）和放线菌四大类群。 3.微生物群体的生长过程，大致可划分为４个阶段：延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。 4.微生物生长所需的基本营养物质有碳源、氮源、无机盐类、生长因子和水分。 5.发酵工业生产中的碳源主要是糖类和淀粉，如葡萄糖、玉米、大米、 大麦、高梁、麸皮等。氮源主要是玉米浆、花生饼粉等有机氮源，也有尿素、硫酸铵、硝酸铵等无机氮液。 6.筛选新菌种的具体步骤大体可分为采样、增殖培养、纯种分离、发酵试验、性能测定等。 7.菌种的选育方法常用的有新菌种的分离与筛选、诱变育种和基因重组育种。 8.常见的菌种保藏方法有：斜面转接保藏法、液体石蜡保藏法、 砂土管保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法。 9.培养基的种类繁多，一般可根据其营养物质的不同来源分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基，根据培养基的不同用途分为基础培养基、增殖培养基、鉴别培养基和选择培养基；根据培养基的物理状态的不同分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。在工业发酵中，依据生产流程和作用的不同分为斜面培养基、种子培养基以及发酵培养基。 11.发酵生产中常用的除菌方法有高压蒸汽灭菌法、巴斯德消毒法、空气过滤除菌法、、辐射灭菌法和化学试剂消毒等 1、获得纯培养的方法有：平板划线法、平板稀释法、组织分离法 等方法。 的目的通常是为了__ 中和有机酸，调节PH _。 2、液体培养基中加入CaCO ３
氧传递系数测定实验 一、实验目的： 1、了解α和β的意义。 2、掌握非耗氧生物污水α、β值的测定： 二、实验原理 影响氧转移的主要因素有：①曝气水水质②曝气水水温③氧分压④气液之间的接触面积和接触时间⑤水的紊流程度等。而曝气水的水质对氧转移造成的影响主要表现在以下两个方面。（1）由于待曝气充氧的污水中含有各种各样杂质，如表面活性剂、油脂、悬浮固体等，它们会对氧的转移产生一定影响，特别是在两活性物质这类两亲分子会集结在气、液接触面上，阻碍氧的扩散。相对于清水，污水曝气充氧得到的氧转移系数K`La会比清水中的氧总转移系数KLa低，为此引入修正系数α= K`La/ KLa;该式是在相同的设备中，在相同条件下数值比较。（2）由于污水中含有大量盐分，它会影响氧在水中的饱和度，相对于相同条件的清水而言，污水中氧的饱和度C`S要比清水中的氧饱和度CS低，为此引入β= C`S / CS;转移速度由下式表示：dc/dt=K`La(C`S-CS)(式中符号同上) 本实验采用间歇非稳态实验方法，即在相同条件下按照对清水实验的方法，分别对清水和污水（十字河水）进行充氧实验，利用实验得出的数据应用公式计算出α、β值。因为是对比实验，实验中应严格控制基本实验条件，如水温、水量、供气量等，以保证数据可靠。 三、实验设备及仪器 1）实验装置：有鼓风机、转子流量计、曝气筒等；（2）温度计、秒表；（3）碘量法测定溶解氧时所需的药品及仪器；（4）实验水样（十字河水和自来水）四、实验试剂 （1）脱氧剂：无水亚硫酸钠；（2）催化剂：氯化钴（0.1mg/L） （3）针筒50ml。 五、实验步骤及记录 1、分别将待曝气污水和清水注入曝气筒，水位相同； 2、分别从两个曝气筒取样测溶液溶解氧浓度，计算脱氧 剂无水亚硫酸钠和催化剂氯化钴的投加量，计算公式：
华中科技大学硕士研究生入学考试《生物化工基础》 考试大纲 （科目代码：822） 第一部分考试说明 一、考试性质 生物化工基础是针对生物工程、生物材料与组织工程专业硕士生的专业课考试科目。它的评价标准是高等学校优秀本科毕业生能达到的水平，以保证被录取者具有较好的生物化工基础理论和应用基础。 考试对象为参加全国硕士研究生入学考试的准考考生。 二、考试形式与试卷结构 （一）答卷方式：闭卷，笔试 （二）答题时间：150分钟 （三）题型比例 名词解释约20％ 判断题约20％ 问答题约30％ 综合题约30％ 第二部分考查要点 一、发酵工程概论 发酵及发酵工程的定义，发酵工程发展史，发酵工业特点及范围，发酵类型与工艺流程，发酵工程应用前景 二、发酵工业菌种 发酵工业菌种的分离筛选，发酵工业菌种鉴定，发酵工业菌种改良，发酵工业菌种保藏 三、发酵工业培养基设计 常用培养基的基本要求，培养基的成分及来源，培养基的类型与区别，发酵培养基设计原理与优化方法 四、发酵工业的无菌技术 工业发酵污染的防治，灭菌方法，培养基及设备灭菌，空气除菌 五、发酵工业的种子制备 种子制备原理与技术，影响种子质量的因素，种子质量的控制措施，种子制备的放大原理与技术 六、发酵动力学 分批发酵动力学，连续发酵动力学，补料分批发酵动力学，基因工程菌培养过程的动力学模型 七、发酵工业中氧的供需 微生物对氧的需求，发酵过程中氧的传递，发酵过程耗氧与供氧的动态关系，影响氧传递的因素，传氧效率，摄氧率、溶解氧、K L a的测定 八、发酵过程控制 发酵过程控制的基本概念，温度对发酵的影响及其控制，pH值对发酵的影响及其控制，溶氧对发酵的影响及其控制，CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制，基质浓度对发酵的影响及补料控制，泡沫控制，高密度发酵及过程控制，发酵终点检测与控制，自动控制技术
生物反应器中的氧传递 在发酵中微生物只能利用溶解于水中的氧，不能利用气态的氧。而氧是难溶气体，在1atm 下、20oC 时，氧在纯水中的溶解度为0.21mmol/L ，在发酵液中溶解度更低，每升发酵液中菌体数一般为108~109个，耗氧量非常大，如果终止供氧，极短时间内发酵 液中溶氧将降为零。因此，氧常常成为发酵过程的限制性基质，解决好氧传递总是成为发酵过程的关键问题。体积溶氧系数k L a 是表征生物反应器传递氧效能的重要指标。工业生产中，将除菌后的空气通入发酵液中，使之分散成细小的气泡，尽可能增大气泡接触面积和接触时间，以促进氧的溶解。 氧的溶解实质上是气体传递的过程，是由气相向液相传递的过程。这一过程可用双膜理论加以阐明。 1．双膜理论 这是一个放大的气泡，在气泡与包围着气泡的液体之间存在着界面，在界面的气泡一侧存在着一层气膜，在界面的液体一侧存在着一层液膜。气膜内的气体分子与液膜内的液体分子都处于层流状态，分子间无对流运动，氧的分子只能以扩散方式，即靠浓度并差推动而穿过双膜进入液相主流。另外，气泡内膜以外的气体分子处于湍流状态，称气体主流，主流中的任一点氧分子的浓度相等。液体主流也是如此。在双膜之间的两相界面上，氧的分压强与溶于界面液膜中的氧浓度处于平衡关系。传质过程处于稳定状态，传质途径上各点的氧浓度不随时间而变。 气体吸收双膜理论图解
从图中可以看出，通过气膜的传氧推动力为P-P i ，通过液膜时推动力为C i -C 。 在稳定传质过程中，通过气、液膜的传氧速率N 应相等。 )()(C C k P P k N i L i g -=-= (1) 式中 N ：传氧速率(kmol/m 2.h) k g ：气膜传质系数 [kmol/(m 2.h .atm)] k L ：液膜传质系数(m/h) 设：P *为与液相主流中溶氧浓度C 相平衡的氧的分压强(atm)。 C *为与气相主流中氧的分压强相平衡的氧的浓度(kmol/m 3)。 根据亨利定律：C *=P/H 或P *=HC H 为亨利常数，随气体及溶剂及温度而异，它表示气体溶于溶剂的难易。氧难溶于水，H 值很大。将气膜、液膜作为一个整体考虑，则 N=K G (P-P *)=K L (C *-C) (2) 式中 K G ：以氧的分压差为总推动力的总传质系数[kmol/(m 2.h .atm) K L ：以氧的浓度差为总推动力的总传质系数(m/h) 溶氧浓度C 较易于测量，C *可以用公式C *=P/H 算出(P 为发酵罐进气氧分压)，故以(C *-C)为推动力较方便。 总传质系数K L 与k g 及k L 的关系如下： N C C K L -=*1 L g i i i k k H N C C N H P P N C C N C C 11*+?=-+?-=-+-= 氧气H 值很大，因此k L ≈K L 所以： N=k L (C *-C) (3) 这说明氧气溶于水的速率是液膜阻力控制的。 式（3）是单位界面上的每小时的传氧量。由于输送面积难于测量，N 也是如此。另外k L 也难于测量。在式（3）两边各乘以a ，a 为单位体积液体中气液两相的总界面积(m 2/m 3)，则得： N V =k L a(C *-C) 式中 N V ：体积溶氧速率(kmol/m 3.h)
楚雄师范学院化学与生命科学系 生物技术专业《发酵工程》（理论）课程教学大纲 一、课程基本信息 课程代码：031106009 课程中文名称：发酵工程 课程英文名称：Fermentation Engineering 课程性质：共同学科课程选修 使用专业：生物技术、葡萄酒专业 开课学期：第6学期 总学时：36 总学分：2 预修课程：无机及分机化学、有机化学、微生物、分子生物学、生物化学 课程简介：本课程是生物技术专业的必修课。课程系统讲授发酵工程基本概念、基本理论和分析方法，主要内容包括：工业微生物菌种选育、工业发酵培养基设计、发酵工业无菌技术、种子扩大培养、发酵动力学、氧的供需、发酵生理及其过程控制、发酵罐的放大与设计、基因工程菌发酵、发酵产品的提取与精制、发酵工业清洁生产、发酵工厂设计、发酵经济学、发酵产品生产原理与技术应用，以及发酵工程在现代生物化工中的应用等方面。 教材建议：余龙江，《发酵工程原理与技术应用》，北京，化学工业出版社，2006年。 参考书：李艳主编，《发酵工程原理与技术》，高等教育出版社，2007年。 李艳，《发酵工业概论》，中国轻工业出版社，2002年。 姚汝华，《微生物工程工艺原理》，华南理工大学出版社，2005年。 熊宗贵，《发酵工艺原理》，中国医药科技出版社，2000年。 毛忠贵，《生物工业下游技术》，中国轻工业出版社，2002年。 梅乐和等，《生化生产工艺学》，科学出版社，2007年。 俞俊棠等，《生物工艺学》，华东化工大学出版社，1992年。 贺小贤，《生物工艺原理》，化学工业出版社，2003年。 二、课程性质、目的及总体教学要求 课程的基本特性：发酵工程具有涉及领域宽、涵盖范围广、基础性强的特点，就其学科性质而言它又是一门实践性较强的学科。通过本课程的学习，使学生在微生物学、生物化学等课程的基础上，系统的掌握发酵工程的基本理论、基本知识和基本技能，建立较深刻的微生物学观点，形成科学的思维方式。同时要求学生能了解现代发酵工程理论和技术的新发展。
一、名称解释 1、前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 2、发酵生长因子从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子 3、菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。 4、搅拌热：在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关 5、分批培养：简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。 6、接种量：移入种子的体积 接种量＝————————— 接种后培养液的体积 7、比耗氧速度或呼吸强度单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2?g菌-1?h-1 8、次级代谢产物是指微生物在一定生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质过程，这一过程的产物，即为次级代谢产物。 9、实罐灭菌实罐灭菌（即分批灭菌）将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，在冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，也叫间歇灭菌。 10、种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
《发酵工程原理与技术》习题集 问答题 1、发酵工业有何特点？简述发酵生产过程的主要环节。 2、工业用微生物的要求在哪些？试举例说明微生物要工业中的应用。 3、工业生产中使用的微生物为什么会发生衰退？菌种衰退表现在哪些方面？防止菌种衰退的措施有哪些？ 4、在菌种扩大培养中，就注意哪些事项？ 5、影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子的质量？ 6、配制发酵培养基时应注意哪些问题？本着什么原则进行配制？ 7、发酵培养基的碳氮比对菌体的生长和产物的生成有何影响？ 8、请列出适用于发酵培养基灭菌的方法，并比较其各自的优缺点。 9、某制药厂现有一发酵罐，内装80t发酵培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。如果每毫升培养基中含有耐热的芽孢数为2*107个，121℃时灭菌速度常数为0.0287S-1.请部灭菌失败概率为0.001时所需的灭菌时间是多少？ 10、请列出空气除菌的方法，并比较各种方法的优缺点。 11、影响空气过滤除菌效率的因素有哪些？ 12、比较两级冷却除菌流程、冷热空气直接混合除菌流程、高效前置过滤除菌流程的优缺点和适用场合，并分析原因。 13、解释氧在发酵液中的传质阻力和气体溶解过程的双膜理论。 14、说明影响氧传递速率的主要因素和效果。 15、比较酵母菌的酒精发酵和细菌的酒精发酵之异同。 16、说明初级代谢和次级代谢的关系及次级代谢产物的特征。 17、抗生素产生菌的主要代谢调节有哪几种方式？说明各种抗生素的生物合成机制。 18、阐述菌体生长速率、基质消耗速率、产物生成速率及意义。 19、发酵动力学如何分类？ 20、试比较不同发酵方法的优缺点。 叙述生物反应器（发酵设备）的功能和分类。 21、设计反应器时要本着哪些原则？反应器必须具备什么条件？ 22、机械搅拌发酵罐有哪些主要组成部分，它们各有怎样的功能或作用？ 23、发酵过程中温度升高对微生物生长和产物的形成有什么影响？什么原因造成温度升高？
《生物化工基础》第八次作业 细胞生物反应器及氧传递 化23 张猛 2012011916 一． 查阅资料，各举出搅拌式反应器、气升式反应器和鼓泡式反应器的一个应用例子，要求列出具体的培养体系，发酵培养基配方，达到的细胞密度以及生产的具体产品。 答： 1）搅拌式生物反应器[1] 背景介绍：搅拌式生物反应器悬浮培养水母雪莲细胞的研究 本实验所采用的搅拌式生物反应器的结构示意图如下： 图1. 搅拌式生物反应器示意图 【具体培养体系】 水母雪莲（Saussurea m edusa M axim）愈伤组织红色系，为实验室筛选所得。 【悬浮培养基配方】 悬浮培养基采用Murashige和Skoog设计的MS培养基*，附加0.5mg/L的6--‐苄基腺嘌呤(6--‐BA)、2mg/L的萘乙酸(NAA)、30g/ L的蔗糖、10g/L的葡萄糖。 *由于MS培养基成分复杂，考虑篇幅因素，将其配方列于最后的附录中，供参考。 【达到的细胞密度】 本实验中，发酵液中达到的细胞密度用细胞干重来表示。该实验对比相同营养条件下，水母雪莲细胞在摇瓶和搅拌式生物反应器中的生长情况，结果如下图所示：
图2. 摇瓶及反应器中的细胞生长情况 从图中可以看到，无论在摇瓶中还是在反应器中，细胞的生长都经过的相同的阶段：经过4d左右的延迟期后，进入对数生长期（4d~9d），12d时细胞生长达到高峰，随后进入稳定期。 对于摇瓶而言，所能达到的最大细胞干重约为23g/L,而在搅拌式生物反应器中，达到的最大细胞干重约为14g/L. 【生产的具体产品】 水母雪莲(Saussurea m edusa M axim)为我国传统的中草药，含生物碱、黄酮等多种有效成分。 本文关注于反应器的搅拌特性对该细胞发酵过程的带来的影响，初步探讨了搅拌式反应器中黄酮产量下降的原因，因此可为工业上利用水母雪莲细胞发酵生产黄酮提供参考依据。 2）气升式反应器[2] 背景介绍：利用稻谷壳水解液在气升式生物反应器中发酵生产单细胞蛋白 本实验所采用的气升式生物反应器为外循环结构，总容积为11. 5L，上升管与下降管的直径比(D/d)为6.6，罐体高径比(H/D )为2. 9，罐内可加装筛板，形成带筛板的外循环气升式生物反应器，其结构如下图所示：
氧供需平衡的监控 氧是人体维持生命所必须的物质。呼吸系统将氧摄入人体内，再由循环系统将氧输送机体各处为组织细胞利用，在细胞线粒体中通过生化反应将能量以三磷腺苷（A TP）的形式储存起来。缺氧可引起体内代谢异常和生理紊乱，导致重要脏器组织损害及功能障碍。因此，监控氧供需平衡对早期发现和防治组织缺氧，维持机体内环境的稳定有着重要的意义。 第一节氧供 一、氧输送及氧供的定义 1、氧输送（oxygen transport）空气中的氧输送到细胞内利用氧的部位线粒体的过程叫做氧输送。氧输送包括肺通气、肺换气、氧在血液中的运输及氧在组织的释放共四个阶段，其中任何一个阶段发生障碍，都会引起缺氧（hypoxia）。 2、氧供（oxygen delivery,DO2）又称整体氧供（global oxygen delivery）是指单位时间内循环系统向全身组织输送氧的总量。广义的讲，氧输送与氧从两个概念可以互相通用，但严格来说，二者还有有所不同。输输送的氧是指由心脏泵入到体循环中的氧量，而氧供是指经过毛细血管输送到机体组织为新陈代谢所利用的氧量。例如当存在动-静脉短路时，机体输送的氧量虽然正常，但该部位的氧供动为零。不过，在临床应用中很难将二者区分开来。 二、氧输送的监测 （一）氧吸入监测：即外呼吸过程的监测，包括肺通气和肺换气两个阶段。主要指标如下： 1、动脉血氧分压（PaO2）：PaO2是分析动脉血氧合状态的重要指标，也是判断低氧血症的唯一标准。其正常值为80~100mmHg，PaO2随年龄及所处海拔高度而异。需抽取动脉血通过血气分析（BGA）分析测定；目前已有连续动脉血气分析仪，可以动态监测PaO2变化。 2、氧合指数：即PaO2/FiO2。又称通气-灌注或呼吸衰竭指数。正常值为400~500mmHg。发生呼吸功能不全时，PaO2明显降低，加大吸入氧浓度无助于进一步提高PaO2，氧合指数小于300mmHg。 3、肺泡-动脉血氧分压差（PA-aO2，或A-aDO2）：即肺泡气氧分压（PAO2）与动脉血氧分压（PaO2）的差值。正常生理状态下，吸入空气时A-aDO2为0±10mmHg，吸入纯氧时为50±25mmHg。当存在肺换气功能障碍，如弥散障碍、肺泡通气与血流比值失调或肺内分流增加时，除PaO2下降外，还可引起A-aDO2增高。而通气不足时，虽然PaO2下降，但是A-aDO2正常。因此，监测A-aDO2有助于了解低氧血症的病理生理变化及判断原因。 由于肺泡气氧分压（PAO2）较难直接测量，临床上多采用以下公式计算 PAO2=FiO2×(PB-47)-PaCO2/RQ 式中PB为大气压（mmHg），47为呼吸道饱和水蒸气压（mmHg），PaCO2为动脉血二氧化
发酵工程复习题 第一章绪论 一名词解释 发酵，发酵工程，现代发酵工程，巴氏灭菌法，需氧发酵，厌氧发酵，兼性厌氧发酵，液体发酵，固体发酵（浅盘固体发酵和深层固体发酵），半固体发酵，分批发酵，连续发酵，补料分批发酵。 二简答题 1. 简述发酵工业的特点； 2. 简述发酵的一般工艺流程（菌种制备、培养基的制备、灭菌、接种、控制发酵条件、产物的提取与精制、回收处理三废物质)。 第二章发酵工业菌种 一名词解释 菌落，芽孢，荚膜，鞭毛，富集培养，比生长速率，连续培养，诱变育种，菌种退化，菌种的复壮。 二简答题 1. 简述酵母菌的形态结构及繁殖方式； 2. 菌种分离筛选步骤。 第三章发酵工业培养基设计 一名词解释 培养基，基础培养基，选择培养基，加富培养基，鉴别培养基，斜面培养基，种子培养基，发酵培养基。 二简答题 1. 培养基设计的基本原则 第四章发酵工业的无菌技术 一名词解释 灭菌，消毒，除菌，防腐，分批灭菌，连续灭菌。 二简答题 1. 发酵过程污染的危害； 2. 发酵过程染菌的检查方法； 3. 发酵工业常用的无菌技术； 4. 湿热灭菌的原理及优缺点。 第五章发酵工业的种子制备 一名词解释 接种龄，接种量 二简答题 1. 种子制备过程。 第六章发酵动力学 一名词解释 发酵动力学，恒化器，恒浊器 第七章发酵工业中氧的供需 一名词解释 呼吸强度（QO2），耗氧速率（摄氧率）(?)。 二简答题 1. 氧在微生物发酵中的作用； 2. 简述发酵工业无菌氧气的供应过程； 3. 简述发酵液中氧的传递过程。 第八章发酵过程控制 一名词解释 生物热，搅拌热，蒸发热，临界氧浓度（C临），泡沫，污染，呼吸商，通气，搅拌器，罐体，挡板，发酵罐，发酵罐夹套，发酵罐盘管，消泡器。
发酵工程试题及答案 一、名词解释 1、分批发酵：在发酵中，营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空 气进入和尾气排出外，与外部没有物料交换。 2、补料分批发酵：又称半连续发酵，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统 不 加一定物料的培养技术。 3、絮凝：在某些高分子絮凝剂的作用下，溶液中的较小胶粒聚合形成较大絮凝团的过程。 1、生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种制备、种子培养、发酵和提取精制等下游 处理几个过程。 2、根据过滤介质截留的物质颗粒大小的不同，过滤可分为粗滤、微滤、超滤和反渗透四 大类。 3、微生物的育种方法主要有三类：诱变法，细胞融合法，基因工程法。 4、发酵培养基主要由碳源，氮源，无机盐，生长因子组成。 5、青霉素发酵生产中，发酵后的处理包括：过滤、提炼，脱色，结晶。 6、利用专门的灭菌设备进行连续灭菌称为连消，用高压蒸汽进行空罐灭菌称为空消。 7、可用于生产酶的微生物有细菌、真菌、酵母菌。 常用的发酵液的预处理方法有酸化、加热、加絮凝剂。 8、根据搅拌方式的不同，好氧发酵设备可分为 9、依据培养基在生产中的用途，可将其分成 10、现代发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用。 11、发酵工程的主要内容包括生产菌种的选育、发酵条件的优化与控制、反应器的设计 及产物的分离、提取与精制。 12、发酵类型有微生物菌体的发酵、微生物酶的发酵、微生物代谢产物的发酵、微生物 转化发酵、生物工程细胞的发酵。
13、发酵工业生产上常用的微生物主要有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。 14、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢调控 育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 15、根据操作方式的不同，液体深层发酵主要有分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。 16、分批发酵全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐，所需的时间总和为一个发酵周期。 17、分批发酵中微生物处于限制性的条件下生长，其生长周期分为延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期。 18、根据搅拌的方式不同，好氧发酵设备又可分为机械搅拌式发酵罐、通风搅拌式发酵罐。 19、下流加工过程由许多化工单元操作组成，通常可以分为发酵液预处理和固液分离、 提取、精制及成品加工四个阶段。 20、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢调控 育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 21、微生物发酵产酶步骤为先选择合适的产酶菌株、后采用适当的培养基和培养方式进 行发酵、微生物发酵产酶、酶的分离纯化、制成酶制剂。 1、微生物发酵的最适氧浓度与临界氧浓度的概念是完全一样的（×） 2、从微生物中发现的抗生素，有约90%是由放线菌产生的。（×） 3、在微生物杀虫剂中，引用最广泛的是苏云金芽孢杆菌，他用来毒杀鳞翅目和双翅目的 害虫。（√） 4、分批发酵又称为半连续发酵。（×） 5、青霉素是由放线菌产生的。（×） 6、培养基的连续灭菌称为空消（×） 7、在微生物杀虫剂中，引用最广泛的是苏云金芽孢杆菌，他用来毒杀鳞翅目和双翅目的 害虫。（√） 8、在分批发酵中，最好的收获期是指数生长期。（×）
一、选择题（共10小题，每题2分，共计20分） 1.下列关于发酵工程的说法，错误的是（C ） A 发酵工程产品主要是指微生物的代谢产物、酶和菌体本身 B 可以通过人工诱变选育新菌株 C 培养基、发酵设备和菌种必须经过严格的灭菌 D 环境条件的变化既影响菌种的生长繁殖又影响菌体代谢产物的形成 2.当培养基pH发生变化时，应该（C ） A 加酸 B 加碱 C 加缓冲液 D 加无机盐 3. 甘油生物合成主要由下列哪种物质引起（D ） A 尿素 B 硫酸铵 C 酶 D 亚硫酸盐 4. 对谷氨酸发酵的叙述正确的是（D ） A 菌体是异养厌氧型微生物 B 生物素对谷氨酸生成无影响 C 谷氨酸的形成与搅拌速度无关 D 产物可用离子交换法提取 5. 为使淀粉和纤维素进行代谢而提供能量，（B ） A 它们必须第一步变成脂肪分子 B 它们的葡萄糖单位必须被释放 C 环境中必须有游离氧存在 D 遗传密码必须起促进作用 6. 关于微生物代谢产物的说法中不正确的是（D ） A 初级代谢产物是微生物生长和繁殖所必须的 B 次级代谢产物并非是微生物生长和繁殖所必须的 C 初级代谢产物在代谢调节下产生 D 次级代谢产物的合成无需代谢调节 7. 在发酵中有关氧的利用正确的是（B ） A 微生物可直接利用空气中的氧 B 微生物只能利用发酵液中溶解氧 C 温度升高，发酵液中溶解氧增多 D 机械搅拌与溶氧浓度无关 8.某药厂用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸，结果代谢产物没有谷氨酸而产生乳酸及琥珀酸，其原因可能是（B ） A 温度控制不适 B 通气量过多 C pH呈酸性 D 溶氧不足 9.下列可用于生产谷氨酸的菌种是（C ）
华中科技大学硕士研究生入学考试《生物化工基础》考试大纲 第一部分考试说明 一、考试性质 生物化工基础是针对生物化工专业硕士生的专业课考试科目。它的评价标准是高等学校优秀本科毕业生能达到的水平，以保证被录取者具有较好的生物化工基础理论和应用基础。 考试对象为参加全国硕士研究生入学考试的准考考生。 二、考试形式与试卷结构 （一）答卷方式：闭卷，笔试 （二）答题时间：150分钟 （三）题型比例 名词解释约20％ 填空题约20％ 问答题约30％ 综合题约30％ （四）参考书目 余龙江主编.发酵工程原理与技术应用. 化学工业出版社，2006，第1版第3次印刷 第二部分考查要点 一、发酵工程概论 发酵及发酵工程的定义，发酵工程发展史，发酵工业特点及范围，发酵类型与工艺流程，发酵工程应用前景 二、发酵工业菌种 发酵工业菌种的分离筛选，发酵工业菌种鉴定，发酵工业菌种改良，发酵工业菌种保藏 三、发酵工业培养基设计 常用培养基的基本要求，培养基的成分及来源，培养基的类型与区别，发酵培养基设计原理与优化方法 四、发酵工业的无菌技术 工业发酵污染的防治，灭菌方法，培养基及设备灭菌，空气除菌 五、发酵工业的种子制备 种子制备原理与技术，影响种子质量的因素，种子质量的控制措施，种子制备的放大原理与技术 六、发酵动力学 分批发酵动力学，连续发酵动力学，补料分批发酵动力学，基因工程菌培养过程的动力学模型 七、发酵工业中氧的供需 微生物对氧的需求，发酵过程中氧的传递，发酵过程耗氧与供氧的动态关系，影响氧传递的因素，传氧效率，摄氧率、溶解氧、K L a的测定 八、发酵过程控制 发酵过程控制的基本概念，温度对发酵的影响及其控制，pH值对发酵的影响及其控制，溶氧对发酵的影响及其控制，CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制，基质浓度对发酵的影响及补料控制，泡沫控制，高密度发酵及过程控制，发酵终点检测与控制，自动控制技术