基于基因技术的难降解污染物的微
生物治理研究
摘要：基于我国农田重金属污染、水体中持久性有机污染物以及海洋石油污染三种难降解污染物的污染状况，从微生物技术，尤其是微生物基因工程技术在治理环境中的优势入手，介绍了近年来研究者们在微生物基因工程层面上对以上三种污染物的研究进展，并对以后微生物的重建、重组等基因技术进行了展望：生物工程菌将会有很好的应用前景。
1、难降解污染物的污染现状
1.1我国农田重金属污染现状
随着我国社会经济的发展，农田重金属污染的问题越来越引起政府和公众的广泛关注。土壤重金属污染直接影响到土壤质别、水质状况、作物生长、农业产量、农产品品质等，并通过食物链对人体健康造成危害。我国对8个城市农田土壤中的Cr、Cu、Pb、Zn、Ni、Cd、Hg和As进行过过统计，大部分城市都高于其背景值。农业部农产品污染防治重点实验室对对全国24个省市土地调查显示，320个严重污染区，约548×104 hm2农产品占污染物超标农产品总面积的80%以上[1]。2012年前，环境保护部对30×104 hm2基本农田保护区土壤重金属抽测了 3.6×104 hm2，重金属超标率达12.1%。目前，全世界平均每年排放Hg约1.5万t、Cu为340万t、Pb为500万t、Mn为l500万t、Ni为100万t，造成了不同程度的土壤重金属污[2]。
1.2水体中持久性有机污染物的污染现状
持久性有机污染物简称POPs，又称难降解化学污染物，是一类
具有高毒性、持久性、易于在生物体内聚集和长距离迁移与沉积、对环境和人体有着严重危害的有机化学污染物质。由于POPs对全球环境造成潜在威胁, 对人类健康造成巨大危害[3]。近年来, POPs已经引起各国政府、学术界、工业界和公众的广泛关注,成为倍受关注的全球性环境焦点，近年来,我国对一些水体环境污染展开了调查, 在长江黄石段检出100多种有机物，松花江哈尔滨段检出264种，第二松花江吉林段检出的有机物近417种,珠江检出的有机物241种,太湖检出有机物74种，沱江检出有机物175种, 上海黄浦江水源中检出有机污染物400多种[4]。被检出的有机物中有些是有毒有害的“三致”污染物，其中多数属于POPs物质。POPs农药已不同程度地残留于大部分河流和湖泊水体中，由于其长距离迁移性，也导致了地下水污染[5]。
1.3海洋石油污染现状
随着人们对石油重要性认识的加强以及航海技术的发展，大量石油的开采、运输和使用等使海洋石油污染空前严重。据统计,每年通过各种渠道泄入海洋的石油和石油产品, 约占全世界石油总产量的5‰，倾注到海洋的石油量达2*106-1*107t，我国作为世界上石油使用最早的国家之一, 目前海上各种溢油事故每年约发生 500起，沿海地区海水含油量已超过国家规定的海水水质标准 2-8倍[6]。以江
苏省为例，对其23条主要入海河流的监测统计, 经由江苏省河流的
入海石油类污染物为4357.6t/a，入海石油量在500t/a 以上的河流
有长江口北支、射阳河、苏北灌溉总渠和新洋港；灌河、排水渠和斗龙港也在100t以上;直接排海企业入海石油类污染物为1.5t/a。江
苏省海洋石油污染除了陆源以外, 海洋运输船只溢油事故、压舱水无处理排放以及其他海域石油污染扩散等也对江苏省海域产生了重要
影响[7]。
2、生物技术在环境治理中的优势
微生物在解决环境问题过程中所显示的独特功能与显著优越性充
分体现了它是一个纯生态过程，从根本上体现了可持续发展的战略思想。微生物技术在治理环境污染方面具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和以及不会产生二次污染等显著优点，并且其技术有着广阔的应用前景，所以受到了各国政府、科技工作者和企业家的高度重视。
就目前来说，微生物技术已经是环境保护中应用最广的、最为重
要的单项技术。它在水污染控制、大气污染治理、有毒有害物质的降解、物质资源化、污染环境的修复以及污染严重的企业的清洁生产等各个方面都发挥着极其重要的作用。应用微生物技术处理污染物时的最终产物大都是无毒无害的稳定的物质，如二氧化碳、水和氮等，并且该技术处理污染物通常能一步到位，避免了污染物的多次转移，因此它是一种消除污染安全彻底的方法，特别是现代为生物技术的发展，尤其是基因工程、细胞工程和酶工程等生物高技术的飞速发展和应用，使的微生物处理有了更高的效率、更低的成本和更好的专一性，为微
生物技术在环境保护中的应用展示了更为广阔的前景[8]。
近年来，研究者们对极端微生物的研究也越来越多。所谓极端微生物是指在极端环境下能够正常生存的微生物群体的统称。极端环境是指对生物生长产生限制因子的环境，通常指pH在4以下或9以上，温度在45℃以上或20℃以下，盐浓度在10％以上，诸如高温、低温、高酸、高碱、高盐、高毒、高渗、高压、干旱或高辐射强度等环境，在这样的环境中一般生物无法生存[9]。
利用生物方法治理极端环境中的污染物时，普通微生物甚至在实验室构建的工程菌在实际应用中不能发挥作用，而极端微生物则是作用的主体。当高原或纬度高的寒冷地带的河流、湖泊及土壤被污染时，嗜冷微生物可对污染物进行降解和转化。应用低温微生物对广受污染的寒冷地域环境进行废物处理越来越受到人们的重视，受污染寒冷土壤和水体的恢复可通过低温微生物的原位清洁作用来实现。工业生产产生的酸性工业废水和碱性工业废水可以分别考虑用嗜酸微生物和
嗜碱微生物进行处理，可以大大简化处理程序，降低处理成本。而在高温高盐的极端环境中，污染物的降解则需嗜热、嗜盐微生物。
极端微生物具有普通微生物不可比拟的抗逆能力，极端微生物产生的酶在极端环境中也可以保持活性，对极端环境的污染生物治理起着主要作用；同时，极端微生物在清洁能源的生产和环保产品的开发方面具有巨大的应用潜力，将有助于污染预防，在源头上解决环境污染问题[10]。因此极端微生物在环境保护中发挥着重要的作用。随着越来越多的极端微生物被分离鉴定、新产物的研究与生产、极端酶被分
离纯化和极端酶工程研究的进展，极端微生物及其产生的极端酶在环境保护中的应用将会进一步得到拓展。
3、微生物基因工程治理技术的研究进展
3.1微生物治理农田重金属
随着现代生物工程技术自然存的发展，使细菌上表达异源型成为
了可能。该技术在免疫学、疫苗学和生物工程学等方面已被广泛应用。基于蛋白在的微生物对重金属的吸附能力和特异性都比较低，利用生物工程技术在微生物细胞上表达金属结合蛋白或金属结合肽，从而制备全细胞工具来分离重金属方面的研究日益受到关注。研究表明，自然存在的金属结合蛋白在细菌细胞内或外膜表达能提高其对重金属
的富集能力。金属结合肽和金属结合蛋白通过表达在胞内或胞外，能增强微生物细胞对重金属的富集水平和亲和力，金属结合肽比自然存在的金属结合蛋白赋予细胞更高的亲和力、特异性和更高的富集容量。Chen和Wilson在大肠杆菌内同时表达MT基因和汞运输系统基因，
该细菌株对汞的富集能力明显高于单独表达MT基因的细菌[11]。Bac
等将人工合成的金属结合肽EC20表达在大肠杆菌外膜以及将EC20与Hg2+运输系统共同表达，结果与金属运输系统共同表达的细胞株对Hg2+的吸收容量比胞内单独表达EC20的细胞多三倍，而与细菌外膜表达
的细菌株类似。到目前为止，已明确汞、锡等极少数金属的运输系统基因[12]。近年来随着微生物表面肽库表达技术的发展，从肽库中筛选出对特定金属有高度特异性和亲和力的肽链也已成为现实。另外，从裂殖酵母菌、某些藻类和植物中也可以分离到一些多肽，称之为植物
麦合素，能结合Cd、Cu、zn、Hg、Pb、等重金属，从而达到去除重金属的目的。
3.2微生物治理水体中持久性有机污染物
目前,POPs的微生物治理成为国内外的研究热点。接种外源性高效微生物、添加微生物营养盐、提供电子受体、提供共代谢底物以及提高生物可利用性是促进生物修复的几大措施[12]。国内外学者对利用微生物处理持久性有机污染物进行了大量的实验和实践研究。这些研究主要考虑了以下2大方面：
⑴利用有效菌种降解有机污染物
实验人员利用从自然环境中通过驯化、筛选、分离得到能够去除特殊污染物的有效菌种。通过从污染现场的分离，目前已经得到不少表1 一些有机污染物的降解菌种[13]
能够降解有机污染物的特殊菌种。如广州科研所研制出了具有广谱脱色能力和降解苯胺能力的希瓦氏菌；中科院兰州化物所从土壤中筛选出的“帕氏氢噬胞菌LHJ38”和“类黄氢噬胞菌LHJ39”。对芳香烃类化合物有较强的降解作用[14]。任华峰等人从活性污泥中分离出一株降解对氯苯胺的细菌PCA039 菌株，该菌株能够以对氯苯胺为唯一碳源与氮源生长。美国研究人员发现一种叫G4的细菌，对高浓度的三氯乙烯(TCE)有分解能力。日本研究人员也获得一种叫M菌的菌株具有类似的降解TCE的效力[15]。在美国, 还获得耐抗生素的拟球菌195 菌株，能专一地使高氯乙烯(如四氯乙烯) 完全转化为无害的乙烯[16]。表中列举出一些能够降解典型有机污染物的有效果菌种。
⑵过诱变、质粒转移、原生质融合和基因重组等手段构建细菌[17]。由于从自然环境中驯化分离特殊菌种非常缓慢，远不能满足生物处理的需要，因此构建高效工程菌种日益受到研究者的重视。闫艳春等用抗性库蚊酯酶基因，引入原核表达载体pRL439，转化大肠杆菌HB101 细胞，获得表达。通过酶切、Southern 杂交鉴定重组质粒，4-二氯苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯) 进行原生质融合，得到能降解4 种污染物的融合体工程菌CB129，且产生了双亲所没有的新性状(能降解1，4-二氯苯甲酸酯)。也有研究者从美国密执安州地下土壤中找到一种专一性降解TCE的脱卤拟球菌，其脱卤功能是该菌产生脱氯酶作用的结果，若找到这种酶基因建构“脱卤工程菌”的话，那么它有可能更
有效直接用于脱除高氯乙烯污染物[18]。发现该重组质粒pRL2B1表达的酯酶具有高酶活性并能高效降解酯酶的特异性底物a-乙酸萘酯
(a-2NA) 和β2乙酸萘酯(β-2NA)。高枫等人以嗜蜡的不动杆菌4-1
作为受体菌，经溶菌酶破壁后，用嗜胶的假单胞菌Z17的全DNA 转化，构建具有嗜蜡、嗜胶双重性能的多功能石油降解菌-不动杆菌ZH20。Haugland等将能降解2，4-二氯苯氧乙酸的Alcaligenes eutrophus 质粒JMP134 转移到Pseudomonas putidaAC1100(该菌株能降解2，4 ，52三氯苯氧乙酸) 中，构建了工程菌RHJ1，能同时降解2，4-二氯
苯氧乙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸。Krckel 等将Pseudomonasalcaligenes CO (该菌株能降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯，但不能降解1，4-二氯苯甲酸酯和甲苯)和Pseudomonas
putida1R523 (该菌株能降解甲苯和苯甲酸酯，但不能降解1，4-二
氯苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯) 进行原生质融合，得到能降解4 种污
染物的融合体工程菌CB129，且产生了双亲所没有的新性状(能降解
1 ，4-二氯苯甲酸酯)。也有研究者从美国密执安州地下土壤中找到
一种专一性降解TCE的脱卤拟球菌，其脱卤功能是该菌产生脱氯酶作用的结果，若找到这种酶基因建构“脱卤工程菌”的话，那么它有可能更有效直接用于脱除高氯乙烯污染物[19]。
3.3微生物治理海洋中石油污染
微生物生长代谢过程中能够利用石油烃作为碳源和能源，并在酶
的催化下将其水解成甘油、脂肪酸，最后降解为H20、C02等无危害
的代谢产物。
多年来,美国通用电气公司A.M.Chakrabarty等人在研究假单胞
杆菌的遗传调控中发现，操纵这类细菌降解原油一些烃组分的酶的遗传基因，是集中在细菌染色体外的质粒上。A.M·C hakrabarty等人在假单胞杆菌中香烃茶的细菌质粒NAH接合到一个细菌细胞先后发
现了8种携带操纵降解不同石油烃及其中去,结果得到了一个具有四个降解质粒的所衍生物基因的质粒。经过多年的研究,A.M.Chakra barty等人在1975年,把降解脂肪烃辛烷的细菌质粒OCT、降解芳香烃二甲苯的细菌质粒XYL、降解菇烃樟脑的细菌质粒CAM,以及降解多环芳香烃茶的细菌质粒NAH接合到一个细菌细胞中去,结果得到了一个具有四个降解质粒的所谓“超级菌”。据称,这种“超级菌”能把原油中约三分之二的烃类分解掉，比目前已知的任何自然菌株的降解能力都高[20]。
四、展望
微生物在污染治理中具有广泛的应用前景，为提高微生物降解能力，扩大其应用范围，分离、重建高效的降解微生物具有重要意义。同时，在微生物对污染物的适应及其降解遗传学机制，微生物净化的高效性及安全性，研究成果从实验室研究向工程应用的转移，以及高效、准确评估技术的应用等方面，尚需加大投入和作进一步研究。生物工程技术的应用是生物具有更强的吸附和修复能力，加速了微生物处理技术的应用进程。但是我国的环境微生物技术研究尚处于起步阶段，与国际先进水平还有很大差距，应根据我国的国情，应充分利用我国的资源优势，借鉴国外先进技术和经验，重点加强环境微生物基
因技术的研究与开发，还需要进一步加强生物降解工程菌质粒的稳定性，使微生物工程菌的研究进入更高领域，以期取得更好的环境效益和经济效益。
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