兔肌肌酸激酶的分离纯化
及部分性质的测定
一、实验目的：
通过兔肌肌酸激酶的分离纯化及其酶活性质的测定，进一步熟悉和综合运用各种分离提纯办法，熟练掌握生化实验的基本方法。
进一步掌握酶的分离纯化方法，了解兔肌肌酸激酶的部分酶性质。
二、实验内容及实验技术：
实验内容：
1.肌酸激酶概况；
2.肌酸激酶的催化机制；
3.肌酸激酶的测活方法—pH比色法；
4.肌酸激酶的分离纯化；
5.肌酸激酶的动力学参数测定；
6.肌酸激酶DTNB修饰反应动力学及酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定。
实验技术：
1.颈动脉放血杀兔子；
2.机械法粉碎动物材料的方法；
3.盐析、等电点沉淀和有机溶剂变性、热变性除杂蛋白；
4.盐浴与冰盐浴盐析目的蛋白肌酸激酶(CK)；
5.乙醇分级除杂蛋白和沉淀目的蛋白肌酸激酶；
6.-8℃，12000r/m高速冷冻离心分离杂蛋白与目的蛋白；
7.透析法除残余有机溶剂小分子；
8.凸形梯度洗脱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化目的蛋白CK；
9.pH比色法测定酶活性；
10.A280光吸收法测定酶浓度；
11.酶的动力学参数（K a,V max）的测定；
12.CK的DTNB修饰反应动力学；
13.酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定；
14.SDS-PAGE测定亚基的分子质量和CK纯度；
15.凝胶层析测定CK分子质量。
三、实验原理：
肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应：
-OOC H2
C N
CH3
C
-
NH2
NH2
-OOC H2
C N
CH3
C
-
NH2
NHPO32-
+ MgATP2-
CK
+ MgADP- + H-
肌酸激酶有四种同工酶形式：即肌肉型（ＭＭ）、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体
型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，而MiMi型存在于线粒体内膜上。前3种肌酸激酶为胞浆肌酸激
酶。
细胞在线粒体上发生氧化磷酸化，产生ATP。但动物体内贮存能量的高能物质不是ATP而是磷酸肌酸。能量贮存和运送是通过磷酸肌酸穿梭机制(creatine phosphaate shuttle)来完成的，这个机制包含了肌酸激酶的线粒体型和肌肉型两种同工酶。氧化磷酸化产生的ATP在ATP-ADP转位酶(translocase)的帮助下被直接送到位于线粒体内膜外侧的线粒体型肌酸激酶所在部位（Ⅰ），线粒体型肌酸激酶将ATP内的高能磷酸键转移到肌酸上，变成ADP和高能物质磷酸肌酸（Ⅱ）。磷酸肌酸在胞内扩散到达肌原纤维(myofibrils)，肌原纤维的M-区带上结合了肌肉型肌酸激酶（Ⅲ），这样，当肌肉收缩时，需要大量的ATP供给能量，肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸转化为A TP，而反应产生的肌酸再扩散回线粒体，重新磷酸化（Ⅳ）。
肌酸激酶同工酶具有重要的生理功能和医学应用价值。
肌肉型肌酸激酶分子是有两个相同的亚基组成的二聚体。在催化过程中，该酶的最小功能单位是亚基，亚基在二聚体中独立地起催化作用。根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子质量为43 000u 左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。根据旋光色散研究的结果，这个酶的亚基大约有25 %-30 ％的α-螺旋，15 ％左右的β-折叠。
肌酸激酶的纯化方法有许多种，本实验采用的提纯方法为改进的Kuby 法。
该酶的测活方法也有许多种，本实验采用的是pH-比色法。
肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）：
肌酸激酶在催化正向反应时，随着ATP 向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的H +，其最适pH 为7.5-9.0，在此范围内测定H + 的生成速度，可以作为酶活力的指标。本实验采用百里酚蓝作为pH 指示剂，在分光光度计上通过pH-比色法测定肌酸激酶的活性，即在597nm 波长下，监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化反应生成的H +使溶液的pH 值降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光度值A 597不断降低。
在pH-比色法中，肌酸激酶测活的底物溶液需要新配。配制方法见试剂部分。 测活时，取1.0ml 的底物溶液置于微量比色皿中，加入10μl 酶溶液，迅速盖盖，混匀后立即监测597nm 处光吸收的变化，每15秒或30秒读一次吸光度值(A 597 )，共读取8个数据点，用A 597对时间作图，从图中求出每min 吸光度值的变化，即△A 597。并按下式计算酶的比活力（U ）：
稀释倍数＝
?????B
A
V C V A U 5973.1 （μmol ／(min ?mg)）
其中：1.3 为吸光度的变化换算成H +的系数。
V A =1.0ml (底物溶液)， V B =0.01ml (加入的酶溶液)。 C ：加入酶溶液的浓度。
酶溶液浓度C 的测定按其在280nm 处的吸光度值来确定，其百分吸光系数为 E 1
％
1cm =8.8。
即：稀释倍数＝
??8
.810
280A C 四、
试剂：
1. KCl ：0.01mol/L ，200ml 。 (0.15g KCl 加水至200ml)
2. NH 4OH ：1.7mmol/L ，1000ml 。(取0.12ml 浓氨水，加H 2O 至1000ml)
3. 柠檬酸铵：0.05mol/L ，pH9.0，1000ml 。(称12.15g 溶于1000ml H 2O)
4. Tris-HCl ：0.1mol/L ，pH8.0，1000ml 。（称Tris 12.1g ，取HCl 23ml ，调pH 为8.0，
加水至1000ml ） 5. NH 4Cl ：研细，10g 。
6. NH 4OH ：5mol/L ，100ml (公用)
7. MgSO 4：2.0mol/L ，pH8.5，20ml 。(公用) 8. MgA C2：0.07mol/L ，pH9.0，100ml 。(公用)
9. NaOH ：0.2，0.5，1.0，2.0，5.0( mol/L )。(公用) 10. HA C ：0.2mol/L 。
11. 95% CH 3CH 2OH （乙醇） 12. 粗盐
13. 底物溶液的配制：
通常一次配制20ml ，当天使用。
配制方法：取10ml 48mmol/L 的肌酸溶液，加入1.0ml 0.1mol/L 的MgAC 2，2.0ml 0.1％的百里酚蓝(称100mg 百里酚蓝，加20ml 乙醇溶解后再加水60ml)，1.0ml 0.1mol/L pH9.0的Gly-NaOH 缓冲液，称48mg ATP 溶于此溶液，再补加水5.0ml ，用0.1～0.2mol/L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为1.8～2.2）即可。
五、
实验步骤：
（一）、兔肌肌酸激酶的分离纯化：
1. 将兔子化冻后取大腿肌50g ，去除结缔组织和神经后剪碎。加200ml 0.01mol/L KCl ，
用组织打碎机(或食品加工机)和高速分散器各粉碎3次以上，每次不超过30s ，以防过热。
2. 冰浴搅拌提取15-30min ，用8000r/min ，0℃，离心10min ，弃去沉淀，测上清体积
为V 1，取样0.5ml 。 V 1=81.0ml 。
3. 在其余上清中加入研细的NH 4Cl 至浓度为0.1mol/L （逐滴加入）。
加入的NH 4Cl 的量：M NH4Cl =5.35×V 1=0.431 g 。
用5mol/L NH 4OH 调pH 至9.0（最适pH 值），冰浴搅拌30min （0℃）。 4. 加入1.5倍V 1体积的95％冷乙醇，20℃搅拌2.5h 。以热变性法用60%的有机溶剂
变性除杂蛋白。 1.5V 1=121.50ml
－8℃， 8000r/min 离心 10min 。
弃沉淀，测上清液体积为V 2，取样0.5ml 。 V 2=155.5ml
5. 其余上清液中加入V A ml 的2 mol/L MgSO 4(pH=8.5)，至终浓度为0.03mol/L 。
03.02
2
=+?V V V A A ， V A =2.37ml
1.5V A =3.55ml
再补加1.5 V A 体积的95%冷乙醇，逐滴加入，搅拌30min ，－8℃，8000r/min 离心10min ，弃去上清。
6. 沉淀加1/10 V 1体积的MgA C2 (0.07mol/L ，pH=9.0) 溶解悬浮(冰浴)。冰浴搅拌1h
后，0℃，12000r/min 离心 10 min ，弃去沉淀，测上清体积为V 3，取样0.5ml 。 V 3=13.2ml
7. 其余上清液用0.5-1mol/L NaOH 调pH=8.0。置冰盐浴内缓慢加入V B 体积的95％的
冷乙醇至终浓度为36％。 V B 的计算式：
36.06.0)(323＝＋＋的加入量－B
B
V V V MgAC V ?
本实验中：V B =2.64ml 。
8. 搅拌30min 后，－8℃，12000r/min 离心 10 min ，弃去沉淀，测上清体积为V 4，取
样0.5ml 。 V 4=14.5ml.
9. 其余上清置于冰盐浴中，缓慢加入V C 体积的95％的冷乙醇至终浓度为50％。
V C 的计算式：
5.03
6.044＝＋＋C
C
V V V V ?
本实验中V c=4.06ml 。
10. 搅拌30min 后，－8℃，12000r/min ，离心 10 min ，弃上清，沉淀溶于4ml pH 9.0
0.05mol/L 的柠檬酸铵溶液，即为V 5，取样0.2ml 。（以NH 4OH 调pH 值） V 5=4.6ml.
11. 对此缓冲液透析过夜。透析袋内加液量控制在1/2到1/3左右，最外面加上冰浴，
每小时换一次缓冲液，4-5h 。
12. 再对1.7mmol/L 的NH 4OH 透析，0℃， 12000r/min 离心 10 min ，弃去沉淀，测上
清体积为V 6，取样0.5ml 。 V 6=4.5ml.
13. 其余的V 6溶液用此NH 4OH 透析液调蛋白的质量浓度约为5g/L 后用恒流泵上样至
DEAE-52离子交换层析柱，用0.01mol/L pH 8.0的Tris-HCl 平衡缓冲液洗至基线平。 将上样时未被吸附液和冲洗前阶段液体收集，得穿过峰体积，即为V 8。取样0.5ml 。
14. 用凸形梯度洗脱法洗脱兔肌肌酸激酶，收集活性峰（峰管测活），合并得到V 7样品，
取样0.5ml ，其余冰冻干燥得到最终的兔肌肌酸激酶样品。
离子交换柱层析：
取约10mL 湿的DE-52阴离子交换纤维素，抽干后在0.5mol/L NaCl-NaOH 溶液中浸泡30min ，水洗至中性，在0.5mol/L HCl 中浸泡30min ，水洗至中性，
在0.5mol/L NaOH 中浸泡30min，水洗至中性抽干，然后再用0.01mol/L pH8.0 Tris-HCl 平衡缓冲液浸泡过夜。
在本次实验中，我们使用的柱子是做过一次兔肌肌酸激酶分离的旧柱子，所以直接用50ml 1mol/L NaCl上泵洗柱，再用0.01mol/L pH8.0 Tris-HCl 平衡缓冲
液平衡。最终柱高约4cm。
凸形梯度洗脱液体系：
C1（混合瓶）：0.01 mol/L，pH8.0，Tris-HCl，50ml，（瓶塞不漏气）；
C2（贮液瓶）：0.10mol/L，pH8.0，Tris-HCl，150ml；
洗脱速度：0.2-0.3ml/min；
收集体积：2-3ml/管/10-15min。
从上样开始收集，洗脱完毕，逐管测定A280。
选择A280较大的管测活，绘制洗脱图。
凸形梯度洗脱用在此处的优点：在前几十管分离杂蛋白时，盐梯度增长很快，而后几十管洗脱兔肌肌酸激酶时，盐梯度变化缓慢，有利于该酶与杂蛋白的分
离。
洗脱后逐管测电导，画出凸形梯度洗脱曲线，并换算出该酶洗脱下来时相应的Tris-HCl缓冲液的盐浓度。
（二）、峰管与分离过程中各级分测活：
1.确定合适的稀释倍数，使所得吸光度值在可测范围之内；
2.用微量可见塑料杯，取测酶活底物1.0ml，加入10μl已稀释好的酶样品溶液，
盖盖摇匀后测A597（15s读一次数），画图计算ΔA597；
3.计算酶的比活力U。
（三）、SDS-PAGE检测分离纯度：
1.样品处理：
将冰干的待检测样（V7与V8）用0.01MTris-HCl溶解，取20μl溶解的样品，加入20μl样品处理液后沸水浴煮沸5min。样品最终浓度约为1mg/ml ，吸光度A280约为1。
2.灌胶
3.上样：
第3孔上V7，第7、第9孔上V8。上样量：20μl/孔。
4.加电解槽液在外侧，至高玻璃下。
5.稳压100V电泳，至溴酚蓝到距下沿1cm处。
6.停止电泳。
7.以考马斯亮蓝染色2h，脱色过夜。
六、数据记录及处理：
1.洗脱图及洗脱曲线的测定(表1)：
表1 洗脱数据
管号A280nm电导率(μS/cm) 管号A280nm电导率(μS/cm)
1 0.006 440 28 0.017 510
2 0.007 29 0.020 530
3 0.049
160 30 0.018 650
4 0.11
5 31 0.020 740
5 0.094 32 0.021 750
6 0.02
7 310 33 0.023 740
7 0.010 34 0.028 770
8 0.008 360 35 0.115 990
9 0.011 36 0.213 1210
10 0.013 390 37 0.217 1450
11 0.033 580 38 0.168 1530
12 0.035 39 0.134 1920
13 0.056 40 0.092 1710
14 0.251 41 0.061 790
15 0.418 42 0.054 2750
16 0.553 43 0.037 2850
17 0.667 44 0.033 2810
18 0.589 45 0.033 3100
19 0.297 46 0.033 3290
20 0.140 47 0.036 3290
21 0.079 720 48 0.036 3330
22 0.043 580 49 0.045 3460
23 0.027 530 50 0.053 3350
24 51 0.062 3310
25 0.021 510 52 0.060 3530
26 0.022 610 53 0.047 3730
27 0.018 510 54 0.040 3890
说明：
?测量中第24管自动部分收集器发生跳管，即24管中没有接到任何液体；
?在开始收集时，由于流速太慢，每管接收不到1ml，所以电导率的测定只有合
并几管进行。
?由于疏忽，将第13管到第20管在测完吸光度时就合并了，导致了无法逐管测
量其电导率。
电导率的数据变化异常。
洗脱图 (图1)：
10
20
30
40
50
60
0.0
0.10.20.30.40.50.60.7A 280n m
管数
洗 脱图
图1 洗脱图
14-20管为穿过峰，合并得V 8； 34-40管为活性峰，合并得V 7。
凸形洗脱曲线图 (图2):
10
20
30
40
50
60
500
100015002000250030003500
4000电导率（μS /c m ）
管数
电导率变 化曲线
图2凸形洗脱曲线图
2. 峰管酶活测定 (表2)：
表2 活性峰管酶活测定 管号 A 597nm (每隔15秒读一数) 14 1.555 1.392 1.233 1.083 0.944 0.820 0.711 0.618 15 1.330 1.043 0.798 0.607 0.472 0.384 0.327 0.290 16 1.229 0.890 0.629 0.456 0.354 0.296 0.261 0.238 17 1.126 0.696 0.441 0.321 0.265 0.236 0.219 0.208 18 1.247 0.932 0.675 0.495 0.383 0.317 0.276 0.250 19 1.310 1.108 0.924 0.763 0.631 0.526 0.447 0.387 20 1.533 1.479 1.426 1.373 1.321 1.270 1.220 1.171 20(稀释2倍) 1.462 1.424 1.387 1.350 1.314 1.278 1.242 1.208 20(稀释5倍) 1.478 1.468 1.457 1.446 1.436 1.427 1.419 1.140 34 1.382 1.322 1.264 1.206 1.149 1.095 1.043 0.993 35 0.968 0.886 0.812 0.743 0.681 0.629 0.573 0.528 36 0.397 0.363 0.334 0.310 0.289 0.272 0.256 0.243 37 0.828 0.765 0.710 0.654 0.603 0.559 0.522 0.486 38 0.925 0.880 0.837 0.795 0.755 0.717 0.682 0.648 39 0.846 0.826 0.805 0.779 0.753 0.731 0.714 0.697 40 0.873 0.856 0.837 0.820 0.805 0.789 0.772 0.753 51 0.674 0.671 0.667 0.663 0.660 0.656 0.653 0.650 52
0.799
0.798
0.795
0.790
0.788
0.786
0.781
0.776
说明：
由于第51、52管的吸光度比周围管稍高一点，所以也被选出测酶活，检测其活性。
第14管测活
y = -0.009x + 1.5171
R 2 = 0.9919
0.5
11.52
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第14管测活曲线线性 (第14管测活曲线)
图3 第14管的A597
计算：第14管535.075
.1618
.0555.1597=-=
?A
第15管测活
y = -0.0097x + 1.1663
R 2 = 0.9126
00.20.40.60.81
1.21.40
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第15管测活曲线线性(第15管测活曲线)
图4 第15管的A597 -1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。
第15管测活
y = -0.0161x + 1.3066
R 2 = 0.9921
0.5
0.70.91.11.3
1.50
15
30
45
60
时间/s
A 597n m
第15管测活曲线线性 (第15管测活曲线)
图5 第15管的A597 -2 计算：第15管964.075
.0607
.0330.1597=-=
?A
第16管测活
y = -0.0089x + 1.0101
R 2 = 0.8505
00.20.40.60.81
1.21.40
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第16管测活曲线线性(第16管测活曲线)
图6 第16管的A597 -1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。
第16管测活
y = -0.0172x + 1.188
R 2 = 0.9797
0.2
0.40.60.81
1.21.40
15
3045
60
时间/s
A 597n m
第16管测活曲线线性 (第16管测活曲线)
图7 第16管的A597 -2 计算：第16管031.175
.0456
.0229.1597=-=
?A
第17管测活
y = -0.0075x + 0.8341
R 2 = 0.738
00.20.40.60.811.20
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第17管测活曲线线性(第17管测活曲线)
图8 第17管的A597 -1(线性不好，选前3点重新拟合检查其线性)。
第17管测活
y = -0.0228x + 1.0968
R 2 = 0.9787
0.2
0.40.60.811.20
15
30
45
时间/s
A 597n m
第17管测活曲线线性 (第17管测活曲线)
图9 第17管的A597 -2 计算：第17管370.15
.0441
.0126.1597=-=
?A
第18管测活
y = -0.0091x + 1.0488
R 2 = 0.8723
00.20.40.60.81
1.21.40
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第18管测活曲线线性 (第18管测活曲线)
图10 第18管的A597 -1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。
第18管测活
y = -0.0168x + 1.2142
R 2 = 0.9857
0.2
0.40.60.81
1.21.40
15
3045
60
时间/s
A 597n m
第18管测活曲线线性 (第18管测活曲线)
图11 第18管的A597 -2 计算：第18管003.175
.0495
.0247.1597=-=?A
图12 第19管的A597 -1(线性不好，选前4点重新拟合检查其线性)。
第19管测活
y = -0.0088x + 1.2242
R 2 = 0.9649
0.2
0.40.60.81
1.21.40
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第19管测活曲线线性 (第19管测活曲线)
图13 第19管的A597 -2 计算：第19管729.075
.0763
.0310.1597=-=?A
图14 第20管的A597
计算：第20管207.075
.1171
.1533.1597=-=?A
第19管测活
y = -0.0122x + 1.3
R 2 = 0.9975
0.6
0.8
1
1.2
1.4
15
30
45
60
时间/s
A 597n m
第19管测活曲线线性 (第19管测活曲线)
第20管测活
y = -0.0035x + 1.5303
R 2 = 0.9997
11.11.21.31.4
1.51.60
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第20管测活曲线线性 (第20管测活曲线)
图15 第34管的A597 计算：第34管222.075
.1993
.0382.1597=-=
?A
第35管测活
y = -0.0042x + 0.9465
R 2 = 0.9913
0.4
0.60.81
1.20
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第35管测活曲线线性 (第35管测活曲线)
图16 第35管的A597
计算：第35管251.075
.1528
.0968.0597=-=
?A
第34管测活
y = -0.0037x + 1.3768
R 2 = 0.9991
0.8
11.21.4
1.60
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第34管测活曲线线性 (第34管测活曲线)
第36管测活
y = -0.0014x + 0.3838
R 2 = 0.9755
0.1
0.150.20.250.30.350.40.450.50
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第36管测活曲线线性 (第36管测活曲线)
图17 第36管的A597
计算：第36管088.075
.1243
.0397.0597=-=
?A
第37管测活
y = -0.0033x + 0.8123
R 2 = 0.9908
0.4
0.50.60.70.8
0.910
15
30
45
60
75
90
105
120
时间/s
A 597n m
第37管测活曲线线性 (第37管测活曲线)
图18 第37管的A597
计算：第37管195.075
.1486
.0828.0597=-=
?A
第38管测活
y = -0.0026x + 0.9186
R 2 = 0.9977
0.5
0.60.70.80.9
10
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第38管测活曲线线性 (第38管测活曲线)
图19 第38管的A597
计算：第38管158.075
.1648
.0925.0597=-=
?A
第39管测活
y = -0.0015x + 0.846
R 2 = 0.9957
0.5
0.550.60.650.70.750.80.850.90.9510
15
30
45
607590105120
时间/s
A 597n m
第39管测活曲线线性 (第39管测活曲线)
图20 第39管的A597
计算：第39管085.075
.1697
.0846.0597=-=
?A
第40管测活
y = -0.0011x + 0.8723
R 2 = 0.9992
0.74
0.760.780.80.820.84
0.860.880
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第40管测活曲线线性 (第40管测活曲线)
图21 第40管的A597
计算：第40管068.075
.1753
.0873.0597=-=
?A
第51管测活
y = -0.0002x + 0.674
R 2 = 0.9981
0.645
0.650.6550.660.6650.67
0.6750.680
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第51管测活曲线线性 (第51管测活曲线)
图22 第51管的A597
计算：第51管014.075
.1650
.0674.0597=-=
?A
第52管测活
y = -0.0002x + 0.8006
R 2 = 0.9767
0.77
0.7750.780.7850.790.7950.80.8050
15
30
45
6075
90
105
120
时间/s
A 597n m
第52管测活曲线线性 (第52管测活曲线)
图23 第52管的A597
计算：第52管013.075
.1776
.0799.0597=-=?A
各峰管活性及浓度计算：
计算公式：
比活力（U ）：稀释倍数
＝
?????B
A
V C V A U 5973.1 （μmol ／(min ?mg)）
加入酶溶液的浓度（C ）：稀释倍数＝
??8
.810
280A C
表3 活性峰酶溶液的浓度及比活力
管号 ΔA 597nm 浓度C 比活力U 管号 ΔA 597nm 浓度C 比活力U 14 0.535 0.285 244.04 35 0.251 0.131 249.08 15 0.964 0.475 263.83 36 0.088 0.242 47.27 16 1.031 0.628 213.42 37 0.195 0.247 102.63 17 1.370 0.758 234.96 38 0.158 0.191 107.54 18 1.003 0.669 194.90 39 0.085 0.152 72.70 19 0.729 0.338 280.38 40 0.068 0.105 84.19 20 0.207 0.159 169.25 51 0.014 0.070 26.00 34 0.222
0.032
903.04
52
0.013
0.068
24.85
3. 各级分吸光度及酶活测定：
表4 V1-V7的稀释 级分
稀释倍数 A 280nm
A 597nm （每隔15秒读一次数）
V 1 40 1.770 1.793 1.725 1.656 1.587 1.519 1.452 1.387 1.324 V 2 20 0.260 1.934 1.875 1.820 1.762 1.705 1.652 1.602 1.552 V 3 10 1.287 1.477 1.000 0.667 0.468 0.360 0.300 0.263 0.240 V 4 10 1.354 1.548 1.184 0.881 0.655 0.508 0.419 0.358 0.315 V 5 10 0.263 1.742 1.641 1.539 1.437 1.334 1.234 1.142 1.057 V 6 5 0.222 1.755 1.635 1.515 1.397 1.285 1.178 1.077 0.983 V 7 不稀释 0.135 0.969 0.840 0.730 0.643 0.554 0.489 0.436 0.394 V 8
不稀释
0.440 1.373 1.111 0.889 0.715 0.585 0.491 0.421 0.371 沉淀2 溶解 1.674 1.474 1.237 1.104 0.960 0.839 0.749 0.673 沉淀4 溶解
0.897 0.539 0.345 0.267 0.232 0.214 0.204 0.198
说明：
? 沉淀2是指分离过程中，离心后留取上清液为V 2时对应的沉淀。沉淀4是指离
心后留取上清液为V 4时对应的沉淀。将沉淀用适量去离子水溶解后检验是否有酶活。
? 第34至第40管合并得到V 7，V 7体积为12.5ml 。 ? 第14至第20管合并得到V 8，V 8体积为8.4ml 。 ? 表中稀释倍数既是指测吸光度A 280nm 时的稀释倍数，也是酶活测定时的稀释倍数。
V1酶活测定
y = -0.0045x + 1.7909
R 2 = 0.9998
11.2
1.4
1.6
1.8
2
15
30
45
60
75
90
105
120
时间/s
A 597n m
V1测活曲线线性(V1测活曲线)
图24 V 1的A597
计算：268.075
.1324
.1793.1597=-=
?A
肌酸激酶（CK）测定及意义 肌酸激酶（Creatine Kinase, CK ）通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运 转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型（MM）脑型（BB）、杂化型（MB）和线粒体型（MiMi）。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi 型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。在临床上主要用于诊断心肌梗塞。心肌梗塞患者发病后2－4 小时，血液中此酶活动即开始升高。比血清中谷草转酸酶和乳酸脱氢酶的活力变化都出现得早。1．正常参考值： 健康成年男性：38-174 U/L ； 健康成年女性：26-140 U/L 。 2．临床意义： （1）心脏疾病：此酶是继转氨酶后至今临床上最重要的酶，特别是在诊断心肌梗死上有较高价值。和常用的谷草转氨酶、乳酸脱氢酶相比，有下列优点：在这几个酶中肌酸激酶最先升高，疼痛出现后 4 小时肌酸激酶急剧上升，最高可达正常上限的10?12倍，是目前最敏感的酶试验。因肝中肌酸激酶含量很少，心脏疾病伴有肝郁血或肝损伤时，谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氨酶往往升高而肌酸激酶无变化，特异性较强。红细胞中此酶活力很低，溶血标本对此酶测定干扰较谷草转氨酶和乳酸脱氢酶小，已成为临床化学方面常用酶之一，每年全
世界约进行一亿次肌酸激酶测定。在心肌梗死病程中，如肌酸激酶活力再次升高，往往说明心肌再次梗死。但此酶活力增高持续时间短，2?4天后就可恢复正常。所以如用此酶诊断心肌梗死，一定要注意病程时间。发病时间较长的病例，应测定能较长维持增高的酶活力的 乳酸脱氢酶，此时肌酸激酶活性正常并不能否定心肌梗死诊断。 （2）在骨骼肌损伤时，甚至在肌注某些药物如青霉素、氯丙嗪时，以及在进行一些心脏疾病治疗，如心导管、电复律时均可引起肌酸激酶活力升高，也就是虽然肌酸激酶同工酶诊断心肌梗死阳性率可高达98 ％，但特异性只有85 ％。目前公认测定肌酸激酶同工酶（主要为 C K －M B）是特异性更高的酶试验。 （3）有学者提出连续观察肌酸激酶动态变化，根据一些常数进行公式计算，可推测心肌梗死的大小，从而有助于判断病人预后。此法需频繁抽血，各学者对所用常数也有不同意见，用于临床可能还需要一段时间。 （4）国内资料表明：病毒性心肌炎时此酶活性明显升高，对心肌炎诊断和预后有参考价值。 （5）肌肉疾病：在Duchenne 肌萎缩患者血中，肌酸激酶极度增高，甚至可高出正常值上限50 倍，而后随病程延长下降。此病是和性染色体有关的遗传病，在无症状的女性，隐性携带者约 75 ％肌酸激酶也高于正常。其他类型的原发性肌萎缩患者肌酸激酶 也有不同程度的升高，这可用于区别继发性肌病如神经性或废用性肌萎缩，此时肌酸激酶活力往往正常。
血清肌酸激酶测定标准操作规程 1 检验申请 单独检验项目申请：血清肌酸激酶(缩写CK)测定，各种体液肌酸激酶测定；组合项目申请：血生化中心肌酶谱项目测定。临床医生根据需要提出检验申请。 2 标本采集与处理 2.1标本采集 2.1.1常规静脉采血约2 ml，不抗凝，置普通试管中。或采用含分离胶的真空采血管。检查体液乳酸脱氢酶的体液标本应用肝素抗凝。 2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。 2.1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。 2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。 2.1.5下列标本为不合格标本 2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本，或少于0.1ml的血清或血浆。 2.1.5.2对反应吸光度有干扰的标本，包括严重溶血、严重浑浊的标本。 2.1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的。 2.1.5.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。 2.2标本保存 2.2.1接收标本后在30min内将标本离心分离出血清。 2.2.2标本保存时间：室温（15～25℃）下可稳定4h，普通冰箱中（2～8℃）稳定12h。-20℃保存稳定30天。为避免标本中水分挥发使血清浓缩，对保存时间超过1天的标本均加塞密闭或覆盖湿巾。
2.2.3 已完成测试的标本保持完整的识别号，置4～8℃冰箱内保存7天。 2.3 标本采集的注意事项 2.3.1 采血前使受检者保持平静、松弛、避免剧烈活动，24h 不饮酒和12h 以上禁食空腹状态。 2.3.2 注意有无应用影响测试项目的药物。 2.3.3 可以使用肝素抗凝的血液标本。 3 方法原理 通过下面的3个反应式表示反应，在两个工具酶的参与下，将CK 的活性与NADPH 生成的量或速率相联系，在340nm 波长处连续监测NADPH 吸光度的增加速率，推算出CK 的活性。 ATP ADP CK +?→?+肌酸磷酸肌酸 ADP 6ATP HK +--?→?+磷酸葡萄糖葡萄糖 NADPH 6NADP 6PDH 6G +-???→?+ --磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖 4 试剂及其他用品 4.1 试剂：肌酸激酶测定试剂盒，由北京利德曼生化技术有限公司出品。 4.2 试剂盒保存：未开瓶的试剂储存在2～8℃可稳定至有效期。试剂开瓶后，在仪器冰箱试剂仓中可保存28天。开盖后避免污染。当试剂变混浊，或者未开盖的液体有沉淀，或起始吸光率>0.8时，表明试剂已变质，不能继续使用。 4.3 试剂盒准备：液态双试剂型，即开即用，无特殊准备。 4.4 试剂盒主要成分：
血清肌酸激酶(CK) DGKC推荐方法测定 1.实验原理 德国临床化学学会(DGKC)和国际临床化学学会(IFCC)推荐的连续监测法。 ADP + 磷酸肌酸CK→肌酸+ ATP ATP + 葡萄糖HK→ADP + 葡萄糖-6-磷酸 葡萄糖-6-磷酸+ NADP+G6PD→6-磷酸葡萄糖酸+ NADPH + H+ NADPH在340nm处有特异吸收，通过测定NADPH 生成速率计算出CK活性。 2. 标本： 2.1 病人准备：无特殊要求。 2.2 类型：血清，肝素或EDTA血浆。 3. 标本存放：稳定性：2～8℃保存稳定7天;15～25℃保存稳定1天;-20℃保存稳定4周（避光保存）。3天内的活性损失：2～8℃保存24小时或18～22℃保存1小时至少损失10%。 4. 标本运输：常温条件下保存运输。 5. 标本拒收标准：细菌污染的标本。 6. 实验材料
6.1 试剂欧泰克CK测定试剂盒 6.1.1 试剂组成： 咪唑缓冲液（pH6.7）100mmol/L 磷酸肌酸30mmol/L 葡萄糖20mmol/L N-乙酰半胱氨酸（NAC）20mmol/L EDTA-Na22mmol/L ADP 2mmol/L NADP 2mmol/L 二腺苷-5'-磷酸10μmol/L 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6P-DH）2800 U/L 已糖激酶（HK）4000 U/L 6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。试剂不可冰冻。 6.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。 6.1.5 注意事项：试剂中含叠氮钠（0.95g/L）为防腐剂。不可入口！避免接触皮肤及粘膜。应采取必要的预防措施使用试剂。 6.2 校准品：使用罗氏复合校准品对自动分析仪进行
肌酸激酶（CK） 主要存在于骨骼肌、脑和心肌组织中。增高可见于心肌损伤坏死、脑血管疾病、急性脑外伤、酒精中毒、全身性惊厥、癫痫发作时血清CK的水平增高；甲状腺功能减退出现黏液性水肿和脑梗死时CK水平亦可增高。手术后、心导管、冠状动脉造影、运动试验、反复肌注、剧烈运动，肌酸激酶可以过性增高。意见建议：建议你去三级医院心血管内科就诊，明确诊断后，再对症下药进行治疗 磷酸肌酸激酶增高。在心肌或骨骼肌受损时，此酶会增高，但您无相应的病史和症状，您若体检前有较剧烈的运动此酶也会增高。 中文名称：血清磷酸肌酸激酶 英文名称：CPK 化验介绍：磷酸肌酸激酶（CPK），主要存在于骨骼肌和心肌，在脑组织中也存在，是参与体内的能量代谢的一种酶。在临床上主要用于诊断心肌梗塞。心肌梗塞患者发病后2－4小时，血液中此酶活动即开始升高。比血清中谷草转酸酶和乳酸脱氢酶的活力变化都出现得早。临床意义： （1）心肌梗塞后，CPK较谷草转氨酶和乳酸脱氢酶特异性高，但持续时间短，2－4天恢复正常。 （2）病毒性心肌炎，CPK也可升高，对诊断及预后有参考价值。（3）进行性肌营养不良、多发性肌炎以及肌肉损伤时CPK也可升高。（4）严重的心绞痛、心包炎、房颤、脑血管意外、脑膜炎以及心脏手术等，CPK可见升高。
正常值：无机磷法：0－200U/dL 比色法：M（男）：0．55－7．5U/dL F（女）：1．45－4．0U/dL 肌酸磷酸激酶及其同功酶的升高是急性心肌梗死的一个重要诊断指标。肌酸磷酸肌酶是一种酶，并证实主要存在骨骼肌、心肌和脑组织中，而胃肠道、子宫、肾和膀胱只有微量的浓度。血清中的肌酸磷酸激酶升高，说明组织中有细胞坏死，这些酶有两个组成部分，肌肉部分和脑部分。血浆中证实有3种同功酶，BB-CPK、MM-CPK和MB-CPK。MB-CPK主要存在心肌组织中，可用免疫学或电泳测定的方法测得结果。 酸磷酸激酶（CPK）过高，说明你的心血管不好，需要注意身体了 尽量不要抽烟，喝酒，少吃胆固醇过高的食品 建议：磷酸肌酸激酶（CPK），主要存在于骨骼肌和心肌，在脑组织中也存在，是参与体内的能量代谢的一种酶。在临床上主要用于诊断心肌梗塞。心肌梗塞患者发病后2－4小时，血液中此酶活动即开始升高。比血清中谷草转酸酶和乳酸脱氢酶的活力变化都出现得早。 临床意义： （1）心肌梗塞后，CPK较谷草转氨酶和乳酸脱氢酶特异性高，但持续时间短，2－4天恢复正常。 （2）病毒性心肌炎，CPK也可升高，对诊断及预后有参考价值。（3）进行性肌营养不良、多发性肌炎以及肌肉损伤时CPK也可升高。（4）严重的心绞痛、心包炎、房颤、脑血管意外、脑膜炎以及心脏
肌酸激酶文献综述 摘要：本文从肌酸激酶的在体内的分布，及其临床意义，对肌酸激酶的现状进行说明，并对其未来的发展趋势进行阐述。 关键词：肌酸激酶、研究现状、发展趋势 1、肌酸激酶（Creatinekinase，CK）旧称为肌酸磷酸激酶（Creatinephosphokinase，CPK），但现在不叫CPK。CK分子量为81000，由两个亚基组成。通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶【1,2】，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。 CK在ATP参与下催化肌酸磷酸化，生成ATP(供给肌肉能量的来源)和磷酸肌酸。这种酶催化反应是可逆的。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型(CK-MM)、脑型(CK-BB)、杂化型(CK-MB)和线粒体型(CK-MiMi)。CK-MM型主要存在于各种肌肉细胞中，CK-BB型主要存在于脑细胞中，CK-MB型主要存在于心肌细胞中，CK-MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。临床上测定的血清CK指的是总的活性。 2、生理结构 天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子量为43 KDa左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。大熊猫肌肉型肌酸激酶也是二聚体酶，每个亚基由376个氨基酸残基组成，分子量为42 KDa近来关于肌酸激酶构象变化和活力变化关系的研究显示了酶分子活性部位构象的柔性，即酶分子活性部位的微区构象在变性剂作用下易发生改变而导致酶分子快速失活，此时酶分子整体构象尚未发生明显变化。周海梦等人用荧光探针标记兔肌肌酸激酶的活性部位，监测了荧光衍生物微区构象变化与相应酶活力丧失速度，发现二者几乎一致，为酶活性部位柔性的假说提供了有力的证据。 CK分布：分布于骨骼肌、心肌、脑、甲状腺、肺组织、胃肠平滑肌中，以骨骼肌含量最高，其次为心肌，再其次为脑和胃肠平滑肌。在肌纤维中主要集中于亚细胞结构的上清部分，也少量含于线粒体、微粒体部分。正常情况下，细胞外液的CK浓度仅是细胞内液的1/1000-1/10000。因此，血清中肌酸激酶升高一般提示含有CK的组织细胞的通透性增强或组织细胞的破坏。 正常人的CK变动： 参考值：
血清肌酸激酶MB同工酶测定 1 检验目的 指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。 2 实验原理 使用CK-M 多克隆抗体对肌酸激酶（CK）中CK-M同工酶的活性进行抑制后，采用德国临床化学会（DGKC）和国际临床化学会（IFCC）推荐的连续监测法测定余下的肌酸激酶（CK）活性。其反应原理如下： ⑴CK-MM 型同工酶 + CK-M抗体→ CK-MM型同工酶的活性被抑制；CK-MB 型同工酶+ CK-M 抗体→ 50%的CK-MB 型同工酶的活性被抑制； ⑵剩余的50%无活性的CK-MB型同工酶 + N-乙酰半胱氨酸→有活性的CK-B型同工酶 CK同工酶 ⑶磷酸肌酸 + ADP 肌酸 + ATP 己糖激酶(HK)
ATP + 葡萄糖 ADP + 葡萄糖-6-磷酸 (G6P-DH) 葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+ 式中：ADP为二磷酸腺苷；ATP为三磷酸腺苷；NADP+为氧化型辅酶II；NADPH+H+为还原型辅酶II。 在上述反应中，NADPH+H+ 的生成速率与样本中肌酸激酶B 型同工酶（CK-B）的活性成正比。通过在波长340nm 处监测吸光度值的上升速率，即可测得样本中肌 酸激酶B 型同工酶（CK-B）的活性。肌酸激酶B 型同工酶（CK-B）活性相当于1/2肌酸激酶MB型同工酶的活性，将所测得的肌酸激酶B型同工酶（CK-B）的活性乘以2，即为肌酸激酶MB 型同工酶（CK-MB）的活性。 3 标本： 3.1 病人准备：无特殊。 3.2 类型：血清或肝素血浆。
3.3 标本存放：稳定性：-20℃保存稳定4周（避光保存）。 活性损失：2～8℃保存24小时或18～22℃保存1小时至少 损失10%。 3.4 标本运输：常温条件下保存运输。血标本应尽快送往化 验室,室温下放置30―45分钟,后离心,放置时间不得超过3h. 血清必须吸出,转移至有盖的试管中. 3.5 标本拒收标准：细菌污染的标本。 4 实验材料 4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司CK-MB试剂盒（沪 食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014） 4.1.1 试剂组成 试剂1（R1）： D-葡萄糖27mmol/L 咪唑缓冲液 60mmol/L 乙酸镁14mmol/L NADP 2.7mmol/L
肌酸激酶MM亚型测定及其临床意义 上海医学检验杂志1992年第7卷第1期 卜 }1f1,两;/L-.函符,臻,盈 肌酸激酶MM亚型测定及其临床意义 上海长征医院心内科(2o0003) 黄高忠综述陈思聪许绍辉*审校R,』/.——————一●, 肌酸激酶(CK)及其同工酶CK—MB是目前公 认的诊断急性心肌梗塞(AMI)最有价值的生化指 标,具有很高的敏感性和特异性n.近十余年来, CK—MM亚型的研究逐渐受到重视,观察AMI后发 现该亚型的演变可早期诊断AMI,推测梗塞时间及 判断再灌注,对于AMI溶栓治疗病例的选择,疗效 和顶后的判断具有独特的价值,已成为近年来国外 酶学研究的热点之一.现简要介绍如下. 一 ,命名及理化特性1968年Kumuduvalli发 现从人类肌肉中提取的CKMM可通过电泳区分为 三个不同的区带,但未引起重视.七十年代末, Wevei.s[.,3通过杂交试验证实l『CK—MM是山两
个不完全相同的亚单位构成的二聚体,其不同的组 合形成一j’CK—MM的三种亚型.目前命名方法尚未统一.一般根据其电泳迁移率的差异,从阳极到阴 极命名为CK—MM,CK—MM,CK—MM3(有的以C,B,A分别代替1,2,3).其亚基组成分别为:CK— MM3一M2M2;CK—MM2一MlM2;CK—MMl—M】M1. 现已证实,人心肌和骨骼肌中fl,~CK—MM均以CK—MM3的形式存在,又称为组织型或纯基因型CK—MM.AMI后CK—MM3随同其他生物大分子如肌球蛋白,谷草转氨酶等一起从坏死细胞内逸出,经 淋巴回流入血,在血中羧肽酶N(CP—N)的作用下, 其中一个M亚基肽链羧基末端上的赖氨酸被切除 转变成CK—MM.;随后另一个M亚基又经历同样变化,转变成CK—MM,(可见M.和MI亚基仅相差一 个赖氨酸).这三种亚型具有相同的抗原性, 分子量和酶活力,8].因在生理pH下赖氨酸带正 电,故其等电点不同.Hashimoto应用聚焦层析 法测定的等电点CK—MM3,CK—MM2CK—MM1分别为7.91,7.74~N7.51.CK—MM1的等电点最低,故 其向阳极的迁移率最大. CP-N存在于E常血t…HJ-f1,分了量19万,不能透
肌酸激酶升高的原因及处理 肌酸激酶（CK），主要存在于骨骼肌、脑和心肌组织中。正常情况下，绝大多数肌酸激酶位于肌细胞内，血液中肌酸激酶升高一般提示已有肌肉损害或正发生肌肉损害。肌酸激酶（C PK）增高，为一个化验结果异常，可见于很多疾患，不是个独立疾病。 临床上我们常常见到肌酸激酶（CK）单独升高的情况，但是，经过各种有关心脏检查排除了心肌梗死的诊断。此时，需要我们的医生要从多方面考虑，作出合理的有益的处理，以免延误病情，造成误诊误治。北京大学人民医院风湿免疫科杨铁生 临床医生在诊断过程中如发现检验结果有疑问，应及时与检验科联系，了解相关情况，以做出正确诊断。 一、生化特性 肌酸激酶（Creatine kinase,CK）的系统命名为三磷酸腺苷：肌酸磷酸转移酶。 CK作用生成的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源，在3种肌组织和脑组织中含量最高。 CK是由两种不同亚基(M和B)组成的二聚体，这样正常人体组织常含3种同工酶，按电泳速率快慢顺序分别为：CK-BB(CK1)，CK-MB(CK2)和CK-MM(CK3)。 二、组织分布 CK主要存在于骨骼肌、心肌、脑组织中，此外还存在于一些含平滑肌的器官如胃肠道、子宫内。而在肝、红细胞中含量极微或者没有。 三、生理变异 年龄、性别和种族对CK含量都有一定影响。 CK含量和肌肉运动密切相关，其量和人体肌肉总量有关。 14岁以下儿童的CK-MB无论是绝对活性或相对活性，均高于成人，在诊断儿童急性心肌炎时应考虑到这一生理差异。 四、CK的测定 (一)标本的采集、处理和贮存 为了减少运动对检验结果的影响，一般主张化验前2天内尽可能避免剧烈的运动和锻炼。早晨匆忙赶到门诊的患者最好休息。 （二）测定方法 CK的测定方法有比色法、酶偶联法，荧光法和生物发光法等 五、CK同工酶的测定 (一) 标本采集、处理和贮存 CK同工酶检测血清和血浆均可。在4℃可保存数天，-15℃可保存2周，若用血浆宜用EGT A，而不用EDTA抗凝。 六、临床应用 CK及其同工酶是目前世界上临床测定次数最多的酶。 CK在骨骼肌、心肌和脑疾患时常明显升高，如同时测定同工酶还有助于疾病的鉴别诊断。
血清肌酸激酶CK测定 1 检验目的 指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。 2 实验原理 德国临床化学学会(DGKC)和国际临床化学学会(IFCC) 肌酸激 推荐的连续监测法。 ADP + 磷酸肌酸肌酸 + ATP 己糖激酶(HK) ATP + 葡萄糖 ADP + 葡萄糖-6-磷酸 (G6P-DH) 葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸葡萄糖酸 +NADPH+H+ NADPH在340nm处有特异吸收，通过测定NADPH生成速率计算出CK活性。 3 标本： 3.1 病人准备：无特殊要求。
3.2 类型：血清或EDTA血浆。 3.3. 标本存放：稳定性：2～8℃保存稳定7天;15～25℃保 存稳定1天;-20℃保存稳定4周（避光保存）。3天内的活性 损失：2～8℃保存24小时或18～22℃保存1小时至少损失 10%。 3.4 标本运输：常温条件下保存运输。 3.5 标本拒收标准：细菌污染的标本。 4 实验材料 4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司CK试剂盒（沪 食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014） 4.1.1 试剂组成： 试剂1（R1）： D-葡萄糖27mmol/L 咪唑缓冲液 60mmol/L 乙酸镁14mmol/L NADP 2.7mmol/L
N-乙酰半胱氨酸27mmol/L AMP 7mmol/L 试剂2（R2）： 磷酸肌酸 160mmol/L 6-磷酸葡萄糖脱氢酶≥ 20KU/L ADP 11mmol/L 己糖激酶≥ 20KU/L 4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 4.1.3 试剂稳定性与贮存：2～8℃避光、密封的储存条件下， 试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。试剂1 与试剂 2 启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定20天。 4.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度， 或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使 用。 4.1.5 注意事项：试剂中含叠氮钠防腐剂。不可入口！避免 接触皮肤及粘膜。应采取必要的预防措施使用试剂。
肌酸激酶偏高的原因和危害性 肌酸激酶增高的原因 1由于心肌里面含有肌酸激酶的量较多，所以患有心肌炎的人也长出现肌酸激酶偏高这一现象; 2营养不良，其中假肥大型肌营养不良的人最容易出现肌酸激酶的偏高; 3大量运动，如距离自行车、滑雪及马拉松跑等运动都可导致肌酸激酶的偏高; 4乙肝患者出现肌酸激酶偏高有可能是病毒性肝炎引起的其他并发症所导致，所以乙肝患者出现肌酸激酶偏高现象需要引起重视。 肌酸激酶增高的危害 一、对骨骼产生影响 首先第一点肌酸激酶高对我们的骨骼产生一定的影响，因为它是存在于我们的骨骼之中的一种病毒，所以说有的时候我们会感觉骨头发痛，肌肉发痛，一旦出现这种感觉就是肌酸激酶高的影响，大家需要及时的提高警惕，一定要要认真的进行对待，可以采用一些药物来进行治疗。 二、会引发心脏疾病 肌酸激酶高的危害，就是会让到我们得心脏疾病，会对我们的心脏器官以及其他器官产生一定的影响，对于身体比较重要，
而且还会产生一定的负面影响，所以说大家一定要提高警惕，尽量减少让这种病毒的产生。 三、会影响肝脏健康 肌酸激酶高就会影响到我们的肝脏健康，会产生肝炎，这一点也需要我们提高警惕，因为以前就有很多的案例证明肌酸激酶高会产生一定的肝炎症状，对我们的身体是非常不利的，只有危害而没有好处的。 四、影响细胞成活率 肌酸激酶高影响到我们的肌肉血液细胞的成活率，影响到我们血液细胞的浓度和生长，对我们的身心健康带来一定的负面影响，所以说，大家必须要提高警惕。 无症状性高肌酸激酶血症 慢性ck升高称为高ck血症,偶尔也见于正常人。1980年rowland将无神经肌肉病临床和组织病理学证据的高ck血症称为特发性高ck血症。 对于有神经肌肉病临床症状的高ck血症者,一般情况下行各种相关检查可明确诊断。符合以下条件者属无症状性高ck血症: ①偶然发现血清ck升高; ②至少3个月持续性高ck血症; ③无症状或仅在就诊时发现轻微和非特异性症状(偶发轻度肌肉痛); ④无神经肌肉病家族史; ⑤缺乏与高ck血症相关的神经肌肉病临床表现; ⑥无心脏疾病(ck-mb及心电图正常);⑦无其他高ck血症的
磷酸肌酸激酶（CK）： 肌酸激酶(Creative Kinase, CK)，又称为磷酸肌酸激酶(Creative Phospho Kinase, CPK)。肌酸激酶之所以受到运动界的广泛重视，是因为它与能量代谢密切相关，正常情况下，肌细胞膜结构完整、功能正常，使CK极少透出细胞膜，安静时，血清CK总活性的范围为：正常男子10~100 U/L，女子10~60 U/L. 运动后人体血清CK活性升高的原因： 一是运动使肌细胞膜通透性发生变化；二是运动导致肌细胞损伤。 运动训练后血清CK活性变化的规律 不同种类的血清酶对运动产生的适应性变化有所差异，表现在运动后血清酶活性增加的时间和程度不同。运动后血清CK变化规律是0~2 h轻度增高，8h明显升高，16~24 h达到最高峰值。一般认为，运动后CK活性立即升高，8~16 h出现峰值，48 h或72 h恢复到正常水平。 血清CK在运动训练中的应用 一个训练良好的运动员，进行大强度或持续长时间训练后，CK值一般在48h恢复到正常水平，若明显减慢或要几天才恢复到正常水平，预示运动员可能出现疲劳症状。因此，动态测定血清CK活性，对监测运动员疲劳的出现和恢复程度具有实践意义。近来有文献报道，运动所致肌肉损伤均与血清CK活性的变化有关，CK活性变化可作为了解运动性骨骼肌损伤的一个敏感生化指标。 血清CK活性升高的幅度与运动量的关系极为密切。多数报道表明，剧烈运动后血清CK活性显著升高。亚极限强度的运动可使CK活性增加到100~200 IU/L，极限强度的运动CK活性可增加到500~1000 U/L左右。血清CK活性升高不仅与运动时间的长短有关，而且与运动强度有关。血清CK无昼夜生物节律变化，运动后升高幅度大，能较好地反映运动量的大小及运动后的恢复过程，是一个灵敏度高，便于运动实践中应用的有效指标。血清CK在运动后活性上升与恢复时间变化一致。通过比较训练前和训练后的活性值，可以用来评定身体的恢复状况及运动负荷的适应情况。 总结 不同项目类型对血清CK活性的影响也不同。冲击性较大的运动项目，如跑、跳、摔、举重等项目血清CK活性变化幅度较大:球类、水上、自行车等项目血清CK活性变化幅度较小。通常认为造成这种现象的原因与肌纤维受损程度高度相关。 上页【血红蛋白（Hb）介】下页：没有了
肌酸激酶偏高的诱因有哪些 对于肌酸激酶我们可能了解的不多，肌酸激酶是通过抽血检查，化验结果中的一项检查内容。肌酸激酶值的高低是和我们身体的健康状态息息相关的。那么当出现肌酸激酶偏高时，您是否惊慌无措呢?肌酸激酶偏高也不要过于紧张，了解其原因，对治疗调理，很快就会恢复正常的。下面我们一起来了解一下有关肌酸激酶偏高的主要原因。 血清肌酸激酶主要存在于我们的骨骼肌、脑和心肌组织中,其运动时很容易使血清肌酸激酶升高从而导致缺氧,若是 血清肌酸激酶存在异常很容易引发其他疾病,目前很多人可能还不清楚什么是血清肌酸激酶,那么针对血清肌酸激酶意义是什么,下面我来和大家一起了解下吧。
肌酸激酶(CK)又称肌酸磷酸激酶,能可逆地催化肌酸和三磷酸腺苷生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷的反应。在pH中性条件下,以ATP生成为主,以保证组织细胞的供能。正向反应利于线粒体内氧化磷酸化生成的ATP,以磷酸肌酸的形式进入细胞液,满足细胞生理活动之需要。CK广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中。 ★肌酸激酶偏高的原因是什么 ★1、营养不良,其中假肥大型肌营养不良的人最容易出现肌酸激酶的偏高;
★2、大量运动,如距离自行车、滑雪及马拉松跑等运动都可导致肌酸激酶的偏高 ★3、乙肝患者出现肌酸激酶偏高有可能是病毒性肝炎引起的其他并发症所导致,所以乙肝患者出现肌酸激酶偏高现象需要引起重视; 当发现自己的肌酸激酶偏高时一定要第一时间 到正规的医院接受科学检查,根据病因来分析自己是否需要进行治疗,该如何进行治疗。切勿自私乱用药,导致患者病情的加重。
关于肌酸激酶高的原因,相信大家已经了解了。营养不良就是其中一种,此外大量的剧烈运动,甚至是病毒性乙肝的患者等,都容易导致肌酸激酶偏高。而如果我们发现自己的身体出现不适的状况的时候,千万不要私自用药,应该及时到医院就医,这样才对肌酸激酶偏高这个疾病才会有帮助。
参考值：男24～195U／L 女24～170U／L CK水平在人群中不是正态分布，受到性别、年龄、种族、生理状态的影响。男性因为肌肉容量大，血清CK活性要高于女性。新生儿出生时，由于骨骼肌受到损伤和短暂的缺氧可引起CK释放，故血清CK水平约为成人的2～3倍；出生后7个月可降至成年人水平。儿童和成人的血清CK会随着年龄的增长而发生变化：女性的平均CK值在最初20年中会呈下降趋势，以后变化不大，而男性的平均CK值在15～20岁会出现生理性的高峰，其他时间变化不大。老人和长期卧床者由于肌肉容量减低也可能低于成人水平。在不同种族之间，白人的CK活性通常为黑人的2／3.故在确定参考值时应注意不同"正常人群"的情况。临床意义： 1.当发生AMI时，CK活性在3～8小时升高，血中半寿期约为l5小时，峰值在10～36小时之间，3～4天后回复至正常水平。AMI时CK 升高一般为的数倍，很少超过的30倍。 2.如果在AMI后及时进行了溶栓治疗出现（再灌注）时，梗塞区心肌细胞中的CK就会被冲洗出来，导致CK成倍增加，使达峰时间提前。故CK测定有助于判断溶栓治疗后是否出现。但总CK活性测定仅有中度敏感，不能检出很早期的。如在发病4小时内CK即达峰值，提示冠状动脉再通的能力为40％～60％。 3.施行心律转复、心导管和无并发症的冠状动脉成形术等均会引起CK值的升高。值得注意的是，心脏插管以及冠状动脉造影在导致CK总活性升高的同时，可以引起CK-MM 同工酶的升高，但CK-MB同工酶的活性上升并不明显。 4.心脏手术和非心脏手术后都将导致CK活性的增高，且增高的幅度与肌肉的损伤范围的大小以及手术时间的长短密切相关。心肌炎时CK可轻度增高。 5.生理性增高人体在运动后将导致CK活性明显增高，运动越剧烈，时间越长，则CK活性上升的幅度越大，通常在运动后l2～20小时达到峰值，并维持36～48小时。一般而言，对于较少运动的人，运动时间越长、幅度越剧烈，则CK上升的幅度越高；而对于训练有素的运动员，则CK在同等条件下增高的幅度有限；也有报道，怀孕妇女通常在14～26周时出现CK活性降低，而后又逐渐增高，分娩时CK升高。 6.由于骨骼肌中CK单位含量极高，且其全身总量大大超过心肌，所以在各种肌肉损伤（如挫伤、手术、肌肉注射、癫痫发作）和疾病（如多发性肌炎、肌炎、横纹肌溶解症、进行性肌营养不良、重症肌无力、甲状腺功能减低出现粘液性水肿）时，CK极度升高，活性常高于参考数值数十至数百倍。7.在急性脑外伤、恶性肿瘤时CK也可增高。8.长期卧床，CK可有下降。
白蛋白溴甲酚绿复合物 ）白蛋白＋溴甲酚绿（????→?-35,2.4Brij pH BCG 临 床 意 义 α-L-岩藻糖苷酶(AFU)测定 检验原理: CNP-α-L-Fucoside ：2-氯-对硝基苯-α-L-岩藻吡喃糖苷(CNPF) AFU ：α-L-岩藻糖苷酶 以2－氯－对硝基苯－α－L －岩藻吡喃糖苷（CNPF ）为底物 用AFU 连续监测，反应产物2－氯－对硝基酚（CNP ），在AFU 反应最适pH 时呈现显著黄色。 临床意义: α-L-岩藻糖苷酶（α-L-Fucosidase ，AFU ）是一种溶酶体酸性水解酶。基本生理功能是催化含岩藻糖基的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖苷的分解代谢，广泛分布于人体内的各种组织、细胞及体液中。如肝、脑、肾、胰、胎盘组织；细胞培养液中的成纤维细胞、白细胞以及血清、尿液、唾液、泪液和垂体液中均含此酶。遗传性AFU 缺乏可使含岩藻糖基的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖苷这些物质从初生儿起就在组织中堆积，引起岩藻糖苷贮积病。组织细胞、尿液和血清中AFU 测定可协助该病的诊断，并借以与其他遗传性粘多糖贮积病鉴别，这也是早期对AFU 检测的主要目的。病人准备与样品要求：病人需空腹，标本采用不溶血的血清或肝素抗凝血浆，常温下保存8小时，2~8℃可稳定7天。 白蛋白(ALB)测定 检验原理: 白蛋白溴甲酚绿复合物的生成，引起在波长630nm 处吸光度的上升，吸光度的变化与样品中白蛋白含量成正比 临床意义： 血清（血浆）白蛋白是分子量为66.3KD 的单链分子，生理功能广泛，包括营养价值；有效胶体渗透压的保持；血清Ca 2、未结合胆红素、游离脂肪酸、药物、菑类激素以及甲状腺素的运输。白蛋白的多种生理功能使其成为检测肝脏疾病的重要指标。 病人准备与样品要求：不溶血的血清或血浆。样品中ALB 在2~8℃可稳定7天。及时分离血清；黄疸血，溶血，脂血标本应作样本空白管。 碱性磷酸酶(ALP/AKP)测定 检验原理: 磷酸＋对硝基苯酚磷酸对硝基苯＋-??→?AMP AMP ALP AMP ：2-氨基-2-甲基-1,3-丙醇 4-NPP ：磷酸对硝基苯酚 磷酸对硝基苯酚（4-NPP ）在碱性磷酸酶（ALP ）的作用下，将磷酸基转移到2-氨基-2-甲基-1,3-丙醇(AMP)受体分子上，释放出的对硝基苯酚(4-NPP)在碱性溶液中分子重排形成黄色醌，可在405nm 下检测，黄色醌形成速率与ALP 活力成正比。 岩藻糖--+?? →?+---L CNP O H ide Fu L CNP AFU αα2cos
心肌酶是什么？在临床上有何作用？ 冠心病诊断检查—心肌酶学检查 摘要：心肌酶学检查是冠心病诊断检查之一，临床上根据血清酶浓度的序列变化和特异性同工酶的升高等肯定性酶学改变便可明确诊断为急性心肌梗塞。 早期发现、早期诊断、早期治疗对疾病的疗效、预后都具有重要意义，冠心病也不例外。如果出现不适情况，要及时就医，尽早发现冠心病，以免延误病情。 2007 欧洲心脏年会发布的最新研究表明，女性冠心病死亡率显著高于男性。我国的流行病学资料也显示出同样的趋势。传统观点认为，女性比男性晚发病10年，心肌梗死约晚10―15年。而现在两性冠心病发病均有年轻化趋势，尤其是伴有吸烟、原发性高血压、糖尿病、高脂血症等危险因素的患者，发病年龄更明显提前。调查表明，目前美国45岁以下的女性心脏病患者以每年9000人的速度递增。 女性冠心病临床症状很多不如男性典型。异常疲倦往往是女性冠心病的重要先兆。对于急性冠状动脉综合征，男性患者常诉说胸痛，而女性患者多为背痛和大汗症状。男性急性心肌梗死患者多表现为压榨性胸痛，女性则主诉气短、极度疲乏，伴或不伴有典型胸痛，包括腹部、颈部和肩部疼痛以及恶心。高龄并伴有糖尿病史的女性发生无症状心梗比男性多。并且，女性冠心病比男性更易受季节变化影响，秋冬季发病增高，并发症及死亡率也高于男性。 心肌酶学检查是冠心病诊断检查之一，心肌酶学检查是急性心肌梗塞的诊断和鉴别诊断的重要手段之一。临床上根据血清酶浓度的序列变化和特异性同工酶的升高等肯定性酶学改变便可明确诊断为急性心肌梗塞。 心肌酶是存在于心肌的多种酶的总称，一般有天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）及同功酶、a一羟丁酸脱氢酶（a-HBDH）和肌酸激酶（CK）及同工酶（CKMB），中国国内常将这一组与心肌损伤相关的酶合称为心肌酶谱，对诊断心肌梗塞有一定的价值。 心肌酶——心肌损伤或者坏死后这些酶有不同程度的增高。 其中CK-MB，LDH1特异性最高，目前心肌酶谱正常值多为成人标准，而小儿的正常值要高于成人，所以不要认为孩子心肌酶谱值增高就认为是患了心肌炎，由于影响心肌酶谱的因素较多，很多医院采用测定心肌肌钙蛋白来辅助诊断心肌炎，绝大多数儿童的心肌酶谱是正常参考值的2~3倍。 临床诊断用 在诊断疾病时，应该测定哪些心肌酶在临床是一个重要的问题。临床当然希望测定高度敏感高度特异的指标，高（或低）就能确诊，否则就可排除，但这类理想化的指标是很难存在的，因此我们选择诊断用指标时就得依照如下原则： 1、有较高的组织/血清酶活力比，这样轻微的组织损伤也能得到明显的指标变化。 2、组织损害时能较快的释放，以便早期诊断。
肌酸激酶偏高的原因和危害 肌酸激酶偏高的原因 01急性心肌梗死，发生急性心肌梗死时,磷酸肌酸激酶在发病的3-8小时内就升高，并且心肌梗死溶栓治疗过程中会出现心肌血液再灌，也会导致肌酸激酶活性明显升高。 02肌肉创伤还有类型肌营养不良均可发生肌酸激酶偏高，其中假肥大型肌营养不良酶的活力约可达正常的10--50倍。 03一般来说，肌酸激酶在心肌里面的含量较多，尤其是患有心肌炎的人出现肌酸激酶偏高这一现象较为严重。 04长时间骑车、滑雪及马拉松跑等剧烈体育运动都可能导致肌酸激酶偏高。 05病毒性肝炎引起的其他并发症也是诱发肌酸激酶偏高的一大主要原因。 肌酸激酶偏高的危害 一、对骨骼产生影响 首先第一点肌酸激酶高对我们的骨骼产生一定的影响，因为它是存在于我们的骨骼之中的一种病毒，所以说有的时候我们会感觉骨头发痛，肌肉发痛，一旦出现这种感觉就是肌酸激酶高的影响，大家需要及时的提高警惕，一定要要认真的进行对待，可以采用一些药物来进行治疗。 二、会引发心脏疾病
肌酸激酶高的危害，就是会让到我们得心脏疾病，会对我们的心脏器官以及其他器官产生一定的影响，对于身体比较重要，而且还会产生一定的负面影响，所以说大家一定要提高警惕，尽量减少让这种病毒的产生。 三、会影响肝脏健康 肌酸激酶高就会影响到我们的肝脏健康，会产生肝炎，这一点也需要我们提高警惕，因为以前就有很多的案例证明肌酸激酶高会产生一定的肝炎症状，对我们的身体是非常不利的，只有危害而没有好处的。 四、影响细胞成活率 肌酸激酶高影响到我们的肌肉血液细胞的成活率，影响到我们血液细胞的浓度和生长，对我们的身心健康带来一定的负面影响，所以说，大家必须要提高警惕。 肌酸激酶临床意义 异常结果： 增高： (1) 主要用心肌梗死诊断，ck升高幅度较ast和ldh都大，且出现早，2-4小时开始升高，12-48小时达到高峰，2-4天恢复到正常。尤其对心肌缺血和心内膜下心肌梗死的诊断比其他酶灵敏度高。故动态检测ck变化有助于观察病情和预后估计。 (2) 还见于进行性肌营养不良发作期、病毒性心肌炎、多发性心肌炎、肌肉损伤或手术后、脑血管疾病、酒精中毒、甲状腺功能减退、肺梗塞等。 减低：见于甲状腺功能亢进症。
肌酸激酶：（CK） 主要分布在胞质和线粒体中，以骨骼肌、心肌含量最多，其次是脑组织和平滑肌。肝脏、胰腺和红细胞中的CK含量极少。 一、检测CK的适应症： 1.怀疑有心肌疾病:有临床和ECG表现的典型心肌梗死 （检查CK和CK-MB活性）。 2.介入疗法有禁忌症的病人：（检查CK和CK-MB活性） 3.治疗血栓溶解的评价：（检查CK和CK-MB活性） 4.对心绞痛病人危险分级（检查CK浓度和肌钙蛋白） 5.心肌炎 二、临床意义：CK水平受性别、年龄、种族、生理状态 的影响。 1.男性肌肉容量大的，CK活性高于女性。 2.新生儿出生时由于骨骼肌损伤和暂时性缺氧，可使CK 升高。 3.黑人CK约为白人的1.5倍。 4.运动后可导致CK明显增高，且运动越剧烈、时间越长， 则CK升高越明显。 三、CK增高 1.AMI：CK水平在发病3-8小时明显增高，3-4天恢复正 常。如在AMI病程中CK再次升高，提示心肌再次梗死。
CK为早期诊断AMI的灵敏指标。发病8小时之内CK不增高，不可轻易排除AMI，诮继续动态观察。发病毒4小时的CK检测价值最大，此时的CK应达峰值，如果CK 小于参考值的上限，可排除AMI。但应除外CK基础值极低的病人和心肌梗死范围小及心内膜下心肌梗死等，此时心肌梗死，CK也可正常。 2.心肌炎和肌肉疾病:心肌炎时CK明显升高。各种肌肉疾病，如多发性肌炎、横纹肌溶解症、进行性肌营养不良、重症肌无力时CK明显升高。 3.溶栓治疗：AMI溶栓治疗后出现再灌注，导致CK活性增高，使峰值时间提前。CK水平有助于判断溶栓后的再灌注情况，但由于CK检测具有中度灵敏度，所以不能早期判断再灌注。如果发病后4小时内CK即达峰值，提示冠状动脉的再通能力达40-60%。 4.手术：心脏手术或非心脏手术后均可导致CK增高，其增高的程度与肌肉损伤的程度、手术范围、手术时间有密切关系。转复心律、心导管术以及冠状动脉成形术等均可引起CK增高。 四、CK减低:长期卧床、甲状腺功能亢进、激素治疗等CK均减低。 五、肌酸激酶同工酶测定: CK是由2个单位组成的二聚体，形成3个不同的亚型：