项目学习：普外科肝癌总共4套题答案的选A 第一套题 1、在肝癌的TNM分期中，T代表的是（c ） A、肿瘤大小 B、远处转移 C、原发灶 D、区域淋巴结 2、下列哪项不属于原发性肝癌（a ） A、肝脏继发性肿瘤 B、肝细胞癌 C、肝内胆管细胞癌 D、肝细胞-胆管细胞混合型癌 3、肝细胞癌的特点不包括（a ） A、进展缓慢 B、起病隐匿 C、治疗困难 D、预后很差 4、若肝癌病变位于左肝，一般疼痛部位是（c） A、右腰部 B、右肋区 C、剑突下 D、右背部 5、肝癌诊断的金标准是（b） A、慢性肝病背景 B、病理学诊断 C、影像学检查结果 D、血清甲胎蛋白水平 6、肝细胞癌多见，占到肝癌的（d）以上 A、60% B、70% C、80% D、90% 7、肝性脑病常发生在肝病（d ） A、早期 B、中期 C、晚期 D、终末期 8、在我国引起肝细胞癌的因素主要是肝炎病毒感染导致的（b ） A、甲肝 B、乙肝 C、丙肝 D、戊肝 9、下列哪项是肝硬化门脉高压引起的肝癌并发症（a） A、消化道出血
B、肝肾综合征 C、肝性脑病 D、肝癌破裂出血 10、（b）是肝细胞癌的重要症状，常为间歇性或者持续性 A、持续低热 B、肝区疼痛 C、食欲减退 D、消瘦乏力 第二套题 1、2.Okuda分期的不足不包括（d ） A、对肿瘤累及范围的确定过大 B、血清胆红素的界值定义过高 C、未纳入早期肝癌预后因素 D、唯一未加干预措施评估生存期 2、下列哪项是碱性磷酸酶的主要分布位置（b ） A、脾脏 B、肾脏 C、胰腺 D、心脏 3、在肝癌的TNM分期中，T3代表的是（a） A、肿瘤多发，最大径>5cm；侵及门脉或肝静脉主要属支 B、肿瘤单发，有血管浸润；多发，最大径≤5cm C、肿瘤单发，无血管浸润 D、无原发肿瘤证据 4、在BCLC分期中，早期患者可行根治性治疗措施指的是（a ）期 A、A B、B C、C D、D 5、CLIP分期是1998年（b ）肝癌研究组提出的 A、奥地利 B、意大利 C、加拿大 D、美国 6、（d ）是良好的肝脏储备功能评价指标 A、天门冬氨酸氨基转移酶 B、碱性磷酸酶 C、3.白蛋白 D、前白蛋白 7、Kampala分期是（a）年乌干达首都坎帕拉举行的国际肝癌讨论会上制定 A、1971 B、1981 C、1991 D、2001
综述：肝细胞性肝癌 原发性肝癌以肝细胞性肝癌（HCC）为主。在全球范围内，肝癌是导致癌症相关死亡的第四大常见原因，在发病率方面排名第六。根据世界卫生组织的年度预测，估计2030年将有100多万患者死于肝癌。 在美国，从2000年到2016年，肝癌的死亡率增加了43%（从7.2人/10万人上升到10.3人/10万人），而5年生存率为18%，肝癌已成为仅次于胰腺癌的第二大致死性肿瘤。大部分的HCC发生在有基础肝脏疾病的患者当中，主要是HBV或HCV感染或酒精滥用。 普遍接种HBV疫苗和广泛应用针对HCV的直接作用抗病毒药物可能将改变HCC的病因谱。而非酒精性脂肪肝（NAFLD）、代谢综合征和肥胖患者的增加放大了肝癌的发生风险，在西方国家，NAFLD将很快成为肝癌的主要病因。 针对晚期肝癌患者的系统疗法发展迅速，在过去2年，有4种新药在3期临床试验中显示出了临床疗效。本文将主要论述HCC的主要遗传学改变、风险因素、监测和诊断，以及循证治疗方法。 一、发病机制 慢性肝病患者存在持续性肝脏炎症、肝纤维化和肝细胞异常再生。这些异常的生理过程可导致肝硬化，并导致一系列遗传学和表观遗传学事件，最终导致异常增生结节（真正的肿瘤癌前病变）的形成。额外的分子改变能使异常增生细胞获得增殖、侵袭性和生存优势，并完成到成熟HCC的转变（图1）。HCC也可发生于不存在肝硬化或明显炎症的慢性肝病患者（如HBV感染患者）。 图1HCC的主要遗传学改变及分子分型 图中描述了人HCC发生过程中关键的分子和组织学改变，以及HCC两个分子亚型的主要遗
传和临床特征。*表示高水平的DNA扩增。在非增生型中，CTNNB1突变增强了免疫排斥。 二、风险因素 没有基础肝病的患者很少罹患HCC，男性的HCC发病率是女性的两倍。任何原因的肝硬化都会增加HCC的发生风险。 这种风险因病因、地理区域、性别、年龄和肝损伤程度而异。 在世界范围内，HBV感染是HCC的主要病因。尽管乙肝疫苗的广泛接种降低了HCC的发病率，但仍有许多未接种疫苗的人感染HBV（2015年为2.57亿人），有罹患HCC的风险。饮食中接触黄曲霉毒素B1可导致249位TP53的特异性突变（R→S），增加HBV感染患者发生HCC的风险。在西方国家和日本，HCC的主要病因是HCV感染。无论潜在的肝纤维化程度如何，HBV感染都有直接的致癌作用，但在HCV感染者中，若不伴有重度肝纤维化，则HCC很少发生。 全世界范围内，NAFLD相关HCC的发病率呈上升趋势。在美国，从2016年到2030年，该发病率预计将增加122%（从5510例增加到12240例）。 酒精性肝硬化是HCC的另一常见病因。 吸烟合并HIV感染也可能导致HCC的发生。抗病毒治疗在降低HCC的发生率方面是有效的，但不能根除这种风险。 与无应答的患者相比，在对干扰素治疗方案有持续病毒学应答的HCV感染患者中，HCC 的风险从6.2%降低到了1.5%。据报道，使用直接作用抗病毒药物治疗的HCV感染患者发生HCC的风险也会降低。 除了肝病的病因治疗外，尚无任何药物可以降低HCC的发生率。 三、HCC的监测 癌症监测旨在早期发现肿瘤，增加治疗机会，提高生存率。然而，尚无高质量的随机对照试验评估HCC监测对肝硬化患者的临床价值。不过，数学模型、低质量的临床试验（在方法学上有局限性）以及meta分析都显示了监测对患者的生存益处。 HCC监测的目标人群是肝硬化患者，且不考虑肝硬化的病因。 由于重度肝功能不全的肝硬化患者不适合接受根治性治疗，所以没有癌症监测的必要。但因肝功能障碍而等待肝移植的患者则需要进行监测，目的是确保肿瘤不会发展到按照既定标准无法进行移植的程度。 一些没有肝硬化的肝病患者也应该被纳为癌症监测目标。慢乙肝患者发生HCC的风险存在地区差异（非洲和亚洲地区的发生风险高于其他地区），且老年、男性、肝纤维化、病毒复制水平高、基因C型以及HCC家族史都提示着更高的HCC发生风险。 虽然无肝硬化的非酒精性肝病患者可能会发生HCC，但实际风险是未知的，且可能非常低。除非有方法可以识别出风险较高的患者，否则不建议对无肝硬化的NAFLD患者进行癌症监测。 HCC的推荐监测方法为：每6个月进行一次腹部超声检查，联合/不联合血清甲胎蛋白水平检测。结果对操作者的依赖性较高，敏感度为47%-84%，特异度＞90%。对肥胖患者，超声检测的实用性会降低。 四、HCC的诊断 在肝硬化患者中，利用影像学技术就可以诊断HCC（图2）。由于肝细胞在恶性转变期间会发生血管转变：良性病灶（如增生性结节）由门静脉系统分支供血，而恶性病灶由肝动脉分支供血。这种转变转化为一种独特的模式：对比增强CT或MRI可显示动脉后期明显强
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备
1 PPAR信号通路：过氧化物酶体增殖物激活受体( PPARs) 是与维甲酸、类固醇 和甲状腺激素受体相关的配体激活转录因子超家族核激素受体成员。它们作为脂 肪传感器调节脂肪代谢酶的转录。PPARs由PPARα、PPARβ和PPARγ 3种亚型组成。PPARα主要在脂肪酸代谢水平高的组织，如：肝、棕色脂肪、心、肾和骨骼肌表达。他通过调控靶基因的表达而调节机体许多生理功能包括能量代谢、生 长发育等。另外，他还通过调节脂质代谢的生物感受器而调节细胞生长、分化与 凋亡。PPARa同时也是一种磷酸化蛋白，他受多种磷酸化酶的调节包括丝裂原激活蛋白激酶( ERK-和p38．M APK) ，蛋白激酶A和C( PKA，PKC) ，AM PK和糖原合成酶一3( G SK3) 等调控。调控PPARa生长信号的酶报道有M APK、PKA和G SK3。PPARβ广泛表达于各种组织，而PPAR γ主要局限表达在血和棕色脂肪，其他组织如骨骼肌和心肌有少量表达。PPAR-γ在诸如炎症、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和糖代谢调节，以及肿瘤和肥胖等方面均有着举足轻重的作用， 而其众多生物学效应则是通过启动或参与的复杂信号通路予以实现。鉴于目前人 们对PPAR—γ信号通路尚不甚清，PPARs通常是通过与9-cis维甲酸受体( RXR)结合实现其转录活性的。 2 MAPK信号通路:mapk简介:丝裂原激活蛋白激酶（mitogen—activated protein kinase，MAPK）是广泛存在于动植物细胞中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。作用主要是将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞的生物化学反应（增殖、分化、凋亡、应激等）。 MAPKs家族的亚族 :ERKs（extracellular signal regulated kinase)：包括ERK1、ERK2。生长因子、细胞因子或激素激活此通路，介导细胞增殖、分化。 JNKs(c-Jun N-terminal kinase)包括JNK1、JNK2、JNK3。此亚族成员能使 Jun转录因子N末端的两个氨基酸磷酸化而失活，因此称为Jun N末端激酶(JNKs)。物理、化学的因素引起的细胞外环境变化以及致炎细胞因子调节此通路。P38 MAPKs：丝氨酸/络氨酸激酶，包括p38 α、p38β、p38γ、p38δ。p38 MAP K参与多种细胞内信息传递过程 ,能对多种细胞外刺激发生反应,可磷酸化其它细胞质蛋白,并能从胞浆移位至细胞核而调节转录因子的活性来改变基因的表达水平 ,从而介导细胞生长、发育、分化及死亡的全过程。 ERK5:是一种非典型的MAPK通路，也叫大MAPK通路，只有一个成员。它可被各种刺激因素激活。不仅可以通过磷酸化作用使底物活化，并且通过C端的物理性结合作用激活底物。 3 ERBB信号途径:ErbB 蛋白属于跨膜酪氨酸激酶的 EGF 受体家族成员。ErbB 的命名来源于在禽红白血病 B( v-Erb-B) 发现的 EGF 受体的突变体,因而 EGF 受体 亦称为“ ErbB1”。人源 ErbB2 称为HER2, 特指人的 EGF 受体。ErbB 家族的
健康教育 一、用药指导 1、遵医嘱按时、准确、合理使用止痛剂。对于晚期肝癌发生难以控制的疼痛时，应尽可能在疼痛前给药。 2、出血患者，中药汤剂宜偏凉服。胃纳不佳者，中药应浓煎，并予多次少量进服，以饭前或饭后1小时为宜。对胃有刺激的药宜饭后服，补益药宜饭前服。 3、癌性发热者应用消炎痛纳肛退热时，因汗出较多，应及时补充水分，更换汗湿的衣服。 4、应用化疗药物时应防止药液外渗，并计划使用静脉。 二、饮食指导 饮食原则以高蛋白、适当热量、高维生素、低脂肪食物为宜，限制动物油的摄入；饮食多样化，注意食物搭配，做到色、香、味俱全，以增进食欲；进食应以易消坚硬、辛辣之品，少食煎炸食品，少量多餐：肝硬化时避免有刺激性及植物纤维素多的食物，以免引起食管或胃底静脉破裂出血：多食新鲜蔬菜、水果，饮用果汁饮料，补充维生素：出现腹水时应限制钠的摄入，要用低盐或无盐饮食：出血倾向宜吃贝、橘、海参、乌贼等：疼痛宜吃金橘、杨梅、山楂等：出现呕血、黑便时立即禁饮食。 三、心理指导 1．本病病情发展快，预后差，患者精神压力大，情绪低落，应予以关心、体贴、帮助、支持和鼓励，使患者对疾病有正确的认识，积极组东配合治疗。 2．保持心情愉快，学会自我心理调节，避免不良因素的刺激。控制情绪波动，防止病情恶化。 3．培养自己的多种兴趣，自己给自己找乐趣，如：下棋、聊天、看电视、集邮、养花等以分散注意力，有利于养病、避免在家胡思乱想。 四、日常生活指导 1、根据体质、病情和耐受情况进行体育锻炼，如打太极拳、练保健操等。 2、遵医嘱继续用药。 3、戒除嗜酒、酗酒等不良习惯，不喝烈性酒、劣质酒、以防酒精对肝细胞的破坏，造成肝脏的操作及慢性肝脏中毒。 4、定期随诊复查，了解肝功能变化及病情复发情况。术后还应注意甲胎蛋白追踪检查结果，或注意观察有无肝癌的转移。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 陈素君 200900140007 实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制 及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。 实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。 要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。 细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。 实验用品： 一、器材 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好 倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板 二、试剂 PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝 三、小白鼠 实验方法： 1. 细胞的原代培养 1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。 1.2在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿 开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。 1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针 头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。 1.4将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。
干货细胞信号通路图解之MAPK通路【值得珍藏】 科研小助手原创，转载请注明来源。公众号内回复“Cell Signaling Pathway”获取全套信号通路图本文由百度贴吧nosce吧吧主黄杰投稿一、MAPK信号通路： （1）有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是一族在真核生物中非常保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，在许多细胞活动中起作用，如生长增殖，细胞分化，细胞运动或死亡。MAPK级联信号传导由3 个不同层次的分子所组成。MAPK被MAPK的激 酶( MAPKK)磷酸化后激活，MAPKK被MAPKK的激酶(MAPKKK )磷酸化而激活。而MAPKKK通过与小GTPase 和/或其他蛋白酶相互作用而被激活，从而将MAPK和细胞 表面的受体以及胞外的信号联系在一起。 （2）许多参与生长和分化的受体都能够激活MAPK/ERK信号通路，比如说受体酪氨酸激酶(RTK)，整合素，和离子通道。响应特定信号所涉及到的具体分子会相差很大，但通路的结构是一致的，那就是接头分子(adaptor，如Shc, GRB2, Crk等)将鸟苷酸交换因子(SOS, C3G 等)和受体连接在一起，然后把信号向小GTP 结合蛋白(Ras, Rap1)传递，后者又激活核心的级联反应，这是由一个MAPKKK( Raf) ，一个MAPKK( MEK1/2)和MAPK( Erk)所构成的。活化的ERK 二聚体能调节胞浆中的目标分子，也可以转移到细胞核中，然
后对一系列转录因子进行磷酸化以调节基因表达。SciRes（3）很多外部的刺激都能够激活G蛋白偶联受体(GPCR)。在受体活化以后，G 蛋白将GDP 转换成GTP ，然后结合了GTP的α和β/γ亚基从受体脱离开，启动信号向胞内的传导。与不同亚型的异质三聚体G 蛋白结合的受体可以采取不同 的手段激活小G 蛋白/MAPK级联反应，至少有三个不同家族的酪氨酸激酶参与其中。Src家族激酶响应活化的PI3Kγ，而后者被β/γ亚基激活。它们还能够响应受体的内化，受体酪氨酸激酶的交叉活化，以及有Pyk2 和/或FAK参与的整 合素途径信号。GPCRs同样可以通过PLCβ去激活PKC 和CaMKII ，对下游的MAPK通路可以有激活或抑制的影响。SciRes（4）压力激活的蛋白激酶(Stress-activated protein kinase, SAPK)或称Jun氨基端激酶(Jun amino-terminal kinase, JNK) 是MAPK的家族成员，能被一系列的环境压力，炎症细胞因子，生长因子和GPCR激动剂所激活。压力信号通过Rho家族的小GTP 酶(small GTPase)向这条级联通路传导，这些小GTP酶包括(Rac, Rho, cdc42) 。和其他的MAPK情况一样，靠近膜的激酶是一个MAPKKK，一般 是MEKK1-4 ，或者是一个混合激酶去磷酸化并激活 MKK4(SEK)或MKK7，它们是SAPK/JNK的激酶。另外，MKK4/7也可以被生发中心激酶(germinal center kinase, GCK)以一种GTPase 依赖的方式激活。活化后的
原发性肝癌诊疗规范(2011年版) 一、概述 原发性肝癌(Primary liver cancer，PLC,以下简称肝癌) 是常见恶性肿瘤。由于起病隐匿，早期没有症状或症状不明显，进展迅速，确诊时大多数患者已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后很差，如果仅采取支持对症治疗，自然生存时间很短，严重地威胁人民群众的身体健康和生命安全。 原发性肝癌主要包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管细胞癌(ICC)和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型，在其发病机制、生物学行为、组织学形态、临床表现、治疗方法以及预后等方面均有明显的不同；由于其中HCC占到90%以上，故本文所指的“肝癌”主要是指HCC。 二、诊断技术和应用 （一）高危人群的监测筛查。 我国肝癌的病因因素，主要有肝炎病毒感染、食物黄曲霉毒素污染、长期酗酒以及农村饮水蓝绿藻类毒素污染等，其他肝脏代谢疾病、自身免疫性疾病以及隐原性肝病或隐原性肝硬化。由于肝癌的早期诊断对于有效治疗和长期生存至关重要,因此,十分强调肝癌的早期筛查和早期监测。常规监测筛查指标主要包括血清甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein，AFP)和肝脏超声检查(US)。对于≥40
岁的男性或≥50岁女性，具有HBV和/或HCV感染，嗜酒、合并糖尿病以及有肝癌家族史的高危人群，一般是每隔6个月进行一次检查。一般认为，AFP是HCC相对特异的肿瘤标志物，AFP持续升高是发生HCC的危险因素。新近，有些欧美学者认为AFP的敏感性和特异度不高，2010版美国肝病研究学会(AASLD)指南已不再将AFP作为筛查指标，但是我国的HCC大多与HBV感染相关，与西方国家HCC致病因素不同（多为HCV、酒精和代谢性因素），结合国内随机研究(RCT) 结果和实际情况，对HCC的常规监测筛查指标中继续保留AFP。 （二）临床表现。 1.症状。 肝癌的亚临床前期是指从病变开始至诊断亚临床肝癌 之前，患者没有临床症状与体征，临床上难以发现，通常大约10个月时间。在肝癌亚临床期（早期），瘤体约3－5cm，大多数患者仍无典型症状，诊断仍较困难，多为血清AFP普查发现，平均8个月左右，期间少数患者可以有上腹闷胀、腹痛、乏力和食欲不振等慢性基础肝病的相关症状。因此,对于具备高危因素，发生上述情况者，应该警惕肝癌的可能性。一旦出现典型症状，往往已达中、晚期肝癌,此时，病情发展迅速, 共约3-6个月, 其主要表现:
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 实验背景： 一、细胞培养的基本条件： 1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 4.细胞保存条件：液氮罐 1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱： CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃，14 h)。 ③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液 蒸发。 三、细胞培养用液的配制： 1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 3.消化液： ①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 ②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 ③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25％。用滤器过滤除菌。 ④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 ⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 4.培养基： 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 ①天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污
呼吸系统疾病 １、慢支继发感染 长期医嘱: 内科疾病护理常规 2级护理 陪床１人 普食 持续低流量吸氧 健康咨询 化痰片０.5,3／日,口服． 复方甘草片 2片,３／日，口服. a－糜蛋白酶 5ｍg，２/日,肌注 环丙沙星１00ml (或氧氟沙星）静点,2/日. 0.9%盐水２00ml 先锋霉素六5．0静点,1/日 5%葡萄糖２00ml 氨茶碱 0．２5静点,2/日. 临时医嘱: 青霉素皮试 胸片 血尿便常规 血沉 血钾钠氯 血二氧化碳结合力＋尿素氮 血糖 2、肺部感染(发热、体质差) 长期医嘱: 内科疾病护理常规 ２级护理 陪床1人 半流食 持续低流量吸氧 健康咨询 化痰片０.5,3／日,口服. 复方甘草片 2片,３/日,口服. a－糜蛋白酶 5ｍｇ,２/日，肌注 氧氟沙星１00ml (或环丙沙星)静点,２/日. 0.9%盐水2０0ml 菌必治 2．0 (或舒普深2.０)静点，2/日. 5%葡萄糖２0０ｍl 氨茶碱０．25(或喘定0．25)静点，1/日. 临时医嘱: 青霉素皮试 胸片 血尿便常规 血沉血钾钠氯 血二氧化碳结合力+尿素氮 血气分析 痰培养 心电图 5％葡萄糖３00mｌ 穿琥宁 4０0-800ｍg（或清开灵40mｌ)静点，1/日. 脂肪乳５０0ml静点 0．9%盐水 50ml 蓉生静丙(静注人免疫球蛋白(PH4）) 2.5g静点3、肺脓肿（右侧) 长期医嘱： 内科疾病护理常规 2级护理 陪床1人 半流食 持续低流量吸氧 健康咨询 化痰片0.5,３/日,口服. 0.9％盐水 300ml 菌必治 2.0 (或氧派嗪青霉素4.0）静点，２/日. 灭滴灵 2５0ｍl静点,2/日. 0.9％盐水 300ｍl 丁氨卡那霉素0．4静点，1/日. 5％葡萄糖５００mｌ 穿琥宁８00ｍｇ静点,1/日. 临时医嘱: 青霉素皮试 胸片(正位) 血尿便常规 血沉 血钾钠氯 血二氧化碳结合力+尿素氮 痰培养+药敏 心电图 4、右侧结核性胸膜炎伴胸腔积液 长期医嘱: 内科疾病护理常规 2级护理 陪床1人 普食 健康咨询 利福平 0．45,3/日,口服. 乙胺丁醇0.７５,1/日,口服. 肝泰乐0.1,3/日,口服. 链霉素 0.7５,1/日,口服．
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
呼吸系统疾病 慢支继发感染 长期医嘱： 内科疾病护理常规 2级护理 陪床1人 普食 持续低流量吸氧 健康咨询 化痰片 ,3/日,口服. 复方甘草片 2片,3/日,口服. a-糜蛋白酶 5mg,2/日,肌注 环丙沙星 100ml (或氧氟沙星)静点,2/日. %盐水 200ml 先锋霉素六 静点,1/日 5%葡萄糖 200ml 氨茶碱 静点,2/日.临时医嘱: 青霉素皮试 胸片 血尿便常规 血沉 血钾钠氯 血二氧化碳结合力+尿素氮血糖 肺部感染(发热、体质差) 长期医嘱： 内科疾病护理常规 2级护理 陪床1人 半流食 持续低流量吸氧 健康咨询 化痰片 ,3/日,口服. 复方甘草片 2片,3/日,口服. a-糜蛋白酶 5mg,2/日,肌注 氧氟沙星 100ml (或环丙沙星)静点,2/日. %盐水 200ml 菌必治 (或舒普深 静点,2/日. 5%葡萄糖 200ml 氨茶碱 (或喘定 静点,1/日.临时医嘱: 青霉素皮试 胸片 血尿便常规 血沉 血钾钠氯 血二氧化碳结合力+尿素氮 血气分析 痰培养 心电图 5%葡萄糖 300ml 穿琥宁 400-800mg(或清开灵40ml)静点,1/日. 脂肪乳 500ml静点 %盐水 50ml 蓉生静丙 2.5g静点
肺脓肿(右侧) 长期医嘱： 内科疾病护理常规 2级护理 陪床1人 半流食 持续低流量吸氧 健康咨询 化痰片 ,3/日,口服. %盐水 300ml 菌必治 (或氧派嗪青霉素静点,2/日. 灭滴灵 250ml 静点,2/日. %盐水 300ml 丁氨卡那霉素静点,1/日. 5%葡萄糖 500ml 穿琥宁 800mg静点,1/日.临时医嘱: 青霉素皮试 胸片(正位) 血尿便常规 血沉 血钾钠氯 血二氧化碳结合力+尿素氮痰培养+药敏 心电图 右侧结核性胸膜炎伴胸腔积液 长期医嘱： 内科疾病护理常规 2级护理 陪床1人 普食 健康咨询 利福平 ,3/日,口服. 乙胺丁醇,1/日,口服. 肝泰乐,3/日,口服. 链霉素 ,1/日,口服. 强的松 5mg,3/日,口服(1周后改5mg,2/日,口服) 5%葡萄糖 500ml 雷米封静点,1/日.临时医嘱: 链霉素皮试 血尿便常规 血沉 血钾钠氯 血二氧化碳结合力+尿素氮肝功能 二对半 (第二日) 胸穿一次 胸水常规+分类检查 胸水离心沉淀找抗酸杆菌胸水病理找癌细胞 胸片
参与细胞信号转导通路的蛋白简写及全拼 4E-BP eIF4E binding protein Abl Ableson protein tyrosine kinase ACTR A histone acetyltransferase AIF Programmed cell death protein 8 ANT Adenine nucleotide translocation channel Apaf-1 Apoptotic protease activating factor 1 APP beta-Amyloid precursor protein APPs Acute phase proteins ASIP Agouti switch protein ASK Apoptosis signal-regulating kinase (e.g., ASK1) ATF-2 Activating transcription factor 2 ATM Ataxia telangiectasia?mutated protein kinase ATR ATM and Rad3?related protein kinase Bam32 B-cell adaptor molecule 32 kDa BCAP B-cell adaptor for PI3K Bcl-10 B-cell leukemia 10 protein Bfl-1 Bcl-2-related protein A1 Bid A BH3 domain?only death agonist protein Bimp1 B-lymphocyte-induced maturation protein 1 BLNK B-cell linker protein BRCA Breast cancer growth suppressor protein Btk Brutonís tyrosine kinase C3G Guanine nucleotide?releasing factor 2 CAD Caspase-activated deoxyribonuclease Cam Calmodulin CaMK Calcium/calmodulin-dependent kinase CAP c-Cbl-associated protein Cas p130CAS, Crk-associated substrate Caspase Cysteine proteases with aspartate specificity CBL Cellular homologue of the v-Cbl oncogene CBP CREB binding protein CD19 B-lymphocyte antigen CD19 CD22 B-cell receptor CD22 CD40 B-cell surface antigen CD40 CD45 Leukocyte common antigen, a phospho-tyrosine phosphatase CD5 Lymphocyte antigen CD5 cdc2 Cell division cycle protein 2, CDK1 cdc34 Cell division cycle protein 34, a ubiquitin conjugating (E2) enzyme cdc42 Cell division cycle protein 42, a G-protein CDK Cyclin-dependent kinase Chk Checkpoint kinase CHOP C/EBP homologous protein 10
生物学通报２００７年第４２卷第９期细胞体外培养时为什么会贴到培养皿壁上 刘梅芳徐国恒‘（北京大学医学都生理系北京１０００８３） 北京市第２２中学的生物学教师陈珊问：动物细胞培养时为什么会出现贴壁现象？ 答：第１。绝大部分细胞在机体内的环境下是与其他细胞或者细胞外基质结合的，不是孤立存在的。第２，细胞与细胞或者细胞外基质结合的物质基础以及在体外培养中贴壁的物质基础是什么。 在体内，大部分细胞不是孤立存在的（血液中的细胞除外）。一般一种细胞具有一种特定的功能．不同种细胞有机组合在一起就构成能够完成较为完整的一项功能的器官。细胞之问，细胞与细胞外基质之间结合在一起，这使得每一部分组织或者器官具有一定的外形及特定的功能。血液在体内是起运输作用的，不停地流动，要通过只有几个“ｍ的毛细血管，所以血液中的细胞是单个存在的。否则就会发生血管阻塞。但是它们受到刺激．其表面与黏附有关的蛋白会被激活然后与其他细胞或细胞外基质结合．如血小板接触到破损内皮下的胶原被激活而黏附在局部，从而发挥止血的功能；如巨噬细胞可以将衰老的红细胞、血液中凋亡的中性粒细胞结合并将其吞噬，这些都应该是属于细胞之间的结合。另外有些研究表明细胞必须与其他的细胞发生联系才能够生存．如果没有其他细胞或者细胞外基质与之结合．此细胞就会发生凋亡，称为失巢凋亡。 细胞在体外培养的条件下的贴壁，首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。贴壁的过程可能是这样的。细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面），然后细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。所以细胞贴壁与否与细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。 细胞贴壁的过程使形态发生很大变化．细胞变形运动是细胞内骨架本身和细胞外基质共同作用的结果。细胞为什么要贴壁，可以想象一下．密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）会沉在底面上，那么细胞要生存必定改善这个环境。分泌细胞外基质，然后很自然就贴附在底面上了，而悬浮细胞．如淋巴细胞由于重力原因沉在培养瓶的底面，但是并不贴附，这可能与细胞表面的黏附分子少，以及分泌的细胞外基质过少有关．有人研究用细胞外基质处理培养器皿的底面．即增加细胞外基质，可以使悬浮的淋巴细胞贴壁。另外悬浮生长的细胞系ＴＨＰ一１受到某些药物刺激之后也可以贴壁．这可能与细胞本身分泌的细胞外基质以及细胞表面的黏附分子表达增多有关。密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上。所以不可能贴在底面上．但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。 （Ｅ—ＩＩｌａｉｌ：ｘｕｇ＠ｂｊｗＬＩ．ｅｄｕ．ｃｎ） （ＢＨ） 欢迎订阅２００８年《生物学教学》杂志 《生物学教学）杂志是由华东师范大学主办，向国内外正式发行的全国教育类核心期刊。国内统一刊号：ｃＮ３１一Ｉ００９，ｃ４．国际标准刊号：１００４—７５４９。读者对象以中学生物学教师为主，兼顾高校和其他生物学工作者。主要栏目有：生物科学综述、国家课程标准与实验教材、现代教育论坛、教育教学研究、课堂教学设计与实践、信息技术、国外教育动态、考试与命题、实验教学、科技活动、教学参考、生物学科技信息、科学技术与社会、读者之窗等。另外，封面、封底刊登生物照片。 《生物学教学》杂志为８０页，月刊，国际标准１６Ｋ，２００８年定价：７．００元，全年８４元。国内订购：全国各地邮局，代号４—４５０。国外订购：中国国际图书贸易公司（北京３９９信箱，邮编：１０００４４），代号：Ｍ５１０５。如果错过了邮局订购时间，可以与杂志社联系邮购。杂志社地址：华东师范大学《生物学教学》杂志社，邮编：２０００６２．电话０２ｌ一６２２３２２２５。电子信箱：ｓｗｘｉｗ＠ｂｉｏ．ｅｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。