第28卷 第4期2016年4月V ol. 28, No. 4Apr., 2016
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2016)04-0513-08
? 技术与应用 ?
收稿日期：2015-08-26； 修回日期：2015-11-09
基金项目：国家自然科学基金项目(91229123，4137- 6151)；国家中医临床研究基地项目(LYTD-21，JDZX- 2012123)；上海交通大学SMC-晨星青年学者奖励计划 (15X100090011)；上海交通大学PRP 计划(T082-PRP27004/6，T082PRP28006)
*通信作者：E-mail: kangyani@https://www.doczj.com/doc/fc5394960.html, ；Tel: 021-********
肿瘤细胞DNA 甲基化检测技术与研究方法新进展
赖伊杰，康亚妮*
(上海交通大学生物医学工程学院，上海 200240)
摘 要：DNA 甲基化作为一种常见的表观遗传学修饰方式，在基因表达调控中发挥着重要作用，与肿瘤的发生发展有着密切的联系。检测肿瘤相关基因的甲基化状态对开发肿瘤诊断、治疗等相关技术及研究肿瘤发生机制具有重要意义。现对肿瘤细胞DNA 甲基化检测技术的优缺点及应用进行综述，以期为研究者在选择检测方法时提供参考。
关键词：DNA 甲基化；肿瘤；基因表达；检测技术中图分类号： R394；R730.4 文献标志码：A
New progress on detection and research methods
of DNA methylation in tumor cells
LAI Yi-Jie, KANG Ya-Ni*
(School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)
Abstract: DNA methylation is a common epigenetic modification, which plays an important role in the regulation of gene expression and is closely related to the process of tumorigenesis. Investigating into the methylation patterns in tumor related genes shares tremendous significance in developing technologies for tumor diagnosis and tumor treatment and in understanding the mechanisms underlying tumorigenesis. This review gives an intensive look into the existing DNA methylation detection methods and a brief comment about their relative merits and applications to provide reference for researchers when selecting a proper detection method.
Key words: DNA methylation; cancer; gene expression; methylation detection method
DNA 甲基化反应是在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase , DNMT)催化作用下，以S2腺苷甲硫氨酸(S2 adenosylmethionine , SAM)作为供体将活化的甲基引入DNA 链中的过程。肿瘤细胞DNA 甲基化的异常状态与肿瘤的发生发展密切相关。原癌基因的异常低甲基化可诱导细胞异常增殖，最终诱发肿瘤；抑癌基因启动子区的异常高甲基化可导
致基因沉默，从而促进肿瘤的发生发展[1]
。与传统
的遗传信息序列不一样，基因的表观遗传学修饰是可逆的，通过改变细胞生长的环境、甲基化酶抑制
剂以及靶向治疗等方法可以抑制肿瘤的生长[2]
。由于5-甲基胞嘧啶的存在并不影响碱基的配对，因此，
在传统的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction , PCR)扩增的过程中将会丢失甲基化的信息。研究
人员开发了各种技术对DNA 进行预处理来保留DNA 甲基化信息，依据对目标DNA 的预处理手段将甲基化检测技术分为3类，即基于限制性酶切预处理、基于亲和富集预处理以及基于亚硫酸盐修饰预处理的甲基化检测技术。在真核生物中，DNA 甲基化主要发生于胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤(cytosine-DOI: 10.13376/j.cbls/2016066
网络出版时间：2016-04-29 10:21:10
网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/fc5394960.html,/kcms/detail/31.1600.Q.20160429.1021.013.html
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phosphate-guanine, CpG)二核苷酸，并以5-甲基胞嘧啶形式存在[3]。研究肿瘤细胞的甲基化状态对于理解和认识肿瘤的发生发展机制至关重要，并为肿瘤基因的靶向治疗提供新的思路。本文对肿瘤细胞DNA甲基化检测技术与研究方法的优缺点及其应用进行了综述，以便为研究者们在方法选择上提供意见参考。
1 基于限制性酶切的DNA甲基化检测技术
由于甲基化敏感的限制性酶无法切割甲基化的DNA，使用甲基化敏感性不同的限制性内切酶(如Hpa II和Msp I)处理样本DNA继而获得不同的酶切片段，便可以实现对差异性甲基化片段的区分。
基于限制性酶切预处理的DNA甲基化检测技术，主要包括限制性路标基因扫描技术(restrictional and mark genomic scanning, RLGS)[4]、甲基化敏感的扩增片段长度多态性技术(methylation-sensitive amp- lified fragment length polymorphism, MS-AFLP)[5]、差异甲基化杂交技术(differential methylation hybrid-ization using CGI army, DMH)[6]、甲基化特异性多重连接探针扩增(methylation-specific multiplex ligation- dependent probe amplification,MS-MLPA)[7]以及近期发展的基于限制性酶的单细胞甲基分析技术(restriction enzyme based single cell methylation assay, RSMA)[8]等。这些方法的主要区别在于检测酶切产物片段的方法，即电泳的维度、是否采用芯片杂交以及样本细胞的个数。
RLGS是第一个检测DNA甲基化图谱的技术，其使用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，通过二维电泳的方式对具有放射性的酶切产物进行分离，电泳图谱上斑点的位置与密度则分别对应于该位点的位置与拷贝数。该方法不需使用PCR扩增，在对全基因组甲基化位点分析上具有优势，适用于同时分析不同肿瘤中的甲基化模式和寻找肿瘤内DNA甲基化的新靶点，如发现胃癌基因甲基化的新靶点BACH2[9]以及对肺癌细胞的全基因组差异甲基化区域的扫描[10]等。但由于其操作复杂，需使用放射性同位素，且无法定量分析，现已基本不使用。
MS-AFLP使用识别位点不含CG的内切酶和识别位点含有CG序列的内切酶(如Not I-Mse I)对DNA进行处理，连接上标记的接头引物，在PCR 扩增后通过电泳区分出甲基化情况不同的片段。Ymamotto等[11]评估其敏感性和特异性分别为78.5% 和97.1%。随后Muto等[12]将与荧光阵列杂交相结合的FL-MS-AFLP (fluorescence-labeled MS-AFLP)
用于甲基化的定量分析，发现出现微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)的结肠癌细胞较无柄锯齿状腺瘤细胞(sessile serrated adenomas, SSA)有着更高频的低甲基化。DMH则是在Mse I酶切后将荧光标记的产物与CGI芯片进行杂交，比较荧光强度来检测甲基化状态的差异，可用于多样本、多位点甲基化的检测，样本需要量少，适于临床样本，但存在假阳性问题，需进行后续鉴定[13]。目前DMH 被广泛用于筛选肿瘤中启动子区域异常甲基化的基因，如筛选前列腺癌基因中的潜在甲基化位点[6]。
MS-MLPA由Nygren等[7]首先开发，并可用于石蜡包埋的样本的甲基化分析，其通过引入可以被限制性酶切割的探针从而实现了对特定位点甲基化的定量检测。目标DNA在变性之后与探针结合，在甲基化敏感的限制性酶作用下未甲基化的片段被切割，从而不会扩增而没有信号，因此，在毛细管电泳中仅能检测到甲基化片段的信号。这种方法因为可通过改变探针序列来实现对不同位点的甲基化定量检测，而在许多癌症基因的甲基化检测中广泛应用[14-15]。
Kantlehner等[8]在对人类结直肠癌SW480细胞DNA的甲基化研究中报道了RSMA技术。RSMA 主要使用AmpliGrid玻片完成对单个细胞的沉积以及DNA的准备，并使用甲基化敏感的限制性内切酶切割基因组DNA，经过PCR扩增后观察电泳条带。此方法最大的优势是能对单个细胞的甲基化状态进行检测，从而将表观遗传学的重编程与细胞命运决定联系在一起，这对于研究肿瘤细胞中不同细胞的基因表达具有重要意义；但单细胞甲基化分析技术在特定位点甲基化检测上存在困难，并且在单细胞环境下DNA样本容易丢失[16-19]。
2 基于亲和富集的DNA甲基化检测技术基于亲和富集的DNA甲基化检测技术主要有
甲基化DNA免疫沉淀技术(methylated DNA imm-unoprecipitation, MeDIP)与甲基化CpG结合蛋白亲和捕获技术(methyl-CpGbinding domain-based proteins, MBDCap)。因为采用的富集蛋白不同， MeDIP普遍富集CpG低密度的甲基化区域，而MBDCap则普遍富集CpG高密度的甲基化区域[20]。在需要确定具体单个CpG甲基化位点时，可将富集操作与亚硫酸盐转化测序(bisulfite-seq)相结合以获得单个核苷酸位点的甲基化信息。
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MeDIP方法在将基因组DNA超声波打断并变性后，使用5-甲基胞嘧啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化DNA片段。MeDIP 得到的DNA片段可以与阵列杂交联用(MeDIP-array)进行高通量、快速的基因组甲基化分析。如对大鼠皮肤癌的肿瘤特异性甲基化区域的筛选[21]，也可以与测序相结合(MeDIP-Seq)；如Borno等[22]对前列腺癌组织与正常组织进行的基因组DNA甲基化模式进行分析，鉴定了14.7万个癌症特异性的差异性甲基化区域，并基于TMPRSS2-ERG基因融合阴性的肿瘤细胞的表观遗传学改变对前列腺癌的发生机制提出了新的解释。
MBDCap技术与MeDIP方法类似，也需要经过超声波片段化、富集与洗提的步骤。Jadhav等[23]将MBDCap技术与测序技术相结合(MBDCap-Seq)，发现大规模邻近基因群的甲基化情况可以作为乳腺癌的诊断标志；Wang等[24]在MBDCap富集CG序列之后使用启动子微阵列对胃癌相关基因进行扫描，发现XRCC1基因的启动子区出现高甲基化。3 基于亚硫酸盐转化的DNA甲基化检测技术Frommer等[25]于1992年首次报道了基于亚硫酸氢钠处理的基因组测序法。经亚硫酸氢盐处理后，原DNA样本中的胞嘧啶(C)可转化为尿嘧啶(U)，而5-甲基胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶的几率极低，所以，亚硫酸氢钠处理后再进行PCR的产物中，胞嘧啶只来自于5-甲基胞嘧啶。这种方式可有效保留DNA的甲基化信息，被广泛使用于特定位点和全基因组的甲基化检测。
3.1 亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing,BS-Seq)
对亚硫酸盐处理后的DNA进行测序分析是DNA甲基化检测的金标准，主要分为全基因组测序和靶向位点测序两大类。
全基因组亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing, WGBS)是绘制基因组甲基化图谱的最好方法。WGBS被用于人类结直肠瘤、乳腺癌和正常组织甲基化图谱的比较，以单碱基分辨率最为直观地证明了肿瘤细胞中基因甲基化的改变[26]。然而，尽管WGBS在全基因组甲基化检测上有着无可比拟的优越性，但由于人类基因组过于庞大，在测序大量样品时费用较高，这限制了其在肿瘤临床检测中的应用。
由于在许多人类细胞中70%~80%的CpG位点都存在着稳定的甲基化，对全基因组的甲基化检测仅能提供十分有限的肿瘤特异性的基因调控信息，因此，可以对亚硫酸盐处理后的DNA进行肿瘤特异性潜在CpG甲基化调控位点的筛选，以提高测序的效率、降低测序的花费[27]。BSP克隆测序法(bisulfite sequencing PCR, BSP)设计特定的引物对亚硫酸盐修饰后的产物进行PCR，将目的产物纯化后进行克隆测序，测序方法包括桑格法(Sanger)和下一代测序法(next generation sequencing, NGS)，是目前实验室里常用的定量特定位点的甲基化检测手段[28-29]；减容代表亚硫酸氢盐测序法(reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)利用限制性内切酶对基因组进行酶切，通过凝胶电泳将CpG 位点富集出来，再对其进行亚硫酸盐转化进行PCR 扩增以及测序，虽然降低了测序量，但在其覆盖范围内，对结肠癌、腺癌以及淋巴瘤中相关基因的CpG岛、启动子区域以及增强子元件的甲基化信息检测仍可达到单碱基分辨率，并且单细胞RRBS、单管RRBS以及双酶切RRBS的发展进一步提高了RRBS测序方法覆盖区域的代表性和深度[30-34]；亚硫酸盐锁式探针(bisulfite padlock probe, BSPP)的捕获臂和亚硫酸盐处理后的DNA互补配对时可以扩增并连接成环形，用核酸外切酶可以筛选出连接成环状的锁式探针，对扩增产物进行测序就可以得到相应的DNA信息，锁式探针法不局限于限制酶识别的位点，其也比RRBS在选择基因组靶点上有着更大的灵活性[35]。
3.2 甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR, MSP)及其衍生方法
甲基化特异性PCR (MSP)是一种快速、实用的基因甲基化检测方法，灵敏度高、特异性强，能同时检测多个CpG位点的甲基化情况，定量分析基因启动子区CpG岛每个CpG位点的甲基化水平，对于深入研究肿瘤相关基因表达调控机制具有重要意义，可以更好地揭示启动子区CpG岛所包含的表观遗传学信息，以明确DNA甲基化模式在基因差异表达机制中的作用。在MSP的基础上研发的MethyLight技术使用荧光定量PCR和荧光水解探针，不需要放射性标记探针以及凝胶电泳的繁琐过程；由于其可以闭管高通量进行检测，对微量模板DNA的甲基化检测也十分敏感，常被用于定量检测肿瘤基因的甲基化情况，但探针的引入会增加设计的复杂性，且探针有可能无法检出杂合甲基化[36]。Bonanno等[37]所报道的甲基化特异性荧光扩增(methylation-specific fluorescent amplicon generation,
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MS-FLAG)是利用热稳定的Psp GI核酸内切酶切割双链PCR产物5'端的淬灭荧光基团产生实时荧光信号来定量检测甲基化，无需设计荧光探针，此法被用于检测肺腺瘤的3个抑癌基因的甲基化情况，有着高特异性、高敏感性(2~3个质粒拷贝)与高选择性(0.01%甲基化DNA)。为了增加对多基因样本同时甲基化分析的敏感性和特异性，Lan等[38]在研究前列腺癌相关基因GSTP1和RASSF1A时开发了甲基化特异性的斑点杂交技术(methylation specific dot blot assay, MSP-DB)，即先用引物扩增出富含CpG 位点的标记探针，再将其与用紫外线固定在尼龙膜上的MSP产物进行杂交，利用此方法可以将CpG富集区域的甲基化状态的检测敏感度提高至0.01%[38]。
3.3 甲基化敏感熔解曲线分析(methylation-sensitive high-resolution melting,MS-HRM)
通过熔解曲线分析技术可检测亚硫酸盐处理后获得的甲基化与未甲基化DNA间序列的差异。使用在插入DNA双链时不会干扰PCR的新一代荧光染料SYTO9(高温解链时脱离下来，从而造成荧光的迅速衰减)进行荧光定量PCR，因为甲基化DNA 在经过处理之后含有更多的GC相对更难解链，在HRM的过程中对荧光信号进行实时分析便可以知道DNA的序列信息以及甲基化情况的定量结果。
MS-HRM继承了HRM方法的高敏感性、高通量、低污染的特点，可以鉴定由于亚硫酸盐转化不完全与错误起始而造成的假阳性结果，以及同源和异源甲基化，这些特点都要优于基于电泳结果的分析。Amornpisutt等[39]使用此法对胆管癌中OPCML 和SFRP1基因的甲基化状态进行了定量检测，发现其均处于高甲基化状态，并且MS-HRM的敏感性、特异性和准确性均在80%以上。
3.4 重亚硫酸盐限制性内切酶联合分析法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)
COBRA将亚硫酸盐处理后DNA的PCR产物用识别位点包含CG序列的限制性内切酶消化并进行电泳分离，对产物进行探针杂交、扫描定量，即可得出原样本中酶切位点发生甲基化的比例。Jacob 等[40]应用COBRA与测序相结合(COBRA-Seq)检测出在卵巢癌中GBGT1基因启动子区出现高甲基化。
3.5基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)
基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后PCR扩增并逆转录，经鸟嘌呤特异性的RNase TI酶切后用MALDI-TOF检测可检测出原DNA中甲基化的胞嘧啶的位点。Sequenom公司推出的EpiTYPER质谱反转录测序平台实现了质谱分析DNA甲基化的自动化、高通量化[41]。虽然MALDI-TOF-MS质谱检测法具有高通量的特性，在宫颈癌、肝母细胞瘤等研究中得到应用，且在一定程度上可实现自动化，但由于其设备昂贵、方法繁琐，限制了其临床应用[42]。
3.6 基于阵列杂交的检测平台infinium human methy- lation 450 BeadChip (Infinium 450K)
Infinium 450K甲基化检测平台的原理是用两种不同的微珠来检测CpG的甲基化状态：U微珠与未甲基化的CpG位点配对，M微珠与甲基化的位点配对。未甲基化的靶点与U微珠上的探针配对，实现碱基的延长与检测，然而，其与M微珠上的探针存在一个碱基的差异，所以不能顺利延伸。此平台具有高通量与高基因组覆盖性的特点，其能覆盖99% RefSeq (NCBI reference sequence)中的基因，具有单核苷酸分辨率，且能靶向同一个基因中的多个位点(约17个探针)。除了每个基因的启动子区域外，其探针还包括许多非CGI(CpG island)区域，如5'-UTR、第一外显子、基因体与3'-UTR。相比于前一款illumina infinium human methylation 27 Bead- Chip (Infinium 27K)检测平台，由于Infinium 450K 在27K已有探针的基础上增加了使用两种不同染料以区分甲基化与未甲基化信号的新探针，其覆盖位点更为全面，可以帮助人们发现更多新的、位于传统CpG岛外的基因调控区域，且排除了相邻CpG 位点的甲基化差异的干扰[43]。
3.7 变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)
Deng等[44]借鉴了DHPLC检测点突变的方法，把发生甲基化的多个CpG位点作为多位点突变。原理为，先用亚硫酸氢盐修饰DNA，再用PCR扩增含CpG位点的靶序列，采用DHPLC在部分变性温度下测定靶序列的保留时间。靶序列发生甲基化后，其保留时间比未甲基化的靶序列明显增长。
DHPLC法可以进行甲基化基因的筛查，能够测定整个扩增区域内CpG 位点的甲基化，但是不能对甲基化CpG 位点进行精确定位。如果靶CpG 位点不是完全甲基化，则MSP 法和酶切法的非甲基化测定结果可能毫无意义，而DHPLC 法由于能够显示整个目标片段中所有CpG位点的总甲基化状态，测定结果更可靠[45]。
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4 总结
4.1 肿瘤细胞DNA 甲基化检测技术分类
肿瘤细胞DNA 甲基化检测技术根据DNA 样本的预处理方式可以分为基于限制性酶切、基于亲和富集和基于亚硫酸盐转化三种类型，这三种类型的预处理与不同的甲基化信息读取手段的灵活组合可以适用于不同细胞、组织的DNA 甲基化检测。检测方法归类见表1。
4.2 肿瘤细胞DNA 甲基化检测技术优缺点分类总结
DNA 样本预处理方法的选择主要由样本状况和通量需求来决定。如样本为经过福尔马林固定、石蜡包埋等处理，则DNA 的纯度和完整性都会有所下降，这时使用限制性酶切的方法就很可能会导致结果的偏差，而使用对样本状况敏感性较低的亲和富集和亚硫酸盐处理则效果较好；使用亲和富集的方法要求充足的样本DNA 量，而在样本较少或者样本细胞间个体差异明显时，使用另外两种方法则更好；由于限制性酶切与亲和富集方法操作的自动化程度低，在需要高通量分析甲基化状态时则要选择亚硫酸盐处理的方法。
而在甲基化信息获取方法的选择上，主要由分析的范围(全基因组或特定位点)与量化程度(定量或定性)来选择，如测序虽能获得良好的量化分析与位点特异性的信息，但进行全基因组的筛查成本太高；凝胶电泳操作方便，但不能用于定量分析等。具体的优缺点分析及总结如下(表2、表3、表4)。
5 展望
目前的甲基化检测方法中，就耗时长短来说，传统的限制性酶切、亲和富集与亚硫酸盐修饰法耗时较长且操作繁琐，在检测的便利性与实时性上打了一些折扣；高通量测序平台快速、高效，但价格不菲。目前迅速发展的纳米孔测序(nanopore sequencing)在甲基化检测中已经有了应用，设备简单、操作方便，无需预处理，但是由于其样本DNA 较少，假阳性以及样本丢失的现象很严重，并且由于DNA 通过小孔的速率过快，很多方法并不能满足检测所需要的碱基分辨率，应用也相当局限[47]。另外，Xu 等[48]
报道的化学氧化切割触发的指数扩增反应(chemical-oxidation cleavage triggered exponential amplification reaction , COEXPAR)可在 5 h 内实现等温的甲基化检测反应，省去了样品准备时间，也无需精确的热循环仪器，并且可以通过改变氧化切割反应试剂实现对5-hmC 的检测，这对于发展甲基化检测方法是一个重要的启发。
DNA 甲基化异常和肿瘤的发生、发展有着密切的关系，DNA 的甲基化改变也为癌症的诊断和治疗提供了一条新途径，可靠的甲基化检测结果对发病风险评估、早期诊断、疗效评价及预测复发等具有重要意义。然而，就基因甲基化对表达的调控作用这一点来讲，一个目的CpG 岛上不同区段甲基化位点对基因转录活性的影响存在很大的差别，在基因特异性DNA 甲基化分析时存在的最大问题
表1 肿瘤细胞DNA 甲基化检测技术分类表
甲基化信息获取方式
DNA 样本预处理方式
基于限制性酶切 基于亲和富集
基于亚硫酸盐转化基于测序(Sanger 、NGS) RRBS MeDIP-Seq RRBS
MBDCap-Seq BSPP
COBRA-Seq 基于阵列杂交 DMH
MeDIP-array Infinium 450K
FL-MS-AFLP MBDCap- array 基于凝胶电泳 RLGS —— MSP
MS-AFLP
RSMA 基于qPCR
—— —— Methylight
MS-FLAG
MS-HRM 基于斑点杂交 —— —— MSP-DB
基于飞行质谱 ——
—— MALDI-TOF-MS (EpiTYPER)基于毛细管电泳
MS-MLPA —— ——
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表2 肿瘤细胞DNA甲基化检测技术优缺点比较表(基于样本预处理方式)
优缺点
DNA样本预处理方式
基于限制性酶切基于亲和富集基于亚硫酸盐转化
优点 1.检测CpG岛甲基化灵敏度高 1. 基因组检测速度快 1. 对样本纯度、完整性要求较低
2.无需预知被检DNA的序列 2. 对样本DNA纯度、完整性要求低 (如Illumina的检测平台等多可用
3. 无需预知被检DNA序列 于福尔马林固定、石蜡包埋的样本)
2. 易自动化，易高通量检测
量化程度基于甲基化图谱检测基于甲基化分型检测
定量或半定量MeDIP-Seq MS-MLPA
MBDCap-Seq BSP(Sanger, Pyro-sequencing)
WGBS RRBS
Infinium 450K BSPP
FL-MS-AFLP Methylight
DHPLC MS-FLAG
MS-HRM
COBRA
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是不了解这一点随意使用引物，使研究的生物学意义不明，而且用不同引物所得的研究结果没有办法横向比较，甚至相互矛盾。为了获取更为精确的甲基化数据、更好地解读甲基化与基因表达的关系，除了继续优化甲基化检测方法之外，人们还需要将不同的分析方法联合使用，融合多学科优势来确定关键性的CpG位点，并准确地阐明甲基化与基因表达的关系。
[参 考 文 献]
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DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取。 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA 应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
DNA甲基化检测技术全攻略 近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。 特异位点的甲基化检测 甲基化特异性PCR(MS-PCR) 这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。 这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。 亚硫酸氢盐处理+测序 这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。 联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA) DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。 这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。 荧光定量法(Methylight) 此种方法利用TaqMan? 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。 Qiagen就提供了多种预制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了两条甲基化敏感的TaqMan探针和2条甲基化不敏感的PCR引物。随着目标序列甲基化状态的不同，只有FAM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针，或只有VIC
基因甲基化检测 甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程. DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。 CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。 因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断（如甲基化检测与低剂量CT相结合）、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。 目前甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA 序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。 一. MSP实验流程： 1.基因组抽提； 2.基因组DNA定量； 3.重亚硫酸盐转化（C转化为U)，本步实验至关重要，转化效率高低直接影响实验结果，所以， 需要实验者在实验过程中不断摸索合适的实验条件以确保较高的转化效率； 4.引物设计（每个基因设计两对引物，分别为：甲基化引物M，非基因化引物U，对应扩增甲 基化和非甲基化的目的片段），有时需设计巢式引物； 5.PCR扩增：对甲基化和非甲基化的目的片段分别扩增,此时尽可能使用梯度PCR仪，可以同 时使用不同的退火温度，以筛选合适的退火温度； 6.PCR产物电泳； 7.电泳结果分析（定性即有无甲基化，半定量即甲基化程度高低）。 图1：MSP PCR产物电泳图
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA 和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC 区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
甲基化检测方法 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
甲基化检测（detection of methylation） 概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM) 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞(≥106个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥等样品材料，基因组DNA(体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl)。
甲基化研究方法学回顾 1 整体水平甲基化分析 1.1 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法 HPLC是一种比较传统的方法，能够定量测定整体水平DNA 甲基化水平。它由Kuo等1980年[18]首次报道。过程是将DNA 样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5m C/(5m C+5℃)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA 甲基化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002年[19]运用高效毛细管电泳法(HPCE)处理DNA 水解产物，以确定5mC的水平。与HPLC相比，HPCE更加简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。Oefner等1992年[20]提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA 分子。邓大君等2001[21]将其改进与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增，由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测定出PCR产物中甲基化的情况。 这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG位点甲基化的情况，但不能对甲基化的CpG位点进行定位。 1.2 SssI 甲基转移酶法[22]
SssI甲基转移酶能够催化DNA 的CpG位点发生甲基化。3 H-S-腺苷甲硫氨酸(3 H-SAM)在SssI甲基转移酶催化作用使基因组DNA 的CpG位点发生甲基化。通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA 甲基化水平成反比。这种方法的缺点是所使用的SssI甲基转移酶不稳定，致结果不够精确。 1.3 免疫化学法[23] 这种方法是基于单抗体能够与5m C发生特异性反应。应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA 特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5m C的水平，其荧光素强度与5m C水平成正比。Oakeley等199 7年[23]报道了这种方法。这种方法需要精密的仪器。 1.4 氯乙醛法 Oakeley等1999年[24]首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。首先，将DNA 经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变（Frommer等1992年）[25]，然后经过银或色谱柱去除D NA 链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5m C就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5m C的水平成正比。这种方法可以直接测定整体5m C水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒的物质。 2 特异性位点的DNA 甲基化的检测 2.2.1 甲基化敏感性限制性内切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）-PCR/Southern法
甲基化检测(detection of methylation) 概念：DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA 甲基化转移酶(DNMTs) 的作用下使CpG 二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA 甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA 修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA 的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG 岛以外的CpG 序列非甲基化程度增加，CpG 岛中的CpG 则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA ，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA 链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA ，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR 产物进行测序就可以判断CpG
位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR 产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting ，HRM） 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物, 这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC 含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞（＞106个）、组织（＞300mg）、血液（＞1ml）、血清（》等样品材料，基因组DNA（体积》20卩I，浓度》50 ng/口l）。
甲基化检测方法 Prepared on 22 November 2020
甲基化检测（d e t e c t i o n o f m e t h y l a t i o n）概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
甲基化检测（detection of methylation） 概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG 岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为
尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM) 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞(≥106个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等样品材料，基因组DNA(体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl)。