分类一号:一里车一一一
UDC:-I
密级:-一生浮一一
编号刁耍卿李勒:缭叫一
,,护利梦
J}ANGSUUN}VERS}TY
博士学位论文
DISSER工绷几ON
;八!!"新型无机纳米载体的构建及其卜匕夕-夕招华仁习:))
药物/基因的高效传递研究
学科专业:
作者姓名:
指导教师:
答辩日期:
l!备床检验诊断学
曹霞
徐希明教授
2011年12月23日分类号断分
UDe6,
密级一一一么无一一
编号业群血翅吵,
新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究FabricationofNovelInorganicNanoPartieulate CarriersandtheAPPlieationforEffieient
Drug/GeneDelivery
学生姓名:曹霞
指导教师:徐希明
专业名称:临床检验诊断学
申请学位:博士
论文答辩日期:20n.12.23
学位授予单位:江苏大学ClassifiedIndex:
UDC:
FabrieationofNovelInorganicNanoParticulate CarriersandtheAPPlieationforEfficientDrug/Gene
Delivery
ByCaoXla
Major:Clinicallaboratorydiagnostics
SuPervisor:Prof.Xuximing
ProLYujiangnan
JiangsuUniversity
Dee.,23.2011学位论文版权使用授权书
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保密口,在年解密后适用本授权书"
本学位论文属于
不保密囚"
,如必心誉么太的学位论文作者签名:.飞.儿导师签名:乃万-厂甲0)
签字日期:词11年陪月可日签字日期:习l/年肠月才日
学位论文作者毕业后去向:
工作单位:
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邮编:独创性声明
本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独
立进行研究工作所取得的成果"除文中已经注明引用的内容以外,本
论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果"对本
文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明"
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担"
学位论文作者签名:-青-氰
日期:0!}年阵月〕丁户日江苏大学博士学位论文
摘要
纳米载体在药物/基因传递中具有特殊的价值和意义"纳米载体粒径大小在
10一SOOIun,可将药物分子包裹其中或吸附在其表面,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向药物输送
和基因治疗"无机纳米粒载体因具有生物安全!高效!价廉等优点,己成为近年
来新型药物/基因传递系统研究的热点"本论文重点围绕新型无机纳米粒载体的
构建及其在药物/基因传递中的应用开展研究,主要分为四个部分:
第一部分纳米载体在药物/基因传递中的应用研究进展
对纳米药物载体及基因载体的国内外研究现状进行了综述,主要内容包括:
纳米载体的特点及制备新技术!纳米药物缓控释系统的优点!基因载体的分类与
特点!非病毒纳米基因传递系统的优点!新型纳米载体在药物/基因传递系统中
的应用进展!基于组织工程的三维支架以及软骨种子细胞的定向诱导分化研究进展等"文献综述为论文后续实验工作的开展奠定了基础"
第二部分新型多孔二氧化硅纳米粒在药物传递中的应用研究
以生物安全的硅胶为载体材料,运用纳米技术,自行研制出具有高效增溶!
长效缓释作用的新型多孔二氧化硅纳米粒(poroussilicananopartieles,pSNs)"分别选择水溶性药物水飞蓟宾葡甲钱(silybinmeglumine,sLBM和难溶性药物水
飞蓟宾(Silybin,SLB)为模型药物,研究PsNs新载体在水溶性药物和难溶性
药物72h高效长效制剂开发中的应用可能,为3天给药1次的高效长效新制剂开发提供技术支撑"
1.水溶性药物72h高效长效新制剂的研制:以水溶性药物水飞蓟宾葡甲钱)
为模型药物
(3d一SLBM)
PSNs为载体,制备了水飞蓟宾葡甲钱72h
"体外评价研究结果表明:3d一SLBM的主药含量为
高效长效制剂
29.46mg/50mg,
载药量为58.91士0.39%,包封率为58.43士0.62%;体外释药特性研究结果显示,
3d一SLBM中SLBM的释放适宜在低浓度的碳酸钠溶液中进行,72h累积释放大
于80%;体内药动学研究结果显示:比格犬口服3d一SLBM,高效液相法测定犬
体内血药浓度,3d一SLBM的Tmax24h与参比制剂Tmax0.5h相比大大增加,
3d一SLBM的MRT38.89h与参比制剂的MRT7.31h相比显著延长,显示出长效新型无机纳米载体的构建及其药物噬因的高效传递研究
缓释特征;3d一SLBM中游离药物的相对生物利用度达到803.99%;体外溶出结
果与体内吸收具有良好的相关性,体外溶出结果可以间接反映其体内质量;药效
实验结果表明:3d一SLBM组小鼠血浆中AST(291.83士76.03IU几)和ALT
(774.92土223.85IU几)值明显低于CC从对照组(AST:901.00士174.32IU几,ALT: 1997.58土335.08IU/L),具有统计学意义(p<0.01)"说明3d一sLBM的生物利用度
高!保肝效果好"
2.难溶性药物72h高效长效新制剂的研制:以难溶性药物水飞蓟宾为模型药
物,综合运用固体分散速释技术!亲水凝胶骨架缓释技术和PSNS长效缓释技术
制备了水飞蓟宾72h高效长效制剂(3d一SLB)"体外评价研究结果表明:3d一SLB
中SLB的释放适宜在低浓度的碳酸钠溶液中进行,72h累积释放大于80%;体
内药动学研究结果显示:比格犬口服3d一SLB,高效液相法测定犬体内血药浓度,
3d一SLB的Tmax24h与参比制剂Tmaxlh相比大大增加,3d一SLB的MRrr32.15h
与参比制剂的MRT6.nh相比显著延长,显示出长效缓释特征;3d一SLB中游离
药物的相对生物利用度达到458.98%,体外溶出结果与体内吸收具有良好的相关
性,体外溶出结果可以间接反映其体内质量;药效实验结果表明:3d一SLB小
鼠血浆中AST(149.90士28.14IU/L)和ALT(843.33士169.18IU/L)值明显低于
CCI;对照组(AST:901.00士174.32IU/L,ALT:1997.58士335.08IU/L),具有统计
学意义(P<0.01)"说明3d一SLB生物利用度高!保肝性能优越"
第三部分载基因纳米粒的制备及其在基因传递中的应用研究
选择生物安全的磷酸钙纳米粒(ealeiumphosphatenanopartieles,CpNps)
和PSNS,制备载基因DNA一CPNPS和DNA一PSNS;通过对载基因纳米粒进行修
饰,成功制备了多糖修饰的DNA一CPNPS和钙离子化DNA一PSNs;着重研究了
DNA一CPNPs!多糖修饰的DNA一CPNPS!钙离子化DNA一PSNs3种新型载基因纳
米粒对干细胞的传递效果"
1.DNA一磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞的传递研究:用反相微乳法制备了
DNA一CPNPS,对其进行表征,并将其应用于干细胞的转染"研究结果表明:
DNA一CPNPS的粒径为20一50nm;琼脂糖电泳结果表明:磷酸钙:质粒质量比为
2二1时,CPNPS携带质粒量最大,可有效阻滞DNA的迁移;活细胞工作站测定
结果显示:游离DNA因没有纳米粒载体的作用,细胞未显红色,说明游离DNA江苏大学博士学位论文
未进入细胞内,而DNA一CPNPsZh开始有少数细胞显红色,随着时间的推移,
越来越多的外源基因进入细胞,说明纳米粒可有效携带基因进入细胞;激光共聚
焦显微镜观察核转运结果显示:Zh未见细胞核内显红色,说明DNA一CPNPs此
时尚未进入细胞核,4h进核亦不明显,sh有少量进核,18h可见细胞核内呈明
显的红色,表明此时外源DNA在纳米粒作用下进核明显;活细胞工作站和共聚
焦显微镜测定结果均显示纳米粒可被干细胞吞噬"MTT法测定细胞毒性,结果
显示:DNA一CpNps的毒性明显低于市售转染试剂Lipo企etamineZ000(P<0.01); ELISA测定结果表明,DNA一CPNPS在干细胞中的转染效果与转染试剂
Lipofeetamine200o相当(p>0.05)"实验研究结果表明:DNA一CpNps转染效率
高!毒性低,可以作为一种生物安全的非病毒基因载体"
2.多糖修饰的DNA一磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞的传递研究:选择
DNA一CPNPS,通过对载基因纳米粒进行修饰,成功制备了多糖修饰的
DNA一CPNPS,初步研究了多糖修饰的DNA一CPNPS在千细胞中的转运情况"透
射电镜测定结果表明:多糖修饰的DNA一CPNPs呈球型!粒径分布稳定!分散均
一,粒径在50nm左右;ELISA测定结果表明:与市售脂质体lipofectamine2000
相比,多糖修饰的DNA一CPNPS在干细胞中具有更高的转染效率"
3.钙离子化DNA一多孔二氧化硅纳米粒的制备及其性能评价:选择PSNS为
载体,通过对其进行修饰,成功制备了钙离子化DNA一PSNS,初步研究了钙离子
化DNA一PSNS在干细胞中的转运"琼脂糖电泳结果表明:钙离子化的PSNS能够
与质粒DNA较好的结合,阻滞其电泳迁移,而未修饰的PSNS与DNA结合能力
弱,不能有效阻滞DNA迁移;EDS能谱分析结果表明:钙离子有效结合到PSNs
上;倒置荧光显微结果表明:与DNA一PSNs相比,钙离子化DNA一PSNs能够转
染更多的细胞,说明钙离子化DNA一PSNS可以作为一种有效的非病毒基因载体"
第四部分三维纳米基因传递系统的构建及其在干细胞诱导分化中的应用研究
将细胞外基质修饰纳米粒技术与基于组织工程的三维支架技术相结合,构建
非病毒三维纳米基因传递系统"以细胞外基质(ECM)成分为支架材料,制备
嵌合有DNA一CPNPS的三维支架,成功构建了兼具高效!缓释特征的非病毒三维
纳米基因传递系统(3dimensiona一nanoparticlesgenedeliverysystem,3D一NGDs)"
1.三维纳米基因传递系统的构建及其性能评价:以细胞外基质劲附实验为新型无机纳米载体的构建及其药物恩因的高效传递研究
基础,选择对干细胞豁附及增殖效果好的纤维粘结蛋白!胶原为支架材料,制备
胶原/FN/壳聚糖三维支架;在此基础上,采用冷冻干燥法制备嵌合DNA一CPNPs
的三维纳米基因传递系统(3D一GDS),并观测其孔径!孔隙率!吸水率!保水
率,结果表明:3D一GDs中存在较大孔径(扒00林m)的孔道,吸水率和保水率
与支架材料的配比有关"研究结果表明:3D一NGDS多孔!生物安全,适宜干细
胞生长"
2.三维纳米基因传递系统的基因转运研究:以碘化丙咤标记基因,通过活细
胞工作站观测,结合免疫组化的方法,对3D一GDS中基因的细胞内转运进行了
研究;运用PicogreenDye法测定不同支架不同时间培养液中DNA的含量,绘制
DNA累积释放曲线,结果显示3D一GDS中DNA累积释放率3d达到33.4%,
Zld达到69.7%;而游离DNA一三维支架3dDNA累积释放率达到87.7%,3D一GDS
对DNA具有良好的缓释作用"ELISA法测定二维体系及3D一NGDS3一巧天细胞
表达的TGF一田浓度,结果表明:3D一GDS在3一巧天内,蛋白表达水平维持在
10ng/ml左右,其中第6天表达浓度达到12石n留ml,显著高于二维转染体系
(P<0.01),达到了外加TGF一印因子有效浓度,显示出明显的高效特征"通过观
测干细胞在二维及3D一NGDS中转染巧天的甲苯胺蓝(GAG)染色图及n型胶
原免疫组化染色图,结果表明:二维单层培养细胞的GAG染色和n型胶原免疫
组化染色均为阴性,干细胞在3D一NGDS中培养巧天后,GAG染色和n型胶原
免疫组化染色均为阳性,说明种子细胞已成功分化成软骨细胞,分泌软骨细胞特
征性的细胞外基质:H型胶原和GAG"三维纳米基因传递系统作为一种新型的
非病毒基因载体,可以实现外源基因在种子细胞中的高效持续表达,为后续组织
工程和再生医学研究提供新技术!新思路"
关键词:无机纳米载体,多孔二氧化硅纳米粒,磷酸钙纳米粒,药物传递系统,
基因传递系统,72h高效长效药物新制剂,非病毒三维纳米基因传递系统,干细
胞,组织工程三维支架"江苏大学博士学位论文
ABSTRACT
Nano一sealedearriershavespeeialvalueand51助ifieanceindrug/genedeliv卿. TheParticlesizeofnano一earriersrangesfrom10to500nm.Drugmoleeuleseouldbe encapsulatedintheearrierorabsorbedonthesurfaee.Safeandeffeetivetargeteddrug deliveryandgenetherapyeouldbeachievedbythecombinationoftargeting moleculeswiththesPeeificreeePtorsoneellsurfaeefollowedbyenieringintoeells viaeellularuPtake.InorganienanoPartielesenjoyingsuchadvantagesasbiosafety, high一efficacyandlowPrieehavebecomethehotsPotofnewdrug/genedelivery systemstudyinrecentyears.ThisPaperfoeusesontheeonstrUetionofnovel inorganienanoParticlesandtheinvestigationoftheirapPlieationindrug/genedeliv ery.
TherearemainlyfourPartsinthisthesis. PartOneResentAdvaneesontheAPPlieationofNano一SealedCarriersfor
Drug/GeneDelivery
ThisParthassummarizedtheresearchstatusofnano一sealeddrugandgene veetorsovertheworld,ineludingeharaeteristicsandnewPreParationteehnologyof nano一sealedvectors,advantagesofnanodrug一sustained一
releasesystem,elassification
andeharaeteristiesofgeneveetors,meritsofnonviralnanogenedeliverysystem,the apPlieationofnewnanoveetorsindrug/genedeliverysystem,andProgressofstudy onthree一dimensionalseaffoldbasedontissueengineeringandinducing
oriented一differentiationofseededchondroeyte.Theliteraturereviewhaslaida foundationforthedeveloPmentofsubsequentworkinthisstudy.
Partl!voNovelPorousSilieaNanoParticlesandtheAPPlieationinSustained DrugDelivery AnewPoroussilieananoPartielewithhighsolubilizationeffieientandlong一term sustained一releaseeffeethasbeenPreParedinthisstudybasedonnanoteclmology usingsilieaastheearriermaterialswhieh15biologicallysafe.Thewater一solubledrug
V
2新型无机纳米载住今鱼步匆壑些兰壑些些量蟹竺些1一一一一一silybinmeglumineandPoorlywater-solubledrugsilybinareemPloyedasmodel drugsresPeetivelytoinvestigatethePossibilityofthenovelPoroussiliea
nanoP叭ielestodeveloplong一tennsustainedreleasesystemfor72hofboth
water-solubleandPoorlywater-solubledrugs,which初
11ProvidePromisingfuturefor
thedeveloPmentofhigh一effieacyandlong一actingPreParationsafteroral administrationoneeevery3days.
1.DeveloPmentof72hlong一lastingandhigh一effieacyPreParationfor
water-solubledrugs.
几klngthewater-solubledrugsilybinmeglumine(SLBM)asthemodeldrugand PoroussilieananoPartielesasearriers,wePreParedSLBM一loadednanoP叭ieles (3d一SLBM).Theresultsofinvitroevaluationrevealedthattheamountofdruginthe d扭g一loadednanoPartieleswas29.46mg/50mg,thedrugloadingratewas
58.91土0.39%,andeneapsulatingratewas58.43士
0.62%.Theinvestigationofinvitro
dissolutionsho丫vedthatloweoneentrationsodiumcarbonatesolution认,asmost suitableforthereleaseofSLBMfrom3d一SLBM,withthe72haccumulativerelease rateover80%.FortheinvivoPharnnacokinetiesstudy,drugwasadministratedorally tobeagledogsandhighPerformaneeliquidcliromatography(HPLC)wasusedto determinethePlasmaeoneenirationinbeagledogs.Theresultsofinvivostudy demonstratedthattheTmaxof3d一SLBMwas24h,significantlyincreasedcomPared withthatofthereferencePreParation(Tmax0.5h).Furthermore,eomParedwiththe MRT7.3lhofthereferencePreParation,theMR月,of3d一SLBMwasnotieeably Prolongedto38,89h,revealinglong一lastingsustainedreleaseeharaeteristie. Additionally,therelativebioavailabilityofthefreedrugfrom3d一SLBMreaehed 803.99%.Interestingly,theinvitrodissolutionandinvivoabsorptionshowedagood eorrelation,that15,theinvivoabsorptionProfileeanberefleetedindireetlyfromth e
invitrodissolutionProfile.TheresultsofhePatieProteetionshowedthat
AsT(291.83士76.03Iu/L)andALT(774.92士223.85IU/L)levelintheplasmaofmice whichweregiven3d一SLBMweresignifieantlylowerthanthatofmieeinCC14treated grouP(AST:901.00士174.32IU/L,ALT:1997.58士335.08IU/L),withstatistieal signifieance(P<0.01).Alltheseresultsindicatedthat3d一SLBMPossessedhigh
VI江苏大学博士学位论文
bioavailabilityandexeellenthePatieProteetioneffeet.
2.DeveloPmentof72hlong一lastingandhigh一effieaeyPreParationforPoorly water-solubledrugs.
A3一dayreleaseformulationofsilybin(3d一SLB)withhigh一effieacy,long一acting,
andslow一releaseProPertieswasPreParedinthisstudybyeombineduseofsilybin soliddisPersion,silybinloadedsilieananoPartielesandslow一releasematrixmaterial.
SilybinwasemPloyedasthemodeldrug.Theresultofinvitroevaluation demonstratedthatSLBwasapttoreleasefrom3d一SLBinloweoneentrationsodium earbonatesolution,Withtheaeeumulatedreleaserateover80%.Theresultsofinvivo PharnnaeokinetiesresearehshowedthatTmaxof3d一SLBwas24h,whlehwasmueh laterthanthatofthereferencePreParation(Tmaxlh).TheMRTof3d一SLBwas32.15h, greatlyProlongedthantheMRT6.llhoftherefereneePreParation,indicatingthe long一
lastingsustainedreleaseProfile.Moreover,thebioavailabilityofthefreedrug releasedfrom3d一SLBreaehed458.98%;there15agoodcorrelationbetweenthein vitrodissolutionandinvivoabsorption,that15,theinvivoabsorptionProfileeanbe
refleetedindirectlyfromtheinvitrodissolutionProfile.Theresultsofdrugeffeet showedthatAST(149.90士28.14IU/L)andALT(843.33士169.18IU/L)levelsinthe Plasmaofmicewhiehwereadministered3d一SLBMweresignifieantlylowerthanthat ofmieeinCC14treatedgrouP(AST:901.00士174.32IU/L,ALT:1997.58士335.08
IU/L),withstatistiealsignifieanee(P<0.01).Alltheseresultsindieatedthat3d一SLB
PossessedhighbioavailabilityandexeellenthePaticProteetioneffeet. PartThreePreParationofGeneLoadedNanoPartielesandtheAPPlieationin GeneDelivery BiologieallysafeealciumPhosPhatenanoPartielesandPoroussilieananoParticles wereusedtoencapsulategenetoPrePareDNA一caleiumPhosPhatenanoPartielesand DNA一PoroussilicananoPartieles.PolysaccharidemodifiedDNA一ealeiumPhosPhate
nanoPartielesandealcium一ionizedDNA一PoroussilieananoPartieleswerealso suceessfullyPreParedbymodifieationofgene一
loadednanoPartieles.ThisPartfoeuses onthetransfeetioneffeetofthleekindsofnewgene一loadednanoPartieleson
V11
了新型无机纳米载体的构建及其药物噬因的高效传递研究mesenehymalstemeells,ineludingDNA一caleiuxnPhosPhatenanoPartieles, PolysaecharidemodifiedDNA一ealeiumPhosPhatenanoPartielesandcaleium一ionized
DNA一PoroussilieananoParticles.
1.PreParationofDNA一ealeiumPhosPhatenanoPartielesandtheaPPlication ingenedeliverytomesenchymalstemeells.
DNA一caleiumphosphatenanoPartieleswerepreparedbyreversemieroemulsion method,eharacterized,andapPliedintransfeetionofmesenehymalstemeells.The resultshowedthatthePartielesizeofDNA一ealciumPhosPhatenanoParticlesranged from20to50nm.AgarosegeleleetroPhoresisfoundthatcaleiumPhosPhate nanoPartieleseouldloadthemaximumamountofDNAwhentheweightratioof ealeiumPhosPhatetoPlasmid
nanoparticleswiththisweight
DNA152:1.Additionally,DNA一ealeium
ratioeouldeffeetivelyretardPlasmid
Plasmid
DNA
PhosPhate
migration.
Thedeterminationofliveeellimagingrevealedthatfreehadalmostno transfeetioneffectwithnostaininginthecells,indieatingthatfreeDNAeouldnot enterintocells.FortheDNA一ealeiumPhosPhatenanoPartielestransfeetedcells,a feweellswerestainedatZhPosttransfeetion.Withtimewentby,moreandmore exogenousgeneenteredintocells,demonstratingthatDNA一ealeiumPhosPhate https://www.doczj.com/doc/f04441166.html,sereonfoealfluoreseenee
mieroseoPydisPlayedthatnoredfloresceneewasobservedinthenucleiatZhPost transfeetion,indicatingthatDNA一ealciumPhosPhatenanoPartieleswerenotinnuclei
atthistime.At4hPosttransfeetion,therewasstillnoobviousredstaininginthe nuelei.AtshPosttransfeetion,afewDNA一ealeiumPhosPhatenanoPartielesshowed inthenuelei.At1shPosttransfeetion,obviousredflorescencewasobservedinnuclei, indieatingthatexogenousgenehadenteredintoeellswiththehelPofealeium PhosPhatenanoPartieles.Theresultsofbothliveeellimagingandlasereonfoeal fluoreseencemicroseoPyindieatedthatDNA一ealeiumPhosPhatenanoPartieleseould bePhagoeytosedbymesenehymalstemeells.CytotoxicitydeterminedbyMTTassay showedthatDNA一caleiumPhosPhatenanoPartieleshadlowercytotoxieitythan colnmereiallyavailabletransfeetionagentLIPofeetamineZ000(P<0.01).Theresulto f
ELISAtestrevealedthatDNA一ealciumPhosPhatenanoPartieleshadeomParable
Vlll江苏大学博士学位论文transfectioneffeetwithtransfeetionagentLIPofeetamine2000(P>0.05),whiehwas obviouslyhigherthanstandardealeiumPhosPhatetransfeetionageni(P<0.01). Altogether,DNA一ealciumPhosPhatenanoPartieleswithhightransfeetioneffieieney andloweytotoxieityeouldbedeveloPedinioakindofbiologieallysafenonviralgene VeCtof.
2.PreParationofPolysaccharidemodifiedDNA一ealeiumPhosPhate nanoPartielesandtheaPPlieationingenedeliverytomesenehymalstemeells. ModifiedbyPolysaeeharide,DNA一ealeiumPhosPhatenanoPartieleswere
emP10yedsuccessfullytoPreParePolysaeeharidemodifledDNA一ealciumPhosPhate nanoPartieles.PrimaryresearehhasbeenearriedoutaboutthetransPortationof PolysaeeharidemodifledDNA一ealeiumPhosPhatenanoPartielesinthenuelei. TransmissioneleetronmieroseoPydisPlayedthatthePolysaceharidemodifiedDNA- ealeiumPhosPhatenanoParticleswereofsPhericalshape,andthePartielesizewas about50nmwhiehwereuniformlydistributedwithinanarrowrange.Theresultof ELISAtestshowedthatPolysaeeharidemodifiedDNA一calciumPhosPhate nanoPartielesPossessedhighertransfeetioneffieieneyinmesene场malstemeellsthan
theeonllllereiallyusedLIPofeetamine2000.
3.PreParationandevaluationofealeium一ionizedDNA一Poroussiliea nanoPartieles.
Calcium一ionizedDNA一PoroussilieananoPartielesweresueeessfullyPrePared basedonthemodifieationofDNA一
PoroussilieananoParticles.Primaryinvestigation hasbeeneonduetedtostudythetransPortationofealeium一ionizedDNA一Poroussilica
nanoParticles
eleetroPhoresis
insidemesenehymalstemeells.Theresultofagarosegel
demonstratedthatealeium一ionizedDNA一Poroussiliea eouldbewellcombinedwithPlasmidDNAandretardDNAmigration.
nanoPartieles
However,the
unmodifiedDNA一PoroussilieananoPartieleshadaweakabilitytocombinePlasmid DNAandeouldnoteffeetivelyretardDNAmigration.TheresultofEDSrevealedthat ealciumioneouldeffectivelyeombinewithPoroussilieananoPartieles.Fluorescent mieroseoPyshowedthatealeium一ionizedDNA一PoroussilieananoParticleseould transfeetmoreeellsthanDNA一PoroussilicananoParticles,indieatingthat
IX
夕新型无机纳米载体的构建及其药物基因的高效传递研究
ealeium一ionizedDNA一PoroussilieananoParticlescouldbeakindofeffeetive nonviralgenevector.
PartFourConstruetionofThree一DimensionalNanoGeneDeliverySystem andItsAPPlieationintheDifferentiationofMesenehymalStemCells CombiningtheteehnologyofPreParingextraeellularmatrix(ECM)modified nanoPartielesandthxee一dimensionalscaffeldbasedontissueengineering:We eonstruetedanonviral3dimensionalnanogenedeliverysystem(3D一NGDS), FollowingECMingredientsasscaflbldmaterial,DNA一ealciumPhosPhate nanoPartieleswereencapsulatedinthlee一dimensionalseaffoldtofabrieate3D一NGDS,
andthecharacteristieswerethenevaluatedsuehasDNAreleasekineties,eelluPtake, genetransfectioneffieieney,MSCsdifferentiation.
1.Construetionandevaluationofthree一dimensionalnanogenedeliverysystem. ChoosingmaterialsBasedontheresultsofECMadhesionexPeriment,FNand
collagen(C),whiehPossessgoodadhesionandProliferationabilityonmesenehymal stemeells,athree一dimensionalsea且
bldwasPIeParedwitheollagen,FN,andehitosan.
3D一NGDSwasProducedbyeneapsulatingDNA一calciumPhosPhatenanoPartielesin scaffoldusingfreezedryingtechnique.TheresultsofitsPoresize,Porosityrate,wat er
absorptionrate,andwaterretainingrateshowedthatmostofthescaffoldPoresize wasabout100林minadditiontosomePoreswithlargerPoresize(>100林m):the waterabsorptionandwaterretainingabilitieswererelatedtotheProPortioningof seaffoldmaterials.Inaword,thethree一
dimensionalnanoseaffoldwasPorous,biosafe andsuitableforthegrowthofmesenchymalstemeells.
2.Genedeliveryviathethree一dimensionalnanogenedeliverysystem. ByusingProPidiumiodidetomarkgene,eellularuPtakeofexogenousgeneinthe
thlee一dimensionalsystemwasinvestigatedviaeombinedemPloymentofliveeell imagingandimmunohistoehemistry.TheDNAeontentsindifferentthree一dimensional ScaffoldsWeredeterminedbyPicogreenDyemethodatdifferenttimePoints.DNA aeeumulativereleaseeurvesindlft七refltsea伍〕ldsshowedthattheDNAaeeumulative
releaserateofDNAeneapsulatedthxee一dimensionalseaffoldwas33.4%at3d,and
X江苏大学博士学位论文
69.7%at21d;forfreeDNA一three一dimen污ionalseaflbld,theDNAaeeumulative releaseratewas87.7%at3d.Theresultindieatedthat3D一NGDShadgood
sustained一releaseeffeetonDNAdelivery.TGF一pleoncentrationexPressedbyeellsin
3D一GDSfromday3today15wasdeterminedbyELISA,andtheresultrevealed thatduringthePeriodofday3today15,theTGF一plProteinexPressionlevelcould mainiainatabout1ong/m1.Partieularly,theexPressionconeentrationatday6reaehed 12.6ng加1,whiehwassignifieantlyhigherthanthatofthetwo一dimensional transfectionsystem(P<0.01).ThisProteinexPressionlevelreachedtheeffeetive eoneentrationofTGF一plProteinnormallyaddedinmedium,showingobviouslyhigh effieiencyof3D一GDS.Mesenchymalstemeellsintwo一andthree一dimensional nanoseaffoldsat15daysPosttransfectionwereobservedbyGAGstainingandtyPeII collageninununohistoehemistrystaining,andtheresultsfoundthattheGAGstaining andtyPe11collagenimmunohistoehemistrystainingoftheeellseulturedin
two一dimensionalmonolayerconditionwereallnegative,whileforthemesenehymal stemeellsculturedin3D一NGDSfor
Iln们nunohistoehemistrystainingwere
15days,theGAGstainingandtyPe11eollagen
Positive.Theseresultsindieatethattheseeded cellshavesuccessfullydifferentiatedintoehondroey-tes,whicheouldseereteECM withehondrocyteeharaeteristics:tyPe11eollagenandGAG.Asakindofnewnonviral genedeliveryearrier,3D一NGDSeouldachievehigheffieientandlong一lasting exPressionofexogenousgeneintheseededcells,wlliehProvidedanewideaand teelmologyforthesubsequentstudyontissueengineeringandregenerativemedicine. Keywords:inorganienanoPartieleearrier,PoroussilieananoPartieles,caleium PhosPhatenanoParticles,drugdeliverysystem,genedeliverysystem,72hlong一aeting
andhigh一effieaeyoraldrugdeliverysystems,non一viralthree一dimensionalnanogene
deliverysystem,mesenehymalstemeells,tissueengineering
XI
lo新型无机纳米载体的构建及其药物冻因的高效传递研究
目录
第一章纳米载体在药物/基因传递中的应用研究进展......................................,,1
1纳米缓控释药物传递体系研究..........,,,.................................................,,1
1.1纳米药物载体的概况..,,,...............................................................,,1 1.2制备纳米粒的方法................................................................######### ###,,1
1.3纳米药物载体的优势........................,,,,........................................,,2 1.4载药纳米粒在缓控释给药系统中的应用........................................,,2
1.5展望......................................................................... ...........................,,3
2纳米制剂用于基因治疗.,,,,,,,,.,.,..,,..............,,,................................,,3
2.1基因治疗的概述.....................................................#.################## #######,,3
2.2理想基因转运载体的特征..............................,,,...........................,,4
2.3基因载体的研究概况.............................,,,..######!#######################,###,,4 2.
3.1病毒载体系统...........................................................#.############ #,,4
2.3,2非病毒载体系统...............................................#######################,,4 2.4纳米基因载体系统......................................################################### ###,,6
2.5纳米材料的选择,.,.,.,二,.,.........................,,,.,######,##########################,,6
2.6展望......................................................................... ...........................,,7
3组织工程软骨种子细胞的定向诱导分化..................................................,,8
3.1组织工程概述......................................................................... ..........,,8
3.2种子细胞定向诱导分化成软骨方法................................................,,8
3.3展望......................................................................... ....,,,..............,,10
第二章新型多孔二氧化硅纳米粒在药物传递中的应用研究.,,,................,,n
1水溶性药物72h高效长效新制剂的研制...............................................,,H
1.13d一SLBM的制备及体外质量评价...................,,,........................,,11
1.1.1实验材料......................................................................... .......,,n
1.1.2实验方法......................................................................... .......,,12
1.1.3实验结果......................................................................... .......,,14
1.23d一SLBM的犬体内药动学评价...............................................,,,..,17
1.2.1实验材料......................................................................... ......,,17
1.2.2实验方法......................................................................... .......,,17
1.2.3实验结果......................................................................... .......,,18
1.33d一SLBM的药效学评价.................,,,..,,.,...............................,,21
1.3.1实验材料......................................................................... ........,,21
1.3.2实验方法....................,,,..,,.,..,,.,.,......,,,.,...,,,二,,,22 1.3.3实验结果..............,,,..,,.................................................... ,,23江苏大学博士学位论文
2难溶性药物72h高效长效新制剂的研制...............................................,,24
2.13d一SLB的制备及药动学研究..........................................................,,24
2.1.1实验材料......................................................................... .......,,24
2.1.2实验方法......................................................................... .......,,25
2.1.3实验结果......................................................................... .......,,26
2.23d一SLB的药效评价...............................................................,,,....,,2
8
2.2.1实验材料......................................................................... .......,,28
2.2.2实验方法......................................................................... .......,,28
2.2.3实验结果..........................,,,.........................................### ###,,29
3小结......................................................................... ...................................,,30
第三章载基因纳米粒的制备及其基因传递的应用研究.,,............................,,32
1DNA一磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞中的传递研究...........................,,32
1.1实验材料......................................................................... .................,,犯
1.1.1主要试剂......................................................................... .......,,32
1.1.2主要仪器......................................................................... .......,,33
1.1.3主要试剂的配制.................,,,............................................,,33
1.2实验方法......................................................................... .................,,34
1.2.1质粒DNA制备与纯化.........................,,,.,........................,,34
1.2.2酶切鉴定......................................................................... .......,,34
1.2.3DNA一磷酸钙纳米粒的制备...................................................,,34
1.2.4细胞培养......................................................................... .......,,34
1.2.5纳米粒与质粒的结合............................................................,,36
1.2.6二维纳米基因传递系统的研
究............................................,,36
1.2.7毒性评价......................................................................... .......,,36
1.2.8干细胞细胞转染....................................................................,,37 1.3实验结果......................................................................... .................,,37
1.3.1质粒提取结果........................................................................, ,37
1.3.2酶切实验结果........................................................................, ,37
1.3.3DNA一磷酸钙纳米粒的分离纯化...........................................,,38
1.3.4DNA一磷酸钙纳米粒的表征...................................................,,38
1.3.5干细胞培养时首次换液时间的确定....................................,,40新型无机纳叁越鲤业些三塾竺翌鱼竺燮丝一一一一一
1.3.6二维纳米基因传递系统的研究........................,,!............,,,40 1.3.7MTT结果,.............,,,.......................................,,,.........####, ,42
1.3.SDNA一磷酸钙纳米粒纳米粒转染干细胞结果.......................,,43
2多糖修饰DNA一磷酸钙纳米粒的的制备及其千细胞中的传递研究.....,,43
2.1实验材料.............,,,..,,,.,,................................................. ..........,,43
2.1.1主要试剂......................................................................... ........,,43
2.1.2仪器..................................,,,.................................... ...........,,44
2,2实验方法......................................................................... .................,,44
2.2.1多糖修饰的DNA一磷酸钙纳米粒的制备.............................,,44 2.2.2多糖修饰的DNA一磷酸钙纳米粒的表征.............................,,44 2.2.3细胞转染..,,....................,,,.............................................. ..,,44
2.2.4统计学处理......................................................................... ...,,44
2.3实验结果......................................................................... .................,,45
2.3.1制备流程.............................................................,,"......... ..,,45
2.3.2多糖修饰的DNA一磷酸钙纳米粒形态观察.........................,,45
2.3.3ELISA测定各组TGF一印表达水平......................................,,45
3钙离子化多孔二氧化硅纳米粒的的制备及其性能评价........................,,46 3.1实验材料......................................................................... .................,,46
3.1.1主要试剂......................................................................... .......,,46
3.1.2仪器......................................................................... ...............,,46
3.2实验方法......................................................................... .................,,46
3,2.1钙离子化DNA一PSNs的制备...............................................,,46
3.2.2钙离子化DNA一PSNs的表征...............................................,,46
3.2.3质粒结合实验........................................................................, ,46
3.2.4干细胞转染,,.....................................................................,,,二47
3.3结果与讨论......................................................................... .............,,47
4小结......................................................................... ...................................,,48
第四章三维纳米基因传递系统的构建及其在干细胞诱导分化中的应用研究,51
1三维纳米基因传递系统的构建及其性能评价.......................................,,51
1.1实验材料......................................................................... .................,,51
1.1.1主要试
剂...........................,,!........................................... ...,,51
1.1.2主要仪
器!...................................................,,,.................. ...,,51江苏大学博士学位论文
1.2实验方法......................................................................... .................,,51
1.2.13D一GDS的构建.........................................,,,...................,,51
1.2.23D一GDS的质量评价...........................................................,,53
1.3实验结果......................................................................... ..............,,,二53
1.3.1三种不同方法制备的支架比较.........................................,,,二53
1.3.23D一NGDS的表征...,,,.........................................................,,54
23D一GDS的基因转运研究.............................................,,,...................,,56 2.1实验材料......................................................................... .................,,56
2.1.1主要试剂......................................................................... .......,,56
2.1.2主要仪器......................................................................... .......,,56
2.2实验方法......................................................................... .................,,56
2.2.1DNA一磷酸钙纳米粒在支架中的转染........................,,,....,,56 2.2.23D一NGDS的基因转运研究...................................................,,57
2.3实验结果..................................,,,.......................,,,.......... ......,,,二59
2.3.13D一NGDS中干细胞的转染..,,,.......................................,,,
二59
2.3.23D一NGDS的基因转运研究...................................................,,60
2.3.3ECM勃附性能与基因转染效率之间的关系研究................,,62
2.3.43D一NGDS对DNA的缓释作用研究...........,,,...................,,63 2.3.53D一NGDS对软骨再生的促进作用研究............................,,,二63 3二维与三维纳米基因传递系统性能比较...........................................,,,二/
3.1转染效率的比较研究............................................,,,...................,,66 3.2对软骨的再生作用......................................................................... .,,67
4小结......................................................................... ...................................,,67
第五章全文总结......................................................................... ....................,,69
参考文献........................................................,,,.............. ............................,,73
致谢......................................................................... ........................................,,81
发表论文及专利.................................................,,,..................... ..................,,,二82
/丫江苏大学博士学位论文
第一章纳米载体在药物/基因传递中的应用研究进展
1纳米缓控释药物传递体系研究
1.1纳米药物载体的概况
纳米技术是一种新兴的科技,它的基本涵义是在纳米尺寸(10一9一10一,m)范围
内认识和改造自然,通过直接操作和安排原子!分子创制新物质"由于物理空间
的改变,物质的理化特性!生物学特性发生令人惊奇的变化,其在药学领域中的
应用,已成为本世纪崭新的前沿科学I-]"而纳米药物载体是指粒径大小在10一500 nIn的一类新型药物载体,可将药物治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表
面,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,
实现安全有效的靶向药物输送和基因治疗"纳米载体技术是纳米生物技术的重要
发展方向之一I2]"
纳米技术在医学中的应用主要有以下几方面:
l)纳米生物材料:具有自组装的纳米颗粒和其它类型的纳米材料可提高机
械性能和生物相容性"例如,利用纳米材料制作牙和骨骼包裹物或替代物;制作
带有生物激活信号分子的埋植材料用于刺激生物体,如刺激细胞生长或分化[3]"
2)药物载体:将纳米粒子用于提高治疗药物的生物利用率和延迟药物代谢
活性"例如碳纳米管l4]!多聚物纳米颗粒[5]!纳米枝状体l6]等"利用纳米颗粒或
者具有独特性能的纳米材料提高药物分子的药代动力学特征将会成为以纳米医
学为基础的新型药物传输体系"
3)医学诊断:基于纳米管!纳米线或者原子力显微镜产生的新型的生物传
感器用于临床医学诊断,目的就是提高检测灵敏度或者用于增强传统方式无法诊
断的病变"例如,超顺磁性的氧化铁颗粒作为MRI纳米颗粒造影剂可提供良好
的检测信号对比度和生物分布度I7],提高诊断效率"
4)纳米治疗:纳米尺度的颗粒或分子可以直接用于治疗疾病,由于它们自
身的结构具备独特的生物效果,从而区别于传统的化疗药物"
1.2制备纳米粒的方法
制备纳米粒的方法主要有降20]乳化聚合法!天然高分子聚合法!液中干燥法!
自动乳化/溶剂扩散法!超临界流体法!复乳法!溶剂挥发法等"由于制备过程
的不同,纳米粒可用于包裹亲水性药物或疏水性药物,适用于不同的给药途径,新型无机纳米载体的构建及其药物冻因的高效传递研究
如静脉注射的靶向作用,肌肉皮下注射的缓释作用"
1.3纳米药物载体的优势
纳米控释系统的药物释放机理,可能是药物通过囊壁沥滤!渗透和扩散出来,
也可能是基质本身的溶蚀而使其中的药物释放出来"因此,纳米微粒在药物输送
方面具有许多优越性121一35]:可使药物作用具有靶向性;可缓释药物,从而延长
药物半衰期;可在保证药物作用的前提下,减少给药剂量,从而减轻或避免毒副
反应;可提高药物的稳定性,保护药物使其免受体内各种酶类的降解等"它为临
床各种疾病的治疗提供了理想的药物和手段"
1.4载药纳米粒在缓控释给药系统中的应用
目前,缓控释给药系统从传统的O,1级释药系统向对疾病发作更具针对性
的定时!定位!自调式释药系统转变"口服定时释药系统即脉冲式给药系统,是
根据疾病发作的时间规律及药物治疗时辰药理学特性设计给药时间和剂量方案,
并选用合适剂型开发的给药系统"近年来有越来越多的缓释!控释制剂上市,其
中多为口服制剂,而这些口服缓释!控释制剂存在易受食物!同服药物及肝首过
效应的影响而使释药曲线不稳定;缓释时间较短,一般不超过24hr等不足"因
而一些在胃肠道内不稳定!需长期给药的药物就有必要开发非胃肠道给药制剂,
以获得更稳定!更长效的缓释控释制剂"
载药纳米粒可作为异物而被巨噬细胞吞噬[36那],到达网状内皮系统分布集中
的肝!脾!肺!骨髓!淋巴等靶部位"调整载体材料的种类或配比可调整药物的
释放速度,可以制备出具有缓释特性的载药纳米粒"由于载药纳米粒表面的豁附
性及小的粒径,既有利于局部用药时滞留性的增加,也有利于增加药物与肠壁的
接触时间及接触面积,提高药物口服吸收的生物利用度;载药纳米粒可以改变膜
转运机制,增加药物对生物膜的透过性,有利于药物透皮吸收与细胞内药效的发
挥,因而载药纳米粒主要用于靶向!缓释及提高口服!眼用!透皮给药的生物利
用度等方向"
纳米技术在生物医学与生物工程方面的应用越来越广泛,与有机纳米粒及生
物可降解聚合物相比,无机纳米材料在大小!形状控制及表面功能化方面具有相
当的优势"无机纳米粒的纳米医学应用研究正引起人们极大的兴趣"纳米管!纳
米壳和中空多孔纳米粒,由于其中空及多孔结构,以及表面易功能化等特点而成江苏大
学博士学位论文
为极有吸引力的药物/基因载体"纳米粒的内部空间可以容纳大量的药物,其孔
的开放端则成为控制药物/基因释放的通路"
近年来,具有特殊结构和特殊形貌的纳米材料研究备受关注,其中研究最活
跃的有中空球壳纳米材料(honownanosPheres,HNP)"空心纳米材料具有低密
度!高比表面积!高的稳定性和表面渗透性的特点,同时其空心部分可以容纳大
量的客体分子或大尺寸客体,从而产生一些奇特的基于微观/封装0!/包裹0效
应的性质,使其在医药!化学!材料科学领域具有极其广泛的应用前景[4l]"本
文依据现有文献及预实验基础,制备了多孔二氧化硅纳米粒并将其应用于药物的
体内外释药研究,研究结果表明载药硅纳米粒能够在72h内平稳释药"
1.5展望
纳米药物载体的研究方向是向智能化进行,研究制备纳米级载体与具有特异
性的药物相结合以得到具有自动靶向和定量定时释药的纳米智能药物,以解决重
大疾病的诊断和治疗[42]"
纳米生物技术是一门新的交叉学科,为研究!改造生物分子结构和进行医学
治疗提供了新的手段和思维方式,而纳米药物载体技术在医药领域的发展前景更
为广阔,相信纳米药物载体将在人类重大疾病的诊断!治疗!预防等方面发挥重
大的作用[43]"
2纳米制剂用于基因治疗
2.1基因治疗的概述
所谓基因治疗(GeneTherapy),是以改变人的遗传物质为基础的生物学治疗,
是指将人体正常基因或者有治疗作用的基因通过一定的方式导入人体靶细胞以
纠正基因的缺陷或发挥治疗作用,从而达到治疗疾病目的的治疗方法"基因治疗
的对象主要是那些严重威胁人类生命健康和生活质量的疾病,如遗传病!肿瘤和
病毒性疾病等"它是伴随着基因工程技术和分子生物学的发展而逐渐形成的一种
新型/分子治疗0手段"
虽然近年来基因治疗取得了很大发展,但当前基因治疗研究中仍存在很多技
术性的难题,其中之一就是治疗基因的有效传输,由于治疗基因(包括DNA!RNA
以及反义寡核甘酸)容易在传输的过程中被血液!组织或者胞浆中的酶类所降解,
生物半衰期很短"而且,治疗基因是高度亲水的大分子物质,在生理条件下带有新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究
较强的负电性,因此难以穿透细胞膜进入靶细胞"随着基因治疗研究的不断深入,
人们愈来愈认识到选择恰当的载体,使目的基因靶向!可控并有效的表达,是基
因治疗成功的关键所在[44l"
2.2理想基因转运载体的特征
既然基因载体是基因治疗成功的关键因素,那么理想的基因载体应该具有以
下特征:安全性高且稳定性好;无免疫原性;目的基因的持续表达;组织靶向性;
转载容量;感染分裂期细胞和未分裂期细胞;具有良好的复制!分裂和整合能力"
理想的基因载体能够将治疗基因特异地整合入靶细胞染色体的某个位置,或者以
游离的形式存在细胞核中,严格随着细胞分裂而分裂"易于生产,成本低"
2.3基因载体的研究概况
无论在基因表达调控,还是在基因治疗研究方面,基因传递系统(genedelivery systems,GDS)都起着非常重要的作用"常用的GDs通常包括病毒及非病毒两大
类"
2.3.1病毒载体系统
病毒载体是将外源基因包装到天然病毒的外壳中,利用病毒对宿主细胞的感
染性将外源基因导入细胞中"目前常用的病毒载体有逆转录病毒(retrovirus,RV), 腺病毒(adenovirus,刀),腺相关病毒(adeno一assoeiatedvirus,A脚),疤疹病毒(he印essimplexvirus,HSv),慢病毒(lentivirus)等"虽然病毒型GDS转染效率高, 但由于该系统存在自身局限性,如[#5一]:能诱导宿主免疫反应!具有潜在的致瘤
性!装载容量有限!代价高等,特别是1999年基因治疗临床试验中,出现首例
运用腺病毒载体致人死亡的严重后果,其安全性问题迫使人们对病毒型GDS的
选择持更为谨慎的态度"应用病毒载体(如反转录病毒!腺病毒)进行体内肿瘤基
因治疗时,除直接注射到瘤体外,如果采用静脉给药,由于其不具有靶向性,因
此在肿瘤中的分布极低,很难达到治疗作用"另外[49]病毒载体容量有限;制备
滴度不高;生产成本昂贵等也在一定程度上限制了它的临床应用"
2.3.2非病毒载体系统
非病毒载体是一种新型的基因载体系统,尽管其基因转染效率仍不及病毒载
体,然而其具有病毒载体无法比拟的诸多优点[50#.->,如:低毒!低免疫原性!
外源基因整合概率低!无基因插入片段大小限制!使用简单!制备方便!易于生
产!便于保存和检验等"目前,在严格控制病毒型GDS临床应用的同时,人们江苏大学博士学位论文
把注意力和希望逐步转向非病毒GDS的研究和应用"非病毒型基因载体主要是
将治疗基因表达载体一质粒基因印lasmidDNA,pDNA)递送到细胞内,质粒调
控基因表达,基因表达产物发挥治疗作用"目前常用的非病毒基因载体主要包括
裸DNA!脂质体!阳离子多聚物和纳米基因载体等"
裸DNA注射法是将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射于病变
的组织而不依赖其它物质的介导,是最简单的非病毒载体输送系统"但是由于裸
DNA直接暴露在血清中,存在被血清中核酶降解的可能,因此基因转移率较低,
不稳定,需大剂量多次给药152]"另外虽然将裸DNA直接用于病变组织是可行的
基因转移策略,但是,对于解剖学上不能进入的部位,如器官里的实体瘤,显然
给予裸DNA是无效的,目前只在肌肉和皮肤中可以进行直接的局部裸DNA注
射[53]"
自从1987年Felgne等率先应用脂质体作为基因转移载体以来,相继合成了
许多阳离子脂质,并且至今己有多种商品化阳离子脂质体转染试剂[54l问世"然
而,尽管目前普遍使用的阳离子脂质体在体外不含血清介质中具有较高的转染效
率,但其体内应用的效果不甚理想,其主要原因是阳离子脂质体容易与血浆中多
种成分如血浆蛋白(如白蛋白)结合生成聚集体[55],从而难以进入细胞,并且这种
聚集体在脉管系统的循环能力很差,容易聚集在肺部引起肺栓塞等"另有体外试
验研究证实阳离子磷脂/DNA复合物有明显的细胞毒性156一59],而且脂质体中所载基因容易泄漏,半衰期短,缺乏细胞和组织靶向性等[60l"因此,传统的脂质体
作为基因载体仍存在一定的局限性,距理想的基因载体尚存在差距"
阳离子聚合物是另外一种颇有前景的非病毒基因载体,具有许多病毒载体无
可比拟的优势"常用的阳离子聚合物载体包括:左旋赖氨酸(L一PLL)!聚乙烯亚
胺(PEI)!多胺树突状多聚物(PAMAM)等16.]"但阳离子多聚物是非生物可降解材
料,尤其在反复给药后这些材料会积聚于体内可能会引发毒性反应"而且,研究
发现阳离子聚合物所携带的正电荷会破坏细胞的膜结构,对于血细胞而言会产生
溶血现象[62],且聚合物的分子量越高,电荷量越大,毒性也越大[63];而分子量
纳米药物载体构建哪家好 纳米药物载体构建哪家好？这是大家想了解的问题。纳米级药物载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。可以将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。先丰纳米推出的纳米药物载体构建服务可以很好满足客户的需求。下面就简单的介绍纳米药物载体构建。 客户可以选择上述载体递送药物，从而实现药物递送研究。这些纳米药物载体可以借助肿瘤EPR（增强的渗透于滞留）效应实现肿瘤靶向给药，同时还可以在表面修饰靶向配体而实现主动靶向递送，还可以结合成像单元构建具有靶向诊疗一体化功能的纳米药物。 基于高分子材料的纳米药物载体构建，如：脂质体载药，聚合物胶束载药，聚合物（蛋白）纳米粒载药，磁性脂质纳米颗粒载药，纳米颗粒（球形颗粒、金纳米棒、金纳米笼）载药，纳米石墨烯载药等。 脂质体、聚合物胶束与聚合物纳米粒载药体系
案例：磁性脂质纳米颗粒药物递送 如果想要了解给更多关于纳米药物载体构建的内容，欢迎立即咨询先丰纳米公司。 先丰纳米是江苏先进纳米材料制造商和技术服务商，专注于石墨烯、类石墨烯、碳纳 米管、分子筛、黑磷、银纳米线等发展方向，现拥有石墨烯粉体、石墨烯浆料和石墨烯膜 完整生产线。 自2009年成立以来一直在科研和工业两个方面为客户提供完善服务。科研客户超过 一万家，工业客户超过两百家。 南京先丰纳米材料科技有限公司2009年9月注册于南京大学国家大学科技园内，现 专注于石墨烯、类石墨烯、碳纳米管、分子筛、银纳米线等发展方向，立志做先进材料及 技术提供商。 2016年公司一期投资5000万在南京江北新区浦口开发区成立“江苏先丰纳米材料科技有限公司”，建筑面积近4000平方，形成了运营、研发、中试、生产全流程先进纳米 材料制造和技术服务中心。现拥有石墨烯粉体、石墨烯浆料和石墨烯膜完整生产线，2017年年产高品质石墨烯粉末50吨，石墨烯浆料1000吨。 欢迎广大客户和各界朋友莅临我司指导！欢迎电话咨询或者登陆我们的官网进行查看。
纳米药物载体构建厂家 纳米药物载体构建厂家哪个好？纳米级药物载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒 药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。先丰纳米作为专业的纳米药物载体构建厂家，下 面就简单的介绍纳米药物载体构建服务。 基于高分子材料的纳米药物载体构建，如：脂质体载药，聚合物胶束载药，聚合物（蛋白）纳米粒载药，磁性脂质纳米颗粒载药，纳米颗粒（球形颗粒、金纳米棒、金纳米笼）载药，纳米石墨烯载药等。 客户可以选择上述载体递送药物，从而实现药物递送研究。这些纳米药物载体可以借 助肿瘤EPR（增强的渗透于滞留）效应实现肿瘤靶向给药，同时还可以在表面修饰靶向配体而实现主动靶向递送，还可以结合成像单元构建具有靶向诊疗一体化功能的纳米药物。 纳米药物载体可经过血液循环进入毛细血管，还可透过内皮细胞间隙，进入病灶，被 细胞以胞饮的方式吸收，实现靶向用药，提高了药物的生物利用率。 纳米载体粒径较小，拥有较高的比表面，可以包埋疏水性药物，提高其溶解性，减少 常规用药中助溶剂的副作用。 纳米药物载体经靶向基团修饰后可实现靶向药物给药，可减少用药剂量，降低其副作用，如叶酸修饰载药纳米粒、磁性载药纳米粒等。 纳米载体可延长药物的消除半衰期（t1/2β），提高有效血药浓度时间，提高药效， 降低用药频率，减少其毒副作用。 纳米载体可透过机体屏障对药物作用的限制，如血脑屏障、血眼屏障及细胞生物膜屏 障等，使药物到达病灶，提高药效。
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纳米药物载体的制备与药物缓释 廖凡 PB12206262 摘要： 根据已有知识设计了共聚物的结构，合成路线，合成步骤和实验方案，综合表征分析方法，确定了聚合条件和产品性能。 前言： 一般的给药方式，使人体内的药物浓度只能维持较短的时间，血液中或是体内组织中的药物浓度上下波动较大，有时超过病人的药物最高耐受剂量，有时又低于有效剂量，这样不但起不到应有的疗效，而且还可能产生副作用。频繁的小剂量给药可以调节血药浓度，避免上述现象，但往往使患者难以接受，实施起来有很多困难。因此，制备能够缓慢释放药物成分的缓释性长效药品在治疗中经常是非常需要的。要制备缓释长效药品，关键是要制备能使被承载的药物缓慢释放的载体材料。 温敏性水凝胶是一种亲水的聚合物网络，对其大量的研究发现，其在凝胶形成过程中不涉及化学反应，分子链间的交联通过分子间相互作用力(范德华力、疏水相互作用及氢键等)形成。通过改变温度就可以影响并改变这些疏水相互作用以及氢键作用，在水中经过简单的可逆性相转变(溶胶一凝胶) 即可形成水凝胶．因此温敏性水凝胶的制备过程更为简单，且不需要有机溶剂，将更有利于药物的传递。目前一些研究表明，温敏性PLGA／PEG水凝胶具有比较理想的凝胶特性，可在温度低于30 ℃时装载药物，在体温条件下发生溶胶一凝胶相变，并由于其良好的生物可降解性和安全性而受到广泛的关注。但这种给药体系仍存在一些尚未解决的问题，如载药时须在较低温度下操作，且药物的缓释周期较短(仅为7 d)，给临床应用带来了不便和局限。另外，从材料角度看，提高疏水的PLGA 嵌段长度会引起蛋白药物的聚集。众所周知，聚己内酯(PCL)是一种被广泛研究的可生物降解的结晶聚合物，共聚物可呈粉末状形态，相比于其它材料在临床使
纳米药物载体技术 用纳米粒子作为药物载体可实现靶向输送、缓释给药的目的, 这是由于小粒子可以进入很多大粒子难以进入的人体器官组织, 如小于50nm 的粒子就能穿过肝脏皮或通过淋巴传送到脾和骨髓, 也可能到达肿瘤组织。另外纳米粒子能越过许多生物屏障到达病灶部位, 如透过血脑屏障( BBB) 把药物送到脑部, 通过口服给药可使药物在淋巴结中富集等。具有生物活性的大分子药物( 如多肽、蛋白类药物) 很难越过生物屏障, 用纳米粒子作为载体可克服这一困难, 并提高其在体输送过程中的稳定性。用纳米粒子实现基因非病毒转染, 是输送基因药物的有效途径。 药物既可以通过物理包埋也可以通过化学键合的方式结合到聚合物纳米粒子中。载有药物的聚合物纳米粒子通常以胶体分散体的形式通过口服、经皮、皮下及肌肉注射、动脉注射、静脉点滴和体腔黏膜吸附等给药方式进入人体。制备聚合物纳米粒子的方法主要有以下几种: ( 1) 单体聚合形成聚合物纳米粒子; ( 2) 聚合物后分散形成纳米粒子; ( 3) 结构规整的两亲性聚合物在水介质中自组装形成纳米粒子。 1 单体聚合制备的聚合物纳米粒子 聚氰基丙烯酸烷基酯( PACA) 在人体极易生物降解, 且对许多组织具有生物相容性。制备聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒子采用的是阴离子引发的乳液聚合方法, 通常以OH-为引发剂, 反应一般在酸性水介质中进行, 常用的乳化剂有葡聚糖、乙二醇与丙二醇的嵌段共聚物和聚山梨酸酯等, 具体制备过程见图1。当反应介质pH 值偏高时, OH-浓度大, 反应速度快, 形成的PACA 分子量低, 以此作为给药载体材料进入人体后, 降解速度太快, 不利于药物缓释。因此聚合反应介质的pH 值通常控制在1.0~ 3.5 围。
近日，东南大学研究者在实验视频期刊发表了文章。视频展示了关于聚乙烯亚胺包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒制备及其作为载体进行靶向递送siRNA到巨噬细胞的研究工作。 这是该研究团队继2014年发表文章之后，通过实验视频的方式向广大科研工作者介绍基于磁性纳米颗粒的基因转染和递送研究。 研究背景 由于巨噬细胞在调节免疫反应方面的重要作用，巨噬细胞一直是研究的热点，并在许多疾病中，如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症中，成为一个有希望的治疗靶点。 RNAi介导的基因沉默是探索和调控巨噬细胞功能的一种有价值的方法; 然而，用siRNA转染巨噬细胞通常被认为在技术上非常具有挑战，目前很少有专门研究siRNA转染到巨噬细胞的方法。 这里，我们提出了一种使用聚乙烯亚胺包覆的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（PEI-SPIO）作为载体进行靶向递送siRNA到巨噬细胞的方案。 具体方案
当Fe: siRNA重量比达到4及以上时，PEI-SPIO能够结合siRNA并完全浓聚siRNA。在体外，这些纳米颗粒可以有效地将siRNA递送到原始巨噬细胞，以及类似巨噬细胞的264.7细胞系中，并且在较佳转染剂量下不影响细胞活力，最终诱导siRNA介导的靶基因沉默。 PEI-SPIO除了用于体外siRNA转染外，也是一种很有前途的将siRNA递送到体内巨噬细胞的工具。 鉴于PEI-SPIO/siRNA颗粒复合的磁性和基因沉默能力，系统地应用PEI-SPIO/siRNA颗粒不仅可以调节巨噬细胞的功能，还可以实现巨噬细胞的成像和跟踪。 从本质上讲，PEI-SPIO是一个简单、安全、有效的非病毒平台，可以在体内和体外实现巨噬细胞的siRNA递送。 对大鼠关节炎的治疗效果 在先前的研究工作中，同样以PEI-SPIO纳米颗粒为载体，研究靶向IL-15受体β亚基（IL-15Rβ）的siRNA对佐剂型关节炎（AA）大鼠在体治疗效果。 ●PEI-SPIO纳米颗粒与siRNA在Fe: siRNA质量比≥4时可紧密结合， 普鲁士蓝染色和流式检测结果表明PEI-SPIO/siRNA 纳米颗粒可以被巨噬细胞有效摄取。 ●MTS实验说明PEI-SPIO/siRNA 纳米颗粒在0~100 μg Fe/mL范 围内不具有细胞毒性。 ●血清稳定性实验说明PEI-SPIO纳米颗粒确实可保护siRNA不被降 解。
纳米药物载体系统 年级: 2012级 专业: 材料科学与工程 姓名: 俞 学号: 3**
摘要: 着科技的发展，纳米生物技术越来越受到关注，物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景，特别是纳米药物载体、纳米生物传感器和成像技术以及微型智能化医疗器械等，将在疾病的诊断、治疗和卫生保健方面发挥重要作用。本文着重介绍纳米药物载体系统。纳米药物载体的属性纳米药物载体种类纳米药物载体的制备方法及纳米生物技术的发展前景。 关键词：纳米生物技术纳米药物载体纳米粒子 纳米技术是一种新兴的科技,它的基本涵义是在纳米尺寸(10-9~10-7m)范围内认识和改造自然,通过直接操作和安排原子、分子创制新物质。由于物理空间的改变,物质的理化特性、生物学特性发生令人惊奇的变化,其在药学领域中的应用,已成为本世纪崭新的前沿科学[1] 纳米药物载体是指粒径大小在10~1000nm的一类新型载体,通常由天然或合成高分子材料制成。它是以纳米颗粒作为药物载体,将药物治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向药物输送和基因治疗。纳米 载体技术是纳米生物技术的重要发展方向之一[2] 一、纳米药物载体的性质 作为药物载体的纳米材料，是粒径大小介于10~1000nm的固态胶体颗粒，包括纳米粒子、纳米囊、纳米胶束和纳米乳剂等。 其中较常见的是纳米粒子，一般指由天然或合成的高分子材料制成的、粒度在纳米级的固态胶体颗粒。 纳米粒子表面的亲水性与亲脂性将影响纳米粒子与调理蛋白吸附结合力的大小，从而影响吞噬细胞对其吞噬的快慢。一般而言，纳米粒子的表面亲脂性越大，则其对调理蛋白的结合力越强，吞噬细胞对其吞噬的速度越快。所以要延长纳米粒子在体内的循环时间，需增加其表面的亲水性，这是对纳米粒子进行表面修饰时选择材料的一个必要条件[3] 二、纳米药物载体的属性 1 具有较高的载药量 2 具有较高的包封率
第29卷第2期济宁医学院学报2006年6月Vol129,No12JOURNAL OF JINING MEDICAL COLLEGE Jun,2006 纳米药物载体在医药领域中的研究进展 钱倩综述王伯瑶审校 (四川大学基础医学与法医学院基础医学系) 纳米本身是个长度单位,1nm等于10-9m,纳米颗粒的粒径比毛细血管通路还要小12个数量级。当一种物质被不断切割至一定程度,其粒子小至纳米量级即为纳米材料。纳米材料往往会产生一些新的理化特性,正是这些特有的特性,使其在药物和基因输送方面有许多优越性:1许多半衰期短的药物可能需要每天重复给药多次,制备成缓释药物后,将极大延长药物作用时间o能解决口服易水解药物的给药途径问题,大大降低药物与胃蛋白酶等消化酶接触的机会?可进行靶向给药:纳米载体经特殊加工后可达到靶向输送的目的,更加准确地对准组织或器官,减少药物对人体的不良反应?载药纳米粒可以改变膜转运机制,增加药物对生物膜的透过性,有利于药物透皮吸收与细胞内药物发挥?可在保证药物作用的前提下,减少给药剂量,减少药物的副作用?可消除特殊生物屏障对药物作用的阻碍?能携带多种化学药物à载体及其生物学降解产物易被消除。 纳米药物载体在医药领域的应用极为广泛,提高药物的利用率疗效和减少药物的副作用已成为医药研究领域的一项重要课题。一种理想的纳米药物载体应具备以下特征:1具有较高的载药量,>30%o具有较高的包封率,>80%?制备和纯化方法简便,容易放大至工业化生产?载体材料可生物降解,毒性较低或没有毒性?具有适当的粒径与粒型?具有较长的体内循环时间。 1纳米药物的种类 111纳米粒 纳米囊和纳米球统称为纳米粒(nanopar ticles),是直径为10-1000nm的一类聚合物胶体系统,纳米球有高分子基质骨架,药物分散其中。纳米囊由高分子材料形成的外壳和液状(水或油状)内核构成,药物通常被聚合物膜包封在内核层[1]。理想的纳米粒载体是无毒和可生物降解的,纳米粒的特异靶向性使药物和靶基因被定向释放出来,载体则被生物降解,避免在转运过程中在其他组织释放,产生副作用或过早被灭活。用于纳米粒载体研究的生物可降解聚合物主要有合成聚合物如:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸共聚乙醇酸(PL-GA)以及天然高分子材料,如普鲁兰、壳聚糖、明胶、海藻酸钠以及其他亲水性生物可降解聚合物[2]。 参考文献 11程雪梅,边旭明,郎景和,等.妊娠期宫颈涂片细胞学检查.中国医学科学院学报,2000,22(2):174 21Palle C,B angsboll S,Andreas son B.Cervical intraepithelial neoplasia i n pregnan cy.Acta Obstet Gynecol Scand,2000,79(4):306 31Bristow RE,F.J.Montz1Cervical cancer i n pregnancy.Lippi ncott Willi ams and Wi lkins,19991157~175 41Nobbenhuis MAE,Helmerhorst TJM,van-den-B rule AJC,et al. High-risk human papill omavirus clearance in pregnant women: trends for lower clearance during pregnancy with a catch-up post2 partum..B r J Cancer,2002,87(1):75 51Arena S,Marconi M,Ubertosi M,et al.H PV and pregnancy:diagnos2 tic methods,transmission and evoluti on.Minerva Ginecol,2002,54 (3):225 61Si lverberg MJ,Thorsen MP,Lindeberg H,et al.Condyloma i n preg2 nancy is strongly predictive of juvenile onset recurrent respiratory pa2 pillomatosis.Obstet Gyn ecol,2003,101(4):645 71邓东锐,闻良珍,凌霞珍.亚临床型人乳头瘤病毒感染垂直传播途径的研究.中国实用妇科与产科杂志,2005,21(1):45 81Mikhail MS;Anyaegbunam A;Romney https://www.doczj.com/doc/f04441166.html,puteried colposcopy and conservative managem ent of cervical intraepi theli al n eoplasia i n pregnan cy.Obstet Gynecol Survey,1996,51(3):169 91Baldauf JJ;Dreyfus M;Ritter J.et al.Benefits and ri sks of directed biopsy in pregnancy.Obstet Gynecol Survey,1998,53(2):81 101郎景和.子宫颈上皮内瘤变的诊断与治疗.中华妇产科杂志, 2001,36(5):261 111Richard RM,Barron B A.A follow-up study of patients with cervi2 cal dysplasia.Am J Obstet Gynecol,1969,105:386121David A,Van Nos trand KM,Nguyen NJ,et al.T he effect of rout of deli very on regression of abnormal cervical cytology fi n dings in the postpartum period.Am J Obstet Gynecol,1998,178(6):1116 131Paraskevaidis E;Koliopoulos G;Kalantaridou S;et al.Management and evoluti on of cervical intraepitheli al neoplasia during pregnancy and pos tpartum.Eur J Obstet Gynecol Reprod Bi ol,2002,104(1): 67 141Howard MJIII.Pos tpartum evoluation of cervical squamous i ntraep2 ithelial lesions wi th respect to the route of delivery.Obs tet Gyn ecol Survey,2003,58(2):109 151Vlahos G;Rodolakis A;Di akomanolis E;et al.Conservative manage2 ment of cervical intraepith elial neoplasia(CIN(2-3))i n pregnant women.Gynecol Obstet Invest,2002,54(2):78 161Murta EFC;de-Souza FH C;de-Souza MAH,et al.High-grade cervi cal squamous intraepithelial lesion during pregnancy.Tumori, 2002,88(3):246 171Gentry DJ,B uggish MS,Brady K,et al.The effect of loop ex i sion of the transformation zone on cervical length:i m plication for pregnan2 cy.Am J Obstet Gynecol,2000,182(3):516 181Robinson WR,Webb S,Tirpack J.et al.Managem ent of cervical i n2 traepithelial neoplasia duri ng pregnancy wi th loop exision.Gyn ecol Oncol,1997,64:153 191M i tsuhashi A,Sekiya S.Loop electrosurgical excision procedure (LEEP)during first trimester of pregnancy.Int J Gynecol Obstet, 2000,71:237 201Dunn TS,Ginsburg V,Wolf D.Loop-cone cerclage in pregnancy:a 5-year review.Gynecol Oncol,2003,90:577 (收稿日期2006-04-20) # 82 #
纳米粒子在药物载体中的应用
纳米粒子在药物载体的研究进展 摘要：:纳米粒子作为一种新型的药物载体, 由于它的超微小体积, 能穿过组织间隙并被细胞吸收, 通过人体最细的毛细血管, 还可透过血脑屏障, 显现出极大的潜力并被广泛研究, 具有广阔的发展前景。本文从不同分类的纳米粒子着手，综述其在药物载体中的应用. 关键词：纳米粒子、药物载体、控制释放 纳米粒子( nanoparticle) 也叫超微粒子，尺寸在1—1 000 nm 之间，通常由天然或合成高分子材料制成，目前无机材料也研究得比较多。主要通过静电吸附、共价连接将药物结合在其表面，或者直接将药物分子包裹在其中，然后通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向药物输送和基因治疗。纳米控释系统作为独特的药物新剂型得到越来越广泛的关注。本文通过从不同类别的纳米粒子着手综述对其在药物载体中的应用。 1、有机纳米粒 纳米粒使用的载体材料目前多为天然或者合成的可降解的高分子化合物。天然高分子及其衍生物可分为蛋白类（白蛋白、明胶和植物蛋白）和多糖类（纤维素和淀粉及其衍生物、海藻酸盐、壳聚糖等）。合成高分子主要有聚乳酸、聚己类酯等。 1.1天然化合物 1.1.1环糊精 环糊精是一种来自于淀粉的环状材料，其结构是葡萄糖单体通过1,4α连接的环状分子。在水相中，通过分子内氢键作用形成稳定的桶状结构，外围是亲水性表层而易溶于水溶液中，内部是疏水性的空腔，可以有效地包含疏水性的小分子，而形成主客体作用(环糊精称为主体，包含的小分子称为客体，这种通过疏水性作用的结合成为主客体作用)。李媛[1]等采用α-环糊精（α-CD）穿入两端带有可光交联基团的改性PEG链形成包含复合物，通过疏水性端基的自组装形成纳米粒子，并将抗肿瘤药物阿霉素负载到纳米粒子中，结果显示超分子纳米粒子具有很好的生物相容性和药物缓释作用，载药纳米粒子对肿瘤细胞具有很好的杀伤效果。 张先正等制备了由α-环糊精及其经马来酸酐改性的衍生物与聚(ε-己内酯)(PCL)通过主客体包合作用形成的超分子纳米胶束，并研究了这种胶束的药