作者信息：
第一作者：张红E-mail: pretty_zhang@https://www.doczj.com/doc/fa1665479.html,
通讯作者：王建东E-mail: wangjiandong79@https://www.doczj.com/doc/fa1665479.html,
基金项目：成都医学院基金CYZ11-007；四川省教育厅青年基金项目10ZB096
调节细胞自噬对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的影响
张红，刘湧，杨淑霞，张芹，刘进，王建东*
(成都医学院，四川成都 610083)
摘要：以鱼藤酮处理的PC12细胞为帕金森病体外模型，分别使用雷帕霉素作为自噬途径的促进剂，巴佛洛霉素A1和3-甲基腺嘌呤作为抑制剂，检测调节细胞自噬对细胞凋亡的影响，发现巴佛洛霉素A1极大提高了细胞凋亡率，3-甲基腺嘌呤则可以减轻鱼藤酮诱导的细胞凋亡，而雷帕霉素虽然促进受损细胞凋亡，但降低了受损细胞早期的死亡率。构建pEGFP-LC3稳定转染的PC12细胞，流式细胞检测结果显示，抑制或促进细胞自噬，细胞内自噬相关蛋白LC3均有明显增加。推测部分抑制细胞自噬，可以避免细胞受损诱导的过度自噬对细胞的损伤作用，而完全阻断细胞自噬则会引起细胞死亡。
关键词：帕金森病；自噬；鱼藤酮；PC12细胞
Effects of adjusting autophagy on rotenone induced PC12 cells damage ZHANG Hong, LIU Yong, Yang Shuxia, ZHANG Qin, LIU Jin, W ANG Jian-dong *
( ChengDu Medical College, ChengDu 610083, China)
Abstract: To detect the effects of adjusting autophagy on rotenone induced PC12 cells apoptosis, PC12 cells treated by rotenone were used as an in vitro model of Parkinson’s disease, and, using rapamycin as the autophagy enhancer, Bafilomycin A1 and 3-MA as inhibitor of autophagy. It was found that Bafilomycin A1 greatly increased the apoptosis of cells，and 3-MA reduced the apoptosis of rotenone-induced cells, and rapamycin may contribute to impaired apoptosis, but reduce the damaged cells in early mortality. Construction PC12 cells of stably transfected pEGFP-LC3, flow cytometry results show, inhibit or promote autophagy, cell autophagy related protein LC3 were significantly increased. Hypothesized that partial inhibition of autophagy, can prevent cell damage induced by excessive autophagy, and completely blocked autophagy can cause cell death.
Key words: Parkinson’s disease, autophagy, Rotenone, PC12 cells
1 前言
在细胞内，线粒体受损能够引起活性氧(Reactive oxygen speeies, ROS)的释放，造成细胞内氧化应激水平提高，并且诱导细胞死亡[1]。这一细胞死亡过程是导致帕金森病（Parkinson’s disease,PD）以及其它神经退行性疾病乃至心脏疾病发生的一个重要因素[2]。最近的研究发现自噬在线粒体受损以及氧化应激诱导的细胞死亡过程中发挥了重要作用[3]。
自噬（Autophagy）是细胞内一种依赖溶酶体的物质降解途径，目前发现其降解对象囊括了从可溶蛋白到完整细胞器在内的所有胞内物质。在细胞受到外界
环境刺激时，如饥饿、氧化应激等，均可以激活细胞自噬途径，降解细胞内冗余或受损组分，因此自噬对细胞具有一定的保护作用。但同时也有研究发现，过度活化的细胞自噬也可以导致细胞自噬性死亡，这是一种不同于凋亡的程序性死亡方式，也称为Ⅱ型程序性细胞死亡[4]。那么，在细胞受到损害时，自噬是如何发挥其保护细胞或促进细胞死亡的作用？为了更好地研究自噬在细胞损伤中的作用机制，本研究以鱼藤酮处理的PC12细胞为模型，分别使用雷帕霉素作为自噬途径的促进剂、巴佛洛霉素A1和3-甲基腺嘌呤作为完全抑制剂和部分抑制剂，检测调节细胞自噬对细胞自噬的产生，重组自噬标志性蛋白LC3的表达变化，以及对细胞存活的影响。
2 材料和方法
2.1.1 材料和试剂
DMEM完全培养基、Opti-MEMI优化培养基和胎牛血清购自GIBCO公司，MegaTran 1.0转染试剂盒购自OrGene公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Roche公司，鼠源神经生长因子(b-NGF)购自Prospec公司，雷帕霉素和巴佛洛霉素A1购自ENZO公司，鱼藤酮和3-甲基腺嘌呤购自Sigma公司，抗体anti-MAP1LC3-A和anti-LAMP-1购自Millipore公司，DAPI购自碧云天生物公司，荧光标记二抗购自北京中杉公司，其余试剂为国产分析纯。pEGFP-LC3质粒由四川大学姜长安教授惠赠。
2.1.2 仪器
），OLYMPUS IXT1倒置荧光显酶标仪（Gene公司，BioTek powerwave XS
2
培养箱，BD FACSCalibur flow cytometer 微镜，Themo Forma 3110 series CO
2
流式细胞仪，Olympus Fluoview 500 IX71激光扫描共聚焦显微镜。
2.2 方法
2.2.1 PC12细胞的培养
PC12细胞株冻存于液氮罐，取出后迅速置于37℃的水浴中融化。细胞悬液用10倍体积的DMEM完全培养基（含10%热灭活性胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，pH 7.3），按1×104个/ml的密度接种到培养瓶中，在37℃、5%CO2的培养箱饱和湿度条件下培养。每2-3d换一次液，0.25%胰蛋白酶消化传代。为诱导产生神经元样DA能细胞，培养液中被加入100ng/ml的b-NGF诱导8天。
2.2.2 流式细胞法检测细胞凋亡
取对数生长期的PC12细胞，用DMEM完全培养基调至5×104个/ml，接种于12孔板(1ml/每孔)。细胞完全贴壁、生长为单层后加入不同处理试剂。实验分组:模型组(接种24h后加入终浓度为0.1μmol/L的鱼藤酮)，对照组(加入同等体积D-hanks液)，雷帕霉素对照组(接种24h后加入终浓度为1.25μg/L的雷帕霉素)，雷帕霉素实验组(接种24h后加入终浓度为 1.25μg/L的雷帕霉素和0.1μmol/L的鱼藤酮)，巴佛洛霉素A1对照组(接种24h后加入终浓度为0.4μmol/L的巴佛洛霉素A1)，巴佛洛霉素A1实验组(接种24h后加入终浓度为0.4μmol/L的巴佛洛霉素A1和0.1μmol/L的鱼藤酮)，3-甲基腺嘌呤对照组(接种24h后加入终浓度为20μg/L的3-甲基腺嘌呤)，3-甲基腺嘌呤实验组(接种24h
后加入终浓度为20μg/L的3-甲基腺嘌呤和0.1μmol/L的鱼藤酮)。继续处理24h 后，胰酶消化、收集各组细胞，1000r/min离心10min，调整细胞浓度为1×106个/ml，取100μl细胞悬液加入10μl Annexin V-FITC和10μl 20μg/m l的PI 溶液, 混匀后室温避光孵育15min，加入400μl PBS，流式细胞仪进行荧光强度分析与凋亡早期细胞的检测。
2.2.3 免疫荧光检测细胞中的自噬发生
取对数生长期的PC12细胞，用DMEM完全培养基调至1×104个/ml，接种于放置了多聚赖氨酸包被圆玻片的24孔板(1ml/每孔)。细胞完全贴壁、生长为单层后加入不同处理试剂，实验分组同细胞凋亡实验。各组细胞处理12h后，吸去培养基，0.01M PBS洗涤三次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤三次，封闭液封闭1h，分别加入抗体anti-MAP1LC3-A(1:500)和anti-LAMP-1(1:500)37℃孵育2h，PBS洗涤三次，再加荧光标记的二抗和核染料DAPI(1:1000)孵育1h，PBS 洗涤三次，封片，利用激光扫描共聚焦显微镜观察照相。
2.2.4 pEGFP-LC3稳定转染PC12细胞的构建
取对数生长期的PC12细胞，用DMEM完全培养基调至5×104个/ml，接种于6孔板中(2ml/每孔)，当细胞生长至50-70%时，取3 g pEGFP-LC3质粒按照OrGene 公司提供操作方法转染PC12细胞，转染细胞培养24h后，加G418（终浓度800μg/ml）筛选稳定表达细胞系，并不断进行细胞传代直至筛选出稳定的重组细胞系。
2.2.5 免疫荧光检测细胞中重组LC3蛋白的表达情况
取pEGFP-LC3稳定转染PC12细胞，用DMEM完全培养基调至1×104个/ml，接种于放置了多聚赖氨酸包被圆玻片的24孔板(1ml/每孔)。细胞完全贴壁、生长为单层后加入不同处理试剂，实验分组同细胞凋亡实验。各组细胞处理12h 后，吸去培养基，0.01M PBS洗涤三次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤三次，封闭液封闭1h，加核染料DAPI(1:1000)孵育1h，PBS洗涤三次，封片，利用激光扫描共聚焦显微镜观察照相。
2.2.6 流式细胞法检测细胞中重组LC3蛋白的表达情况
取pEGFP-LC3稳定转染PC12细胞，用DMEM完全培养基调至5×104个/ml，接种于12孔板(1ml/每孔)。细胞完全贴壁、生长为单层后加入不同处理试剂。实验分组同细胞凋亡实验。各组细胞处理12h后，胰酶消化、收集各组细胞，1000r/min离心10min，调整细胞浓度为1×106个/ml，流式细胞仪进行荧光强度分析与LC3蛋白表达的检测。
3 结果
3.1 调节细胞自噬对鱼藤酮致PC12细胞细胞凋亡的影响
用流式细胞仪检测抑制或促进细胞自噬对鱼藤酮致PC12细胞凋亡的影响。结果显示(见图1)，对照组细胞的存活率、早期凋亡率和死亡率分别为81.1%、15.7%和2.8%，模型组细胞的存活率、早期凋亡率和死亡率分别为23.7%、52.2%和22.0%，证明细胞经鱼藤酮处理后其早期凋亡率和死亡率都有显著增加；当加入巴佛洛霉素A1抑制细胞自噬后，可以看到巴佛洛霉素A1对照组的存活率、早
期凋亡率和死亡率分别为9.4%、44.5%和44.0%，表明巴佛洛霉素A1处理极大提高了细胞的早期凋亡率和死亡率，而巴佛洛霉素A1实验组的存活率、早期凋亡率和死亡率分别为5.7%、9.0%和68.7%，显示此时细胞大部分已经死亡；当加入雷帕霉素促进细胞自噬，雷帕霉素对照组的存活率、早期凋亡率和死亡率分别为66.1%、21.8%和9.9%，与对照组相比，雷帕霉素可以引起细胞的早期凋亡率和死亡率轻微增加，而雷帕霉素实验组的存活率、早期凋亡率和死亡率分别为23.1%、62.4%和12.7%，与模型组相比，此时细胞死亡率略有下降，而早期凋亡率略有增加；而当加入3-甲基腺嘌呤部分抑制细胞自噬，可以看到3-甲基腺嘌呤对照组的存活率、早期凋亡率和死亡率分别为75.7%、16.3%和6.4%，表明3-甲基腺嘌呤处理对正常细胞的影响很小，而3-甲基腺嘌呤实验组的存活率、早期凋亡率和死亡率分别为31.0%、44.9%和21.9%，与模型组相比，此时细胞早期凋亡率略有下降，因此细胞存活率略有增加。
图1调节细胞自噬对鱼藤酮致PC12细胞细胞凋亡的影响
模型组（A）、对照组（E）、巴佛洛霉素A1实验组（B）、巴佛洛霉素A1对照组（F）、3-甲基腺嘌呤实验组（C）、3-甲基腺嘌呤对照组（G）、雷帕霉素实验组（D）、雷帕霉素对照组（H）
Fig 1 The effects of adjusting autophagy on rotenone induced PC12 cells apoptosis
Model (A)、Control (E)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 +0.1μmol·L-1 rotenone (B)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 (F)、20μg·L-1 3-MA +0.1μmol·L-1 rotenone (C)、20μg·L-1 3-MA (G)、1.25μg·L-1 rapamycin +0.1μmol·L-1 rotenone (D) and 1.25μg·L-1 rapamycin (H)
3.2 调节细胞自噬对细胞中自噬标记蛋白LC3的影响
免疫荧光检测结果显示，PC12细胞经0.1μmol/L鱼藤酮处理后，细胞胞浆内可见明显的LC3免疫阳性绿色荧光颗粒分布，同时部分细胞表面出现明显的自噬泡样突起（见图2，A，白色箭头所示）；同样，巴佛洛霉素A1实验组、3-甲基腺嘌呤实验组和雷帕霉素实验组的细胞胞浆内也有大量LC3免疫阳性颗粒聚集（见图2，C、E、G），同时雷帕霉素实验组细胞表面也有明显的自噬泡样突起（见图2，G，白色箭头所示），但是3-甲基腺嘌呤实验组和巴佛洛霉素A1实验组细胞表面的自噬泡样突起却少见（见图2，C、E，白色箭头所示）；在各
个对照组中，巴佛洛霉素A1可以引起细胞内明显的LC3免疫阳性颗粒聚集（见图2，D），而3-甲基腺嘌呤和雷帕霉素处理的细胞内只有少量的LC3颗粒聚集（见图2，F、H），表明巴佛洛霉素A1可以诱导细胞内LC3蛋白的大量聚集。
图2调节细胞自噬对细胞中自噬标记蛋白LC3的影响
模型组（A）、对照组（B）、巴佛洛霉素A1实验组（C）、巴佛洛霉素A1对照组（D）、3-甲基腺嘌呤实验组（E）、3-甲基腺嘌呤对照组（F）、雷帕霉素实验组（G）、雷帕霉素对照组（H）
Fig 2 The effects of LC3 by adjusting autophagy on rotenone induced PC12 cells
Model (A)、Control (B)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 +0.1μmol·L-1 rotenone (C)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 (D)、20μg·L-1 3-MA +0.1μmol·L-1 rotenone (E)、20μg·L-1 3-MA (F)、1.25μg·L-1 rapamycin +0.1μmol·L-1 rotenone (G) and 1.25μg·L-1 rapamycin (H)
3.3调节细胞自噬对细胞中溶酶体膜蛋白LAMP-1的影响
免疫荧光检测结果显示，在各个鱼藤酮处理组细胞胞浆内都可见明显的LAMP-1免疫阳性绿色荧光小泡分布（见图3，A、C、E、G，白色箭头所示）；而各个对照组却均无明显的LAMP-1免疫阳性绿色荧光小泡分布（见图3，B、D、F、H）。显示细胞内溶酶体依赖的自噬途径被激活以消除鱼藤酮诱导的细胞损伤，但是对比（图2，D）与（图3，D）的染色结果，可以看到巴佛洛霉素A1阻止了自噬体和溶酶体的融合，此时尽管细胞内有自噬体（LC3免疫阳性颗粒）聚集，但是这些自噬体不能和溶酶体融合降解，因此在细胞内大量聚集。
图3调节细胞自噬对细胞中溶酶体膜蛋白LAMP-1的影响
模型组（A）、对照组（B）、巴佛洛霉素A1实验组（C）、巴佛洛霉素A1对照组（D）、3-甲基腺嘌呤实验组（E）、3-甲基腺嘌呤对照组（F）、雷帕霉素实验组（G）、雷帕霉素对照组（H）
Fig 3 The effects of LAMP-1 by adjusting autophagy on rotenone induced PC12 cells
Model (A)、Control (B)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 +0.1μmol·L-1 rotenone (C)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 (D)、20μg·L-1 3-MA +0.1μmol·L-1 rotenone (E)、20μg·L-1 3-MA (F)、1.25μg·L-1 rapamycin +0.1μmol·L-1 rotenone (G) and 1.25μg·L-1 rapamycin (H)
3.4 调节细胞自噬对细胞中重组LC3蛋白的影响
利用pEGFP-LC3质粒自带的EGFP，荧光检测结果显示，在各个对照组和实验组细胞胞浆内都可见明显的重组LC3蛋白免疫阳性绿色荧光颗粒分布；而鱼藤酮处理组细胞胞浆内的重组LC3蛋白（见图3，A、C、E、G，白色箭头所示）明显高于各个对照组（见图4，B、D、F、H，白色箭头所示）。
图4调节细胞自噬对细胞中重组LC3蛋白的影响
模型组（A）、对照组（B）、巴佛洛霉素A1实验组（C）、巴佛洛霉素A1对照组（D）、3-甲基腺嘌呤实验组（E）、3-甲基腺嘌呤对照组（F）、雷帕霉素实验组（G）、雷帕霉素
对照组（H）
Fig 4 The effects of recombinant LC3 by adjusting autophagy on rotenone induced PC12 cells Model (A)、Control (B)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 +0.1μmol·L-1 rotenone (C)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 (D)、20μg·L-1 3-MA +0.1μmol·L-1 rotenone (E)、20μg·L-1 3-MA (F)、1.25μg·L-1 rapamycin +0.1μmol·L-1 rotenone (G) and 1.25μg·L-1 rapamycin (H)
3.5 流式细胞法检测细胞中重组LC3蛋白的表达情况
用流式细胞仪检测抑制或促进细胞自噬对细胞中重组LC3蛋白的影响。结果显示(见图5)，在对照组中，高表达重组LC3蛋白的细胞为17.4%，模型组为26.7%，表明鱼藤酮可以引起细胞内重组LC3蛋白表达的增加；与对照组相比，巴佛洛霉素A1对照组、3-甲基腺嘌呤对照组和雷帕霉素对照组中高表达重组LC3蛋白的细胞分别为32.7%、27.3%和32.7%；同样，与模型组相比，巴佛洛霉素A1对照组、3-甲基腺嘌呤对照组和雷帕霉素对照组中高表达重组LC3蛋白的细胞分别为36.6%、29.4%和30.0%。可以看到，抑制或促进细胞自噬，细胞内重组自噬相关蛋白LC3均有明显增加，但是对于各个抑制或促进自噬处理组来说，这种增加的机制并不同。巴佛洛霉素A1通过阻断自噬体和溶酶体的融合，从而提高细胞内重组LC3蛋白的聚集；雷帕霉素能促进细胞自噬，因此提高了细胞内重组LC3蛋白的表达；3-甲基腺嘌呤能够抑制自噬，因此3-甲基腺嘌呤处理后，细胞内重组LC3蛋白的聚集要低于巴佛洛霉素A1和雷帕霉素处理组，却高于对照组和模型组。
图5流式细胞法检测细胞中重组LC3蛋白的表达情况
模型组（A）、对照组（E）、巴佛洛霉素A1实验组（B）、巴佛洛霉素A1对照组（F）、3-甲基腺嘌呤实验组（C）、3-甲基腺嘌呤对照组（G）、雷帕霉素实验组（D）、雷帕霉素对照组（H）
Fig 5 The expression of recombinant LC3 by flow cytometric in rotenone induced PC12 cells Model (A)、Control (E)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 +0.1μmol·L-1 rotenone (B)、0.4μmol·L-1 Bafilomycin A1 (F)、20μg·L-1 3-MA +0.1μmol·L-1 rotenone (C)、20μg·L-1 3-MA (G)、1.25μg·L-1
rapamycin +0.1μmol·L-1 rotenone (D) and 1.25μg·L-1 rapamycin (H)
4 讨论
帕金森病是一种神经系统退行性疾病，主要表现为运动障碍，常高发于中老年人群。PD的致病机制复杂，一般认为与遗传因素、线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性神经递质毒性作用以及蛋白降解系统功能障碍等众多因素有关[5]。但是目前发现神经细胞内细胞器和蛋白质代谢异常是导致PD发生的一个共同途径，而这些异常细胞器和蛋白质主要通过细胞自噬的方式降解，因此自噬在PD 的发病过程中发挥了极为重要的作用[6]。
本研究以鱼藤酮处理的PC12细胞为帕金森病体外模型，分别使用雷帕霉素作为自噬途径的促进剂，巴佛洛霉素A1和3-甲基腺嘌呤作为抑制剂，检测调节细胞自噬对细胞凋亡的影响，发现巴佛洛霉素A1极大提高了细胞凋亡率，3-甲基腺嘌呤则可以减轻鱼藤酮诱导的细胞凋亡，而雷帕霉素可以促进细胞凋亡，但降低了受损细胞早期的死亡率。
3-MA是ClassⅢ PI3K特异性抑制剂，而ClassⅢ PI3K可与Beclin-1形成复合物参与自噬体膜的形成[7]。因此，3-MA可以通过抑制ClassⅢ PI3K和Beclin-1复合物的形成发挥抑制自噬的作用。但是，有研究认为3-MA对自噬的抑制效率并不高。我们推测正是这种对细胞自噬的部分抑制使3-MA发挥了保护细胞的作用：一方面自噬的存在可以缓解细胞受损的应激压力不断增加从而诱导细胞凋亡，另一方面抑制自噬避免了细胞过度自噬诱导的细胞自噬性死亡。
雷帕霉素可以通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白mTOR促进细胞自噬，是常用的一种自噬促进剂[8]。在本实验中，我们发现雷帕霉素虽然提高了鱼藤酮诱导PC12细胞的早期凋亡率，但是此时的细胞死亡率反而下降，提示在细胞受损的早期，雷帕霉素促进自噬的作用可能有利于帮助受损的细胞恢复正常。因此，在细胞受到轻微损伤时，自噬的适度激活可以保护细胞，但是在细胞受到长期或严重损伤时，细胞的过度自噬会诱导细胞自噬性死亡，使得细胞的凋亡率增加。
巴佛洛霉素A1是另一种重要的自噬抑制剂，巴佛洛霉素A1不仅能够通过阻止自噬体和溶酶体的融合来抑制自噬，还能抑制溶酶体膜的质子泵活性[9]。与3-MA不同，巴佛洛霉素A1对正常细胞和受损细胞都显示出了较强的致死作用，这与巴佛洛霉素A1对自噬较强的抑制作用有关，自噬修复机制的关闭使得细胞很快因为内部应激压力的增加而凋亡或坏死。
自噬作为细胞重要的自我调控过程，其具有双重作用：保护细胞和诱导细胞死亡，而这两种可能性取决于细胞自噬的程度，我们的研究也证实了这一点。同时，我们使用不同的自噬抑制剂得到了截然不同的结果，提示我们自噬是一个多途径多环节的复杂过程，对于细胞自噬机制的深入研究，将为PD以及其它神经退行性疾病的诊治在分子水平上奠定基础。
参考文献：
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[4] Ko ikeM, Shibata M, TadakoshiM, et al. Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal neuron death after hypoxic-ischemic injury [J]. Am J Pa tho，2008，172(2):454-469.
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第一章、蛋白质的化学 肽键：一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基经脱水缩合后形成的酰胺键。 氨基酸的等电点：在某一PH溶液中,氨基酸分子电离后带有相等正、负电荷时，此时溶液的PH值称为该氨基酸的等电点pI 结构域：指蛋白质多肽链在二级结构的基础上进一步卷曲折叠成几个相对独立的近似球形的组装体。 蛋白质复性：轻度变性的蛋白质在去除变性因素后，可恢复原有的构象和生物学活性。 Motif基序：基序又称超二级结构、模体或模序，是指在多肽内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规律的、在空间上能辨认的二级结构聚集体。 蛋白质的分离方法：透析、沉淀（有机溶剂沉淀，盐析，免疫沉淀）、电泳、层析、超速离心。 第二章、核酸的结构与功能 简述Watson和Crick双螺旋结构特点。 （1）DNA分子由两条走向相反且平行的脱氧多核苷酸链共同围绕同一中心中心轴形成右手螺旋结构。 （2）磷酸与戊糖相间排列形成螺旋的骨架居于外侧，碱基位于螺旋的内侧。 （3）两条链上的碱基严格按照碱基互补配对的原则进行配对，即A ＝T，G＝C，配对的碱基处于同一平面，相邻的两个碱基平面距离为
0.34nm，螺旋一周包含10个碱基对，螺旋直径为两2nm，角度为36°。（4）氢键维持双螺旋的横向稳定，碱基堆积力维持双螺旋的纵向稳定。 （5）双螺旋结构上有两条螺旋凹沟，一条较深称为深沟（大沟），一条较浅称为浅沟。 tRNA二级结构有何特点。 （1）tRNA是分子最小，但含有稀有碱基最多的RNA，其稀有碱基的含量可多达20%。 （2）tRNA是单店核算，但其实分子中的某些局部也可形成双螺旋结构，形成茎环结构。 （3）tRNA的结构上有一反密码环，中间有一反密码子能与密码子配对。 （4）tRNA的3'末端有一柄部结构—CCA-OH，可携带氨基酸。 简述三种RNA的功能。 （1）mRNA的功能是作为指导蛋白质合成的模板。 （2）tRNA的功能是在蛋白质合成中起搬运氨基酸作用。 （3）rRNA的作用是蛋白质的合成提供场所。 真核生物mRNA与原核生物mRNA在结构上有何区别。 （1）真核生物mRNA的3'-末端有一个多聚腺苷酸尾，称poly（A）n 尾巴，原核生物没有 （2）真核生物mRNA的5'-端有帽子结构m7GpppN，原核生物没有（3）真核生物mRNA分子中有编码区和非编码区，原核生物没有
目录 引言 (1) 第一章现代医学对帕金森病的认识…………………………………………………… .2 1.帕金森病的研究历史回顾 (2) 2.帕金森病的病因与发病机制 (2) 3.帕金森病的治疗 (3) 4.帕金森病的动物模型研究 (4) 第二章中医学对帕金森病的认识 (6) 1.帕金森病的中医病名及病因病机 (6) 2.辨证分型、常用方药及特色疗法 (6) 3.中药治疗帕金森病的药理研究 (7) 4.三甲止颤汤组方依据及特点 (8) 第三章实验研究 (9) 实验流程图 (9) 实验一鱼藤酮诱导PD大鼠模型的研究…………………………………………… ..10 1.实验目的 (10) 2.实验材料 (10) 3.实验过程 (10) 4.实验观察 (11) 5.统计学方法 (12) 6.实验结果 (12) 实验二三甲止颤汤对PD大鼠黑质TH、a-syn的影响 (17) 1.实验材料 (17) 2.实验过程 (17) 3.实验观察 (17) 4.统计学方法 (19) 5.实验结果 (19) 第三部分讨论 (26) 1.帕金森病动物模型的选择 (26) 2.三甲止颤汤现代药理研究 (27) 结语 (29) 参考文献 (30) 附录 (34) 致谢 (41)
三甲止颤汤对鱼藤酮致PD大鼠黑质TH、a-syn的影响 引言 帕金森病（Parkinson’s disease，PD），首次详细描述见于1817年的英国James Parkinson医生，因其症状表现又名震颤麻痹（shaking palsy）。该病发病趋势与年龄增加成正比，在我国患病人群集中在65岁以上男性，女性略少，患病率可达1000/10万，是继阿尔茨海默病之后的第二个最常见的神经变性疾病[1]。其病理改变重要是黑质纹状体多巴胺（dopamine，DA）神经元及DA递质的缺失，当黑质致密部DA能神经元丢失约50%，纹状体内DA浓度低于80%时呈现临床症状，运动症状包含运动缓慢、震颤、强直、姿势步态异常等，非运动相关症状有嗅觉阻滞、植物神经功能紊乱、睡眠障碍、抑郁状态、认知障碍等[2]。对于PD，治疗上多数医院利用左旋多巴进行替代性治疗，以补充DA的缺失；虽然患者临床症状得到改善，但疾病进展过程不能阻止，长久服用则会出现恶心、呕吐、腹痛等不良反应；因而PD被神经病学界视为不明原因、疗效不佳、预后不良的难治疾病。 PD在中医学界被归为“颤证”，在PD的防治、康复等方面中医优势独特，以整体观念和辨证论治为指导，对病因病机认识见解独到，全方位、多途径、多靶点治疗，疗效显著，且化学药物的引发的不良反应得到减轻，故成为治疗PD的研究热点。三甲止颤汤是导师经验用方，由龟板、鳖甲、生牡蛎、钩藤、生白芍、麦冬、生地、地龙、寄生、甘草10味中药组成，该方多年来临床疗效显著，具有滋阴潜阳、滋补肝肾、息风健脑之效，与颤证病机相吻合，但对其药理作用机制认识不足。研究发现PD发病与酪氨酸氢化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）缺乏或减少相关，因为它是神经系统DA能神经元的蛋白标志，是DA合成的限速酶。本实验拟通过动物模型研究三甲止颤汤对PD大鼠中脑黑质TH、a-突触核蛋白（alpha-synuclein，a-syn）的影响，来探讨三甲止颤汤治疗PD的药理作用机制，为以后开发PD中成药，增加治疗手段提供实验依据。
2013-04-19 10:17:14来源：南方周末 2010年4月7日，来自湖北省襄樊市近100名帕金森病患者，走进襄樊市第一人民医院，参加该市第三届帕金森病病友联谊会。（CFP/图） 帕金森病是一类老年人中常见的神经性疾病，目前尚无法治愈。随着中国人口老龄化的加剧，帕金森病导致的社会负担也将日益严重。 随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患病率也节节攀升。这类疾病主要病理特征是大脑等中枢系统神经元逐步丢失，且此过程不可逆。老年痴呆和帕金森病是其中患病率最高的两种疾病。 据预测，到2040年，在北美等发达国家和地区，神经退行性疾病将成为人类的第二号杀手，仅次于癌症。 帕金森病得名于英国医生詹姆士·帕金森，他于1817年发表了一篇论文，对六个病人的症状进行了详细的描述，包括静止震颤、肌肉僵直而缺乏控制力、行动迟缓、佝偻蹒跚等。由于帕金森的论文，该病开始被医学界广泛关注。鉴于此，
后世医者遂将这类疾病命名为帕金森病。而他的生日，4月11日，也被定为世界帕金森日。有趣的是，在帕金森论文发表之后很长时间，不少西方医学史学者认为帕金森病是现代工业革命的产物。他们的理由是西方经典医学文献中，没有关于该疾病的记载。 其实，世界各国古文献中对帕金森病的描述，不绝于缕。早在公元前五千多年，印度阿育吠陀医学中就记载了一种名叫“Kampavata”的疾病，即帕金森病。他们还使用了一种热带豆荚类草药治疗Kampavata。最近的一些临床和动物学试验发现，此草药富含左旋多巴（目前帕金森治疗的经典用药），能显著改善帕金森病的症状。 在中国，《黄帝内经》、《中藏经》（华佗著）等医学典籍也对帕金森病症状有生动描述。明代医家王肯堂在其《证治准绳》中，除了详细论述帕金森病的病机外，还写道：“此病壮年鲜有，中年以后乃有之，老年尤多”，明确指出该病年龄特征。近世学者发现，《圣经》中亦有对帕金森症状的零星描述，如《旧约·传道书》中提到了两个主要症状“不自主震颤”和“肌肉强直”：“When the guardians of the house tremble, and the strong men are bent（屋子的看守颤颤巍巍，当年的壮士弓腰佝背)（冯象译）。” 发病人数上升 帕金森病在老年人中高发，世界范围内来说，约1％－2％的65岁以上老年人患有帕金森病，80岁以上，患病率增加到4％。 美国罗切斯特大学Dorsey等人2007年发表在《神经学》上的一篇研究中指出，在全世界15个人口最多的东西方国家55岁以上老年人中，帕金森病人数达460万。 中国研究人员对了解中国帕金森病的患病情况也做了大量工作。如2000年北京协和医科大学的乔友林团队和美国加州大学戴维斯分校合作，对河南林县地区16,488名50岁以上的农村老年居民进行了详细的神经学检查，发现289名（1.75％）帕金森病人。其后协和医院张振馨等人对北京、上海、西安等地的29454名年龄55岁以上的城、乡居民进行了调查，发现被调查者中，1.1％患有帕金森病，而65岁以上老年人患病率是1.7％。他们据此推算中国目前有190万帕金森病人，此研究报告发表于2005年的《柳叶刀》。 Dorsey等人还预测了世界老年人群中帕金森病未来患病人数。他们推算，帕金森病人数在2030年会翻番，达930万。而中国将成为世界上患病率增长最快的国家之一，至2030年，中国帕金森病人数约五百万人，占全世界病人数的57％。 没有客观指标 帕金森病的诊断主要凭借病人主诉症状（静止震颤、肌肉强直、步态不稳等）、对左旋多巴药物的反应，以及各项神经功能测试评分。目前还无法像糖尿病、癌症的疾病一样，通过客观检测指标来明确诊断。因此，医生的专业训练和经验非常重要，误诊时有发生。故建议病人去神经专科医生处寻求诊断。如果有可能，在被某个医生诊断后，应尽量再去不同医院、不同医生处就诊，看是否有相同诊断。
课程论文 课程名称：植物化学保护 题目：浅谈中国植物性农药的现状和进展学院：植物保护学院 专业：植物保护 姓名：张艳荣 学号：13044010 完成日期：2012 年06 月29 日
浅谈我国植物性农药的现状和进展 摘要：植物性农药是指利用植物所含的稳定的有效成分，按一定的方法对受体植物进行使用后，使其免遭或减轻病、虫、杂草等有害生物为害的植物源制剂。各种植物性农药通常不是单一的一种化合物，而是植物有机体的全部或一部分有机物质，成分复杂多变，但一般都包含在生物碱、糖苷、有毒蛋白质、挥发性香精油、单宁、树脂、有机酸、酯、酮、萜等各类物质中。由于植物性农药物质性质的特殊性，有害生物难以对其产生抗药性。另外，植物性农药对受体植物相对于化学农药来说更不容易造成药害，而且也容易与环境中其他生物相协调。植物性农药是非人工化学结构的天然化学物质，一般在自然界有天然的微生物类群对其进行自然分解，在保护生态平衡方面大大优于化学农药，特别是在无公害农产品的生产和保证农业的可持续发展中扮演着重要角色。本文综述了我国植物性农药的现状和研究进展，同时介绍几种应用前景比较好的植物性农药 关键字：植物性农药；合成化合物；杀虫植物 1植物性农药研究发展概况 1.1植物性农药的发展历史 植物性农药的发展具有悠久的历史,我国古代早就用菊科艾属的艾蒿茎、叶熏蚊蝇,一直流传至今。公元前7-5世纪的古籍中已有用嘉草、莽草、枚菊杀虫的记述。在《齐民要术》、《本草纲目》中都不乏用植物性农药杀虫、防病的记载。17世纪后,世界各地陆续发现了一些杀虫力较强的药用农药,其中最著名的是烟草、鱼藤、除虫菊。在长期的实践中,人们早已发现楝科植物中的印楝、苦楝、川楝等具有抑制昆虫取食和生长发育的活性,人们还先后发现卫茅科雷公藤,豆科槐属的苦参、大戟科的乌柏、茄科茄属的龙葵等植物均具有杀虫活性。 1.2植物性农药的发展现状 目前,对植物性农药的研究面窄、深度不够,缺少系统的、成熟的理论指导。在研究内容方面,作为杀虫剂研究的较多,杀菌剂则较少,而植物生长调节剂和除草剂研究的更少。基本研究模式是发现有某种生理活性的植物后,先分离出活性有效成分,确定化学结构,再以活性化合物结构作为靶标,合成该化合物,开发农药品种。如以除虫菊和毒扁豆碱为先导,开发出的拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类系列农药,但通过仿生合成的这些农药,实际则属于化学合成农药。植物性农药的应用现状则是发现有生物活性的植物不少,但以植物为原料开发应用的却不多。现在农药的主导仍然是化学合成农药,生物农药只占整个农药的2%~3%,而植物性农药所占的比重更小。植物性农药的发展现状与其悠久的发展历史与自然界丰富的植物资源的存在显然是不相称的。
第23卷第2期西 南 农 业 大 学 学 报V ol.23,N o.2 2001年4月Journal of S outhwest Agricultural University Apr.2001 文章编号:1000-2642(2001)02-0140-04 鱼藤酮的研究进展 ① 徐汉虹,黄继光 (华南农业大学昆虫毒理研究室,广东广州 510642) 摘要:鱼藤酮是一种广谱性杀虫剂,对害虫高效且不易产生抗药性。该文对鱼藤酮的生物活性、作用机理以及组织培养技术在鱼藤酮类似物中的应用几个方面进行了比较详细的论述。关 键 词:鱼藤酮;研究进展 中图分类号:S 482.3+9 文献标识码:A ADVANCES I N THE RESE ARCH OF ROTE NONE XU H an -hong ,HUANG Ji -gu ang (Laboratory of Insect T oxicology ,S outh China Agricultural University ,G uangzhou ,G uangdong 510642,China )Abstract :A detailed review is presented in this paper of the advances in the research of the bioactivity ,pest -controlling mechanisms and tissue culture techniques of rotenone ,a broad -spectrum insecticide ,and its analogs.K ey w ords :rotenone ;advance in research 鱼藤酮是早期人们从鱼藤属等植物中提取分离出来的一种有杀虫活性的物质,是3大传统植物性杀 虫剂之一。它主要存在于豆科植物中,特别是在鱼藤属和灰叶属等植物中,且研究比较深入。其结构式如下: 鱼藤酮的作用方式较多。它对菜粉蝶幼虫等昆虫有强烈的触杀作用和胃毒作用,对日本甲虫有拒食作用,对某些鳞翅目害虫有生长发育抑制作用[1,2],鱼藤提取物能抑制某些病菌孢子的萌发和生长,或阻 止病菌侵入植株。 1 鱼藤酮的生物活性 鱼藤对15个目,137科的800多种害虫具有一定的防治效果,作用谱广,尤其对蚜螨类害虫效果突出。Nawrot 等[3]在室内测定了鱼藤酮及其5种衍生物对谷象(Sitophilus granatius )和杂拟谷盗(Tribolium con 2f usum )成虫以及杂拟谷盗和谷斑皮蠹(Trogoderma granarium )幼虫的拒食作用。结果表明,鱼藤酮对储 粮害虫有一定的拒食活性。当温度为26℃,相对湿度(RH )为64%时,发现鱼藤酮对这3种害虫的拒食活性最高,其类似物的拒食活性不如鱼藤酮本身,但表现出一定的选择性。Bloszyk 等[4]用6种拒食活性较高的化合物作为食品包装物,以防治贮粮害虫谷蠹(Rhyzopertha dominica )和谷象的危害,发现鱼藤酮对谷蠹的拒食活性比其他几种药剂都高。 斯里兰卡有一传统的植物药物“Pilamul ”,就是 ①收稿日期:2000-09-04 基金项目:中华农业科教基金(人才基金)和广东省自然科学基金(930841)资助项目 作者简介:徐汉虹(1961-),男,湖北仙桃人,华南农业大学教授,主要从事植物性杀虫剂和农药学研究。
Pael-R基因未参与鱼藤酮诱导帕金森病细胞模型的变化 近来研究发现，环境毒素和遗传缺陷是引发帕金森病的分子机制。中国中南大学湘雅二医院邹婷所在团队前期研究发现，Parkin的作用底物之一Pael-R参与了Parkin基因突变引发多巴胺神经元凋亡的过程，但其是否也同时参与了环境毒素鱼藤酮引发多巴胺神经元凋亡的过程尚未知。在本次实验中探讨了在鱼藤酮诱导的帕金森模型中降低Pael-R的表达对模型细胞凋亡的影响，结果表明下调Pael-R表达后对帕金森病模型细胞的活率和凋亡没有影响，证实下调Pael-R基因的表达对鱼藤酮制作的帕金森病细胞模型没有保护作用。相关结果发表于《中国神经再生研究（英文版）》杂志2014年2月第4期。 Hoechst33258染色显示部分RNA干扰的帕金森病模型细胞细胞出现核固缩和核分裂 Article: " The Pael-R gene does not mediate the changes in rotenone-induced Parkinson’s disease model cells," by Ting Zou, Xiangqi Tang, Zhiling Huang, Niangui Xu, Zhiping Hu (Department of Neurology, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan Province, China) Zou T, Tang XQ, Huang ZL, Xu NG, Hu ZP. The Pael-R gene does not mediate the changes in rotenone-induced Parkinson’s dise ase model cells. Neural Regen Res. 2014;9(4):402-406. 欲获更多资讯： Neural Regen Res The Pael-R gene does not mediate the changes in rotenone-induced PD model cells Currently, the pathogen esis of Parkinson’s disease is not entirely clear, but it has been generally considered to be the result of interactions among various genetic and environmental factors. Ting Zou and coworkers from Second Xiangya Hospital, Central South University in China previously found that Parkin mutation causes Parkin-associated endothelin receptor-like receptor (Pael-R) protein deposition, and the associated cytotoxicity leads to dopaminergic neuronal apoptosis. These researchers speculated that the Pael-R gene is possibly involved in the action of rotenone on cells. Therefore, they investigated the role of the Pael-R gene in rotenone-induced Parkinson’s disease model cells using RNA interference. IN their recent study, Pael-R expression was decreased after RNA interference compared with the control group (no treatment) and the model group (rotenone treatment), while the rate of apoptosis and survival of dopaminergic cells did not differ
1.木脂素：一类由两分子苯丙素衍生物（即C6-C3单体）聚合而成的天然化合物，多数 呈游离状态，少数与糖结合成苷而存在于植物的木部和树脂中。 2.氰苷：主要指具有α-羟基腈的苷。 3.酚苷：是苷元分子中的酚羟基与糖的端基碳原子缩合而成的苷。 4.萜：指具有（C5H8）n通式以及其含氧和不同饱和程度的衍生物，可以看成是由异戊 二烯或异戊烷以各种方式连结而成的一类天然化合物。 5.双皂苷：由6个异戊二烯单位、30个碳原子构成的，组成的糖既有中性糖也有酸性 糖，组成的糖含有两条糖链的苷类化合物。 6.香豆素：香豆素是具有苯骈α-吡喃酮母核的一类天然化合物的总称，在结构上可以 看成是顺邻羟基桂皮酸失水而成的内酯。 7.甾体皂苷：是一类螺旋甾烷及其生源相似的甾族化合物的低聚糖。 8.鞣质：指植物界存在的一类能与蛋白质结合生成水不溶性沉淀的结构复杂的多元酚 类化合物。 简单题： 1.如何预试某中药中是否含有脂溶性生物碱？ 答：利用吸附薄层色谱法检识是否含有脂溶性生物碱。因为硅胶和氧化铝薄层色谱适用于分离和检识脂溶性生物碱。尤其是氧化铝的吸附力较硅胶强，更适合于分离亲脂性较强的生物碱。 2.鞣质可分为哪些类型？分类依据是什么？ 答：（1）可水解鞣质（2）综合鞣质依据是它们的水解情况。 3.如何用化学反应鉴别3-羟基黄酮与5-羟基黄酮？ 答：锆盐－枸橼酸反应：加2%二氯氧锆(ZrOCl)的甲醇溶液到样品的甲醇溶液中，若出现黄色，说明有3-OH或5-OH与锆盐生成络合物，再加入2%的枸橼酸的甲醇溶液，黄色不退，示有3-OH，如果黄色减退，加水稀释后转为无色，示无3-OH，但有5-OH。
鱼藤酮的应用现状及存在问题 姓名：郝瑶学号：20110801111 班级：11生工1班 摘要鱼藤酮是一种广谱性杀虫剂，对害虫高效且不易产生抗药性。它是一种天然的植物质杀虫剂和杀螨剂，为无公害农产品生产推荐使用品种，具有广阔的应用前景。该文简要介绍了鱼藤酮的产品及应用范围、鱼藤酮的应用开发现状以及应用过程中出现的问题和解决方法，并对今后进一步开发应用鱼藤酮提出建议。 关键词鱼藤酮；杀虫剂；应用现状；存在问题；综述 鱼藤酮 (rotenone) 具有触杀、胃毒、拒食和熏蒸作用，杀虫谱广，对果树、蔬菜、茶叶、花卉及粮食作物上的数百种害虫有良好的防治效果[1] ，对哺乳动物低毒，对害虫天敌和农作物安全，是害虫综合治理上较为理想的杀虫剂，被广泛应用于蔬菜、果树等农作物和园林害虫的防治。为了顺应绿色食品发展的要求，近年来我国鱼藤酮产品的发展十分迅速。本文就鱼藤酮的产品、应用开发现状及在应用过程中出现的一系列问题进行了综述。 1 鱼藤酮的产品及应用范围 近年来，鱼藤酮的产品的使用呈逐年递增的趋势，从1 9 9 1 年广东省广州农药厂从化市分厂登记第一个鱼藤酮产品到现在，共有11 家企业登记鱼藤酮产品18 个厂次，其中原药2 个，单剂4 个，复配制剂12 个。这些产品中，2.5%、7.5% 鱼藤酮乳油，3.5% 高渗鱼藤酮乳油，5% 除虫菊素·鱼藤乳油( 除虫菊素+ 鱼藤酮) 、18%辛·鱼藤乳油(辛硫磷+鱼藤酮)和 1.3%氰·鱼藤乳油 (氰戊菊酯+ 鱼藤酮) 用于防治十字花科蔬菜和番茄上的蚜虫；0.2% 苦参碱水剂+1.8% 鱼藤酮乳油桶混剂，25% 敌·鱼藤乳油 (敌百虫+ 鱼藤酮)、1.3% 氰·鱼藤乳油 (氰戊菊酯+ 鱼藤酮) 和2.5% 氰·鱼藤乳油 (氰戊菊酯+ 鱼藤酮) 用于防治菜青虫(Pieris rapae)，7.5%氰·鱼藤乳油 (氰戊菊酯+ 鱼藤酮) 和1.8% 阿维·鱼藤乳油 (阿维菌素+鱼藤酮) 用于防治小菜蛾 (Plutella xylostella)，25% 水胺·鱼藤乳油(水胺硫磷+ 鱼藤酮) 用于防治柑橘上的矢尖蚧 (Prontaspisyanonensis)，21%辛·鱼藤乳油 (辛硫磷+鱼藤酮) 防治棉花上的棉铃虫 (Heliothiszea ) 。[2]这些产品主要以鱼藤为材料，其中大部分是复配产品，防治面积达几千万公顷。经研究表明鱼藤酮与其他化学或生物农药混配[ 3 - 4 ]高效、低毒，可以有效地延缓害虫的抗药性，减少环境污染，还能刺激植物生长，对天敌无杀伤作用，有利于促进生态平衡。 2 鱼藤酮的作用机制 早期的研究表明鱼藤酮的作用机制主要是影响昆虫的呼吸作用，主要是与NADH脱氢酶与辅酶Q之间的某一成分发生作用。鱼藤酮使害虫细胞的电子传递链受到抑制，从而降低生物体内的ATP水平，最终使害虫得不到能量供应，然后行动迟滞、麻痹而缓慢死亡。许多生物细胞中的线粒体、NADH脱氢酶、丁二酸、甘露醇以及其他物质对鱼藤酮都存在一定的敏感性。Setayria cervi线粒体中从NADPH到NADH这一过程的电子传递可被鱼藤酮高度抑制。并且，丝虫寄生物Setaria digitata线粒体颗粒中的反丁烯二酸还原酶系统的活性对鱼藤酮敏感。鱼藤酮和水杨氧肟酸可抑制Trypanosoma brucei brucei线粒体内膜的电动势(EMT)，从而间
目录 前言 (1) 第一部分sestrin2在PD模型细胞中上调；sestrin2的上调参与了自噬的诱导 (3) 一sestrin2蛋白在帕金森体病细胞模型中p53依赖性上调 (11) 二 sestrin2参与了鱼藤酮PD模型细胞中的自噬诱导 (15) 第二部分sestrin2蛋白通过AMPK的介导参与了自噬的诱导；AMPK对于sestrin2自噬的诱导是必须的 (19) 一 sestrin2 通过AMPK 的磷酸化激活参与对自噬的调控 (19) 二 AMPK的激活对于sestrin2对自噬的诱导是必须的 (26) 第三部分sestrin2蛋白的上调降低了鱼藤酮对于多巴胺细胞的神经损伤。 (31) 一 sestrin2对溶酶体功能的影响 (33) 二 sestrin2参与α-synuclein的自噬性降解 (34) 三 sestrin2 抑制了caspase3的激活和影响了细胞的存活 (35) 讨论 (39) 结论 (42) 创新点 (43) 参考文献 (44) 综述 (50) 参考文献 (60) 缩写词 (63) 攻读学位期间发表的论文、科研和获奖情况 (65) 致谢 (66)
Sestrin2 在鱼藤酮诱导的帕金森病细胞模型中的保护作用及机理研究前言 前言 研究背景 帕金森病是第二大常见的神经退行性疾病，包括家族性和散发性帕金森病。其发病率在65岁人群的比例约占1%，在85岁人群中增长到了4-5%( Dauer et al, Neuron, 2003)。帕金森病人伴有运动迟缓，震颤，强直和肢体障碍等症状。帕金森病是由于大脑黑质致密区神经细胞的大量减少所引起，并伴随有脑干、脊髓和大脑皮层中α-突触蛋白(α-synuclein)聚集(Kahle et al, Journal of neurochemistry, 2002)。研究表明，环境因素和遗传因素在该病发病中发挥重要作用(Dauer et al, Neuron, 2003)。环境中的一些毒性物质，包括除草剂（如百草枯）和线粒体毒性物质（如鱼藤酮），以及突变的蛋白（如DJ-1,PINK 1和LRRK2等），可能导致了线粒体功能障碍并且增加了细胞的氧化应激，与帕金森病早期的发病密切相关()。但是关于环境因素和单遗传因素或共同作用于机体以及机体经历何种病变过程最终导致了该病的发生和发展，其机制尚未阐明。 以α-突触蛋白为主要成分的病理性蛋白聚集形成的Lewy小体是帕金森病的主要病理标志之一。氧化应激及氧化应激所伴随的线粒体功能损伤、自噬-溶酶体(ALP, autophagy-lysosome pathway)通路的异常是导致帕金森病的两个重要的因素。氧化应激被认为能够导致脆弱的神经元的死亡，并继而导致神经细胞的减少和神经元的退化。在死亡的帕金森病人的黑质致密区检测到了大量氧化损伤的脂类、蛋白和DNA。线粒体是细胞内氧化磷酸化的主要细胞器，处于一种高度氧化的环境。研究发现，对体内和体外线粒体复合体I的抑制能够诱导α-突触蛋白的聚集(Rijk et al, Neurology, 1995)。氧化应激导致的线粒体功能损伤以及线粒体功能损伤导致的活性氧的产生和氧化应激的进一步加剧，在神经元的死亡和帕金森的病理过程中发挥着重要的作用。 大量的证据表明，自噬的功能失调与帕金森病密切相关(Nixon, Nature medicine, 2013)。细胞内的长寿命蛋白（包括α-突触蛋白）和细胞器（如线粒体）是通过自噬(macroautophagy)途径来降解的。自噬经历起始(initiation)、成核(nucleation)、延伸(elongation)、成熟(maturation)、降解(degradation)等途径，将细 1
1、细胞凋亡的形态学、生化改变？P14 （一）细胞凋亡的形态学改变 细胞凋亡的形态学改变是多阶段的。发生凋亡的细胞，形态上首先变圆，并逐步与周围细胞脱离，表面微绒毛消失。胞浆凝缩，胞膜迅速发生空泡化（blebbing），细胞体积逐渐缩小，出现固缩(condensation)。然后内质网变疏松并与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起，称为出芽（budding）。晚期核质高度浓缩融合成团，染色质集中分布在核膜的边缘，呈新月形或马蹄形分布，称为染色质边集(margination)。胞膜皱缩内陷，分割包裹胞浆，形成泡状小体称为凋亡小体(apoptosis body)，这是凋亡细胞特征性的形态学改变。凋亡小体形成后迅即被周围具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解（图8-2）。整个凋亡过程中胞膜保持完整，没有细胞内容物的外漏，因而不伴有局部的炎症反应。 图2-2 细胞凋亡与坏死的比较 （二）细胞凋亡的生化改变
细胞凋亡过程中可出现各种生化改变，其中DNA的片段化断裂及蛋白质的降解尤为重要。 1.DNA的片段化细胞凋亡时DNA链的断裂有三种方式。最多见的一种断裂方式是核小体间DNA链断裂，是内源性核酸内切酶（endogenous nuclease)被激活所致。 组成染色质的基本结构单位是核小体，核小体之间的连接区易受内切酶的攻击而发生断裂。DNA链上每隔200个核苷酸就有1个核小体，当内切酶在核小体连接区切开DNA时，即可形成180～200bp 或其整倍数的片段。这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯”状（ladder pattern）条带，这是判断凋亡发生的客观指标之一。因此，DNA片段化断裂是细胞凋亡的关键性结局。 2.内源性核酸内切酶激活及其作用在细胞凋亡过程中执行染色质DNA切割任务的是内源性核酸内切酶，这导致DNA断裂成核小体倍数大小的片段，在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的阶梯状DNA 区带。内源性核酸内切酶多数为Ca2+/Mg2+依赖的，但Zn2+可抑制其活性。 3.Caspases的激活及其作用Caspases是目前研究得最清楚的细胞凋亡执行者。这是一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，全名为含半胱氨酸的门冬氨酸特异蛋白酶。目前已发现该蛋白酶家族有10多个成员，第一个被发现的caspase是ICE(interleukin-Iβconverting enzyme,ICE)，即caspase-1，随后又发现了一系列的caspase，曾被分别给予了不同的
目录 摘要 (1) 关键词 (1) 1 前言 (1) 2 应用开发现状 (1) 2.1 资源 (1) 2.2 化学成分 (1) 2.2.1 酚性类成分 (2) 2.2.2 萜类化合物 (2) 2.3 检测现状 (2) 3 杀虫机理 (2) 3.1 毒理学性质 (2) 3.2 致死过程 (3) 3.3 导致细胞凋亡 (4) 4 对人体的潜在危害 (4) 4.1 对人有致死性 (4) 4. 2 造成环境污染 (4) 4.3 对健康的危害 (4) 参考文献: (5)
论述鱼藤酮的杀虫机理 XXX 摘要:鱼藤酮是一种毒性极强的杀虫剂，本文论述了鱼藤酮的发展状况，分析了其化学成分，主要论述了其杀虫机理，也辩证的讨论了鱼藤酮对人类的潜在危害。 关键词:鱼藤酮杀虫机理农药 1 前言 鱼藤酮目前是一种比较完善的植物源生物杀虫剂，具有对害虫的广谱作用大，对天敌干扰少，在环境中易于降解，资源丰富等特点。且可防治的有害生物种类多[1]。对果树、蔬菜、茶叶、花卉及粮食作物上的数百种害虫有良好的防治效果，对哺乳动物低毒，对害虫天敌和农作物安全，是害虫综合治理上较为理想的杀虫剂，被广泛应用于蔬菜、果树等农作物和园林害虫的防治。其市场发展空间极其广阔，为了顺应绿色食品发展的要求，近年来我国鱼藤酮产品的发展十分迅速[2]。目前市场中销售制剂中大多是乳油，也有少数是可湿性粉剂。本文就鱼藤酮的应用开发现状进行了论述，主要论述了鱼藤酮的毒理学性质，以及在及在长期的应用过程中对人和生态系统的潜在危害。 2 应用开发现状 2.1 资源 鱼藤酮的资源十分丰富，目前发现的总共有68种豆科植物含有鱼藤酮，主要分布于鱼藤属、尖荚豆属和灰叶属植物中。生长于东南亚各国的豆科鱼藤属植物毛鱼藤，毛鱼藤的根、茎中的鱼藤酮含量都很丰富。是目前我国鱼藤酮相关产业的主要原料。此外，生长于非洲的山毛豆是鱼藤酮的一种新资源。其植株的叶片、豆荚、根、种子、茎秆等多个部位都含有活性成分，是豆科植物中一种优秀的杀虫植物，对很多害虫具有生物活性。对这种植物有许多地方进行了栽培，比较成功的有秘鲁尖荚豆属植物基地，是目前世界上面积最大的[3]。 2.2 化学成分 据很多国内外的文献报道，鱼藤酮的化学成分主要以黄酮、异黄酮，鱼藤酮为主，还有萜类，单苯环类和脂肪族类化合物。
名词解释： 1蛋白质的一级结构 2蛋白质的三级结构 3结构域 4蛋白质的四 级结构 5蛋白质的等电点 6蛋白质的变性 7肽单元 8肽键 9模体10 16酶 26 循环 41ATP 51酶的区 72转录基因 95回文结构102限制性核酸内切酶103基因组文库104质粒105转化106转导107PCR 108 克隆109DNA重组110受体111G蛋白 112第二信使113蛋白激酶114自身磷酸化115小G蛋白 问答: 1什么是蛋白质的二级结构？它主要有哪几种？2简述α-螺旋结构特征3简述常用的蛋白质分离纯化方法4简述谷胱甘肽的结构特点和功能5哪些因素影响蛋白质α—螺旋结构的形成或稳定6简述细胞内主要的RNA及主要功能7简述真核生物mRNA的结构特点8简述B-DNA的结构要点9简述Chargff规则10什么是单纯酶？什么是结合酶？酶辅助因子有几类？11何为酶的特异性（专一性），举例说明酶的特异性有几种？12何为酶的活性中心，酶的必需基团？13何谓酶促反应动力学？影响酶促反应速率的因素有哪些？14什么是同工酶及同工酶的生物学意义？15试说明酶变构调节的机制及生物学意义? 16什么是酶的化学
修饰调节？有何特点？17什么是酶的可逆抑制，不可逆抑制？可逆抑制有几种？各有何特点？18简述糖酵解的关键酶反应19简述磷酸戊糖途径的生理意义？20简述三羧酸循环的要点21简述三羧酸循环的生理意义22写出三羧酸循环中的脱氢酶促反应23简述糖异生的关键酶反应24简述乳酸循环形成的原因及其生理意义25简述6-磷酸葡萄糖的代谢途径及其在糖代谢中的作用26比较糖的有氧氧化与无氧氧化的特点27 6-磷酸葡糖糖在肝脏的代谢去路有哪些？28简述酮体的生成过程29简述血浆脂蛋 白的分类，来源及主要功能 30简述磷脂酶的种类及其作用特点31 1分子软脂酸彻底氧化分解净生成多少分子ATP？请写出计算依据32乙酰CoA在脂类代谢中的来源与去路33简述呼吸链的组成及各复合体的主要作用34氧化磷酸化的抑制剂分哪几类？请举例分别说明其作用特点35简述NADH氧化呼吸链，如果鱼藤酮错在时其结果如何？36影响氧化磷酸化的因素有哪些，请简述其主要作用37胞浆中NADH是通过何种机制转运而进入线粒体的？ 以肝细胞为例，说明其转运过程 38 40 43 作用 48 平？ 56 58 60 6466试述参与聚合 70 73 76 的特点 作用特点84 8789简述外源性基因与载体的主要连接方式90一种可靠的DNA诊断学方法应符合哪些条件91简述基因位点特异性重组与同源重组的差别92什么是质粒？为什么质粒可作用基因载体 93简述原核表达体系和真核表达体系的优缺点94已知有一mRNA分子，怎样能使它翻译出相应的蛋白质？简述其过程。95叙述膜受体介导的信息传递途径的机制96试述胰高血糖使血糖升高的机制97说明类固醇激素的作用机制98简述细胞内小分子第二信使的共同特点99简述Ca依赖性蛋白激酶途径的信号转导过程100简述受体与配体的结合特点101简述G蛋白的结构特点，分类及作用机制102简 述野生型p53基因的抑癌机制
第一节虾蟹类养成的几种方式 第二节池塘生态学 第三节池塘的处理 第四节虾蟹类饵料生物的培养 第五节池塘水质与底质的调控 第一节虾蟹类养成的几种方式 从饵料来源、养殖形式、放养密度及机械化程度等分为依靠天然饵料为主的粗养（如港养、鱼塭养殖、生态养殖）、以投饵为主的半精养（如池塘养殖、网箱、网笼和拦网养殖）、利用现代技术人工充气、控温、调节水质的集约化精养。 第二节池塘生态学 讨论池塘生态条件与养殖生物之间的相互关系，讨论池塘生产力以及提高生产力的途径。一池塘的物理因子 太阳辐射；池塘的补偿深度（光照强度至池塘的某一深度，浮游植物的光合作用产氧量恰好等于浮游生物呼吸作用的消耗量，此深度即为补偿深度，其以上的水层称增氧层，一下的水层为耗氧层）；水温；池水的运动（混合和对流）和分层（使用增氧机）。 二池塘的化学因子 盐度：淡水（低于1），低盐度（1-10），半咸水（10-25），海水（25-34）。确定海水池塘可养殖的对象，由海水的渗透压及该种生物对渗透压的调节能力而定。在养殖过程中，尽量调节池水的渗透压在养殖对象的等渗点附近，以减少能量损耗，使其迅速生长。 海水的pH及二氧化碳平衡系统：最低出现在早上日出之前，最高在下午日落之前。 海水中溶解气体：溶解氧（来源是通过换水、空气溶入和浮游植物的光合作用，消耗是水中浮游生物、细菌和水中池底淤泥中有机物氧化分解。溶解氧的水平分布与风向、风力有密切关系，一般情况下下风处的氧气条件好于上风处，鱼虾首先出现在上风头附近；溶解氧具有明显的垂直分布，静水池塘水过深有害；溶解氧的昼夜变化很明显，白天逐渐增多，夜间迅速下降至黎明前降至很低。）；氨（来源是含氮有机物分解产生，水中缺氧时含氮化合物被反硝化细菌还原，水生动物的代谢产物一般以氨气形式排出，池塘施尿素后分解。氨也有昼夜和垂直变化，主要与池水溶解氧、水温、pH变化有关，pH升高或温度升高，氨气增多，白天中午前后开增氧机搅水）；硫化氢（缺氧条件下含硫有机物经厌氧细菌分解产生。有毒性，应保持池底有充足的氧气，在池底污染情况下经常加入氧化铁减少其产生。） 池塘中营养盐类：水中氮化合物包括有机氮（氨基酸、蛋白质、核酸和腐植酸等物质中含的氮）和无机氮（溶解氮气、铵态氮、亚硝态氮和硝态氮最先利用铵氮，其次是硝态氮，最后是亚硝酸氮）；磷酸盐存在形式有溶解的无机磷（以磷酸根和亚磷酸根形式存在）、溶解的有机磷（如卵磷脂等，在水中最终水解为磷酸和磷酸盐）和颗粒磷（悬浮于水中颗粒状的各种磷酸酯），直接利用的是溶解的无机磷盐（称为有效磷）。池塘中磷的来源主要由施肥、投饵、换水、动物排泄、生物尸体分解和淤泥中释放而来。碳酸盐类（包括碳酸氢盐和碳酸盐，水中重要的营养要素，也是保持水环境平衡的重要因子）。 三池塘的生物环境 人工控制的生态系，由生产者、消费者和分解者三部分组成。 生产者：植物，主要是浮游藻类和底栖藻类。浮游藻类：第一类是微型蓝球藻类为优势种的池水（蓝绿色或黄绿色，繁殖过盛发生藻败时常引起虾发病和死亡），第二类是以硅藻为优势种的类群（高盐度池塘，水色呈黄褐色或褐绿色，利于鱼虾生长），第三类是以金藻为优
1*天然药物化学研究的内容有哪些？ 答：天然药物中各类化学成分的结构特点、理化性质、提取分离与鉴定方法，操作技术及实际应用。 2*如何理解有效成分和无效成分？ 答：有效成分是指天然药物中经药效实验筛选具有生物活性并能代表临床疗效的单体化合物，能用结构式表示，具有一定的物理常数。天然药物中不代表其治疗作用的成分为无效成分。一般认为天然药物中的蛋白质、多糖、淀粉、树脂、叶绿素、纤维素等成分是无效成分或杂质。 3*天然药物有效成分提取方法有几种？采用这些方法提取的依据是什么？ 答：①溶剂提取法：利用溶剂把天然药物中所需要的成分溶解出来，而对其它成分不溶解或少溶解。②水蒸气蒸馏法：利用某些化学成分具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的性质。③升华法：利用某些化合物具有升华的性。 4*常用溶剂的亲水性或亲脂性的强弱顺序如何排列？哪些与水混溶？哪些与水不混溶？ 答：石油醚>苯>氯仿>乙醚>乙酸乙酯>正丁醇（与水互不相容）> 丙酮>乙醇>甲醇>水（与水相混溶） 5*两相溶剂萃取法是根据什么原理进行？在实际工作中如何选择溶剂？ 答：利用混合物中各成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的目的。实际工作中，在水提取液中有效成分是亲脂的多选用亲脂性有机溶剂如苯、氯仿、乙醚等进行液‐液萃取；若有效成分是偏于亲水性的则改用弱亲脂性溶剂如乙酸乙酯、正丁醇等，也可采用氯仿或乙醚加适量乙醇或甲醇的混合剂。 6*色谱法的基本原理是什么？ 答：利用混合物中各成分在不同的两相中吸附、分配及其亲和力的差异而达到相互分离的方法。 7*聚酰胺吸附力与哪些因素有关？ 答：①与溶剂有关：一般在水中吸附能力最强，有机溶剂中较弱，碱性溶剂中最弱；②与形成氢键的基团多少有关：分子结构中含酚羟基、羧基、醌或羰基越多，吸附越牢；③与形成氢键的基团位置有关：一般间位＞对位＞邻位；④芳香核、共轭双键越多，吸附越牢；⑤对形成分子内氢键的化合物吸附力减弱。 8*简述苷的分类。 答：据苷键的构型不同分为α-苷、β-苷；依据在植物体内的存在状态不同，可分为原生苷和次生苷；依据苷的结构中单糖数目的不同，可分为单糖苷、双糖苷、三糖苷；依据苷元结构不同，可分为黄酮苷、蒽醌苷、香豆素苷；依据糖链的数目不同，分为单糖链苷、双糖链苷；依据苷的生物活性，分为强心苷、皂苷等。 9*简述苷键酸水解的影响因素。 答：①苷原子不同，水解难以顺序：N-苷>O苷>S苷>C苷②呋喃糖苷较吡喃糖易水解③酮糖苷较醛糖苷易水解④吡喃糖苷中C5取代基越大越难水解。⑤吸点子基的诱导效应，尤其是C2上取代基的吸点子基对质子的竞争吸引，使苷键原子的电子云密度降低，质子化能力下降，水解速度下降⑥芳香族苷因苷元部分有供电子基，水解比脂肪族苷容易。 10*如何用化学方法鉴别：葡萄糖、丹皮苷、丹皮酚。 答：三种样品分别做α-萘酚-浓硫酸反应，不产生紫色环的是丹皮酚。产生紫色环的，再分别做斐林反应，产生砖红色沉淀的是葡萄糖，不反应的是丹皮苷。 11*为何《中华人民共和国药典》规定新采集的大黄必须储存两年以上才可药用？