无血清培养基的市场调查报告
第一章无血清培养基概述
通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞不能增殖。目前，血清培养基中通常添加的比较好的血清是牛血清。经研究发现细胞培养中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的风险：由于不同批次牛血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差：制品中残留的牛血清易引起接种者对血清的过敏反应。
无血清培养基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顾名思义，就是在细胞培养中不需要添加血清，但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可简化纯化和鉴定各种细胞产物的程序，避免病毒污染造成的危害。
一、无血清细胞培养基及其优缺点
（一）无血清培养基及分类
无血清培养基是继天然培养基，合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比较，无血清培养基是不含动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。无血清培养技术也是阐明细胞生长，增值，分化及基因表达调控的基础研究问题的有力工具。
目前，无血清培养基的研究有两个方向：一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分；二是培养基中不含有不明确的添加组分。依此可以将当前应用较多的无血清培养基归纳为以下四种：
1.一般意义上的无血清培养基，用各类可代替血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白（BSA），转铁蛋白，胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高，添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。
2.无动物来源培养基：许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。
3.无动物蛋白培养基：培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。
4.化学组分限定培养基，此类培养基是目前最安全的，最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组分。其特点是培养基的性质确定，配起培养基来也比较方便。
（二）无血清培养基的优缺点
无血清培养基的优点：
1. 可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。
2. 避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。
3. 避免血清组分对实验研究的影响。
4. 有利于体外培养细胞的分化。
5. 可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。
6. 组分稳定，可大量生产。
7. 不含有丝分裂原抑制剂，可以促进细胞增殖。
无血清培养基的缺点：
⒈细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不
如传统的合成培养基方便。
2. 成本较高。
3. 针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。
4. 处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方，对生长
因子和细胞因子的选择尤为重要。而且在去除血清的同时，也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用，因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。
二、无血清培养基组成及主要添加因子
无血清培养基由营养完全的基础培养基添加激素，生长因子，贴壁因子和结合蛋白而组成。
（一）基础培养基
早期用于细胞培养的基础培养基有血浆凝块，淋巴液，大豆蛋白胨和胚胎浸膏等天然培养基。1950年Morgan等在前人的研究基础上研究出199培养基，是动物细胞培养基发展到一个崭新的阶段，及合成培养基阶段。合成培养基是按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等组合成的基础培养基。目前市场上已经有上百种的合成培养基商品。在众多的合成培养基中，MEM、DMEM、RPMI 1640、F12、和TC100的使用最为广泛。
基础培养基的成分是完全已知的，因此在对不同的细胞株进行培养时可以对基础培养基的某些组分进行相应的调整，以更好的符合细胞株的营养要求或提高目的蛋白的表达量。
（二）主要添加因子
又称补充因子，是代替血清的各种因子的总称。多数无血清培养液必须补加3—8种因子，任何单一因子都不能取代血清。已知有100多种此类因子，其中有些是必须补充因子，如胰岛素、亚硒酸钠和转铁蛋白，其他多数为辅助作用的因子。
按其功能不同，我们可将补充因子分为四类：
1.激素和生长因子
很多细胞用无血清培养时需要加入激素，如胰岛素、生长激素、胰高糖素等。几乎所有的细胞系都需要胰岛素，它是一种多肽，能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物，促进RNA、蛋白质和脂
肪酸的合成，一致细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。细胞无血清培养中，胰岛素的使用浓度为
0.1-10μg/ml。Jan等认为在批式培养中胰岛素迅速耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。此外甲状腺素等和甾体类激素中的孕酮、氢化可的松、雌二醇等也是无血清细胞培养是常用的补充因子。不同细胞株对激素的种类和数量要求有所不同。
生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。按化学性质可分为多肽类生长因子和甾类生长因子。无血清培养基中添加的生长因子主要是多肽类生长因子，近些年已鉴定的多肽类生长因子已有20-30种，其中半数以上都可以通过基因重组的手段获得相应的重组生长因子。无血清培养基较常见的生长因子有表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和神经生长因子（NGF）等。生长因子是有效的促有丝分裂原，能缩短细胞群体倍增时间。
2.结合蛋白
结合蛋白有两种，一种是转铁蛋白，另一种是白蛋白。
大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体，受体与转铁蛋白与铁离子的复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合。不同细胞对转铁蛋白的需要量也不同。
白蛋白也是无血清培养基中常用的添加因子。它通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定和调节上述物质在无血清培养基中活性的作用，此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用。
3.贴壁因子
绝大多数的真核细胞在体外生长时需要固着在适宜的基底上。细胞固着作用是一个复杂的过程，包括贴壁因子吸附于器皿或载体的表面。细胞与贴壁因子的结合等。无血清培养中常用的贴壁因子有细胞间质和血清中的成分，如纤粘连蛋白、胶原、昆布氨酸和多聚赖氨酸等。
4.其他添加因子
一些细胞系的无血清培养还需要补充某些低分子量的化学物质，如微量元素、维生素、脂类等，维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢，维生素C和维生素E具有抗氧化作用。丁二胺和亚油酸等提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质。
三．无血清培养基的应用
目前在大规模动物细胞的培养中已经普遍适用于无血清培养基。在疫苗生长、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养，降低生产成本。在人类细胞培养中，应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。在无血清培养条件下，某些细胞的生长量和抗体的产量甚至较有血清时高出数倍。
除生产生物制品外，无血清培养基也被广泛应用于细胞生物学、药理学、肿瘤学领域：
（1）研究细胞的分化条件：无血清培养基其组成可以是完全确知的化学物质，因而可根据研究的需要增减具有重要生物活性物质的种类和数量。这就为研究细胞分化的条件提供了有效的手段。
（2）用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究。
（3）用于从多种细胞混杂的培养中选择目的细胞：通过对无血清培养中的某些成分的取舍，可抑制原代组织培养物中非目的细胞的过度生长，达到选择目的细胞的目的。
（4）肿瘤病理学和病因学的研究：如用于研究致癌因子对细胞的影响，研究肿瘤细胞对可能触发正常细胞终末分化的外周信号的反应能力，或用于研究正常细胞与肿瘤细胞的生长和移行与基底膜信号的关系等。
（5）无血清培养基在生物制品生产中的得到广泛应用，国内外的很多生产单位都在致力于如何将无血清培养基与发酵罐培养技术更好的结合应用。
另外，无血清培养基还广泛应用于干细胞和免疫细胞的研究和临床治疗中。且在此领域对无血清培养基的需求量最大而且最迫切。
第二章竞争对手
第一节国际竞争对手
调查方法：在对方公司网站上获取产品信息。以武汉大学研究生身份，以从事干细胞研究，需培养干细胞为由向其国内的代理公司发邮件询价获得产品价格和产品的详细资料。
Invitrogen旗下Gibco品牌（以下关于Gibco的内容，除价格部分是通过网络询价获取外，其他皆从该公司网站上截取）
（一）减血清培养基Advanced? media - require less sera
减少血清用量具有许多好处
（1）减少血清用量可以解决许多日常细胞培养中面临的成本、供货、质量、一致性和法规问题。
（2）以更低的成本获得可重复的结果（dvanced? DMEM, DMEM/F-12, RPMI, and MEM）可重复的结果：血清批间差较小意味着细胞培养条件的变化比较小
降低了成本：血清用量少并且测试的批次量也更少，因而降低了实验室开支
GIBCO? Advanced? media are enhanced basal media formulations of DMEM, DMEM/F-12, MEM, and RPMI 1640. 这些培养基含有丰富的正常血清成分，使用时所需的FBS 更少(50–90%)，却能获得相同或更好的细胞生长效果，并且在许多常用细胞系，没有发现细胞形态或功能的改变
对于许多标准细胞系而言，可以直接使用Advanced? 培养基取代传统培养基。对几种细胞系的研究表明，与传统培养基(5% FBS) 相比，Advanced? 培养基(1–2% FBS) 可提供相同或更好的生长效果，同时也不会使细胞发生形态上的改变（图1）。由图中可以看出，使用更少的血清获得相同的生长效果
Standard RPMI 1640 supplemented with 4 mM L-glutamine and 5% FBS was compared to Advanced? RPMI 1640 supplemented with 4 mM L-glutamine and 5%, 2%, 1%, or 0.5% FBS.以合适的
密度分别将SP2、Jurkat、VERO、Raji 和Daudi 细胞接种在25-cm2烧瓶中，并于37?C、含5% CO2和95% 空气的增湿培养箱中培养两代，每四天传代一次。第三代时，将细胞适当地接种至24 孔板中，并如上所述孵育七天。第 5 天的平均细胞计数（三个平行样品）记录如下。
Figure 1. Growth comparison of multiple cell
es in standard RPMI 1640 supplemented with
% F BS to Advanced? RPMI 1640 supplemented
th 0.5% to 5% FBS.
图一
应用：
a．推荐用于待测细胞系的添加剂；
b．直接替代基础培养基。
对于大多数应用和多种细胞系而言，无需通过逐步切断养分或驯化的方法，即可将血清添加剂至少减少50%。Provided in a 1x liquid format, Advanced? DMEM, DMEM/F-12, MEM, and RPMI 1640 only require the addition of GlutaMAX?-I Supplement or L-glutamine and the appropriate reduced amount of serum to make complete media.
Advanced? 培养基是值得信赖的GIBCO? 产品
GIBCO? 产品以顾客需求为中心，自始至终都保持高品质、创新和优质服务。 GIBCO? 产品始终提供最佳的质量、一致性和性能，使结果持续可靠。种类最广泛的细胞培养产品、一流的服务和久经验证的性能- GIBCO? 产品的质量和一致性让用户放心。当重复性好的结果至关重要时，请使用GIBCO? 产品。
Ordering Information
12491-023
Advanced D-MEM (Dulbecco's
Modified Eagle Medium) (1X), liquid
10 × 500 ml 2075 RMB
(二)无血清培养基
HyQ? CCM1 无血清培养基
蛋白质含量为2.1mg/ml，适用于多种骨髓瘤融合细胞和杂交瘤细胞。无需细胞驯化。
HyQ? CCM1，（液体）含酚红。
SH30043.02
SH30043.03 500ml
1000ml
293.00
518.00
HyQ? CCM1，（液体）不含酚红。
SH30036.02
SH30036.03 500ml
1000ml
293.00
518.00
HyQ? CCM1，（干粉）含酚红。
SH30058.03
SH30058.04 10L
50L
2454.00
11362.00
HyQ? CCM1，（干粉）不含酚红。
SH30059.03
SH30059.04 10L
50L
2454.00
11362.00
HyQ? SFX-Mab 无血清培养基（液体）
蛋白(牛转铁蛋白)含量20g/ml,极适合生物反应罐系统使用。细胞驯化过程简单甚至不需要。SH30206.03
SH30206.01
500ml
1000ml
336.00
570.00
HyQ? PF-Mab (100X)（液体）一种不含任何蛋白的100 倍浓缩液，加入RPMI-1640
可使杂交瘤细胞的抗体生产达到最佳状态。并且大量省下游纯化费用。能适于鼠、兔、人及嵌合杂交瘤细胞的生长和单克隆抗体的生产。SH30138.01
SH30138.02
100ml
1000ml
1642.00
7308.00
昆虫细胞培养基(Insect Cell Culture Medium)
HyQ? CCM3 无血清培养基
为SF9昆虫细胞培养设计。同时适合于HighFive TM和TN-368细胞系，细胞生长迅速。驯化过程简单。
HyQ? CCM3(液体)
SH30065.01
SH30065.02 500ml
1000ml
275.00
489.00
HyQ? CCM3(干粉)
SH30061.03
SH30061.04 10L
50L
1835.00
7776.00
HyQ? SFX-Insect无血清培养基（液体）
为SF9、Sf21、High Five 及其它一些昆虫细胞而设的无血清培养基。细胞生长紧密，目的蛋白产量高，使之成为工业生产中理想的选择。SH30278.01
SH30278.02
500ml
1000ml
356.00
661.00
HyQ? SFX-Insect无血清培养基（干粉）
干粉形式的SFX-Insect无血清培养基。稳定性和性价高，尤其适用于大规模生产重组蛋白。含谷氨酰胺，
不含酚红。SH30350.04
SH30350.02
SH30350.03
1L
5L
10L
195.00
945.00
1835.00
HyQ? TNM-FH无血清培养基（液体）改进的GRACE昆虫细胞培养基,特别适用于培养
hoplusia ni 细胞。若加入10%的昆虫细胞专用特级胎牛清（SH30070I ），可用于多种昆虫细胞的培养，尤其适用于转用无血清培养基SFX-Insect之前细胞的前期培
养。SH30280.02
SH30280.03
500ml
1000ml
309.00
562.00
HyQ? IPL-41无血清培养基（干粉）
通常用做无血清驯化的基础培养基。若加入血清也可用于Spodoptera frugiperda 细胞的培养。SH30282.01
SH30282.02
SH30282.03
SH30282.04
5L
10L
50L
100L
293.00
495.00
2104.00
3787.00
HyQ? BEVS-PlaKit杆状病毒噬斑检测试剂盒
采用噬斑法进行杆状病毒表达载体的筛选、纯化和
量测定。包括噬斑试验所需全部试剂。使用方便，测
快速，并有良好的批间稳定性和可重复性。每盒可进
行50次测定，适用于重组和野生菌株。
SH30340 盒4600.00 CHO细胞培养基(Chinese Hamster Ovary Cell Culture Medium)
HyQ? CCM5 无血清培养基（液体）
蛋白含量为0.37mg/ml，用于CHO及其衍生细胞株的浮和贴壁培养。可在多种生物反应系统中使用。通常无需适应期。大大节省下游纯化费用。SH30100.02
SH30100.03
500ml
1000ml
297.00
522.00
HyQ? SFX-CHO无血清培养基（液体）
蛋白含量10μg/ml。专为CHO细胞及其衍生细胞株的浮培养而设计。几乎无需适应期。是生产和纯化重组
蛋白的上佳选择。SH30187.01
SH30187.02
500ml
1000ml
302.00
551.00
HyQ? PF-CHO无蛋白培养基（液体）
完全不含蛋白，用于CHO及其衍生细胞株的悬浮培。几乎无需适应期。极有利于重组蛋白的生产和纯化。
含谷氨酰胺，含酚红。SH30220.01
SH30220.02
500ml
1000ml
311.00
575.00
HyQ? PF-CHO无蛋白培养基（液体）
含谷氨酰胺，不含酚红。
SH30298.01
SH30298.02 500ml
1000ml
311.00
575.00
HyQ? PF-CHO MPS 无蛋白培养基（干粉）
由两种干粉构成的无蛋白培养基。为细胞悬浮培养计。除具有与HyQPF-CHO液体无蛋白培养基相同的特外，稳定性更好，价格更便宜。尤其适合大规模生产
和纯化重组蛋白。SH30333.01
SH30333.02
SH30333.03
SH30333.04
SH30333.05
5L
10L
50L
100L
1000L
1018.00
1909.00
8970.00
16905.00
158700.00
HyQ? PF-CHO LS 无蛋白培养基（液体）
含4mM谷氨酰胺和0.1%丙酮酸钠，不含酚红。
SH30359.01
SH30359.02 500ml
1000ml
333.50
570.40
其它无蛋白培养基
HyQ? PF-293无蛋白培养基（液体）专为HEK293细胞系的高密度悬浮培养设计，完全不
蛋白成分。腺病毒滴度和重组蛋白产量均高于其它培基。细胞可快速适应（包括从贴壁状态转化为悬浮生）。下游纯化大为简化甚至不需要。含4mM谷氨酰胺，
不含酚红。SH30356.01
SH30356.02
500ml
1000ml
322.00
552.00
HyQ? PF-293 MPS无蛋白培养基（干粉）
稳定性更好，价格经济。不含谷氨酰胺，不含酚红。SH30355.01 5L 1610.00
SH30355.02 10L 2760.00 HyQ? PF-Vero 无蛋白培养基（液体）
第二节国内竞争对手
国内生产无血清培养基的较知名企业有广州赛业，北京清大众一等，但国内生产的无血清培养基无论从质量上还是从口碑上都与GIBCO和Hyclone的产品相去甚远，且产品线尚不完善。
第三章无血清培养基市场容量分析
无血清培养主要用于生命科学领域，所有需要进行细胞或组织培养的机构均需使用。目前国内外生产厂家规模小，产量低，尤其是国内厂家，尚没有进行大规模生产的厂家。随着实验技术的进步，对无血清培养基的需求越来越大。本项目产品适用培养的细胞谱较广，有望占领大部分国内市场甚至一部分国际市场。
无血清培养基在进行干细胞培养方面具有巨大的市场潜力，市场容量和市场需求量都不可估量。在各国政策的鼓励下，目前国内外从事干细胞研究和治疗的机构众多。有报道称：2009年，全国的干细胞实验室有50个。而到今年，这个数字应该是以几何指数增长。目前，全球有229家公司从事干细胞治疗心脏病的研究。预计干细胞治疗心脏病的市场总额在2012年将达到35亿美元。在美国，组织工程产品正以每年市值增加22.5%的速度成为国民经济的支柱产业之一。同样，干细胞治疗的市场规模也在不断扩大，预计到2012年心脏病的干细胞治疗市场规模将达35亿美元。我国SFDA已逐渐放宽对人类胚胎干细胞临床试验的限制，而据生物谷研究院统计，在接下来的五年中，中国的干细胞与再生医学相关领域的市场规模将达到60亿元，不论是临床研究的准入标准，还是干细胞研究的研发外包，甚至关联与干细胞与再生医学研究服务的机构，都将在这个产业链中占有巨大的市场份额。因此在全球再生医学产业化形成的初期及早介入，将在下一轮产业爆发过程中占得先机。
温家宝总理2009年在中科院成立60周年纪念活动及与首都科技界大会上的重要讲话中指出：“目前，世界主要发达国家的干细胞研究发展势头强劲。干细胞研究促进了再生医学的发展，这是继药物治疗、手术治疗之后的又一场医疗革命。我们要力争在干细胞研究的更多领域取得领先地位”。从当今的发展趋势看，再生医学已是现代临床医学的一种崭新的治疗模式，对医学治疗理论、治疗和康复方针的发展有重大的影响，也是近年来包括中国在内的世界各国政府重点发展和研究的高新科技领域之一。
从近年来的快速发展和再生医学所展现的前景看，它已经成为医学研究领域中的一个新的学科，重视再生医学不仅是学科发展、临床应用的需要，同时也是国际竞争的需要[1,2]。目前我国已形成了一支优秀的干细胞研究队伍，通过加大投入，假以时日，完全有能力在干细胞与再生医学研究领域赢得一席之地甚至抢夺制高点。
1. 干细胞与再生医学已成为生物医学国际竞争的一个焦点
干细胞的商业前景及其对改善人类健康的价值无疑是巨大的，这使它成为当今国际间竞相追逐的焦点之一。到目前为止，美国、英国、德国、意大利、荷兰、法国、瑞典、比利时、捷克、以色列、加拿大、中国、日本、韩国、新加坡、印度、澳大利亚、南非、巴西等越来越多的国家和地区纷纷投入到这一领域中。正是由于干细胞与再生医学既能给现有临床治疗模式带来深刻变革，又是21世纪具
有巨大潜力的新兴高科技产业之一，因此国际上已形成了国际性的科技竞争和产业化竞争的热潮，再生生物学产品正逐步成为衡量一个国家或地区科技发展水平与健康水平的重要标志之一，世界各国均纷纷斥巨资参与这一领域的研究与开发。2000年，全球从事再生生物学产品开发的企业为66家，2002年已增至99家，其中仅美国就有50家，目前已经形成价值60亿美元的产业，并以每年25%的速度递增。据预测，到2015年左右，美国的再生医学产品部分将有4 000亿美元的营业额，倘若加上治疗前后的相关费用，市场将会达到10 000亿美元，成为美国经济的支柱性产业之一。
我国是世界第一人口大国，因创伤、疾病、遗传和衰老造成的组织器官缺损或功能障碍人数位居世界之首。我国每年烧伤、烫伤病人达500万—1 000万例；乙肝病毒携带者为1.2亿，丙肝病毒携带者为1 500万人，其转化为乙型肝炎与丙型肝炎的比例分别为20%和50%，即2 400万人和750万人，部分患者将最终发展成肝硬化或肝癌，每年因终末期肝病死亡约30万人，其中约50%死于肝癌；糖尿病已成为继心脑血管性疾病和肿瘤之后位居第三位的严重危害人类健康的慢性非传染性疾病；我国60岁以上人群的帕金森氏病发病率为1.5%，70岁以上人群升至2%。我国对再生医学产品的需求将位居全球之首，但随着我国加入WHO，知识产权保护日益成为我国突出的科学技术问题，因此，加强对再生医学的研究与开发，加大投入，尽快获得拥有自主知识产权的再生医学产品成果，已是医学研究领域中的当务之急。
2 我国已具有一支相当规模的干细胞与再生医学研究队伍
围绕再生医学所开展的干细胞研究已受到世界各国政府和全世界科学家的高度重视。政府和企业均已在此领域投入巨资开展相关研究，而且大量与干细胞和再生医学有关的研究机构不断涌现，许多大学已成立专门的干细胞和再生医学研究机构，比如美国的哈佛大学、耶鲁大学、加州大学，英国的剑桥大学、牛津大学，日本的理化所、东京大学与京都大学等知名大学和研究机构均成立了再生医学研究中心或干细胞研究中心。在美国大学里干细胞实验室的数量在大幅度攀升，从事与之相关研究的人员正在以惊人的速度增加。此外，美国加利福尼亚州政府投资30亿美元建立了再生医学研究所，而且各大药物研发公司——例如著名的Pfizer，也组建了再生医学研究部门，等等。在2009年公布的中国科技发展2050年路线图中，提出了作为新兴学科的干细胞和再生医学，必须在我国大力发展的策略。作为世界上最大的资助生物医学研究的NIH也专门设立了再生医学行动计划，而且已经启动了相关的研究计划开展再生医学研究，并有著名专家呼吁NIH应设立专门的干细胞和再生医学评审组[3]。美国科学院在深入研究了干细胞与再生医学的前景后，已建议美国国会加大对干细胞与再生医学的投入。
作为再生医学基础的干细胞研究，我国与世界几乎同时启动。国家自然科学基金委在成立之初便资助过动物干细胞建系方面的研究；1999年将人类干细胞建系研究列为重点招标领域；2000年科技部也将干细胞研究列为“973”招标领域。之后我国对干细胞的研究一直给予了连续的支持，特别是iPS 技术出现后，国际上的再生医学研究呈现跨越式发展。几年来，国家和地方政府均对干细胞和再生医学有大量投入，国家科技部还设立了干细胞与再生医学的“973”和“863”专项。近期，科技部将干细胞与再生医学列为继生殖与发育、蛋白质科学、量子科学、纳米科学之后的第五个重大专项，充分反映了我国对该领域的高度重视。中科院已将干细胞和再生医学研究列入未来战略性科技先导专项，在“十二五”期间，计划投入9亿人民币资助80个以上的实验室开展相关研究。
许多从事分子生物学研究的科学家也纷纷转向干细胞和再生医学研究领域，使我国形成了一支具有一定实力、在一些领域具有鲜明特色的研究队伍。中科院已将相关的实验室组建为研究联盟，此外不少大学也成立了干细胞研究联盟，而且许多研究单位也成立了相关的部门实验室，估计从事干细胞和再生医学研究的实验室达到300个以上。国家发改委已经成立了两个干细胞工程中心，其目的就是
让再生医学走向临床。国家自然科学基金委近年受理的与干细胞和再生医学研究相关的项目也呈现急剧增加的趋势。
以上是对干细胞研究和干细胞在市场的潜力的分析，因为无血清培养基在干细胞培养方面的市场也是巨大的，所以也从侧面反映了无血清培养基的市场容量巨大。面对如此巨大的市场，对于致力于开发用于干细胞培养的无血清培养基的我们来说，无疑是一个非常好的机遇，但同时也是一场巨大的挑战。
第四章 SWOT分析
S优势
（1）我公司已有成熟产品植物源重组人血清白蛋白，以及即将出来的植物源重组bFGF，可以作为无血清培养基的添加因子。且植物源的成分可以作为一个亮点推出我们的无血清培养基。
（2）目标客户与白蛋白的目标客户基本一致。OsrHSA和无血清培养基的目标客户大多从事干细胞研究和治疗，这一点上基本是一致的，因此开发目标客户的难度相对较小。
（3）成本优势：我公司已有产品Osr HSA 和Osr bFGF，无需对外采购这两种添加组分，成本相对来说较低。
W劣势
（1）市场占领方面失去了先机。因为国内外已经有很多家公司生产出了无血清培养基，先于占领了市场；如GIBCO公司和Hyclone公司，基本上已牢牢占据无血清培养基的市场。因为这两个公司的产品口碑好，效果好，所以在一些关键点上，如干细胞临床治疗，客户多半会选择可靠性好的这两个公司的产品，而并非国内的品牌，即使国内的同类型产品价格会比较便宜。
（2）技术不成熟性。跟其它已经生产出的厂家相比，我们的技术处于很不成熟阶段；在添加因子的种类和配比优化上，尚需要比较长的研发周期以及投入较多的研发资金。
（3）我公司是做分子农业出生，对动物细胞培养特别是干细胞的培养方面并没有太深入的研究。技术方面对目标客户而言并没有说服力。
O 机遇
（1）使用无血清培养基进行细胞培养是大势所趋，特别是在干细胞培养和细胞治疗方面。因为牛血清中的一些未知成分，直接输入人体可能会造成难以估量的严重后果。另外，由于疯牛病的原因，到目前为止，我国政府仍然禁止从北美洲、欧洲和日本等地区进口牛血清，因此市面上的牛血清大多来自澳洲、南美洲，或是国产的。而是用无血清培养基，由于成分确定，对人体基本上没有什么副作用。
（2）市场巨大：国内外从事干细胞研究和治疗的机构非常多。市场容量巨大。
（3）目前国内竞争对手虽然比较多，但大都不成气候，国内尚没有一家生产无血清培养基的公司上市。
（4）目前市场上的无血清培养基售价均比较高，相对来说，利润也比较高。我公司如果研发出效果好的无血清培养基，能获得比生产Osr HSA更多的利润。
T 威胁
GIBCO和Hyclone的无血清培养基的市场占有率较高，且质量和口碑都非常好。想在这个市场分一杯羹，除了生产出性价比更有的产品外，还需做大量的市场工作。
第五章结论
无血清培养基的研究和生产是可行的。建议公司可以“植物源重组”为特色生产无血清培养基，即培养基里添加的因子全部是植物源重组来源的，如植物源重组人血清白蛋白、植物源重组碱性成纤维细胞因子、植物源重组转铁蛋白、植物源重组胰岛素等。
但是考虑到公司目前的现状，我觉得公司把重点放到这一块，若是进行大规模生产的话其实是不理智的，因为公司规模不大，研发资金、生产资金、研发人员、生产人员及其销售人员等并不能全面的配比，也就是现在公司资金、技术、人员等条件都还不成熟，在现有的条件下无法做到对公司现有产品和这个项目的有效兼顾，有可能导致顾此失彼的现象。
无血清培养基的市场无疑是可观的，考虑到以上情况，建议公司可以先进行研发但不需要大规模生产，以现有的产品为主打产品，无血清培养基为辅助产品；由于GIBCO和Hyclone在市场上已经有了一定的地位，那么我们在进行宣传销售时最好避其锋芒，采取技巧型方式，可以进行捆绑宣传销售，因为我们的产品都是有植物源重组这个特色的，我们宣传销售时，紧抓这一点两者一起宣传销售，以现有产品为主打，极力打造现有产品的品牌效应，同时提高无血清培养基的知名度；在销售时，还可以采取优惠购买方式，购买现有产品的情况下，可以优惠出售无血清培养基。这样无论生产、宣传还是销售都可以节约成本，并且两者相互影响可以同时提高其知名度，打造品牌效应，而公司也会更加得心应手。
人干细胞无血清/无饲养层培养基 Stemmera TM人无血清/无饲养层培养基（SFM）是在无血清和饲养层情况下，用于培养人的干细胞能支持干细胞的生长，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。 规格: 500ml 产品描述： Stemmera TM人ESCs/iPSCs无血清/无饲养层培养基(hStemSFM)是一种成分明确的即用型培养基，特殊的配方，在完全无血清和无饲养层环境下能用于人诱导多能干细胞（hiPSCs）和胚胎干细胞(hESC)的重编程、增殖和维持。 产品成分： 两种成分混合后是一种即用型完全培养基 存储和运输： Stemmera TM hStemSFM中的两种成分是分开运输的，基本培养基在室温下运输然而SFM添加物是在干冰环境下运输。在收到产品后基本培养基需存储在2-8°C环境中而SFM 需要存储在-20°C，避免多次冻融。完全培养基储存在2-8°C的黑暗环境中能使用长达1个月。完全培养基分成等份的供每日使用，避免反复预热，避光保存最佳。 产品使用：该产品是仅用于体外使用和研究使用。不可用于人类或动物的诊断或治疗使用。 使用注意事项： 1.使用aerosol barrier枪头，每次用完更换新的枪头。 2.要用新的，干净的手套和穿实验服。 3.材料安全数据表（MSDS）可在网站下载。
4.用70%乙醇或其他合适的消毒剂清洁工作空间。 培养条件: 培养基：Stemmera TM hStemSFM。 细胞：人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）。 培养类型：单细胞传代和贴壁培养。 温度范围：37°C。 孵育器的环境：在含5% CO2或5% O2的潮湿环境中，确保适当的气体交换，减少与外界接触。 建议培养容器：基质胶包被的板子、皿或烧瓶（Corning，货号：356231，稀释比1:100），根据容器的大小，调整细胞数量。 操作手册: ?完全SFM培养基的制备：添加3.5ml冷冻SFM添加物（货号 ST02001-S1）到500ml 基础培养基中（货号st02001-bm 500ml），搅拌均匀，0.22μM滤膜过滤。 ?将完全培养基分成等份并在室温下预热SFM供每天使用。。 ?Corning基质胶包被培养容器：使用Corning基质胶（货号356231，稀释比1:100）包被容器，在5% CO2或5% O2（低氧孵育器）的孵育器中37 o C孵育至少30min或过夜。 已包被的容器能在一周内使用。使用前，立即倒掉所有的基质胶，更换预热的完全Stemmera TM hStemSFM培养基。 注意：所有成分在有效期内存储在黑暗的2-8o C环境中，完全培养基StemmeraTM hStem SFM 能稳定储存时间长达4周。 在完全培养基hStemSFM 中hiPSCs 和hESCs的复苏 1.37°C水浴迅速解冻一小瓶冷冻人干细胞。 2.用移液管轻轻将小瓶中的所有干细胞都吸入含完全培养基的15ml无菌离心管中。 3.在1000转下离心5min。 4.吸弃上清液，尤其小心避免干扰细胞颗粒。 5.在含10nM Rock 抑制剂Y27632（Fisher Scientific, 货号50-863-7）的1ml预热完全培 养基中重悬细胞。
[17] FDA news FDA add boxed waming for heart2related risk to antrdinbetes drug A vandial[E B/OL].2007211214.http// www.fdagov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW0173him1. [18] EMEA:Questions and answers on the benefits and risk of rosiglitazone[EB/OL].2007210218[2007212215]. http//www.emeaeuropaeu/pdfs/human/press/pr/48446407 en pdf. [19] 张杰.罗格列酮心血管安全性问题尚需监测与进一步 评价[J].中国临床药理学杂志,2008,24(1):92294. [20] Lars Slordal,Olav Spigset.Heart Failure Induced by Non2Cardiac Drugs[J].Drug Safety,2006,29(7):5672 586. (收稿日期:2009202219)无血清培养基的研究进展 梁 菁,李多伟(西北大学生命科学学院,陕西西安710069) 摘要:目的 总结无血清培养基的组成、主要补充因子及作用、应用以及新近研究进展,为细胞培养等研究工作提供参考。方法 查阅国内外文献资料进行整理和归纳。结果 无血清培养基克服了完全培养基的种种弊端,且关于无血清培养基的研究取得了诸多进展。结论 无血清培养基在生产实践中已得到广泛应用,进一步提高其通用性、降低成本、用于大规模生产的方法有待探索。 关键词:无血清培养基;补充因子;研究进展 中图分类号:R97 文献标识码:A 文章编号:100422407(2009)0420325203 动物细胞培养技术近年来发展迅速。传统的含血清培养基中的血清给生产与科研带来多种不利因素。血清的主要作用在于给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质,但其存在多种缺点:具有批间差异、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化、容易被病毒和支原体感染;血清昂贵,可能发生供应紧张,血清的来源不稳定等问题。无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分,既能满足细胞的培养要求,又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因而无血清培养基得到了越来越普遍的应用,而且无血清培养基技术也迅速发展并取得了许多进展。1 无血清培养基的发展过程 无血清培养基的发展大致经过了三代,第四代培养基的研制开发并投入市场将成为发展趋势[1](见表1)。 表1 无血清培养基的发展过程 成分优缺点 第1代不含血清,但含有大量的动物或 植物蛋白如BSA和动物激素等。蛋白含量高(低于有血清培养基),不利于目标蛋白的分离纯化,降低回升率,增加成本。 第2代完全不用动物来源蛋白(无动物 衍生蛋白)。降低生产成本,加快报批的速度(目前市面上销售的主要产品)。 第3代完全没有蛋白或含量极低。化学成分确知,细胞培养与生产容易做到恒定, 分离纯化容易,成本低,管理容易。仅限于应用 几株细胞系。 第4代无血清,无蛋白。适合多种不同细胞生长并可高温消毒。2 无血清培养基的组成及其主要补充因子 无血清培养基一般认为是由两部分组成,即基础培养基和替代血清的补充因子。 2.1 基础培养基 无血清培养基的基础培养基一般为与所需培养细胞相应的合成培养基,是按细胞生长需要由一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等组成的。在对不同的细胞进行培养时可根据需要对基础培养基和某些组分进行相应的调整。 2.2 补充因子 补充因子是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称。这些补充因子可使培养基既能满足动物细胞培养的要求,又能有效避免血清培养基成分不明确、有批间差异、常被病毒和支原体污染、血清来源不稳定、细胞产品不易纯化等问题。补充因子可分为如下几类[2]。 2.2.1 激素和生长因子 激素可分为多肽类激素和甾体类激素。多肽类激素有胰岛素、生长因子、胰高血糖素等;甾体类激素有孕酮、氢化可的松、雌二醇等。多肽类生长因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等[3]。 在细胞无血清培养中,胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成,抑制细胞凋亡,是重要的细胞存活因子[3]。Jan等[4]认为在批式培养中胰岛素迅速耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。氢化可的松能促进细胞贴壁和细胞分离,在某些情况下会诱导细胞生长和诱导细胞分化[3]。 2.2.2 结合蛋白 无血清培养基中的结合蛋白主要是白蛋白和转铁蛋白。白蛋白可通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定并调节上述物质在无血清培养基中的活性,此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用[1,5]。大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体,受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源,此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其它微量元素如钒等结合[6]。 2.2.3 贴壁和铺展因子 绝大多数的动物细胞在体外生长时需要固着于适宜生长的基质上,并铺展成一单层,才能开始增殖。目前在无血清培养中常用的贴壁和铺展因子有纤黏蛋白、胶原、聚赖氨酸、昆布氨酸、血清铺展因子等[1,2]。 2.2.4 微量元素和低相对分子质量营养元素 一些细胞系的无血清培养还需要补充某些低相对分子质量的化学物质,如微量元素、维生素、脂类等。微量元素能消除过氧化物酶和氧自由基对细胞的损害,维生素参与代谢、抗氧化等[3],维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢,维生素C和维生素E 具有抗氧化作用。丁二胺和亚油酸等提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质[1]。 2.2.5 酶抑制剂 有时将细胞用酶处理后会有一些酶残留,此时若不对残余的酶加以处理可能会对细胞不利,应加入相应的酶抑制剂终止残余酶的作用以达到保护细胞的作用。 3 无血清培养基的研究进展 由于近年来动物细胞体外培养技术的迅速发展以及无血清培养基在动物细胞培养中的广泛应用,与无血清培养基相关的研究在近几年来也取得了很大的进展,主要表现在以下方面。 3.1 有关无血清培养基的新方法 在人牙龈上皮细胞培养
动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容
无血清培养人脐带间充质干细胞的文献整理 人间充质干细胞培养基的发展 第一代培养基+牛血清 第二代培养基+牛血清替代品：人血清、血小板裂解液和脐带血清 第三代无血清、无动物源、成分确定的培养基 第三代人间充质干细胞培养基不含牛血清或人血清之类的血清替代品，无动物源而且成分确定，免除了异种血清带来的病原体污染风险，而且批次稳定，适合干细胞治疗的临床研究。 一知网 搜索方法 使用题名“脐带”、“间充质干细胞”和“培养”，摘要“无血清”在中国知网搜索，共18篇文献。 人脐带间充质干细胞无血清培养相关整理
二Pubmed 搜索方法 使用(Umbilical Cord[Title] AND Mesenchymal Stem Cells[Title]) AND serum free[Title/Abstract] 在Pubmed搜索，共20篇。 人脐带间充质干细胞无血清培养相关整理 参考文献 一知网 [1]赵艳坤,邵伟,雒诚龙,余雄.无血清共培养条件下脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用（英文）[J].中国实验动物学报,2017,25(04):391-398. [2]屈玟,宋磊,赵瑶,胡振波.人脐带间充质干细胞不同培养方案的比较与优化[J].海南医学院学报,2017,23(08):1009-1013. [3]孙亚如,张炳强,王福斌,许评,王二朴,李翠翠.培养体系对维持人脐带间充质干细胞特性及其体外扩增效率的影响[J].中国组织工程研究,2017,21(13):2023-2028. [4]刘宇,马明,侯俊,高雪华,陈思翔,刘月,邓银,郑东明,田奕,张蓉,陈静娴.体外培养传代人脂肪、脐带、胎盘间充质干细胞的遗传特性比较研究[J].中国细胞生物学学报,2015,37(12):1616-1622. [5]吴洁莹,陆琰,陈劲松,吴韶清,汤雪薇,李焱.脐带血血浆分离培养脐带间充质干细胞及体外扩增人脐血CD34~+细胞的研究[J].中国实验血液学杂志,2015,23(04):1112-1119. [6]任春红,张昕.无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究[J].延安大学学报(医学科学版),2015,13(01):1-4. [7]陈林,张坤,董伟,杨珂,艾辉,陈禄华.脐带间充质干细胞无血清和含胎牛血清培养体系比较[J].重
V ero细胞是日本学者Y asumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴附依赖性细胞系, V ero一词由世界语中的verde(意为绿色的)和reno意为肾脏的)两个词合并而成。V ero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，V ero细胞具有以下特点:①来源方便，可连续传代，生长速度快;②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高;③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高;④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。疫苗的接种对象主要是大范围的健康人群，其质量和安全性一直是备受关注的首要问题。疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程。血清是一种组分复杂而尚不完全明确的混合物，至少含有1 000种不同的蛋白质，总蛋白量高达60~150g/L，它能为细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分。受V ero细胞自身的贴附依赖生长特性和动物细胞培养技术发展进程的影响，本世纪之前的V ero细胞培养及病毒疫苗生产均存在着对血清的依赖。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度;从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，如引起牛海绵状脑炎的阮病毒，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患阎。 由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括V ero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势问。2010年，美国、欧盟和日本等发达国家将全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。 V ero细胞无血清培养基的研究和商业开发 1.1 V ero细胞无血清培养基的研究 培养基是影响体外培养细胞生长代谢、增殖乃至生存的最直接和最重要的环境因素。V ero细胞无血清培养的技术关键在于无血清培养基的设计和优化。 设计V ero细胞无血清培养基组成配方的技术核心是筛选和确定具有促进细胞贴附生长、维持细胞存活、提高病毒扩殖效果的培养基组成成分。基于细胞生长和代谢的高通量分析及Plackett-Burman实验设计和Box-Behnken响应面设计是V ero细胞无血清培养基设计和优化的主要技术。V ero细胞的培养需要在适宜的介质表面贴附、铺展才开始有丝分裂、增殖，病毒的有效感染和增殖也有赖于细胞的贴附生长状态。此外，在某些病毒疫苗(如流感病毒疫苗)的生产过程中，需要在培养基中加人一定浓度的胰蛋白酶以提高病毒的感染和增殖效率。另一方面，病毒的感染和增殖不仅是细胞代谢负荷不断加大的过程，也是细胞病变、以致凋亡和坏死、甚至裂解的渐进性过程。V ero细胞无血清培养基的设计和优化相对于应用于动物细胞悬浮培养工艺生产重组蛋白、特别是治疗性抗体生产的无血清培养基更具挑战性。 设计V ero细胞无血清培养基的较为便捷和有效的策略是以DMEM,F-12,M199和RPMI1640等商品化的合成培养基的单独使用或联合使用为基础培养基，以反映细胞生长和代谢的主要参数为评价指标，结合统计学方法确定向其中添加生长因子、激素、结合蛋白及豁附因子、微量元素、脂类和脂类前体物等的种类和浓度。无血清培养基中常用的黏附因子主要是存在于细胞间质和血清中的胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白，如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原等。其中，纤粘连蛋白和层粘连蛋白不仅具有提高细胞的砧附力及活力的作用，同时在促进有丝分裂中也起着重要的作用。某些含有精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)序列的短肤也能够有效地促进V ero细胞贴附到以聚苯乙烯和醋酸纤维素为材
什么是“真正的无血清”间充质干细胞培养基 近几年，随着细胞治疗的进展，对细胞体外培养的关注热度也在不断提高，作为药品监管的细胞制品，跟所有的药品一样，其评价标准也是“安全性、有效性”。因此培养间充质干细胞的培养基，就成为了研究、应用MSC细胞的企业、科研机构的核心关注点。 市场上突然多出了许多“无血清”培养基，价格从1000-4000不等。弄得用户一头雾水，不知所以。 友康生物作为中国无血清培养基领域的领先企业，经常被客户问起这个问题，换位思考，也觉得确实有必要把这个问题给用户说清楚。 “无血清”间充质干细胞培养基，是指某种培养基可以培养MSC细胞，不需额外添加任何组分，并且这种培养基中没有添加血清。 市场上的“无血清”间充质干细胞培养基产品，可分为三类。第一种是“假的无血清”MSC 培养基；第二种是“揣着明白装糊涂的无血清”MSC培养基；第三种是“真正的无血清”MSC 培养基。以下就简要介绍下这三种产品的历史由来及如何简单的去区分。 一、“假的无血清”间充质干细胞培养基，产品形式一般为1瓶450ml的培养基，培养一瓶50ml的添加剂。销售方称之为无血清添加剂，但其是货真价实的血清。做过细胞实验的都清楚，使用基础培养基一般都要添加10%比例的血清。这种产品来源于实验室的发现，由于不同批号的血清，来自不同种群的牛，血液的成分有所不同是自然的事情，有的血清中的EGF的含量相当低，而EGF对促进细胞生长的作用又很大。所有有经验的实验室老师一般在用血清培养基培养MSC细胞时额外添加一些EGF,会有更好的培养效果。一些企业在血清中额外添加了EGF，称之为“无血清添加剂”。这种产品，在市场上比较少，也比较容易辨识。 二、“揣着明白装糊涂的无血清”MSC培养基。这种产品，很有迷惑性。他确实没有添加血清，因此，从字面理解，是无血清。但他加了牛血，更具体说是牛的血小板。我们都清楚，血液笼统可分为血清、血浆、血小板。在10年前，有人就发现，通过将血小板冷冻、再融化；再冷冻、再融化这种反复冻融的形式，可促使血小板裂解，将其中的物质释放出来，加入培养基中，可以收到与血清相类似的培养效果。由于血小板的含量比较少，一直以来都是作为血清生产的下脚料，后来伴随血清价格的上升，处理下脚料在经济上显得划算了起来。所以，就出现了血小板裂解物这样的产品，有的公司命名为“血清替代物”。从产品形式来看，一般装量为20ml，可以添加到500ml的基础培养基中（比如DMEM/F12，a-MEM）或添加到1000ml的减血清培养基中。这种产品，在市场上为数不少，比较有迷惑性。确实没有加血清，但是加了血小板。
CHO细胞无血清培养基技术手册2009 北京清大天一生物技术有限公司 BEIJING TSINGHUA SKYWING BIO TECH Co.,LTD. 2009年9月
1 CHO细胞 CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC 保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。 ATCC提供的CHO-K1细胞照片 CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO细胞。 二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用
动物细胞无血清培养基的优势、特点与实验研究 摘要：动物细胞无血清培养基相比天然培养基、合成培养基等传统培养基有无可比拟的优势，其组成成分相对清楚，制备过程简单，日益得到生物技术界的重视。运用统计学实验方法，可科学有效地考察细胞培养基中多因素、多水平间的交互作用。应用新型蛋白质组分分析技术及生物芯片技术定位胞浆信号通路相关蛋白、膜表面的生长因子受体、激素受体、细胞因子受体、粘附分子等，用以确定细胞培养基中调控分子的添加组合。对无血清培养基的优势特点及常用的实验研究进行概述。以期为动物细胞无血清培养基的研究与研制提供参考。 关键词：动物细胞；无血清培养基；实验设计 动物细胞培养技术是当今生物工程领域中的前沿研究课题之一，无论是在基础研究还是生产实践方面都得到生物技术界的重视。随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长，基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。无血清细胞培养技术的研究日益得到人们的重视。近年来，有关无血清培养基的研制和开发得到了迅速发展，推动了基因工程产品及产业的发展。 1 无血清培养基的优势特点及分类 细胞培养基是细胞体外培养的最重要因素。无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比，无血清培养基是一种不含有动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。无血清培养技术也是阐明细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的基础研究问题的有力工具。 常规细胞培养基的制备方法是在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物，其中最常用于培养基的血清是一种组分很不明确的混合物。所以常规血清细胞培养基存在以下缺点： （1）血清来自于动物体，其对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用，但同时也有细胞生长抑制因子和毒性因子，所以存在潜在毒性。 （2）由于动物血清提取的局限，使其应用于培养基的价格格外昂贵。 （3）动物血清提取的局限，也给细胞培养的标准化带来困难，同时也存在细胞培养表达产品分离纯化难的问题，具有潜在的细胞毒性作用，给规模化培养细胞增加了难度［1］。 由于上述常规血清细胞培养基存在的诸多问题，促使我们改进培养方法，用
质干细胞基础培养基（BM0001）、AdvCell?干细胞培养添加剂 A（SCM0001A）以及AdvCell?干细胞培养添加物 B（SCM0001B）于37℃解冻并迅速混合。 2.完全培养基的存储：配制好的完全培养基放在4℃冰箱避光保存，并尽量在一个月内使用完。 3.根据需要，培养过程中可添加一定剂量青霉素∕链霉素(P∕S)。 4.为达到最佳培养效果，所有细胞培养皿或培养瓶在接种细胞前用细胞垫材料（Cellpad）（BCP0001）包 被过夜或室温包被2小时，包被后用吸管取走多余的 AdvCell? 细胞垫材料（BCP0001），再接种胞。5.如客户用自己配制的冻存液冻存的细胞是用作临床治疗，应避免用甘油作为保护剂。 ★培养条件 37℃，5%CO2 ，无菌恒温培养箱培养。 ★细胞培养 【复苏】 1.将配置好的完全培养基放入37℃水浴中预热5-15 min； 2.从液氮中取出干细胞迅速放入37℃水浴快速解冻（解冻后不要继续孵育细胞）； 3.在超净台中加入5 ml的完全培养基重悬细胞，1000 rpm离心5 min； 4.弃上清，加入 5 ml的完全培养基重悬细胞，转移到T-25培养瓶中（带滤芯）； 5.将培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养； 6.第二天用新鲜的完全培养基给细胞换液。 【培养】 1.在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80%时，即可传代； 2.37℃水浴预热完全培养基； 3.在超净台中，弃掉T-25细胞培养瓶中的培养基，加入2 ml PBS清洗，再加入1 ml 0.25%胰酶-EDTA 消化细胞；
4.在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5 ml 完全培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞转移到15 ml离心管中，1000 rpm离心5 min； 7.弃上清,加入15-20 ml的完全培养基重悬细胞后转入T-75细胞培养瓶中或按适当比例传到T-25细胞培养瓶中。确保后融合度在25-50%之间，细胞密度在1×104cells/cm2（2.5×105 cells/T-25瓶），混合细胞悬液，确保细胞均匀分布； 8.将细胞培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养； 9.每两天用新鲜、预热的完全培养基进行换液。 【冻存】 1.细胞消化和计数，用胰酶对待冻存的细胞进行消化，并对细胞进行计数。 2.1000 rpm离心5 min，去掉上清。 3.根据细胞计数的情况，加入适量的冻存液，使细胞密度在1×106/ml左右（或根据自己希望达到的细胞 密度）。 4.轻轻地重悬细胞（务必重悬均匀），将重悬的细胞按等份加入到灭菌的冻存管（需提前做好标记或者贴 上标签）中，旋紧冻存管盖。 5.将冻存管放入程序降温冻存盒中，然后将冻存盒直接放入-80℃。 6.第二天将细胞从-80℃转移到液氮中。
用无血清培养基制备V ero细胞 狂犬病疫苗的实验研究 1材料 细胞株： V ero 细胞（中国典型培养物保藏中心CCTCC） 病毒株： CTN-1V株（中国药品生物制品标准化研究中心） 培养基及添加物： Medium 199（Gibco公司） 无血清培养基（Gibco公司、Hyclone公司） 新生牛血清（兰州民海生物有限公司） 细胞培养容器： T75培养瓶，2L转瓶，10L瓶 仪器设备： 细胞培养恒温室，XDS倒置显微镜，转瓶机，7.5L生物反应器 2方法 2.1 2L转瓶试验方法 2.1.1具体步骤 用T75细胞瓶培养复苏的V ero细胞，按照常规方法传代扩增至一定数量的2L转瓶中，待细胞长至均匀单层后接种病毒，换为不同浓度（分别为100%、50%、25%）的两个厂家的无血清培养基作为维持
液，同时以传统培养基（M199+0.2%人血白蛋白）作为对照组，根据病变情况收获病毒液并超滤层析。 2.1.2结果及讨论 2.1.2.1细胞状态比较 均匀的单层细胞接种病毒后,在尚未出现病变时，SFM试验组的细胞，体积略大于人白对照组的细胞，细胞轮廓清晰、饱满，病变的出现亦稍晚于对照组；约3-4天时均有病变产生：细胞面呈网状，有脱落、游离细胞。至5-6天收毒时，SFM试验组的细胞维持较好，未脱落细胞多于对照组，细胞维持时间较对照组长。 人白对照组细胞： Hyclone SFM 试验组细胞：Gibco SFM 试验组细胞：
2.1.2.2滴度比较 2.1.2.2.1 100%SFM(Gibco)作为维持液与2‰人白M199作为维持液所收获的病毒液相比，滴度结果基本一致；但100%SFM(Hyclone)作为维持液的病毒液滴度稍高于人白对照组。（见表一） 表一 2.1.2.2.2在以不同浓度SFM作为维持液的试验中，两者之间差别不明显。（见表二） 表二
无血清培养基 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-17 12:29 文章来源：丁香园 分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养培养基点击次数：1026 无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。 无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分 1.促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 2.促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 3.酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。 4.结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 5.微量元素：硒是最常见的。 使用方法 目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。 为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：
细胞血清培养基和无血清培养基的配制以及区别 细胞培养基是如何配制的？培养细胞的完全培养基由基础培养基和添加剂(如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子)组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是迈健基础培养基和迈健培养基营养添加物的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而迈健培养基也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂(例如核苷酸)。现应用于快速生长的细胞，同培养基含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培养基中这两种物质缺乏时)。但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清用于神经元培养，也有人用马血清来培养胶质细胞。用大鼠进行神经元培养的某些研究者喜欢使用同型血清;人类的胎盘血清，亦曾用于神经组织的器官类型的培养，也用在一些特殊培养种类中。 血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞输入人体，所以可能存在人体异源体排斥和冲突，有一定风险，现如今该研究领域为了规避这样的风险，研究发明了迈健细胞无血清培养基，取代血清培养基的不利因素。 无血清培养基 1979年神经细胞培养出现了一个重要进展，用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中添加血清。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质的
无血清培养基应用 细胞培养就是从机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。体外细胞培养最常见的是合成培养基如DMEM,F12,MEM等混合一定比例的牛血清进行培养;但是大量使用牛血清制品有许多缺陷，如，动物源成分，无法用于临床研究;成分复杂，批间差大，质量不稳定，重复性差，影响实验和生产，而且极易引起交叉污染，所以无血清培养正在替代有血清培养。 无血清培养基成分 无血清培养基成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。 添加组分 1.促贴壁物质 许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。 2.促生长因子及激素 针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。 3.酶抑制剂 培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶;抑制剂。 4.结合蛋白和转运蛋白 常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。
间充质干细胞无血清培养基 MSC NutriStem? XF Medium 一、目的：利用间充质干细胞无血清培养基培养分离之脐带间充质干细胞 二、材料：新生儿脐带 三、主要仪器：医用手术器械，生物安全柜，CO 2 培养箱，6孔培养板(CORNING), T25培养瓶(CORNING) 四、主要试剂： 表 1 实验中用到的主要试剂
五、实验前准备： 5.1 完全即用型培养基的准备 1) 冻存的NutriStem? MSC XF Supplement 间充质干细胞无血清添加物需要在室温 或2-8℃解冻，避免反复冻融及照光。 2) 完全培养基配制：NutriStem? MSC XF Basal Medium (培养基)：NutriStem? MSC XF Supplement (添加物)：青链双抗 = 500 ml : 3 ml : 5 ml ，4℃保存，2周内使用。(注：双抗非必须) 5.2 MSC 贴壁试剂包被培养皿 1) 使用无菌的DPBS 溶液 (货号: 02-023-1，不含Ca 2+ and Mg 2+)，将MSC 贴壁试剂稀 释100倍 (1:100)，用移液管轻轻搅拌混合。 2) 用稀释过的MSC 贴壁试剂涂层培养皿。 3) 使用合适的量以涂层培养孔或板，使用量参照表2。 4) 轻轻摇动培养皿，用封口膜包裹涂层的培养皿，然后在2-8℃孵育过夜；或者在 CO 2 培养箱 (37℃,至少孵育30分钟)。 5) 接种前，用DPBS 轻轻冲洗培养皿。 表2 涂层过程中贴壁试剂建议使用量 厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用)
六、试验方法： 6.1 MSC 原代培养 1) 无菌条件下取新鲜脐带，用DPBS 漂洗净血迹 (如怀疑污染，可先在75%医用酒精中浸泡 2min)。 2) 置10 cm 培养皿中，剪成1~2 cm 脐段，剔除血管，用DPBS 洗净血迹，再剪成1mm 3 组织块。(图 1) 3) 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。 4) 37℃, 5% CO 2培养箱孵育 30min 以使组织块黏贴在培养皿壁上。 5) 向每孔滴加0.8ml 完全培养基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块)。 6) 37℃, 5% CO 2 培养箱孵育过夜，次日 (d1) 每孔再补加1ml 完全培养基。 7) 37℃, 5% CO 2 继续培养，5天 (d6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞，但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出)。 8) 再过5天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出，但最晚可到14天会出现细胞从组织 边沿爬出) (图2、图3)。 9) 此后，每2天换一次培养液，继续培养2~4天，待细胞达到约60~70%后传代培养 (图4)。 注意：组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。 6.2 MSC 传代培养 1) 待细胞饱和度达到约60~70%后进行传代(细胞不能太密集，否则容易分化)，吸弃需传代板孔中的培养基，每孔加适量DPBS 轻轻冲洗1次。 2) 根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA (货号：03-079-1)，37℃, 5% CO 23) 根据重组胰酶-EDTA 使用量加入10倍的 培养箱作 用 2~3 min ，用吸管吹打培养皿底部，镜下观察细胞完全脱落后。 大豆胰酶抑制剂 (货号：03-048-1，用DPBS 稀释50倍)，1200×rpm 离心3~5min 。
无血清细胞培养 摘要：本文综述了动物和昆虫细胞培养对细胞培养基的要求，并且在总结细胞培养基化学成分的基础上归纳了细胞无血清培养的条件和目前的研究现状。 关键词：细胞培养无血清 细胞培养是从生物体内取出细胞, 模拟其体内的生理环境, 在无菌、适温和丰富的营养条件下, 使细胞生存、生长并维持结构和功能的技术。 细胞培养基成分要求 在动物和昆虫细胞培养中，培养基是细胞培养的关键, 培养基是细胞赖以生长、增值、分化的重要因素。不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求, 至少有14种必需的氨基酸是细胞本身不能合成而必须由培养基提供的。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质, 维生素对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有作用, 泛酸、异已酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的,胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖, 无机盐在培养基中维持昆虫细胞生长的渗透压。水解乳蛋白和酵母提取物是昆虫细胞培养基中最常用的添加物。缺少谷氨酰胺会影响到细胞的生长速度，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。因此，昆虫细胞自身合成谷氨酰胺不如直接在培养基中摄取有效，所以各类培养基中都含有较高浓度的谷氨酰胺。有机酸，单独测试时只有苹果酸有生长促进作用。联合使用时，则对细胞生长有显著的促进作用。一般认为，泛酸、异己酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的，而胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖。在昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，这是因为昆虫细胞要在高于哺乳动物细胞生长的渗透压中生长，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na+／K+比例在某些细胞系中有严格的要求。某些微量元素如Fe2+、Mn2+、Cn2+、Zn2+、A13+等能促进细胞贴附和增加产量，其中A13+和Zn2+还可以促进病毒的感染和复制。在昆虫细胞悬浮培养中还需添加一些多聚物如甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮和聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物等，以保护细胞免受机械剪切力的损伤和降低细胞聚集程度。大部分鳞翅目昆虫细胞在25～30℃之间生长最佳。培养基pH保持在6.2左右。多数昆虫细胞倍增时间为16-24 h。 血清的作用及其缺点 动物血清对细胞生长和促进细胞分裂有非常重要的作用。血清能够提供促进细胞生长、