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溶栓新药_纳豆激酶_马子川

构的化合物在功效和成本上与已有的产品相比并没有太大的优势。因此,今后对AQ 及其衍生物的研究、生产和应用技术的革新会是很有发展空间的领域。参考文献:

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溶栓新药 纳豆激酶

马子川1, 张英锋2*, 范 林3

(1.河北师范大学化学与材料科学学院,河北石家庄050016;

2.河北省秦皇岛市第一中学,河北秦皇岛066000;

3.北京师范大学出版社,北京100875)

*河北省教育科学研究 十一五 规划课题No.06010288,No.08010244;河北省科学技术协会2008年资助项目。

纳豆激酶(Nattokinase,NK;也称Subtilisin NAT,Subtilisin BSP )是由纳豆菌(Bacilius subtilis var .natto )产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶,是一种枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)

[1]

1987年日本的须见洋行博士从200余种食品中筛

选出的有很强溶解纤维蛋白作用的纳豆食品。并从其中提取纯化出这种酶,由于是从纳豆中获得因此称为纳豆激酶。纳豆是一种日本的传统食品,大豆经过蒸煮后,接上纳豆芽孢杆菌(B icillus subtilis var .natto ),经发酵后制成的发酵产物。由于在日本纳豆是一种非常大众化的食品,所以日本很多学者对纳豆芽孢杆菌的菌种选育,发酵工艺,提取纯化方法,各种不同产物的分析技术,纳豆及纳豆激酶的

生理生化性质,基因克隆,DN A 序列以及药理学功

能,治疗学上的作用,各种食品添加剂,功能性食品

的生产等进行了深入的研究,并对纳豆食品和含纳豆激酶的保健食品进行深入开发,向世界各地开拓市场,作为一种可以治疗和预防心脑血栓,冠心病,心绞痛,脑中风,老年痴呆以及各种常见多发病的功能食品。实验研究证实该酶不仅易于提取纯化,成本低廉,溶栓效果好,作用迅速,药效时间长,而且安全性好,无任何毒副作用,较目前已开发研制的一些溶栓药物如尿激酶(Uro kinase,UK )、链激酶(Streptokinase,SK )、组织型纤溶酶原激活剂(T issue ty pe plas mino gen activato r,PA )等具有独特的优越性,是一种新型溶栓药物。近几年,我国也掀起对纳豆及纳豆激酶的研究和开发的热潮。从1995年[2]国内第一篇有关纳豆和纳豆激酶的报道以来至今已有数十篇报告,而且研究与开发同时并进。中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室采用诱变处理加定向筛选的方法得到了高单位菌株纳豆菌NLSSe,建立了以大豆为主要原料、通过现代生物工程手段生产纳豆激酶胶囊的工艺。

本文简单介绍纳豆激酶的理化性质、制备过程、

126 化 学 世 界

2009年

溶栓机理、酶的活性测定、开发应用前景等内容。1 理化性质

由于测定相对分子质量采用的技术方法不同,所测得的相对分子质量也明显不同。须见洋行用Sephadex G 100柱凝胶过滤法得到的结果为20000u,后来他在另外的文章中发表用SDS PAGE 凝胶电泳法测得的相对分子质量为35000u 。现由分离纯化的纳豆激酶基因DNA 序列推出其氨基酸序列,根据该顺序计算出该酶的准确相对分子质量为27728u [3],远小于尿激酶的相对分子质量54000u 。

纯化的纳豆激酶无论还原剂巯基乙醇存在与否,其在SDS PA GE 凝胶上均显示1条带,表明该酶为一单链多肽。其由275个氨基酸残基组成,与其它枯草杆菌蛋白酶同源性极高[4]

:它与枯草杆菌蛋白酶E 只差2个氨基酸残基,与枯草杆菌蛋白酶J 相差4个氨基酸残基,与枯草杆菌蛋白酶BPN 的同源性为86%,而与枯草杆菌蛋白酶DY 和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg 也分别有70%和72%的同源性。纳豆激酶的活性中心在Asp 32,H is 64和Ser 221,与底物的结合部位在Ser 125,Leu 126和Gly 127处。pH 稳定性:室温下1h,NK 在pH 5.0~11.0范围内稳定,pH 4.0时残余活力为25%。室温下24h,NK 在pH 5.0~10.0范围内稳定,pH 11.0时残余活力不足5%。最适pH 为9.0(活力达116%,以pH 7.4为100%)。

热稳定性NK 经60 、2h 的加热即完全丧失活性,50 下放置7h 残余活力为18%,37 下放置48h 后仍保持约78%的活性,4 放置6个月、室温放置1个星期未见活性明显下降,说明NK 具有较好的热稳定性。但液态酶在 20 放置3个月活性损失90%, 80 冷冻2.5h 活力下降约30%。2 分离纯化

[6]

分离纯化全过程均使用10m mol/L 磷酸钠缓冲液(pH 7.2~7.4),并在4 下完成。称取50g NK 干粉,溶于500m L 缓冲液,反复冻融2~3次。再加入1000mL 缓冲液,磁力搅拌1h 后,高速冷冻离心(12000r/min,4 ,30min)得上清。磁力搅拌下,向其中缓慢加入适量研磨过的硫酸铵,使其饱和度为75%,完全沉淀纳豆激酶。静置过夜,离心,得沉淀。沉淀用适量缓冲液溶解并对水透析,用聚乙二醇20000浓缩。浓缩后的溶液直接上CM Sepharo se fast flow 阳离子交换柱。然后用200mL 含0~0.5m ol/L NaCl 的该缓冲液线性梯度洗脱溶

溶栓新药_纳豆激酶_马子川

液,控制流速大约0.5mL/m in,并用部分收集器收

集洗脱溶液,每管约5mL 。检测后合并具有纤溶活性部分并对水透析,经浓缩,真空冷冻干燥得提纯酶粉。

3 溶栓机理

[1]

在人和哺乳动物血液中都有一个纤溶系统,如图1所示,它担任溶解血栓和防止出血与保护伤口的双重作用。在纤溶酶原激活剂(PA)的作用下,纤溶酶原(Plasminogen)转变成纤溶酶(Plasmin),纤溶酶将血块上不溶的纤维蛋白降解为可溶性的产物,从而使血栓溶解。

体内纤溶系统是一种平衡调节器,由体内的纤溶作用和抗纤溶作用来保持这种平衡,以免因失去这种平衡而导致疾病的发生。在实现纤溶作用中,血液里有两种纤溶酶原激活剂,其一为源自于血管内皮细胞的组织型纤溶酶原激活剂(t AP),其二是由肾细胞产生和分泌的尿激酶型的纤溶酶原激活剂(u PA)。在正常情况下,血液中只存在少量的PA,而形成微量的纤溶酶,并通过纤溶酶原激活剂的抑

制剂(PAI 1)和

2 抗纤溶酶( 2 A P)来保持纤溶系统的平衡。

图1 人和哺乳动物体内纤溶系统示意图

大多数溶栓药物,如链激酶、尿激酶、t PA 等都是纤溶酶原激活剂型,均需通过激活靶酶,即纤维蛋白溶酶原(Plasminog en)转变为纤维蛋白溶酶,再与纤维蛋白(Fibrin)结合,发挥溶栓作用,而其自身不能直接作用于纤维蛋白。

纳豆激酶则不然,它对纤维蛋白尤其是交联形式的纤维蛋白本身更加敏感,可直接将其水解成小肽和氨基酸,(图2作用A)。当把酶提取液滴加到纤维蛋白平板上,短时间内即可出现透明的溶解圈,体外溶栓效果显著。此外,将纳豆激酶应用于狗的血栓模型实验及健康人群的体内研究,表明其不仅可以抑制血栓的形成,还可迅速降解纤维蛋白,增加纤维蛋白降解产物(FDP)的量,明显缩短血浆中的优球蛋白的溶解时间(ELT),提高优球蛋白的纤溶活性(EFA),并能降低PAI 等纤溶酶原激活因子抑制子的活性[4],从而激活静脉内皮细胞,引起t PA 的继发性增加(图2作用B),同时激活尿激酶原(pro UK)转变为尿激酶(图2作用C),使内源性纤

127 第2期化 学 世 界

溶酶量和活性间接增强,具有双重功能。研究表明,纳豆激酶的溶栓效果远大于纤溶酶和弹性蛋白酶,活性是纤溶酶的4

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倍。

图2 纳豆激酶的作用机理

A.纳豆激酶的直接溶栓作用;

B.左:纳豆激酶的间接溶栓作用,通过降解和失活PAI 1,增加纤溶作用。右:激活血管内皮细胞产生t PA;

C.激活尿激酶原变成尿激酶

4 酶的活性测定4.1 测定方法

纳豆激酶活性测定方法作为研究该酶的基础,得到不断地建立和改进。现已有的活性测定方法包括4种:纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间(CLT)法、酶联免疫吸附法(ELISA)、四肽底物法和血清板法。以上几种纳豆激酶的活性测定方法,各

有优缺点。目前普遍使用的仍是经典的纤维蛋白平板法和纤维蛋白块溶解时间法,本文简单介绍这两种。

纤维蛋白平板法是参照尿激酶或t PA 的测活方法而建立的。是将琼脂糖、血纤维蛋白原(Fibino gen)溶液和凝血酶溶液按一定比例混合,制成人工血栓平板。取纳豆激酶样品点样于平板上,37 恒温孵育,测溶解圈直径,计算面积。并以标准纳豆激酶或尿激酶或纤溶酶等作标准品对照绘制标准曲线,从标准曲线上读取样品酶活性。其原理是以凝血酶和纤维蛋白原作用生成的交联纤维蛋白为底物,酶活与溶解圈面积成线性关系,故可用溶解面积来表示纳豆激酶的溶纤维活性。该法简便直观,但测定值易随恒温孵育时间变化而变化,并受样品中杂质影响较大。

纤维蛋白块溶解时间(CLT )法是参照t PA 、尿激酶等溶栓物质活性测定方法加以改进而建立的。具体方法:0 下,在小试管中依次加入凝血酶、巴比妥钠缓冲溶液、纳豆激酶样品溶液和纤维蛋白原,强烈搅拌,置于37 恒温水浴中。从纤维蛋白形成起开始计时,随着反应液混浊,有气泡上升到液面,至气泡不再冒出时所用时间作为纤维蛋白溶解时间。同样以标准纳豆激酶或尿激酶或纤溶酶等作为标准品绘制标准曲线。原理为以CLT 对纳豆激酶浓度

的对数作图,在10~70 g 范围内有很好的线性关系。此法迅速快捷,有较大的分辨率,不易受样品中杂质影响,但精度不够,随着灵敏度的提高,溶解时间的判定也更加困难。5 开发应用前景

心脑血管疾病严重的威胁着人类的身体健康,全世界共有血栓病人1500万,所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元。目前临床注射的抗血栓药物普遍存在着稳定性差、药效短、副作用大和成本高等缺点,因此,国内外在治疗血栓病方面正趋向于低价高

效、易吸收、体内半衰期长以及可以口服的药物或保健食品方向发展。纳豆激酶来源于传统发酵食品,生产工艺简单,无副作用,安全性高,完全符合治疗血栓病的药品或食品基料的要求,所以纳豆激酶有着很好的应用前景。

各国已开始积极开发纳豆激酶产品,日本、韩国、朝鲜等许多国家已研制出多种以纳豆激酶为主要成分的产品,大多由纳豆激酶与其他种类的酶制剂复合而成,如菠萝蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等,或添加甘油,蜂蜡及卵磷脂,DH A,SOD 等营养物质,制成粉剂、片剂、软硬胶囊、口服液或保健食品。中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室采用诱变处理加定向筛选的方法得到了高单位菌株纳豆菌NLSSe,建立了以大豆为主要原料、通过现代生物工程手段生产纳豆激酶胶囊的工艺

[7]

。但是

还没有关于临床注射用的纳豆激酶产品的报道,可见在提高纳豆激酶产量及对其纯化生产方面还有待进一步研究。参考文献:

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128 化 学 世 界 2009年

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