Pharmacy Information 药物资讯, 2016, 5(4), 62-66
Published Online November 2016 in Hans. https://www.doczj.com/doc/ef1325350.html,/journal/pi https://www.doczj.com/doc/ef1325350.html,/10.12677/pi.2016.54011
文章引用: 俞瑜, 袁浩宇, 曾建鹏. HPLC 法测定门冬氨酸鸟氨酸的含量[J]. 药物资讯, 2016, 5(4): 62-66.
Determination of L-Ornithine-L-Asparate by HPLC
Yu Yu, Haoyu Yuan *, Jianpeng Zeng
416 Hospital of Nucleus Industry Ministry, Chengdu Sichuan
Received: Oct. 20th , 2016; accepted: Nov. 8th , 2016; published: Nov. 15th
, 2016
Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
https://www.doczj.com/doc/ef1325350.html,/licenses/by/4.0/
Abstract
Objective: To establish a HPLC method for assay of L-Ornithine-L-Asparate. Methods: The HPLC method was conducted on Waters Spherisorb NH2 (250 mm × 4.6 mm, id 5 μm ). The mobile phase was composed of acetonitrile-0.05 mol/L KH 2PO 4 (60:40) with the flow of 1.0 mL/min. The detec-tion wave-length was 210 nm. Results: L-ornithine and L-aspartate showed good linear (r = 0.9998) in the range of 0.75 - 2.26 mg/mL and 0.75 - 2.24 mg/mL, respectively. The average recovery of L-Ornithine-L-Asparate was 99.37% (RSD = 0.34%). Conclusion: The method was simple, rapid and accurate. It is suitable for the assay of L-Ornithine-L-Asparate.
Keywords
HPLC, L-Ornithine-L-Asparate, Assay
HPLC 法测定门冬氨酸鸟氨酸的含量
俞 瑜，袁浩宇*，曾建鹏
核工业四一六医院，四川 成都
收稿日期：2016年10月20日；录用日期：2016年11月8日；发布日期：2016年11月15日
Open Access
*
通讯作者。
俞瑜等
摘要
目的：建立HPLC法测定门冬氨酸鸟氨酸的含量。方法：采用氨基键合硅胶色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以0.05M磷酸二氢钾缓冲溶液–乙腈(40:60)为流动相；检测波长为210 nm；流速为1.0 ml/min；进样量为20 μL。结果：门冬氨酸鸟氨酸浓度在1.50~4.50 mg/mL范围内，即门冬氨酸浓度为0.75~2.26 mg/mL (r = 0.9998)，鸟氨酸浓度为0.75~2.24 mg/mL (r = 0.9998)，峰面积与浓度呈良好的线性关系。平均回收率为99.37%，RSD为0.34%。结论：该方法简便、快速、准确，适合于门冬氨酸鸟氨酸原料及制剂的含量测定。
关键词
高效液相色谱法，门冬氨酸鸟氨酸，含量测定
1. 引言
门冬氨酸鸟氨酸(L-Ornithine-L-Asparate)化学名为(s)-2，5-二氨基戊酸-(s)-2-氨基丁二酸盐，是门冬氨酸和鸟氨酸的复合体，主要用于治疗因急、慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎等所致的高血氨症，特别适用于因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状的解除及肝昏迷的抢救[1][2][3]。门冬氨酸鸟氨酸在体内分解为门冬氨酸和鸟氨酸而发挥作用，鸟氨酸是尿素循环中的起始底物，它与血循环中有毒的氨结合，将后者转化为对人体无毒的物质。门冬氨酸能参与肝细胞内核酸的合成，有利于修复被损伤的肝细胞。此外，由于天门冬氨酸对肝细胞内三羧酸循环代谢过程的间接促进作用，促进了肝细胞内的能量生成，使得被损伤的肝细胞的各项功能得以迅速恢复[4]。笔者在参考文献的基础上[5][6][7]，建立了灵敏，准确的HPLC法测定门冬氨酸鸟氨酸原料药的含量。
2. 仪器与试药
岛津LC-10A型高效液相色谱仪；Waters Spherisorb NH2色谱柱(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)；日本岛津LC-solution色谱工作站；赛多利斯BSA224S电子天平。门冬氨酸鸟氨酸对准品(批号：140691-200401)，由中国药品生物制品检定所提供；门冬氨酸鸟氨酸原料(批号：131202，140125，140318)，由湖北兴银河化工有限公司提供；乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件与系统适用性
色谱柱为Waters Spherisorb NH2，250 mm × 4.6 mm，id 5 μm；流动相为0.05M磷酸二氢钾缓冲溶液–乙腈(40:60)；检测波长：210 nm；流速为1.0 ml/min；进样量为20 μL。理论塔板数按理论板数按门冬氨酸峰计不低于5000，门冬氨酸与鸟氨酸与其他杂质峰的分离度应大于1.5。在上述条件下，门冬氨酸和鸟氨酸的保留时间分别为15.7和17.8 min，两者的分离度符合要求(图1)。
3.2. 线性关系
取门冬氨酸鸟氨酸对照品适量，精密称定，用乙腈–水(50:50)配制含门冬氨酸鸟氨酸1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、4.50 mg/mL的溶液，即含门冬氨酸浓度为0.75~2.26 mg/mL，含鸟氨酸浓度为0.75~2.24 mg/mL 的溶液，依次进样，记录色谱图，分别以门冬氨酸和鸟氨酸的峰面积对浓度进行线性回归，得线性方程
俞瑜 等
A ：门冬氨酸；
B ：鸟氨酸。A: aspartic acid; B: ornithine 。
(1) reference substance (2) sample (1) 对照品 (2) 供试品
Figure 1. HPLC chromatogram of L-Ornithine-L-Asparate 图1. 门冬氨酸鸟氨酸的色谱图
为：门冬氨酸：A = 2.05*106C – 91432，r 为0.9998；鸟氨酸：A = 601675C – 61023，r 为0.9998。表明门冬氨酸鸟氨酸浓度在 1.50~4.50 mg/mL 范围内，即门冬氨酸浓度为0.75~2.26 mg/mL ，鸟氨酸浓度为0.75~2.24 mg/mL ，峰面积与浓度呈良好的线性关系。
3.3. 精密度
3.3.1. 重复性试验
取本品精密称定，分别配制6份供试品溶液，各精密量取20 μL ，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法分别计算门冬氨酸和鸟氨酸的含量。两者含量之和为门冬氨酸鸟氨酸的含量，并计算RSD 。结果门冬氨酸鸟氨酸的平均含量为99.23%，RSD 为1.16%，本方法的重复性良好。 3.3.2. 中间精密度
取本品精密称定，用乙腈–水(50:50)稀释制成每1 mL 含有门冬氨酸鸟氨酸2 mg 的溶液6份，由两名试验人员在不同日期测定，记录色谱图。计算门冬氨酸鸟氨酸的含量，并计算RSD 。结果RSD 为1.57% (n = 12)，表明本法的中间精密度较好，可满足含量测定的要求。
3.4. 回收率试验
分别精密称取门冬氨酸鸟氨酸原料16、20、24 mg ，各3份，分别置于10 ml 量瓶中，加乙腈–水(50:50)稀释至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液20 μL ，注入液相色谱仪，记录色谱图。另精密称取门冬氨酸鸟氨酸对照品20 mg ，置10 ml 量瓶中，加乙腈–水(50:50)稀释至刻度，摇匀，滤过。按外标法测定门冬氨酸鸟氨酸的含量。结果见表1。该方法的回收率在98%~101%之间，RSD%小于1.0%，本法的准确度良好。
3.5. 稳定性
取门冬氨酸鸟氨酸对照品适量，置于10 mL 量瓶中，加乙腈–水(50:50)溶解并稀释制成每1 mL 中含有门冬氨酸鸟氨酸2 mg 的溶液，摇匀。于5℃样品池中放置，分别在0、2、4、8、12、20小时精密
A
B
1020
A
B
1020
俞瑜 等
Table 1. Results of recovery test 表1. 回收率试验结果
样品 测得量 (mg) 投入量 (mg) 回收率 (%) 平均 (%)
RSD (%)
80%-1 15.94 16.04 99.38 99.37
0.34
80%-2 16.02 16.11 99.44 80%-3 16.05 16.20 99.07 100%-1 20.25 20.48 98.87 100%-2 20.48 20.63 99.27 100%-3 19.82 19.95 99.34 120%-1 24.18 24.31 99.46 120%-2 24.02 23.99 100.12 120%-3
24.52
24.67
99.39
Table 2. Content determination of samples (n = 3) 表2. 含量测定结果(n = 3)
样品批号 131202 140310 140311 含量(%)
99.29
99.31
99.37
量取20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。计算峰面积的RSD ，结果门冬氨酸峰面积的RSD 为0.71%，鸟氨酸峰面积的RSD 为0.58%，样品在20小时内稳定性良好良好。
3.6. 含量测定
采用所建的HPLC 方法，测定三批样品的含量，结果见表2，含量均符合规定。
4. 讨论
门冬氨酸鸟氨酸是门冬氨酸和鸟氨酸的复合体，在HPLC 色谱图中出现2个峰，分别为门冬氨酸和鸟氨酸峰。在计算含量时，按外标法分别计算门冬氨酸和鸟氨酸的含量，其中门冬氨酸鸟氨酸分子中门冬氨酸量按系数0.5017折算，鸟氨酸量按系数0.4983折算，两者之和即为门冬氨酸鸟氨酸的含量。
分别取门冬氨酸与L-盐酸鸟氨酸对照品适量，加乙腈–水(50:50)溶解并稀释制成每1 mL 中约含门冬氨酸1 mg 和鸟氨酸1 mg 的溶液，通过DAD 检测器在全波长范围内进行扫描，结果门冬氨酸与鸟氨酸在200~210 nm 波长范围内均有较强吸收，考虑到200 nm 属于末端吸收受溶剂等影响较大，故选择200 nm 作为测定波长。
笔者对流动相比例进行了筛选，分别对乙睛:0.05M 磷酸二氢钾比例60:40，55:45，50:50，45:55等进行考察，发现流动相成分比例对本法含量测定有较大影响。当水相比例 ≤ 40%时，出峰顺序依次为门冬氨酸、鸟氨酸，乙睛:当0.05M 磷酸二氢钾 = 60:40时，两者的分离度 > 1，峰对称性较好；水相比例 ≥ 50%时，两个主峰出现了颠倒，出峰顺序依次为鸟氨酸、门冬氨酸，如乙睛:0.05M 磷酸二氢钾 = 50:50，与参考文献[6]结果一致。虽然能够实现基线分离，但考虑到使用的色谱柱是氨基柱，流动相中水相的比例越高越容易发生水解，为延长色谱柱的寿命，最终选择乙睛:0.05M 磷酸二氢钾 = 60:40为流动相。
本研究建立了HPLC 法测定门冬氨酸鸟氨酸的含量，能有效分离色谱峰，方法准确、简便，适用于门冬氨酸鸟氨酸原料药的含量测定。
俞瑜等
参考文献(References)
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28(7): 1174-1176．
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羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0250 规格：50T/48S 产品内容： O（V/V）=1:1，室温保存。 提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 试剂一：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：液体1mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。 产品说明： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、6mol/L盐酸和蒸馏水。操作步骤： 一、羟脯氨酸提取 1.组织：称取约0.5g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入5mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/LNaOH（约3mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至8mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质） 2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm， 第1页共3页
门冬氨酸鸟氨酸 Mengdong’ansuan Niao’ansuan Ornithine Aspartate C 9H 19N 3O 6 265.27 本品为（S ）-2，5-二氨基戊酸-（S ）-2-氨基丁二酸盐。按干燥品计算，含C 5H 12N 2O 2·C 4H 7NO 4不得少于98.0％。 【性状】 本品为白色或类白色的结晶或粉末；无臭，有引湿性。 本品在水或醋酸中极易溶解，在甲醇或乙醇中极微溶解，在三氯甲烷或丙酮中几乎不溶。 比旋度 取本品，精密称定，加盐酸溶液（6→10）溶解并稀释制成每1ml 中含80mg 的溶液，依法测定 (中国药典2010年版二部附录Ⅵ E )，比旋度为＋27.0°～＋29.0°。 【鉴别】 （1）取本品约10mg ，加水2ml 使溶解，加茚三酮约2mg ，加热，溶液显蓝紫色。 （2）本品的红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致(中国药典2010年版二部附录Ⅳ C )。 【检查】溶液的透光率 取本品0.5g ，加水20ml 溶解后，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版二部附录 A Ⅳ），在430nm 的波长处测定透光率，不得低于98.0%。 酸度 取本品0.5g ，加水20ml 溶解后，依法测定（中国药典2010年版二部附录 H Ⅵ），pH 值应为6.0～7.0。 有关物质 取本品约0.4g ，精密称定，置100ml 量瓶中，加0.02mol/L 磷酸二氢钾缓冲液40ml 使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用流动相定量稀释制成每1ml 中含门冬氨酸鸟氨酸4μg 的溶液，作为对照溶液；另精密称取马来酸、富马酸、精氨酸、3-氨基-2-哌啶酮（杂质Ⅰ）与门冬氨酸缩合物（杂质Ⅱ）对照品各适量，分别加流动相溶解并定量稀释制成每1ml 中约含4μg 的溶液，作为各杂质对照品溶液。另取门冬氨酸鸟氨酸、马来酸、富马酸、精氨酸、杂质Ⅰ与杂质Ⅱ对照品各适量，置同一量瓶中，加流动相适量使溶解并稀释制成每1ml 中约含门冬氨酸鸟氨酸4mg 、马来酸、富马酸、精氨酸、杂质Ⅰ与杂质Ⅱ各4μg 的溶液，作为系统适用性溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录 D Ⅴ）试验，用氨基键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L 磷酸二氢钾缓冲液（取磷酸二氢钾2.72g ，加水500ml 溶解后，加入浓氨溶液5ml ，用水稀释至1000ml ，混匀后用磷酸调节pH 值至5.60±0.05）-乙腈（40∶60）为流动相；检测波长为205 nm ；流速为每分钟1.3ml ；柱温为30 ℃。取系统适用性溶液20μl ，注入液相色谱仪，门冬氨酸鸟氨酸、马来酸、富马酸、精氨酸、杂质Ⅰ与杂质Ⅱ峰之间的分离度均应符合要求。取对照溶液20μl ，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使门冬氨酸峰的峰高为满量程的20%~25%。再精密量取对照溶液、供试品溶液与上述5种杂质对照品溶液各20μl ，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至门冬氨酸峰保留时间的4倍。供试品溶液的色谱图中，如有与上述各杂质对照品溶液主峰保留时间相同的色谱峰，按外标法以峰面积分别计算各已知杂质的含量：马来酸、富马酸与精氨酸的量均不得过0.1%，杂质Ⅰ不得过0.1%（供注射用）或0.3%（供口服制剂用），杂质Ⅱ不得过0.15%；供试品溶液的色谱图中如有其他杂质峰，其他最大杂质峰面积不得大于对照溶液两主峰面积之和（0.1%）；杂质总量不得过0.5%（供注射用）或1.0%（供口服制剂用）。 COOH C (CH 2)3 NH 3H H 2N +C H COO H 2N CH 2 COOH - 征 求 意 见 稿
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实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
【通用名称】 门冬氨酸鸟氨酸 【商品名称】 雅博司 【拼音名】 Mendong'ansuan niao'ansuan zhusheye 【英文名】 Ornithine Aspartate Injection 【成份】 活性成分：门冬氨酸鸟氨酸5g 辅料：注射用水 【性状】 淡黄色澄明液体。 【适应症】 因急、慢性肝病(如各型肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝炎后综合症)引发的血氨升高及治疗肝性脑病，如伴发或继发于肝脏解毒功能受损(如肝硬化)的潜在性或发作期肝性脑病，尤其适用于治疗肝昏迷早期或肝昏迷期的意识模糊状态。 【用法用量】 急性肝炎，每天1至2安瓿，静脉滴注。慢性肝炎或肝硬化，每天2至4安瓿，静脉滴注。(病情严重者可酌量增加，但根据目前的临床经验，每天不超过20安瓿为宜。)对于其他情况除非医嘱特殊说明，每天用量为至少4安瓿。对于肝昏迷早期或肝昏迷期出现意识模糊状态的患者，应该根据病情的严重程度，在24小时内给予至少8安瓿该药物。在使用前应该用注射用溶液稀释，然后经静脉输入。本品可以和常用的各种注射用溶液混合而不发生任何问题。由于静脉耐受方面的原因，每500毫升溶液中不要溶解超过6安瓿该药物。输入速度最大不要超过每小时5克门冬氨酸鸟氨酸(相当于1安瓿该药物)。如果患者的肝功能已经完全受损，输液速度必须根据患者的个体情况来调整，以免引起恶心和呕吐。【不良反应】 偶尔会有恶心，少数病例出现呕吐。总的来说，上述症状都是一过性的，不需要停止治疗。减少药物使用剂量或减慢输液速度，这些不良反应就可以消失。 【禁忌】 对于门冬氨酸鸟氨酸或该药物的任何赋形剂过敏的患者禁用本品；严重肾功能不全的患者(诊断标准是血清中肌酐水平超过3mg/100ml)禁用本品。 【注意事项】 当使用大剂量的本品时，应该监测患者血清和尿中的药物水平。如果患者的肝功能已经完全受损，输液速度必须根据患者的个体情况来调整，以免引起恶心和呕吐。 【关联疾病】 获得性肝脑变性综合征肝性脑病肝性脑病 【孕妇及哺乳期妇女用药】 有关生育毒性和致突变方面的研究没有发现任何不良反应。 【药物相互作用】 目前尚不明确。 【药代动力学】
货号: QS1907 规格：50管/48样羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义 HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 测定原理 样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP 含量。 自备实验用品及仪器 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、6mol/L盐酸、高氯酸和蒸馏水。 试剂组成和配制 O（V/V）= 1:1，室温保存。 组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 羟脯氨酸提取 1.组织：称取约0.5g样品于玻璃管，加入5mL的组织提取液，置于110℃烘箱，水解6至12 小时，12000g，25℃，离心20min，用提取液定容至5mL，取上清待测。 2.细胞：取500万个细胞，加入2mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然 降压后待测。 3.血清等液体：直接测定。 羟脯氨酸含量计算公式 标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991 （1）按组织计算 第1页，共2页
HYP含量（mg/g 鲜重）=（A -0.0251）÷ 64.875×V反总÷(V样÷V样总×W) 560 -0.0251）÷W = 0.385×（A 560 （2）按细胞计算 HYP含量（mg/104cell）=（A -0.0251）÷64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个) 560 -0.0251）÷细胞数量（万个） = 0.154×（A 560 （3）按液体体积计算 HYP含量（mg/mL）=（A -0.0251）÷ 64.875×V反总÷V样 560 -0.0251） = 0.077×（A 560 V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样品体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样品质量，g 注意事项 1、OD值大于0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。 2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。 3、最低检出限为3.8mg/L。 第2页，共2页
脯氨酸的检测方法 1. 原理 样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm 检测吸光度，并作空白对照实验。 2. 应用范围 本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。 3. 试剂及仪器 3.1 脯氨酸 3.2 3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（0.3g 茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配） 3.3 2-甲氧基乙醇 3.4 蚁酸（96%），即甲酸 3.5 异丙醇（2- 丙醇）水溶液：水：丙醇= 1：1 3.6 15ml 旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉） 3.7 分光光度计，检测吸光度设定在520nm 下 3.8 1cm 玻璃比色皿 4. 样品准备 4.1苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20 的水进行 稀释。其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L（见稀释表）。浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。蜂蜜的稀释，采用2.5g蜂蜜加50ml水。 将样品在分析之前离心5min 左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。 4.2 原果汁稀释表 稀释比例 颜色空白期望值样品类型 Apple 苹果1:1 yes Apricot 杏21:1 yes Aronia 野樱莓1:1 yes Banana 香蕉1:1 yes Blackberry 黑莓1:1 yes Cherry 樱桃1:1 yes Cranberry 蔓越莓1:1 yes Grape 葡萄16:1 yes Grapefruit 柚子21:1 no Guava 番石榴3:1 yes Kiwi 泥猴桃1:1 yes
脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国） 1.2 药品与试剂 16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。 脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013. 乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。
时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线 起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表 所示的混合溶液。 名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。 衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸
原料中羟脯氨酸含量的测定 1.材料和试剂 1.1材料 秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。 秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。 秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。 1.2试剂 所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。 1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L] 量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。冷却至室温后用水定容。 1.2.3缓冲溶液（PH=6.8） 包括下列组分： a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）； b）14.0g氢氧化钠； c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。 用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。 1.2.4氯胺T溶液 称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。临用前配制。 1.2.5显色剂 称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。临用前配制。 1.3羟脯氨酸标准溶液 1.3.1标准储备液 称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。该溶液于4℃下可稳定存放1个月。 1.3.2标准工作液 移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。分
别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5μg/mL、1.0μg/mL、 1.5μg/mL、 2.0μg/mL。临用前配制。 2.仪器和设备 3.试样制备 用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。用绞肉机将试样均质。将试样装入密封的容器里，防止变质和成分变化。试样应在均质化后24h内尽快分析。 4.分析步骤 4.1试样 称取4g试样（精确至0.001g）于烧杯中，避免试样粘在烧杯壁上。 4.2水解 4.2.1量取30mL±1mL硫酸溶液，加入烧杯中，用培养皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。 4.2.2趁热将水解产物转移至250mL容量瓶中。用10mL硫酸溶液分三次洗涤烧杯，合并至上述容量瓶中。用水定容，摇匀。然后将其过滤至三角瓶中。 4.3测定 4.3.1用移液管移取5mL的上述滤液至250mL容量瓶中。 4.3.2移取4.00mL上述溶液于比色管中，加入2.00mL氯胺T试剂，混合后于室温下放置20min±1min。 4.3.3加入2.00mL显色剂于比色管中，充分混合，用塞子将比色管封
实验四十三植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、目的 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。 3 .试剂及配制： 2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。 冰醋酸；甲苯。 四、实验步骤 1.脯氨酸标准曲线的制作 1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。 加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
高效液相色谱（HPLC ）法测定邻苯二甲酸酯 一、实验目的： 1. 了解高效液相色谱仪原理； 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。 二、实验原理： ① 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC ）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： R ＝ 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1＋W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE ，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC 分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul 微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用） ，高纯水，样品。 出峰次序 样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP ） 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)
Sweetman S (Ed), Martindale: The complete drug reference. London: Pharmaceutical Press. Electronic version, (2005). Ornithine Ornithine Drug Nomenclature Synonyms: L -Ornithine ; α,δ-Diaminovaleric Acid; Ornitina rINN: Ornithine Chemical name: L -2,5-Diaminovaleric acid Molecular formula: C 5H 12N 2O 2 =132.2 CAS: 70-26-8 Pharmacopoeias: Ger. includes Ornithine Aspartate and Ornithine Hydrochloride. Date of monograph revision: 14-Apr-1998; 02-Sep-1999; 30-Oct-2001; 25-May-2004; Drug Profile Ornithine is an aliphatic amino acid. It is used as a dietary supplement. The aspartate, hydrochloride, and oxoglurate (ornithine ketoglutarate) have been used in various indications including the treatment of hyperammonaemia ( ) and hepatic encephalopathy (). References. 1. Kircheis G, et al. Therapeutic efficacy of L -ornithine -L-aspartate infusions in patients with cirrhosis and hepatic encephalopathy: results of a placebo-controlled, double-blind study. Hepatology 1997; 25: 1351–60. PubMed 2. Stauch S, et al. Oral L -ornithine -L-aspartate therapy of chronic hepatic encephalopathy: results of a placebo- controlled double-blind study. J Hepatol 1998; 28: 856–64. PubMed 3. Rapport L, Lockwood B. Ornithine ketoglutarate. Pharm J 2001; 266: 688–90. Preparations Single-ingredient Preparations The symbol ¤ denotes a preparation which is discontinued or no longer actively marketed. Austria : Cere ; Hepa ; Ornicetil ; Braz.: Hepa-Merz¤; Chile : Hepa-Merz ; Fr.: Cetornan ; Ornicetil ; Ger.: Hepa-Merz KT ; Hepa-Merz ; Hepa-Vibolex ; Ornicetil¤; Hong Kong : Hepa-Merz ; Hung.: Hepa-Merz ; India : Hepa-Merz ; Ital.: Ornicetil S¤; Ornicetil ; Ornil KGF ; Ornil ; Spain : Ornicetil¤; Switz.: Ornicetil¤; Multi-ingredient Preparations The symbol ¤ denotes a preparation which is discontinued or no longer actively marketed. Austral.: Anti-Flab¤; Braz.: Necroplex¤; Ornihepat ; Ornitargin ; Fr.: Arnilose¤; Epuram ; Ornitaine ; Ger.: Hepa-Merz Sub-sections Drug Nomenclature Drug Profile Preparations
1羟脯氨酸含量测定 2羟脯氨酸标准曲线绘制 3试剂的配制【6-7】 [6] 李秋营,姚汝琳.细胞中羟脯氨酸的测定.山西医科大学学报.2001,32(6):558-559 [7] David J Etherington, Trevor J Sims. Detection and Estimation of Collagen[J]. J Sci Food Agric, 1981,32:539-546 柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠120g、冰醋酸12mL、柠檬酸46g、氢氧化钠34g 溶解于蒸馏水中，调整pH 值至6.0，然后定容至1000mL。 0.05mol/L 氯胺T 溶液：称取氯胺T 7.05g，溶解于100mL 蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150mL，再加入250mL 柠檬酸缓冲液混合均匀。 对二甲基氨基苯甲醛: 试剂 A：取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74mL；试剂B：取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A 液慢慢加入B，混合均匀。 3.5mol/L 高氯酸溶液：取27mL 高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。 羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准储存液：准确称取L-羟基脯氨酸标准品50mg，加入0.01mol/L 盐酸中溶解，稀释并定容到100mL，在冰箱中保存。 羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液10mL到50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到50mL(临用前配)，浓度为100μg/mL。 4标准曲线绘制 分别吸取羟脯氨酸标准工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中。以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL，加入1mL 柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L 氯胺T 溶液，室温(25 ℃) 氧化10min 后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置10min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色10min，冷却后在560nm处测吸光度。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。 浓度μg/mL0.50 1.00 1.25 1,50 1,75 2.00 2.25 0.612 吸光度A560 0.134 0.284 0.347 0.409 0.477 0.55 6样品水解将样品反复绞碎，充分混合。称取5.000g样品放入250ml三角瓶中，加
脯氨酸含量的测定 在逆境条件下，植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即为红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 待测植物叶片 （二）仪器设备 1. 722型分光光度计； 2.研钵； 3.100ml小烧杯； 4.容量瓶； 5.大试管； 6.普通试管； 7.移液管； 8.注射器； 9.水浴锅； 10.漏斗； 11.漏斗架； 12.滤纸； 13.剪刀。 （三）试剂 1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 2.3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 3.冰醋酸。 4.甲苯。 三、实验步骤 1.标准曲线的绘制 （1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯中内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。 （2）系列脯氨酸浓度的配置：取6个50ml容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。 （3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。 （4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶
门冬氨酸鸟氨酸注射液的研究 门冬氨酸鸟氨酸注射液是国内用于治疗肝性脑病应用最为广泛的药物。本论文的目的:(1)建立门冬氨酸鸟氨酸注射液中试生产的最佳处方和工艺,以保证小试工艺顺利向大生产的转化。 (2)建立建立门冬氨酸鸟氨酸注射液质量标准。(3)对中试生产的注射液的稳定考察进行考察。 整个工作共分三部分完成:第一部分:处方工艺的优化。(1)研究了pH值对注射液稳定性的影响,确定pH值在5.7~6.7门冬氨酸鸟氨酸注射液品质最稳定。 (2)研究了抗氧剂对门冬氨酸鸟氨酸注射液品质最稳定的影响,结果表明入抗氧剂可以减少多数杂质的产生,但鸟氨酸内酰胺的含量随抗氧剂加入量增大而增高。最终采用充氮气保护的方法来控制质杂的产生。 (3)对门冬氨酸鸟氨酸注射液加工过程中原料药溶解的温度、充氮的方式以及活性炭用量与吸附时间等工艺参数进行了优化,确定了最佳工艺条件。(4)对灭菌条件进行了优化,结果表明116℃、40分钟条件下,杂质含量保持稳定,灭菌效果最好。 (5)对门冬氨酸鸟氨酸注射液包装材料进行了考察,结果表明以棕色玻璃安瓿瓶包装,门冬氨酸鸟氨酸注射液稳定性最佳。第二部分:质量标准的建立,所新制订的标准更加严谨、科学。 其中采用高效液相色谱法测定有关物质,色谱条件为乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾13.61g,加水500ml溶解后加入25%~28%的氨水5ml,加水稀释至1000ml,混匀后用磷酸调pH值至4.2±0.1)(60:40)为流动相;检测波长为205nm,对可能产生的5种杂质均能有效检出与分离。含量测定采用高效液相色谱法,色
谱条件同有关物质,进行了方法学验证,回收率、精密度、定量限等各项验证指标均符合要求。 氨基酸比值测定采用高效液相色谱法,色谱条件同有关物质,对原方法进行了大幅度改进,避免了仪器系统误差所造成的影响,方法学验证结果显示,各项验证指标符合要求。采用鲎试剂法对内毒素的测定进行了详细的研究,最终确定每1ml中所含内毒素的量应小于10EU,可以替代目前进口标准中所执行的家兔法测热原。 第三部分:稳定性考察,稳定性考察分别进行了影响因素考察、冻融试验、加速试验与长期试验。试验结果显示自制样品与进口样品在性状、氨基酸比例、含量等方面质量一致,没有明显区别。 鸟氨酸内酰胺的杂质含量自制样品明显低于进口样品,在加速考察6个月及长期考察12个月后,自制样品的鸟氨酸内酰胺杂质含量均未超过0.8%,而进口样品在同样考察周期后已达到2.85%。自制门冬氨酸鸟氨酸注射液与进口样品相比,整体质量有了明显提高,在鸟氨酸内酰胺杂质的控制方面有了很大的提高,杂质含量远低于进口样品,且通过中试生产验证可以实现工业规模化生产。
羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0255 规格：100T/96S 产品内容： O（V/V）=1:1，室温保存。 提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 试剂一：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：0.5mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。 产品说明： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。 操作步骤： 一、羟脯氨酸提取： 1、组织：称取约0.2g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/L NaOH（约1mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至4mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质） 2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm，
脯氨酸（Pro）含量测定试剂盒使用说明 分光光度法50T/48S 货号：BC0290 测定意义： 脯氨酸(Pro)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。 测定原理： 用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰乙酸、甲苯、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：冰乙酸4℃保存。（自备） 试剂二：液体45mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：甲苯4℃保存。（自备） 标准品：脯氨酸10mg，4℃保存。
样品测定的准备： 1、细胞、细菌或组织样品的制备： 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清；按照每100万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），之后置沸水浴振荡提取10min；10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。 组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；之后置沸水浴振荡提取10min，10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。 2、血清（浆）样品：取100μL血清（浆）加入1mL提取液，充分混匀，之后置沸水浴振荡提取10分钟，10000g，常温离心10分钟，取上清，冷却后待测。 3、标准品的处理:称取1mg，将标准品稀释为15、10、8、6、 4、2、1、0g/ml。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。 2、取0.5mL上清液（或稀释后的标准品）+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），每10min振荡一次。 3、待冷却后，在试管中加入1mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8mL-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，用试剂三调零，于520nm波长处比色，记录吸光值。 4、根据标准品吸光值和浓度，建立标准曲线。 Pro含量计算： 1、通过标准曲线计算样品脯氨酸含量(y为脯氨酸含量，μg/mL；x为OD值)
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。