实验二动物细胞融合
【实验目的】
1.了解动物细胞融合的常用方法。
2.学习化学融合和电融合的基本操作过程。
3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
【实验原理】
细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒细胞诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。
1.病毒诱导融合
仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可以介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞的融合。用紫外线灭火后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。这种诱导细胞融合的方法缺点是目标细胞不明确，融合后的细胞需要再次筛选出目标融合细胞。
2.化学诱导融合
很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和力与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性，PEG 是被广泛使用的化学融合剂
3.电激诱导融合
包括电诱导，激光诱导。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破
4.细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融
合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
【实验用品】
1.材料
鸡血红细胞
2.试剂
50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。
3.器材
显微镜、离心机、恒温水浴锅、盖玻片、载玻片、离心管、滴管、废液缸等【实验步骤】
1.取鸡血2ml加入2ml Alsever溶液，再加入6ml Alsever溶液，混匀后制悬液。
2.取步骤1中混匀的悬液1ml，加入4ml 0.85%的氯化钠溶液，放入离心管，
1200r/min离心5分钟。
3.将上一步的沉降血球去上清液后（约剩余0.1-0.2ml），加入GKN溶液至1-2ml,
使之稀释成10%的细胞悬液。
4.取上述10%的血球悬液1ml，加入3mlGKN溶液，使每毫升含血球15000000
个，即1.5×107个/ml。
5.(1)取步骤4中的液体1ml加入0.5ml 50%的PEG溶液，混匀滴片，在常温下
静置2-3分钟后，镜下观察。
（2）取步骤4中的液体1ml加入0.4ml 60%的PEG溶液，按照步骤（1）的方法制片观察。
【实验结果】
细胞融合分为两个细胞刚接触，细胞开始融合，细胞形成哑铃状，两细胞融合成椭球状，两细胞融合成球状合并为双核细胞，这几个阶段。经过镜检只观察到了前三个阶段。图1为两细胞刚接触，图2为两细胞开始融合，图3为细胞形成哑铃状。
A
B
图1. 两细胞刚接触（10×40 A为PEG浓度50% B为PEG浓度60%）
A
B
图2. 细胞开始融合（10×40 A为PEG浓度50% B为PEG浓度60%）
图3. 细胞形成哑铃状（10×40 PEG浓度为60%）
【分析与讨论】
滴加PEG溶液时应注意要沿着管壁换换滴加，PEG溶液密度比较大，会沉入底部。而静置一段时间是为了增大高浓度PEG溶液与细胞的接触时间，从而增加细胞融合的概率。经过镜检，可明显观察到相比于浓度50%的PEG溶液，浓度60%的PEG溶液的融合效率明显高很多。镜检下只看到前三个阶段融合的细胞可能是由于静置的时间不够长，融合时间不够，并且在加入GKN溶液时有些过量，导致细胞浓度降低而造成的。
【拓展】
细胞融合的理论和实际意义
细胞融合的理论
化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有
的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。
过程细胞膜有内外两层，细胞融合首先发生在外层，然后再到内层，由此就出现了两种融合通道，细胞体内物质通过这两种通道转移。病毒膜与目标细胞融合时，只出现一种融合通道，即导致融合的基因只能在病毒中找到，而在目标细胞中却找不到。但是，通过EFF-1发生的细胞融合则是一个双向融合过程，需要EFF-1出现在两个相互融合的细胞中。
细胞融合的实际意义
细胞融合能把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。细胞融合技术已在农业、工业、医药等领域取得了开创性的研究成果，应用领域不断扩大。该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋白动力学等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发育生物学，在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育，绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。
其中最具代表性的应用为单克隆抗体的应用，在下面作详细叙述。
单克隆抗体应用
一、检验医学诊断试剂
作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术，并且单克隆抗体的应用很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：①病原微生物抗原、抗体的检测；②肿瘤抗原的检测；③免疫细胞及其亚群的检测；④激素测定；⑤细胞因子的测定。
单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。
二、蛋白质的提纯
单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质(如Separose 2B、4B、6B等)上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。
将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。
三、小分子抗体的应用
将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将化疗药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。小分子抗体是分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。它有以下独特的优势：分子量小，穿透性强，抗原性低；由于不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不良反应少；半衰期短，有利于及时中和及清除毒素；另外，可在原核系统表达及易于基因工程操作。
四、抗体融合蛋白的应用
1，肿瘤的体内显像诊断单链抗体排除速度快，穿透力强，因此在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高。在放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低，因此是较为理想的显像定位诊断载体，为肿瘤的诊断提供了新的途径。
2．病毒的诊断和抗病毒感染单链抗体为医学上某些至今难以治疗的疾病如病毒病的诊断和治疗提供了新的、高效的免疫制剂。因此用于免疫治疗和诊断显得尤为重要。
血液性疾病的诊断：抗人白血病单链抗体可用于白血病的免疫诊断及分型。
单克隆抗体在临床上的应用最具有代表性，如诊断各类病原体、肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测、检测淋巴细胞表面标志、机体微量成分的测定等。