ＤＮＡ指纹图谱技术在奶酪发酵菌群中的
应用研究
王娟1，张铭霞2，曹雁平1，杨贞耐3，王蓓1，2，*
（1.北京工商大学，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京100048；
2.北京工商大学，北京市食品风味化学重点实验室，北京100048；
3.北京工商大学，食品质量与安全北京实验室，北京100048）
摘要：DNA指纹图谱技术是近年来较为常用的分子生物学技术，由于发酵菌群的DNA指纹图谱直接反映DNA水平上的差异，因而作为微生物指纹图谱的一个组成部分，DNA指纹图谱这一现代分子生物学技术在微生物研究中有其独特的作用，这种技术在发酵菌群的鉴定、遗传育种及多样性等研究领域有广阔的应用前景。常用于发酵菌群研究的DNA指纹图谱技术有RFLP、T-RFLP、SSCP、RAPD、DGGE、AFLP等。本论文在综合介绍DNA指纹图谱的一般常用技术的基础上，结合近年来国内外奶酪发酵菌群中DNA指纹图谱技术研究现状，在探讨其在奶酪发酵菌群相关领域应用的基础上，逐一介绍了各种技术的原理、优缺点及研究现状，对我国传统奶酪发酵菌群的研究具有重要的实际意义与理论价值。
关键词：DNA指纹图谱，传统奶酪，发酵菌群，分子生物学
The application research of DNA fingerprinting technology in the
bacterial fermentation microflora of cheese
WANG Juan1，ZHANG Ming-xia2，CAO Yan-ping1，YANG Zhen-nai3，WANG Bei1，2，*（1.Beijing Engineering and Technology Research Centre of Food Additives，Beijing Technology&Business University（BTBU），
Beijing100048，China；
2.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology&Business University（BTBU），Beijing100048，China；
3.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology Beijing Technology&Business University（BTBU），
Beijing100048，China）
Abstract：In recent years DNA fingerprinting technique was more and more popular in molecular biology researching.The DNA fingerprinting of bacterial fermentation microflora could directly reflect their differences on the DNA level.As a necessary part of the microbial fingerprinting，DNA fingerprinting of the modern molecular biology techniques had played an important role on the microbiological studies，and as well as in the field of identification，and genetic diversity researching of fermentation https://www.doczj.com/doc/eb14867747.html,ually DNA fingerprinting techniques such as RFLP，T-RFLP，SSCP，RAPD，DGGE，AFLP and so on have been applied in most fermentation microflora studies.Based on introduction of the common techniques of DNA fingerprinting technique and discussion of the application of DNA fingerprinting on the fermentation micoflora of cheese，the paper had combined the current situation of DNA fingerprinting on cheese，and introduced the principle，advantages and disadvantages，current researching situation of DNA fingerprinting techniques.And all of these discussions had important the practical significance and theoretical value to study the fermentation microflora of our traditional cheese.
Key words：DNA fingerprinting；traditional cheese；fermentation microflora；molecular biology
中图分类号：TS252.1文献标识码：A文章编号：1002-0306（2015）08-0395-05
doi：10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.074
收稿日期：2014－12－05
作者简介：王娟（1989-），女，硕士研究生，研究方向：乳制品风味。
*通讯作者：王蓓（1981-），女，博士，副教授，研究方向：乳制品呈味肽分析。
基金项目：国家自然基金青年基金资助项目（31201392）；国家“863”计划项目（2011AA100903）；北京市教委科研计划资助项目（KM201310011004）；
北京市属高等学校创新团队建设与教师职业发展计划项目（IDHT20130506）。
DNA指纹图谱技术是通过物质在DNA水平上的差异，以现代分子生物学方法来标记，同时构建DNA 指纹图的一种技术。由于同种微生物的核苷酸序列具有相对稳定性，而不同种类微生物核苷酸序列具有一定差异性，因而可以通过现代分子生物学技术构建体系微生物DNA指纹图谱的方法，达到对微生物菌群多样性的研究。DNA指纹图谱技术已成功地应用于许多领域中，如发酵食品中的微生物群落分析研究[1]，样品原料或中间产物中微生物群落的多样性分析等[2]。
传统奶酪中发酵菌群丰富又复杂，对奶酪的风味和流变学性质有重要的影响。因而近年来奶酪发酵过程中微生物多样性及其对奶酪感官品质的影响的相关研究越来越为人们所关注。人们采用不同的DNA指纹图谱技术对奶酪中的发酵菌群进行系统研究，常用的DNA指纹图谱技术有限制性片段长度多态性、末端限制性片段长度多态性、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、随机扩增多态DNA技术、扩增片段长度多态性、分子杂交技术等，本文拟从这些方法的基本原理及其在奶酪微生物多样性相关分析应用等方面进行阐述。
1限制性片断长度多态性
限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），又称为核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA），该技术是通过DNA的多态性来研究微生物群落多样性的方法。RFLP技术主要是基于PCR技术扩增目的基因序列，然后选择特异限制性内切酶将扩增的目的基因序列切割成大小不同的DNA片断，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析这些片段，从而获得待测样品中微生物群个体差异信息，以达到对样品中菌群分析并鉴定的目的。RFLP方法适用于比较分析不同样品或是样品在不同时期微生物菌落结构的变化，尤其适用于大批量样品的分类、鉴定研究[3]，由于该方法操作简单，因而在奶酪微生物菌群研究中仍被广泛使用。Dariush等对伊朗游牧部落Motal奶酪的益生菌群落结构进行了PCR-RFLP技术分析，并在此技术基础上确定得到Motal奶酪中益生菌的主要类型是嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌[4]。
RFLP技术虽然简单，但由于基因组信息较大，酶切图谱条带过于复杂，因而存在评价结果准确度相对较低的问题。因此近年来在RFLP技术的基础上，又发展出了两种新技术，分别是末端限制性片断长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技术和tRNA Ala-23S rDNA限制性片断长度多态性（tRNA Ala-23S ribosomal DNA Restriction Fragment Length Polymorphism，tRNA Ala-23S rDNA-RFLP）技术。
T-RFLP与RFLP技术主要的区别是在T-RFLP 中，一个引物的5’末端用荧光物质来标记，因而检测得到的为带有荧光标记的末端片断[5]，该步骤极大地简化了图谱带型，使得T-RFLP技术更易于进行复杂菌落结构分析并获得发酵菌群多样性的更多信息，同时该技术也可通过图谱条带来评价微生物的丰度、均度，以及样品间的相似性，因而得到的信息更加准确[6]。Rossetti等[7]在对奶酪微生物种群（乳酸菌，柠檬串珠菌株等）研究过程中，同时对比了以逆转录酶（reverse transcriptase，RT）-PCR为基础的T-RFLP 技术进行的半定量分析结果和利用菌株表型鉴定以及生理生化实验进行的传统培养所得到的分析结果，对比结果表明T-RFLP技术可以对奶酪发酵过程中菌群的细微变化进行检测，并且重复性较好，而传统的菌落计数法灵敏度较低，对菌群的细微变化无法检测。此外，虽然和传统培养技术相比T-RFLP技术具有快捷、灵敏度高的特点，但T-RFLP技术的使用范围仍具有一定限制，尤其对复杂环境内的样品而言，由于在该环境下不同的微生物在酶切后可能会产生相同的切割片断，因而易对样品中微生物的种类与含量作出错误估计，导致结果的不确定性[3]。
tRNA Ala-23S rDNA-RFLP技术是将16S-23S rDNA 基因间区（Intergenic Spacer Region，ISR）分析技术与RFLP技术联合的一种新方法。该方法是利用转录核糖体30S小亚基的16S rDNA和50S大亚基的23S rDNA 的保守区段与基因间区（ISR）来分析样品中发酵菌群系统发育情况，并对菌群进行分类和鉴定的重要方法。其中由于16S-23S rDNA的序列具有长度和序列的可变性，变异的程度比16S rDNA和23S rDNA要大，因而能够得到更加准确的结果。该方法的操作流程如图1所示：同时采用两个特异引物：tRNA Ala（由酒类酒球菌的tDNA Ala的一个保守的序列进行设计）与23S/p10（位于大肠杆菌中23S rRNA基因的456~474），利用PCR技术，对基因区间序列进行扩增，扩增产物再用限制性内切酶（HindⅢ、HinfⅠ和TaqⅠ）进行酶切，最后酶切产物用聚丙烯酞胺凝胶电泳，观察酶切片段的多态性，统计分析电泳图谱，即可得到待测样品中不同菌株的遗传相似水平，还可以用于鉴定样
图1tRNA Ala-23S rDNA-RFLP技术的具体流程
Fig.1tRNA Ala-23S rDNA-RFLP workflow
提取基因组DNA
扩增DNA片段
16S23S
t-RNA Ala
基因间区（Intergenic Spacer Region，ISR）
t-RNA Ala23S/p10
酶切PCR扩增产物
（HindⅢ、HinfⅠ和TaqⅠ）
通过聚丙烯凝胶电泳
获得指纹图谱
分析所得到的
电泳图谱
通过聚类分析对菌株
种属水平上进行鉴定
品中发酵菌株之间的系统发育关系。Mancini等[8]同时运用tRNA Ala-23S rDNA-RFLP技术与其他两种DNA 指纹图谱技术，即随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）和重复基因外回文序列分析技术（repetitive extragenic palindromic-PCR，rep-PCR），对Grana Padano奶酪成熟过程中分离得到的典型乳酸菌种间和种内的多样性进行研究，分析结果表明，tRNA Ala-23S rDNA-RFLP技术的重现性要高于RAPD和rep-PCR技术，并且靶tRNA Ala-23S rDNA序列在细菌鉴定应用中可获得更加准确及有价值的信息，从而能够更好地对奶酪中乳酸菌在种属水平进行进一步的分析与鉴定。
2逆转录变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳技术（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是一种快速、经济、可靠、重复性好的分子生物学技术，能够同时实现多个样品的分析。该技术能较为客观与直观地鉴定及分析微生物，因而被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域。目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一[9-10]，也常用于检测奶酪发酵过程中微生物菌落变化[11]。该技术的主要原理是：在变性梯度聚丙酰胺凝胶电泳中，长度相同但序列不同的DNA分子会在变性剂（尿素、甲酰胺）的作用下产生不同的解链行为，在外加电场的作用下会在凝胶中形成不同的迁移位置，从而使DNA片断得到分离。电泳结束后，经过染色即可观察图谱中分开的不同带型。虽然DGGE技术已广泛用于多种食品发酵过程中菌群研究，然而同其他基于PCR的分子生物技术一样，DGGE技术除了会受到PCR扩增时产生偏差的影响外，也具有一定的自身局限性。例如，DGGE适于分离200~500bp的目的基因片断，超出此范围的片断则难以分析，因此所得序列仅能提供较为有限的系统发育信息。其次，研究表明DGGE仅能检测到发酵乳制品中微生物含量达到1%~2%以上的优势菌种，而弱势菌种一般不易被检测到[12]，因而会造成对样品中某些发酵菌群多样性的低估或者高估。
由于受到传统加工技术与地域的影响，奶酪中的微生物具有独特性，并且不同微生物群体在发酵过程的不同阶段活跃程度不同，因而为了更好地揭示手工奶酪的微生物代谢活性，一些研究者利用RT-RNA技术对奶酪中发酵菌株的多样性进行进一步分析。通过结合RT-PCR-DGGE（基于RNA）和PCR-DGGE（基于DNA），从奶酪总体微生物（DNA衍生的）中区分代谢活性较强（RNA衍生的）的微生物，从而更好地研究奶酪发酵过程中微生物菌群变化。Randazzo等[13]对手工Sicilian奶酪成熟过程中发酵菌群的DNA衍生的DGGE图谱与RNA衍生的DGGE图谱进行比较，表明了该奶酪在不同发酵阶段微生物群体具有不同的代谢活性。已有研究结果表明RT-PCR-DGGE方法对发酵时间较长的奶酪中菌群变化的相关研究非常有效[14]，并且由于RNA的稳定性相对于DNA而言较差，RNA会在已死亡的微生物中迅速地降解，因此基于RNA的测定比基于DNA的测定
法更为敏感。为了获得Fontina PDO奶酪在发酵过程中细菌群落的变化以及该奶酪中的特征微生物菌群更加详细的信息，Dolci等[15]将PCR-DGGE和RT-PCR-DGGE技术同时应用于Fontina PDO奶酪的表面，亚表层以及奶酪内部。研究结果表明：RT-PCR-DGGE分析方法得到的电泳条带更为丰富，因而基于RNA的RT-PCR-DGGE技术能够给出奶酪在发酵过程中微生物多样性的更详细信息。
3单链构象多态性
单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）技术是近年来随着对人类基因组进一步深入研究而发展起来的一种与PCR技术相结合，利用电泳方法分离构象不同的DNA序列，从而检测和分析碱基突变的一种分子生物学技术。由于单链DNA自身核苷酸序列以及物理化学环境折叠成的三级结构不同导致其在非变性凝胶中的电泳迁移率存在差异，因而利用此点可以对DNA单链中基因突变进行检测和分析。
这项技术是由Orita等[16]建立的，最初用来检测已知或未知的DNA多态性或基因的点突变，目前已成为继PCR-DGGE后，研究手工奶酪中复杂的微生物发酵菌群最常用的分析方法。当前大量研究表明SSCP方法操作简单快捷、灵敏度高，但对实验条件（电泳条件）要求相对较严格。Callon等[17]结合SSCP 技术与PCR技术对3种已注册产地标记（Registered Designation of Origin，RDO）的传统Salers奶酪中的酵母菌群落结构进行分析，通过与传统培养方法的对比表明SSCP技术分析得到的菌群结果准确度高，即该技术能够快速分析奶酪在制作和成熟阶段中的酵母菌群落的演替过程。
Retureau等[18]将培养基平板计数与SSCP技术相结合确定奶酪发酵过程中微生物多样性，并以此为指标对Saint-Nectaire鲜乳奶酪的微生物安全性进行检测，检测结果表明命名为TR15的天然混合菌体与分离于Saint-Nectaire鲜乳奶酪表面的菌株在奶酪发酵过程中微生物多样性变化有所不同，并且TR15对李斯特菌的抗性较强，能够显著地抑制该菌在奶酪表面生长。平板培养结果和SSCP分析结果均表明由TR15混合菌株制得的奶酪中含有较高水平的乳杆菌和明串珠菌，同时SSCP分析结果还显示TR15奶酪中同时含有疏松肉杆菌（Carnobacterium mobile），阿氏节杆菌（Arthrobacter arilaitensis）等菌株，这些菌株也能够有效的对李斯特菌进行抑制，因此该研究表明SSCP技术可以更好地对抑制食品中致病菌株生长的微生物的交互作用进行研究，同时对于阐明奶酪中微生物相互作用关系具有重要意义。
4随机扩增多态DNA技术
随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）标记技术是1990年由Williams[19]和Welsh[20]同时发展起来的一种分类鉴定技术。RAPD的基本原理是根据不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同，用一组人为设计的核苷酸作为引物，通过PCR随机扩
增得到该生物种特异性的DNA图谱。该技术可用于细菌种间、亚种间的亲缘关系分析，还可以用于未知菌株的快速测定等。当前研究结果表明RAPD技术的优点是简单便捷，在不了解基因组DNA的任何序列信息的情况下就可以进行鉴定，但缺点是重复性差，鉴定结果不稳定，很难在种以及亚种的水平上准确鉴定。
杨吉霞等[21]探讨了RAPD技术对不同地区牦牛奶酪乳酸菌分类鉴定中的应用，结果表明该技术能够简单快速的实现对发酵奶酪中的乳酸菌种间和种内的区分，并且该研究结果还表明鉴定得到的39株菌株的RAPD图谱的聚类表现出一定的地域性，即西藏与云南的地理位置相邻，菌株较多聚在一起，而新疆的地理位置较远，菌株很少与其余两地的菌株聚为一组，该结论很好地证明了RAPD技术可用于不同地域菌株间的遗传亲缘关系研究。Ruiz等[22]使用三种分子技术，即随机扩增多态性-聚合酶链反应（RAPD-PCR）、肠杆菌基因间重复一致序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC-PCR）和聚三核苷酸（polytrinucleotide（GTG）5-PCR）等，对分离于山羊奶酪和Manchego奶酪中的乳酸菌和参考菌株进行分析，从而比较这些技术对细菌的鉴定能力。结果表明，RAPD-PCR方法得到的电泳结果中的条带数量最多，因而其能够对复杂微生物体系中同种属的菌株进行更好的归类，而ERIC-PCR和（GTG）5-PCR 方法则对某些不同种属的菌株鉴定的结果显示没有差异性，因而RAPD-PCR方法具有较好的分辨能力，可用于对奶酪中不同种属的乳酸菌菌株种属分型鉴定。
5扩增片段长度多态性分析技术
扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是在RFLP技术与PCR相结合的基础上衍生出来的一种新技术，其基本原理是先通过限制性内切酶切割基因组DNA产生不同大小的限制性片段，再使双链人工接头与酶切片段相连接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1~3个选择性核苷酸作引物，对模板DNA基因再进行选择性扩增，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得DNA扩增片段，并根据扩增片段长度的不同检测出多态性。
AFLP与其他DNA指纹技术有相似之处，也有其独特的优点[23]：可用于各种大小不同基因组的指纹分析；具有一定灵活性，可通过特异性PCR引物设计和内切酶组合的选择，来调整AFLP指纹图谱中限制性片段的适宜数目；采用严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳，重复性好，分辨率高；操作简单，可作为连接遗传图谱与物理图谱间的桥梁，用于微生物基因组的分析研究。
AFLP技术建立初期用于植物育种的研究，后来发展成为可以分析任何来源DNA指纹图谱的一项通用技术，近些年来被广泛应用于奶酪相关发酵菌群的分类鉴定。嗜热链球菌是牛奶发酵过程中常用的发酵剂，Lazzi等[24]分别利用AFLP和RAPD对嗜热链球菌的遗传多样性进行比较分析，研究数据表明和RAPD方法相比，AFLP为嗜热链球菌的多样性研究提供了更为精密的检测结果，因而该技术对不同种的微生物识别效果更好。此外，近几年来AFLP技术在奶酪发酵过程中菌体代谢通量相关研究领域也取得较大进展。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）是属于非发酵剂乳酸菌，其对大多数奶酪成熟过程中风味的形成有重要作用。Lazzi等[25]根据互补DNA 的扩增片段长度多态性（cDNA-AFLP）和实时定量逆转录PCR（qPCR）方法对鼠李糖乳杆菌PR1019在CB（cheese-like medium，CB）培养基中生长代谢的相关分子机制进行进一步研究，并取得了较好结果。
6分子杂交技术
核酸分子杂交技术（nucleic acid hybridization，NAH）是细菌分子生态学中利用特异探针来进行定性和定量分析微生物的一个重要工具，可以通过萃取样品中得到的DNA或RNA，或者是原位杂交来进行[26]。一般来说，核酸杂交技术都是根据已知序列来设计的特异的寡核苷酸探针，然后用荧光或放射性元素对该探针进行标记，并通过碱基互补的原则与目的基因进行杂交，最后利用检测得到的杂交信号对发酵微生物群落结构进行分析的方法。分子杂交法自身也存在一定的局限性，它一般对目的片断（如优势菌种）检测灵敏，但是由于其原理是根据已知基因设计探针，因而较难发现新的基因类型。
当前在发酵菌群多样性分析中应用较多的分子杂交技术是数量斑点印迹杂交和原位杂交，它们的特点是不需要对目的片断进行PCR扩增，因而可避免在PCR扩增中造成的误差。此方法简便快速，主要应用于快速检测。Ercolini等[27]对Stilton奶酪进行16S rRNA基因荧光原位杂交，并对其中的细菌进行观察检测，观察到了大量的菌落细胞均匀分布在奶酪基质中，因而该技术在研究食品中微生物群体空间分布，尤其是那些质地较脆弱不易进行检测操作的食品基质中具有良好的应用前景。Babot等[28]针对Gruyère奶酪中丙酸杆菌（propionibacteria）的16S rRNA基因来设计寡核苷酸探针，并优化荧光原位杂交对该类细菌数目进行检测，结果表明和平板计数法相比，该方法能够快速有效地检测奶酪样品中的丙酸杆菌含量，再次验证分子杂交技术可以对奶酪中的一些细菌达到快速检测的效果。
7展望
奶酪中含有丰富的发酵菌群，其对奶酪的风味及流变学性质具有重要影响，因此奶酪发酵菌群的多样性研究是传统奶酪工业化生产的基础。相对于繁琐的传统培养方法而言，应用DNA指纹图谱技术分析，可以快速、准确、灵敏、简便地对发酵菌群进行分类、鉴定和分析，在近年来的研究中已经展现出了巨大的优越性，已成为研究奶酪以及其他食品中微生物群落结构的有效工具。不过每种方法都有其自身的优势与不足，虽然利用不同分子生物学技术可以获得更加真实的微生物群落多样性，弥补了传统
培养方法的不足，但要得到奶酪发酵过程中的主要发酵菌群则仍需要通过传统分离培养的方法。因此，用分子技术指导传统培养的方向，用传统培养的结果对分子方法进行验证，二者互为补充，已经成为研究奶酪以及其他发酵食品中微生物多样性的新方向。
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“种质资源DNA指纹图谱库”科研计划启动铁观音可做“亲子鉴定” 发布时间：2011-10-20 8:31:07 稿件来源：泉州网-泉州晚报 “市面上销售的安溪铁观音是否原产于安溪，做了‘亲子鉴定’就知道。”近日，记者获悉，针对漳州华安、浙江海宁等地茶园冒用铁观音品牌的情况，安溪本地茶企举起科技大旗，以DNA指纹图谱鉴定方式鉴别茶叶的原产地。 抢搭品牌便车 安溪铁观音、西湖龙井、祁门红茶、武夷岩茶……纵观中国十大名茶，每一个茶叶品种之前都要冠上特定的地名，可以说，只有特定的水土和气候条件才能够产出举世闻名的好茶。 安溪西坪铁观音茶叶研究所所长魏火连告诉记者，作为中国十大名茶之一，安溪铁观音以其独具的“香、韵”风靡全国，这让不少外地的茶企动起了“品牌”搭便车的念头。 据悉，漳州华安县本以盛产“清香型五季茶”闻名，可是近年来部分茶企频频使用铁观音对产品进行包装宣传；三明大田县部分茶企则将当地种植的茶叶冠以“安溪铁观音”之名进行销售；此外，福建漳平、贵州黎平等县、市也大量种植铁观音，其部分成品没有标明原产地，而是冠以“安溪铁观音”之名进行销售。 冲击本地茶企 “制茶是一件天时地利人和的事情，要有合适的气候和水土，更要有人工炒茶的技艺和经验。”国家级非物质文化遗产乌龙茶（铁观音）制作技艺代表性传承人魏月德告诉记者，安溪有将近三百年的铁观音制茶经验，这是外地无法复制的。因此，无论华安还是大田，即使两者有安溪相似的地理自然条件，但要做出和安溪一样品质的铁观音，实属不易。 “最怕的是，客商买到冒充安溪铁观音的茶叶后，认为安溪铁观音品质下降，不仅影响来年订单量，还损坏了安溪铁观音的品牌美誉度。”中国茶都茶叶交易市场的茶商吴女士告诉记者，大量外地茶叶的冲击还会导致安溪铁观音价格下跌，这对安溪本地的茶企来讲，是个不容忽视的危险信号。 查图谱辨真伪 “安溪铁观音品牌维权的难题在于如何鉴定茶叶是否原产于安溪。”魏火连告诉记者，铁观音茶产业让安溪近百万人口走上了致富的道路，经30年高速发展，如何保持茶产业的可持续发展，保护好安溪铁观音的品牌价值显得尤为重要。 针对这一情况，福建魏荫名茶有限公司联合福建农林大学茶学系设立了博士后工作站，启动了“铁观音种质资源DNA指纹图谱库”科研计划。 据福建农林大学茶学系主任孙威江教授介绍，利用DNA指纹图谱库检测相当于给茶叶做亲子鉴定，它能分辨安溪产和安溪以外产地生产的铁观音，甚至可分辨出“内安溪”和“外安溪”茶叶。随着图谱信息的完善，查出某批茶叶产自安溪哪个厂商的技术也将成为现实。 安溪县工商局相关科室的负责人告诉记者，该图谱库的研究与建立有利于安溪铁观音的原产地保
DNA指纹图谱分析实验 一. 实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二. 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA?指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、?肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA?指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA 指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，?如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。
DNA指纹图谱实验 上课地点：化学楼120 上课时间：选课时 任课教师：薛闯办公地点：生化楼215 电话：84706308 课程要求： 预习实验内容，掌握实验目的及原理、仪器和试剂、实验步骤； 手写完成预习报告（实验名称、实验目的、实验原理、实验器材与试剂、实验方法与步骤），课堂检查预习报告情况。 自带U盘和尺子。 实验注意事项： 1、实验台上物品按实验室管理老师要求摆放整齐； 2、实验废物按实验室管理老师要求收集； 3、实验结束后，经老师检查后方可离开。 实验纪律： 1、按时上课 2、穿实验服（白大衣） 3、不许吃东西，课堂严禁大声喧哗 4、手机静音 实验成绩： 预习报告：20分 实验操作：40分 报告内容：结果和讨论40分
DNA指纹图谱实验 （指导教师：薛闯） 一．实验目的 1. 掌握DNA 指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA 片段的长度。 3. 掌握对DNA指纹数据进行基本统计分析方法。 二. DNA指纹图谱实验原理 1984 年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys 及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA 指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。由于DNA 指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA 指纹具有下述特点： 1. 高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA 图形的概率仅3×10-11 ；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10 -19。全世界人口约50 亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA 指纹的图形完全相同。 2. 稳定的遗传性：DNA 是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50 % 给子代。 3. 体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA 指纹图形完全一致。 DNA 指纹图谱法的基本操作：
【实验结果】 1 电泳结果图： 图1：电泳结果图 说明：a.条带1-6是marker的条带。 b.条带7-9是基因D1S80的条带。 2 marker的标准曲线的制作： marker1标准带的相关曲线 图4：marker 1的标准曲线根据图4算出marker 2的相关数据： 离
度 所以可以估算出条带1’~6’的标准分子量大概为2400、1700、1000、700、400、200。 将这一组数据应用到实验结果中marker标准曲线的绘制上，显然会给实验结果带来很大的影响。但又不可避免。 marker标准条带的相关数据 图2 marker的标准曲线 3成员A、C、D的D1S80的计算： 根据marker的标准曲线知 表2： 4结果记录表：
表3：结果记录表 【实验分析及讨论】 A从图1可知小组成员里只有A、C、D有正常的条带，而且全是纯合体，而B、E、F并没有出现正确的条带，分析可能原因：a在取样时取得太少了，致使提取的DNA浓度过低，在该实验的PCR条件下30个循环不能得到正确的DNA分子拷贝。b取样不合适，可能在去口腔上皮时并没有在适合的位置取，导致取出来的并不是口腔上皮。c在操作过程中一些错误的步骤导致没有提出正确的DNA分子。 B图1中最下面的有一排亮亮的条带。据分析是PCR体系里引物的条带。但是我们可以发现与B、E、F相比，A、C、D对应的条带最亮最宽，说明引物的含量较多，但是偏偏 A、C、D有正确的条带。这似乎说不通，但是进一步的分析可以推测有以下两种原因：a在向Pcr小管里加入体系时，由于移液枪不准造成的加入体系不同，但这种概率较小。b在向胶孔加入样品时由于加入量不同造成的结果。这个显然比第一种出现的概率要大得多。 C原理中我们指出人类1号染色体上的VNTR D1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知29种不同的等位基因。但是我们的实验结果里D的拷贝数为13，却小于14，由于两者比较接近所以将D的拷贝数应该认为是14，而出现这种偏差的原因可能在于：a marker标准的分子量我们是用的周五晚上组的图估算出来的(如图3)，并不是说明书上标准的，所以marker的标准曲线与实际的可能有一定的差距，这样就会导致最后的结果也会有一定的差距。b在photoshop CS3软件测量距离时，并没有专业的分析距离的功能，而是利用相关功能读出来的，所以这可能会给结果带来很大的偏差。 D如果一个个体的两个D1S80等位基因之间相差一个重复，不可以用琼脂糖凝胶电泳检测。原因是在实验中我们用到的缓冲液是1*TAE，1.5%的琼脂糖。根据相关资料显示这种胶的的分辨率在80bp~4kb，而一个重复是16bp，所以我们不可以用琼脂糖凝胶电泳检测。 F用PCR、RFLP、RAPD方法产生DNA指纹图谱各有利弊：PCR方法简单，但不准确，还需要设计引物.RFLP 利用酶的特异性给为准确快速，缺点有RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制。RAPD利用随机的引物原理简单，快速，弊端有RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。 【结果与分析】 本次实验所选择的方法是D1S80指纹图谱分析的常用方法。人群中D1S80座位的杂合率约为86％。从理论上讲，可能存在435种不同的等位基因组合。利用D1S80座位两侧序列设计的引物（Kasai et al，1990），通过PCR反应，很容易确定特定个体的D1S80等位基因构成，纯合体只有一条DNA带，而杂合体有两条不同的DNA带。 1．将小组的电泳结果拍照，并把照片贴在实验报告上，对照片进行必要的说明，例如，相对分子质量的标记各片段的大小（bp）。 （见附图） 2．
DNA指纹图谱分析 一、实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二. 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA?指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，
中药生物指纹图谱调研报告 一、中药生物指纹图谱简介 中药生物指纹图谱（biological fingerprint of TCM）是利用基因组学和蛋白组学技术研究药材基因型特征和中药作用于特定生物细胞后引起基因和蛋白的表达的变化规律和作用机制，从分子水平上揭示中药、中药与生物的细胞作用后的基因与蛋白的表达特征，研究解决化学成分和药理作用、药效活性的相关性，是中药指纹图谱研究的一个重要方面和最高级阶段。主要包括中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱和中药材DNA指纹图谱[1]。 目前，由于宏观上中药作用靶点和作用机制的多样性及对基因作用的多样性，中药基因组学指纹图谱和蛋白质组学指纹图谱可反映中药制剂作用于某特定细胞或动物后所引起的基因或蛋白的特定构象的复杂变化情况。这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。这种指纹图谱不但包含了化学信息，也体现了和此相关的药效、临床疗效等生物医药信息，通过比较不同蛋白质、基因指纹图谱体现的不同药效结果，就可确定何种物质基础(化学成分群)是该中药制剂的最佳方式，而且为解决中药研究中缺乏标准品的难题提供了一条可行之路[1]。目前，中药基因组学和蛋白质组学有关指纹图谱的研究工作正在开展。中药蛋白质组学及基因组学指纹图谱可从分子水平上丰富整个中药指纹图谱研究体系。无论是中成药二次开发，还是中药新药研究，都有一个关键问题需要解决--逐步在分子水平上研究解决化学成分(物质基础)和药理作用、药效活性的相关性。而其中，通过蛋白质组学的研究得到的蛋白质组学指纹图谱又具有很高的说服力。 中药材DNA指纹图谱多运用聚合酶链反应(PCR)从不同生物样品中人工合成DNA片段,这种DNA片段的大小、数目因不同生物而异,因而称之为DNA指纹图谱。由于DNA分子标记技术直接分析的是生物遗传因子而非表现型,所以结果可不受环境因素、样品状态和材料来源等外界条件的影响,因此为中药品种鉴别中极为可靠的手段。随着分子生物学技术的发展,已有文献报道用DNA指纹图谱作为药材的鉴定方法.李晓波[2]等人的研究预示DNA指纹技术正在逐渐成为中药鉴定的一种新方法。DNA指纹图谱由于其特点，无法客观反映药用植物因外部环境影响基因表达造成的药效成分含量的差异，只能用于药材种质资源的考察。对于DNA指纹技术在中药材鉴定方面的推广和普及的关健是
DNA指纹技术及其应用 周珊珊（浙大环科所，杭州310029） 摘要综合比较、分析了目前常DNA指纹技术，如RFLP、VNRT、RARP、AFLP、STS(SSR、CAPS、SCAR)、RFLP、SSCP、SNP等的原理、特点和适用范围，简要介绍了DNA指纹技术的研究发现状以及发展前景。 关键词DNA指纹技术；分子杂交；PCR技术；DNA芯片技术 前言 DNA指纹图谱是一种在单一实验中可检测出大量DNA位点差异性的分子生物学技术。1985年，Jeffreys及其合作者[1]分析了人的肌红蛋白基因，从中获得了多位点的小卫星探针。它可同时与众多的DNA限制性酶切电泳图谱杂交，可得到具多条带的复杂图谱。这种表现出高度的种属及个体特异性的杂交图谱即称为DNA指纹图谱(DNA fingerprint)。随着各种高水平探针如报卫星探针、寡聚核苷酸探针的相继问世，成为当今最先进的分子水平上的遗传标记系统。指纹图谱具有高度的变异性及多位点性，充分体现了物种的遗传多态性，使其在动植物科学研究、遗传疾病的诊断、基因图谱的绘制，遗传标记及法医学等方面得到广泛应用。本文将对几类主要的DNA指纹技术原理及特点做简要叙述，并进一步阐述其发展前景。 1．DNA指纹技术原理及特点 2.1 基于分子杂交技术的DNA指纹技术 2.1.1 限制性片断长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP） 某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变反映出来，此即限制性片段长度多态性(RFLP)。1980年Botstein等[2]首先提出利用RFLP作为标记构建遗传图图谱。其主要原因是由于DNA序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度的酶切片段。 RFLP的等位基因具有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测的基因座位数为1～4个[3]。RFLP结合基因探针分析的最大优点是产生的带型清楚明确。这是因为相当大量的DNA被切割，电泳和染色后的DNA片段易于显示出来。相反，PCR产生的指纹(如AP－PCR或ERIC－PCR产生的指纹)很难以再现并可能“模糊的”或“假的”带，使其难以解释。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是
DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用pace等于1986年首次利用rrna基因确定环境样品中的微生物，通过对5s rrna基因的序列分析来研究微生物的生态和进化。该方法很快被用于微生物多样性研究领域。由于5s rrna基因相对较小，携带信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。相比之下，随后开展的16s rrna基因序列分析为微生物多样性研究提供了更多信息，且效率更高。目前16s rrna基因序列分析已广泛应用于微生物多样性的研究。16s rrna基因序列分析是主要基于已建立的微生物16s rrna基因序列数据库，用以确定细菌的系统发育关系，并使序列探针用于识别未知菌成为可能。当然序列探针的确定也可根据分子标记方法，如rapd方法进行。利用16s rrna基因序列研究微生物多样性可采用不同的策略。目前一般常用以下几种方法。 一、变性梯度凝胶电泳（dgge）和温度梯度凝胶电泳（tgge ）1993年muyzer等将dgge技术引入环境微生物学多样性的研究。随后该技术被广泛用于比较不同生态系统中的微生物群落的多样 性及监测特定微生物种群的动态变化，dgge和tgge的原理是根据含有不同序列的dna片段（16s rrna基因扩增产物）在具有变性剂梯度或温度梯度的凝胶上由于其解链行为的不同而导致迁移率的 不同，部分解链的dna片段在凝胶中的迁移速率低于完全螺旋形式的dna分子，从而含有不同碱基序列的dna片段就得到有效分离。
结合pcr扩增标记基因或其转录物（rrna和mrna）的dgge方法能直接显示微生物群落中优势组成成分。由于它可同时对多个样品进行分析，使之非常适合研究微生物群落的时空变化，而且可以通过对酶切条带进行序列分析，或通过与独特的探针杂交鉴定群落组成，可以方便地了解环境被干扰后的微生物群落变化或某种指示微生物的命运。oliver等用dgge方法考察了农田微生物的变化情况，认为环境变化对农田微生物的多样性有很大影响。但是dgge/tgge 技术也存在一定的局限性。 其缺陷之一是只能分离约500 bp大小的dna片段，这限制了作为下一步用于杂交分析的探针设计。并且研究报道有些种类细菌16s rdna在dgge上不只显示1条带，而不同种细菌的16s rdna序列在dgge上也可能因为具有相同的解链行为而不能被分开。即便存在以上的一些局限性，dgge/tgge仍是分析微生物群落多样性较为敏感的方法之一。 二、单链构象多态性（sscp） sscp是对16s rrna基因扩增产物进行分析的另一种简便有效的方法。该技术最初用来检测人类dna的基因多态性，lee等在1996年首次报道将sscp技术应用到环境样品微生物群体多样性分析。不同碱基序列的单链dna分子构象不同，dna片段变性成单链后受到凝胶不同分子筛作用力最终使不同dna片段得到分离。电泳结束后可以将不同的条带切下并测序，或采用特异性探针进行杂交，进而
先上个度娘： 鉴定方法 DNA亲子鉴定的方法: 1．DNA指纹法 DNA指纹指具有完全个体特异的dna多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，因而得名。可用来进行个人识别及亲权鉴定，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"。 由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记，可广泛用于亲自鉴定。 特点： 1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10^-11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10^-19。全世界人口约50亿，即 5×10^9。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，
DNA 指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50%给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 2．STR检测，短串联重复序列（short tandem repeat，STR）又称微卫星DNA（micro satellite DNA），是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。它由2~6碱基对构成核心序列，呈串联重复排列。STR基因位点长度一般在100～300 bp之间．因个体间DNA 片断长度或DNA序列差异而成高度多态性，在基因传递过程中遵循孟德尔共显性方式遗传。因其基因片段短、扩增效率高、判型准确等特点，被称作第二代DNA指纹，近几年亲子鉴定多采用该方法。 3.SNP-单核苷酸多态性 SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP 有关。 4 RFLP分析法。 限制图谱标记和可见表型重组频率是可测量的，将遗传图谱分为基因型和表型两种分子标