人类免疫缺陷病毒（I型）核酸定量检测系统标准操作程序1. 目的：规超敏PCR仪器配置系统及人类免疫缺陷病毒（HIV-I RNA）的检测过程，确保检测结果的准确性和重复性。 2. 检测方法和原理 2.1 检测方法：TaqMan探针荧光定量PCR法。 2.2 检测原理：人类免疫缺陷病毒（I型）核算定量检测试剂盒（PCR-荧光法）采用核酸扩增技术，定量检测人血浆中HIV-I RNA。该方法包括三个主要步骤：（1）样品制备以分离HIV-I RNA；（2）靶RNA的逆转录形成互补DNA（cDNA）；（3）靶（cDNA）的PCR扩增以及裂解的、靶特异性的、双标记寡核苷酸探针的检测。 3. 标本要求 3.1 标本类型：血浆（EDTA抗凝）。 3.2 标本的采集与处理 3.2.1 标本采集量：采集患者静脉血6 mL（EDTA抗凝真空采血管）。 3.2.2 标本处理：标本采集后应在2小时送至实验室，实验室收到标本后在1小时处理标本。 3.2.2.1签收：门诊、住院以及CDC标本签收条码，并做好相关登记工作。 3.2.2.2编号：对标本进行唯一编号，容如下：“年月日6位数字+标本号3位数字”，例如2018年1月1日收到一个HIV-RNA标本即编号为：“180101401”。 3.2.2.3离心：800-1600g,20min离心标本。 3.2.2.4标本保存：血浆在室温（25-30℃）最多存储1天；2-8℃最多存储6天；-20℃—-80℃可存储6周。将待检血浆以2管每管1200 uL量存储于2.0mL戴螺旋盖的无菌聚丙烯管，在管壁编写如3.2.2.2的编号。未检标本放置于专用样本盒中，冻存于-80 ℃冰箱。已检血浆置-80oC冰箱保存2个月，到期后按科室有关程序作废弃标本处理。 4.仪器和试剂 4.2 试剂：（配套封闭试剂） 4.2.1 试剂盒（包含核酸提取试剂、质控品及阳性定量参考品组分、PCR 检测试剂组分）保存于2-8℃环境下，有效期22个月。 4.2.3试剂开瓶后，在室温条件下放置时间不应超过72小时；2-8℃条件下不超过30天。 4.2.4 主要组成成份：
人脐血及骨髓淋巴细胞免疫表型的比较及其意义 郭 荣,邹 萍,邹典斌1 (华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所,武汉430022; 1郑州大学医学院第一附属医院血液科,郑州450052) 摘要 为比较脐血和骨髓淋巴细胞及祖细胞分化抗原,通过流式细胞术(FCM)双标法对38份脐血及10份骨髓免疫细胞表型进行了分析研究。研究发现:①脐血及骨髓淋巴细胞中均测到幼稚淋巴细胞(CD3-CD4+),且前者中含量较多,但脐血细胞毒T细胞含量(CTL,CD3+CD16+56+)低于骨髓;②脐血中N K细胞(CD3-CD16+56+)比例高于骨髓;③脐血有核细胞中CD34+细胞的比值接近于骨髓,但脐血CD34+细胞中髓系祖细胞(CD34+ CD13+,CD34+HLA2DR+)及淋巴系祖细胞(CD34+CD19+)含量均低于骨髓。结论:①脐血免疫细胞具有不成熟性,这估计是脐血移植后GVHD程度轻的主要原因;②脐血淋巴细胞中N K细胞含量较高,推测脐血移植后移植物抗白血病效应(GVL)并不会降低;③脐血CD34+细胞中髓系祖细胞及淋巴系祖细胞比例均低于骨髓,可能是脐血移植后造血及免疫重建速度较慢的原因之一。 关键词 脐血;骨髓;淋巴细胞;免疫表型 中图分类号 R33111;R331.2 A Comparison bet w een Immunophenotypes of Lymphoid Cells from H uman Umbilical Cord Blood and Bone Marrow and Its Signif icance GUO Rong,ZOU Ping,ZOU Dian2Bin1 (Instit ute of Hematology,The A f f iliated U nion Hospital,Tongji Medical College,Huaz hong Science and Technology U niversity, W uhan430022,Chi na;1Depart ment of Hematology,The Fi rst A f f iliated Hospital of Medical College of Zhenz hou U niversity, Zhenz hou450052,Chi na) Abstract To compare the expression of CD antigens on immune cells from umbilical cord blood(UCB)and bone marrow(BM)and analyze its clinical significance,the phenotypes of lymphoid cells and nucleated cells from38UCB and 10BM samples were investigated by flow cytometry with double labeling monoclonal antibodies.The results showed that the immature lymphocytes(CD3-CD4+)were detedcted in UCB and higher than those in BM;cytotoxic T lymphocytes (CD3+CD16+CD56+)in UCB were significantly lower than those in BM.N K cells(CD3-CD16+CD56+)in UCB were higher than those in BM.The ratio of CD34+cells in nucleated cells of UCB was similar to that of BM,however,both the contents of myeloid(CD34+CD13+and CD34+HLA2DR+)and lymphoid(CD34+CD19+)progenitor cells in UCB were lower than those in BM.It is concluded that the immune cells in UCBpossess immaturity,which might lead to mild GVHD after UCB trans plantation.It is infered from the higher ratio of N K cells in UCB,GVL will not decrease after UCB transplantation.The lower contents of myeloid and lymphoid progenitor cells in UCB probably accounted for the slow hematopoiesis and immune reconstitution following UCB transplantation. K ey w ords umbilical cord blood;bone marrow;lymphoid cell;immunophenotype 脐血具有经济、来源广、采集方便、无采集并发症,移植后移植物抗宿主病(graft versus host dis2 ease,GV HD)程度轻,移植物抗白血病(graft versus leukemia,GVL)效应不降低等优点。但是脐血也存在造血重建速度慢,易合并感染的问题。本研究应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)对脐血和骨髓免疫细胞分化抗原进行检测,比较二者在淋系祖细胞、髓系祖细胞、幼稚淋巴细胞及N K细胞含量方面有无差别,旨在分析二者免疫表型差异,探讨其在扩大脐血应用范围中的作用和意义。 材料与方法 标本采集 无菌条件下采集正常足月分娩新生儿脐血38份。母亲年龄24-35岁,平均(29.3±3.3)岁。新生儿娩出后,立即(不超过30秒)用止血钳在距脐轮2-3cm处夹住脐带,在两钳间剪断脐带,用含少许肝素的注射器抽取脐血,加入离心管中混匀。骨髓 通讯作者:郭荣 电话:(027)85730575.E2mail:gh7311@yahoo. https://www.doczj.com/doc/e714666183.html, ? 9 1 5 ? 中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2002;10(6):519-522
人类免疫缺陷病毒检验 发表时间：2009-08-03T11:16:23.700Z 来源：《中外健康文摘》2009年第19期供稿作者：陈虹 (黑河市人民医院黑龙江黑河 164300) [导读] 人类免疫缺陷病毒检验 人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency vi-rus，HIY）又称艾滋病毒，是获得性免疫缺陷综合征即艾滋病（acpuired immunodeficiency syndrome，AIDS）的病原体，属逆转录病毒科（retroviridae）的慢病毒（lentivinrs）亚科，形态为典型的D病毒，主要通过性传播途径、血液传播途径和母婴传播途径传播。HIV有HIV-1和HIV-2两种类型，目前在世界广泛流行的是HIV-1型。HIV基因有高度的变异性，目前在全球流行的HIV-1毒株已出现3个组，即M组、O组和N组，其中M组又分为A到J十个基因型。HIV-2是逆转录病毒中的另 一个病毒，也可引起人患上艾滋病，但症状多较HIV-1引起的为轻，HIV-2主要在西非国家流行，其与HIV-1在血清学上有一定的交叉反应。 艾滋病是以机会感染及局部肿瘤为特点的致死性传染病。截止2000年底，我国累计报告HIV/AIDS22517例（AIDS880例），死亡496例，估计实际感染人数远超过已发现的感染者人数，加强艾滋病的预防与控制是我国以及全世界面临的一个紧迫的问题。 1 样本采集 1.1血清（浆）样本 1.1.1抗原、抗体检测静脉采血，血液样品应在l2h内做到：①送到初筛实验室；②分离出血清；③装入一干净试管内，盖上试管盖； ④按标准编号贴上标签。 分离出的血清应立即进行筛查实验。若因故不能立即检测，应将血清放置－20℃低温保存；无条件时亦可放置4℃，但不得超过3d。检测后的血清应于－20℃或更低温保存，以用于确认实验。 1.1.2核酸检测使用EDTA抗凝血浆标本，抗凝后6h内分离血浆；如使用血清标本，则需在2h内分离血清，标本的保存应在－70℃下，并避免反复冻融。 1.2全血标本 全血标本主要用于提取基因组核酸和病毒核酸，静脉取血后可于4℃下短期保存，如用于提取病毒RNA，则应在取血后尽快提取。 1.3淋巴细胞 淋巴细胞主要用于提取核酸，可从抗凝全血制备，主要有两种方法：一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液，裂解全血中的红细胞，经生理盐水数次洗涤，即可得到淋巴细胞。淋巴细胞如暂不提取核酸，可保存于－70℃下。 1.4样品采集的注意事项 1.4.1用于ELISA法检测的血浆或血清样本勿用叠氮化钠防腐。 1.4.2本应无微生物污染，避免溶血。 1.4.3核酸检测用的血液标本严禁使用肝素抗凝，因其对PCR扩增有抑制，且无法在核酸提取过程中去除。 2 检验方法 HIV感染最直接的检查方法是从受检者的血液中分离培养HIV或检测HIV特异性抗原、HiV核酸。但HIV分离培养操作繁琐，费用较高，技术难度大，实验场地要求严格（P3实验室）；HIV抗原检测的敏感性不如抗体检测；核酸检测需要较高的实验操作水平和实验室条件。因而，目前最常用的HIV检测技术是抗体检测。 HIV感染后的检测存在“窗口期”，“窗口期”是指从HIV感染后到用现有方法能检出HIV抗原、抗体和核酸前的一段时间。个体差异、检测方法的种类和试剂的敏感性是影响“窗口期”长短的主要因素。每种检测都要等到“窗口期”之后再进行，否则会得到假阴性结果。 2.1 HIV分离培养 用脐血或已建立的T淋巴细胞，经PHA刺激后培养，3～5d后接种标本，每周加强PHA刺激。如有病毒生长可观察到细胞病变，用电镜观察病毒颗粒，也可用ELISA或免疫荧光法检查病毒抗原，或测定细胞培养上清液中逆转录酶的活性来判断标本中是否存在感染性HIV。病毒分离培养检测HIV的“窗口期”约为7d左右，对于HIV感染的早期诊断有重要意义。 2.2 HIV抗原检测 P24抗原是人体感染HIV后最早出现于血液中的病毒成分，通常在感染后2周即开始出现，因此，P24抗原检测可以在感染者血清抗体阳转前即作出早期报告，大约可以使“窗口期”缩短一周。P24抗原检测在新生儿感染的早期诊断和AIDS病程进展的监测上有重要作用。但应该注意到，P24抗原作为HIV-1的感染指标的作用是有限的，因为在HIV感染者血液中检测到P24抗原的比例不高，因而，P24抗原检测目前只是HIV辅助诊断手段。 2.3 HIV抗体检测 HIV抗体检测是卫生部认可的HIV感染诊断方法，由于HIV检测中任何漏诊、误诊都可能导致极为严重的后果和法律纠纷，为了防止检测工作可能出现的问题，卫生部专门制定了《全国艾滋病检测工作规范》，对开展HIV抗体检测的单位、人员、场地和检测试剂等制定了严格的标准。 HIV抗体检测分为初筛试验和确认试验两个阶段，初筛试验阳性的血清一定要进行确认试验，确认试验为阳性的才能肯定为被HIV感染。HIV初筛试验要求敏感性接近100％，不能出现假阴性，对特异性要求不太严格。初筛试验由取得资格的HIV抗体初筛实验室或确认实验室进行，初筛呈阳性反应的标本不得向受检者公布其结果。
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
中国人血液淋巴细胞免疫表型参考值调查 来源:https://www.doczj.com/doc/e714666183.html,时间:2007-10-06 字体:[大中小] 收藏我要投稿 文章出处：朱敏转载请注明出处 【摘要】目的建立健康中国成人血液淋巴细胞免疫表型分析参考值。方法用Simultest IMK-Lymphocyte试剂盒的荧光抗体对102例健康中国成人血液进行染色，以FACSort流式细胞仪进行分析，Simulset程序获取数据并分析结果，SPSS软件进行统计。结果18～65岁健康中国成人淋巴细胞参考值范围CD+3细胞是50%～84%（955～2 860/μl），CD-3CD+19细胞为5%～18%(90～560/μl)，CD+3CD+4细胞为27%～51%(550～1 440/μl)，CD+3CD+8细胞为15%～44%(320～1 250/μl)，CD-3、CD+16和/或CD+56细胞为7%～40%(150～1 100/μl)，CD+3CD+4/CD+3CD+8比值为0.71～2.87。随着年龄增长CD+3CD+4细胞略有升高，CD+3CD+8细胞略有降低。NK细胞在大年龄组女性低于男性，且有统计学差异(P＜0.05)。与高加索人和美国人相比，中国人的CD+3CD+8细胞和NK细胞(CD-3，CD+16和/或CD+56)的相对值(百分率)与绝对值均高，CD-3CD+19细胞和CD+3CD+4细胞仅相对值较低，但绝对值不少。CD+3CD+4/CD+3CD+8比值向低值漂移。结论种族、性别、年龄和环境因素可影响健康人淋巴细胞表型分布。 Reference values on blood lymphocyte immunophenotype in healthy Chinese adult Zhu Lihua, Wang Jianzhong, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing,100034 【Abstruct】Objective To establish the reference values on blood lymphocyte immunophenotype in healthy Chinese adults.Method Staining whole blood with fluorescein-conjugated monoclonal antibodies supplied by simultest TM IMK lymphocyte kit, we analyzed 102 healthy Chinese residents (age range 18～65 years) by FACSort flow cytometer, acquired results by Simultest programme, and performed statistical analysis by SPSS software.Results The 95% reference ranges in absolute counts per microliter of whole blood (percentage of lymphocytes) for CD+3, CD+3CD+4, CD+3CD+8, CD-3CD+19, CD-3/CD+16 and/or CD+56 cells were 955 to 2 860 (50% to 84%), 550 to 1 440 (27% to 51%), 320 to 1250 (15% to 44%), 90 to 560 (5% to 18%), 150 to 1 100 (7% to 40%) respectively. The CD+3CD+4/CD+3CD+8 ratio was 0.71 to 2.87. CD+3CD+4 cells increased and CD+3CD+8 cells decreased slightly with age. Women were compared to men in old age group, NK cells (CD-3/CD+16 and/or CD+56) were lower (P＜0.05). Compared with Caucasians and Americans, Chinese had higher percentage and absolute numbers of CD+3CD+8 and NK cells, but had lower percentage of CD-3CD+19 and CD+3CD+4 cells without absolute number change. So CD+3CD+4/CD+3CD+8ratio skew to the lower values.Conclusion The race, age and environment could influence the reference value of lymphocyte immunophenotype. 【Key words】Lymphocyte immunophenotype Reference value Flow cytometry 淋巴细胞免疫表型分析在原发或获得性免疫缺陷病、自身免疫性疾病的辅助诊断和移植免疫的监测中具有重要作用。随着流式细胞仪的广泛应用，采用流式细胞术进行淋巴细胞免疫表型分析已逐渐成为临床检验的常规工作之一。各国的流式细胞术实验室均建立了自己的参考值，并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨。目前我国还没有用流式细胞术、采用双染色分析淋巴细胞免疫表型参考值的报告。为此我们对102例健康成人进行了淋巴细胞免疫表型分析，现报告如下。材料和方法 一、研究对象 102例标本均取自于无免疫性疾病、无现症、不吸烟、体检健康、血细胞计数及肝、肾功能检查正常的成人。年龄18～65岁，其中男性54人，女性48人。首先按男女性别分为两大组，每组中又以40岁为界，≤40岁者为小年龄组（男24人，女19人），＞40岁者为大年龄组（男30人，女29人）。
人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂（胶体金法）技术参数 1. 试剂盒：50人份/盒； 2. 灵敏度：100%； 3. 特异性：99.0%以上； 4. 测定时间：≤30分钟； 5. 检测标本：全血/血清/血浆； 6. 产品有效期：不少于16个月； 7. 认证及注册：通过世界卫生组织WHO和联合国艾滋病规划署、美国FDA、中国国家食品药品监督管理局等认证及注册； 8. 质量评估：连续三年参加中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心参比实验室组织的全国艾滋病病毒（HIV）抗体诊断试剂临床质量评估，连续三年灵敏度不低于100%、特异性不低于99.0%； 9. 其他：按用户计划分批供货和结算，计划收到后7个工作日内交货。 梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（胶体金法）技术参数 1. 试剂盒：50人份/盒； 2. 灵敏度：99.5%以上； 3. 特异性：99.0%以上； 4. 测定时间：≤20分钟； 5. 检测标本：全血/血清/血浆；
6. 产品有效期：不少于18个月； 7. 认证及注册：通过美国FDA、中国国家食品药品监督管理局等认证及注册； 8. 其他：按用户计划分批供货和结算，计划收到后7个工作日内交货。 促凝采血管技术参数 1、容积：5ml； 2、材质：塑料管； 3、管内添加促凝剂，促凝剂均匀喷涂于采血管内壁上，使血液可快速凝固，析出高纯净度的血清； 4、胶塞类型：安全帽胶塞（塑料盖帽），管内真空、无菌； 5、采血管标贴：刻度、双码、条形码一体化标贴； 6、其他：按用户计划分批供货和结算，计划收到后7个工作日内交货。 抗凝采血管技术参数 1、容积：5ml； 2、材质：塑料管； 3、抗凝剂：EDTAK2； 4、胶塞类型：安全帽胶塞（塑料盖帽），管内真空，无菌； 5、采血管标贴：刻度、双码、条形码一体化标贴； 6、其他：按用户计划分批供货和结算，计划收到后7个工作日内交货。 采血针技术参数 1、规格：7号；
急性淋巴细胞白血病免疫表型特点及其 临床意义 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的为探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)的免疫表型特征及与治疗的关系。方法采用流式细胞仪对77例ALL患者进行免疫表型分析。结果① 77例ALL中L1型44.16%，L2型50.65%，L3型 5.19%;B淋巴细胞性ALL(B-ALL)80.52%，T淋巴细胞性ALL(T-ALL)15.58%。② 77例ALL中髓系抗原(My)阳性率为57.14%;其中表达CD13的阳性率最高，为84.09%，其次为CD33和CD15;My+ B-ALL占B-ALL的58.06%，My+ T-ALL占T-ALL的50%，两组比较差别无统计学意义(P0.05);My+ ALL组CR率为81.82%，略低于My-ALL 组(88.24%)，但差异无统计学意义(P0.05)。③ CD34表达阳性率为49.35%，B-ALL中为56.45%，明显高于T-ALL的25%(P0.05);My+ ALL 中CD34表达阳性率为71.05%，高于My-ALL的33.33%(P0.05);CD+34 ALL组CR率为76.47%，低于CD-34ALL组的90.91%，但差异无统计学意义(P0.05)。结论 ALL免疫分型与FAB分型变化无相关性;My+ ALL 患者中CD34表达阳性率高于My-ALL患者;CD34和髓系抗原的表达与CR率无相关性。
【关键词】急性淋巴细胞白血病;免疫表型 急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的免疫分型对其诊断、治疗及预后判断有重要意义，而ALL不同的恶性克隆来源存在着显著不同的生物学特征及预后因素。为进一步探讨ALL各亚型免疫表型的特点及其与预后的关系，我们对本院77例ALL患者资料进行了研究，现报告如下。 1 资料和方法 1.1 病例资料 宁夏医科大学附属医院血液科及儿科2002-2008年间的住院初治ALL患者77例。男54例，女23例，年龄2.2～72岁，其中14岁儿童患者42例，中位年龄5.6岁，≥14岁患者35例，中位年龄23岁。所有病例均根据临床表现、骨髓细胞形态学、细胞化学染色及免疫分型而确诊。细胞形态学诊断根据FAB分型标准[1]，对于免疫分型诊断ALL又同时存在髓系抗原表达阳性，但又不够急性混合细胞白血病诊断标准，视为伴髓系抗原表达的ALL(My+ ALL)[2]。 1.2 免疫表型分析 受检者抽取骨髓或外周血经肝素抗凝，采用活细胞三色免疫荧光法标记，流式细胞仪检测，通过二维点图分析抗原表达情况。流式细胞仪型号为FACS Calibur，美国Becton-Dickinson公司生产，所用单克隆抗体亦均为美国BD公司产品。B淋巴细胞系单抗：CD10、CD19、CD20、CD22;T淋巴细胞系单抗：CD3、CD5、CD7;髓系单抗：CD13、CD14、CD15、CD33、CD117;造血干/祖细胞单抗：CD34。结果判定用
××××××医院 Policy No.：Effective Date：January 01,2006 Revision No.：00 文件编号：实施日期：2006年01月01日修订号：00 Generated department：Total Pages：Three 编制部门：检验科总页数：3 人类免疫缺陷病毒抗体诊断指导书（胶体金法） Prepared by : 编制 --------------------------------------------- Name: 姓名： Position: 职务: Date: December 16,2005 日期：2006年01月01日 Audited by: 审核 --------------------------------------------- Name: 姓名： Position: 职务： Date: December 16,2005 日期：2006年01月01日 Approved by 批准 --------------------------------------------- Name: 姓名： Position: 职务： Date: December 16,2005 日期：2006年01月01日 TOTAL COPIES: TWO 共 2 份 COPY TO: 分发至：检验科、质控科。
文件编号：页码：2/2 文件标题：人类免疫缺陷病毒抗体诊断指导书实施日期：2006.01.01 1.0 目的 规范人类免疫缺陷病毒抗体检测（胶体金法）的操作标准，确保检测结果的准确性。 2.0 范围 适用于本医院实验室对待检标本中人类免疫缺陷病毒抗体（胶体金法）的检测。 3.0 参考 3.1《人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（胶体金法）使用说明书》 4.0 程序 4.1采集静脉全血或血浆样本。必须在无菌条件下操作，并避免样品溶血。如果标本在收集后7天内检测， 样品须放在2－8℃保存，如果大于7天须冷冻保存。 4.2将待测标本从储存条件下取出并编号，如有低温保存则应平衡至室温。 4.3将胶体金试剂从包装盒中取出，打开铝箔包装袋，平置于台面上。 4.4用微量加样器取50μL样本血清，加到试剂的加样处。 4.5加样后，阳性标本可在1～30分钟内检出，超过30分钟将对实验结果的观察造成影响，建议30分钟最终观察并记录实验结果。 5.0 结果判断： 5.1阳性：试剂在检测区和对照区位置各出现一条紫红色带，如果检测区的紫红色条带隐约可见，建议对 该样本重复测试，并使用其他方法确认。 5.2阴性：试剂只在对照区位置出现一条紫红色条带。 5.3失效：对照区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏或者是样本中的抗体含 量过高。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并将待测样本稀释后用新的试剂重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。 5.4注意：测试区内的紫红色条带可呈现颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色 深浅，即使只有非常弱的色带也应判定为阳性结果。 6.0注意事项 6.1实验环境应保持一定湿度、避风。避免在过高温度下进行实验。 6.2试剂从包装中取出后，应尽快进行实验，避免放置于空气中过长时间，导致受潮。 6.3试剂可在室温下保存，谨访受潮。低温下保存的试剂应平衡至室温方可使用。 7.0 附件 7.1实验结果记录单
湖南省职业病防治院 作业指导书 标题：人类免疫缺陷病毒抗体（酶联免疫法） 修改记录
湖南省职业病防治院作业指导书文件编号： 标题：人类免疫缺陷病毒抗体（酶联免疫法）版号：第 1 版页码1/2 1、目的 用于临床人类免疫缺陷病毒感染的辅助诊断。 2、范围 适用于献血员筛查与临床病例。 3、职责 检测人员按照本规程进行检测操作。 4、原理 采用纯化基因工程人类免疫缺陷病毒“1”型和“2”型（HIV-1/HIV-2）抗原包被的微孔板和酶标记的HIV-1/HIV-2抗原及其他试剂组成，应用双抗原夹心法原理检测人血清或血浆中的HIV-1和HIV-2抗体。 5、样本要求 仅限于检测人体血清或血浆。 常规方法采集。 血清：采血后，室温放置1-2小时，待血液凝固，再于3000转/分钟离心15分钟。 血浆：采血后，样品与抗凝剂反复轻摇混匀，再3000转/分钟离心15分钟。 如果样品没有在8小时内测定，应将其保存于2℃-8℃。如果样品不能在7天内测定，应将血清或血浆与血细胞分离， -20℃保存，避免反复冻融。 6．分析系统 分析仪器：Thermo Mk3型酶标仪，检测波长450nm，参考波长630nm。 37℃恒温箱。 振荡器用于样品、试剂的混匀。 微量加样枪。 试剂准备： 试剂盒于冰箱保存，使用前应取出置37℃。 取试剂盒内洗涤液用蒸馏水作25倍稀释，置洗瓶中备用。 质控试剂：-20℃保存，溶解后随试剂一起冷藏，每天随样品一起检测并保存质控结果，每月一次质控小结，失控要有记录及纠正的结果。 7、分析步骤 样品编号：从6号开始编号。
设阴性对照3孔，Anti-HIV-1阳性对照1孔，Anti-HIV-2阳性对照1孔，分别加入阴、阳对照各50微升。 每个标本待测孔加入标本血清50微升，充分混匀，封板，置37℃孵育60分钟。 手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置30~60秒，甩干，重复6次后拍干。 每孔加酶标工作液50微升，充分混匀，封板，置37℃孵育30分钟。 手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置30~60秒，甩干，重复6次后拍干。 每孔加显色剂A液，显色剂B液各50微升，充分混匀，封板，置37℃孵育10分钟。 每孔加入终止液50微升，混匀。 选取相应的程序号，用酶标仪双波长比色。 8、计算 Cutoff值=阴性对照平均A值+。 9、参照区间 阴性对照A值应≤ Anti-HIV-1阳性对照A值应≥ Anti-HIV-2阳性对照A值应≥ 10.临床意义 样品A值≥临界值为HIV抗体阳性 样品A值＜临界值为HIV抗体阴性 11.注意事项 从冷藏环境中取出试剂盒应置37℃平衡30分钟后方可使用，余者应按前述方法保存和使用。在平衡试剂的同时，待测样品需置室温平衡30分钟后再行测试。 使用前试剂应摇匀。 须确保样品加样量准确，如果加样量不准确，可能会导致错误的结果，建议使用微量移液器加所有组份；用滴瓶滴加时，应先弃去1~2滴，垂直匀速地滴加。避免在加样过程中，将液体接触到或溅到微孔边缘上。 封片不能重复使用。 结果判断须在反应终止后10分钟内完成。 不同批号的试剂不可混用。 本试剂盒应视为有传染物质，请按传染病实验室检查规程处理。 12.支持性文件 全国临床检验操作规程（第3版）
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体检测试剂盒（乳胶法） 说明书 【检测原理】 人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体检测盒（乳胶法）采用了高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析乳胶标记技术原理。试剂上含有事先固定在膜上检测区（T）的重组HIV-1和HIV-2型抗原。检测时，将样本滴入试剂的加样孔中，样本中的HIV-1，2型抗体与预包被在膜上的重组抗原--乳胶颗粒标记结合物反应，然后，混合物在毛细效应下向上层析，在检测区（T）与固定在膜上的重组HIV-1和HIV-2型抗原反应。如果样本中含有HIV抗体，在检测区内（T）会出现红色条带，检测区内出现红色线条表明是阳性结果。如果在检测区内（T）没有出现红色条带，则样本中不含有HIV抗体，表明的是阴性结果。无论抗HIV抗体是否存在于样本中，混合物都会继续向上层析至质控区(C),出现一条红色的条带。质控区内（c）所显示的红色条带是判定层析过程中是否正常的标准，同时也是检测试剂的内控标准。 【主要组成成份】 本试剂主要原材料包括：包被用重组HIV1型、包被用重组HIV2型抗原、标记用重组HIV1型、标记用重组HIV2型抗原、链霉亲和素结合物、生物素、乳胶颗粒、硝酸纤维塑膜、聚酯纤维塑膜。 检测需要已提供的材料 注意：不同批号试剂中各组份不可互相使用，以免产生错误结果。 检测时另需准备样本收集容器和计时器。 【样本要求】 静脉采血后离心获得血清/血浆样本，不同的抗凝剂如柠檬酸钠，肝素钠，EDTA，草酸钠，枸橼酸钠的血浆标本均可。在2—8℃条件下可保存一周，长期保存需-20℃冷冻，以避免反复冻融。发臭、溶血等异常样本请勿使用。 【检验方法】 在进行检验前必须先完整阅读使用说明书，并将试剂、样本、和缓冲液恢复至室温（20℃-30℃）。 1.从原包装铝箔袋中取出试剂。 2.将试剂放在干净的平台上，用一次性塑料管吸取1滴血清/血浆（25μl）于加样孔（S） 中，随后加入1滴缓冲液（约40μl），开始计时。 3.等待红色条带的出现，检测结果应在15~20分钟判读，20分钟后判读结果无效。
LAMP技术在病毒检测中的应用 发表时间：2013-01-31T16:04:31.107Z 来源：《医药前沿》2012年第31期供稿作者：吴昊1 孙立新2 叶松1 陆军1 杨庆贵2 [导读] LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术 吴昊1 孙立新2 叶松1 陆军1 杨庆贵2 （1安徽理工大学医学院病原生物教研室安徽淮南 232001） （2江苏出入境检验检疫局医学媒介生物监测实验室江苏南京 210001） 【摘要】LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术。因其特异性强、等温扩增，反应灵敏、操作简单、产物易检测，此项技术已被用于多种病原微生物的检测。本文综述了LAMP技术的原理以及其在几种常见病毒检测项目中的应用。 【关键词】 LAMP 技术原理病毒检测 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）31-0064-02 病原微生物带来的卫生问题时常出现，各种检测手段也不断更新。但由于非特异性扩增、反应操作程序复杂、及仪器昂贵等问题，很多方法在疾病爆发时筛查现场和监测站点的应用受到限制。 LAMP技术是由日本学者Notomi等[1]在2000年开发的一种新型快速的扩增技术，它能在一定温度范围内，通过一个步骤在短时间内对目的片段进行大量有效扩增。其具有高特异性、高效性、快速、低成本、易检测、结果易观察等特点，被广泛用于各种病原体检测和研究中并取得了一定的成就。 1 LAMP技术原理 1.1 扩增机制 LAMP技术利用能够特异性识别靶序列上的6个独立区域的两对内、外引物，及具有链置换活性的BstDNA聚合酶启动循环链置换反应来进行靶序列的扩增[1]。反应中，先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现109-1010倍的括增[2]。 1.2 结果观察 扩增后可以通过琼脂糖电泳后染色进行观察，更可通过扩增衍生物焦磷酸镁进行观察：阳性的样本会出现白色浑浊沉淀，而阴性则无此现象。同时也可以应用SYBR Green I染色，呈现绿色的为阳性，橙色的为阴性[2]。 2 病毒检测 2.1 日本脑炎病毒 日本脑炎又称乙脑，是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)引起的一种常见的蚊媒传染病。JEV的检测方式很多，如血清学，病毒分离等，但耗时繁琐、敏感性特异性都较低。TORINIWA等[3]利用LAMP技术原理建立了快速Real-time RT-LAMP方法，该方法通过扩增JEV病毒的包膜（E）蛋白基因来定量检测JEV病毒，可将检测用时缩短至1h，检测下限为1PFU并与常规RT-PCR具有相似的敏感性。且不需特殊设备、操作方便，有利于推广其在基层的应用。 2.2 西尼罗河病毒 西尼罗河病毒（West Nile Virus，WNV）是引起西尼罗河热的病原体，近年来在世界部分地区的流行并造成了重大的损失。PARIDA 等[4]创立了一种一步法来检测WNV，通过凝胶电泳或者浊度仪来对扩增结果进行判定。结果显示其敏感性比常规RT-PCR高10倍。 2.3 甲型流感病毒 甲型流感病毒（AIV)具有高度传染性，致病性，以及致死率。对甲流病毒的检测方法主要为病毒分离，抗原和抗体检测以及PCR方法，但是过程费时繁琐。POON等[5]设计了特异性引物，利用LAMP技术成功的检测了H1-H3型的AIV，与PCR方法比较阳性符合率为100%，敏感度可达传统方法的100倍。LAMP技术由于其检测的简便快速且高度敏感，可更多的用于现场检测。 2.4 禽流感病毒的检测 禽流感是由禽类A型流感病毒引起的一种急性、高接触性的传染病，可带来重大损失。禽流感检测方法有各类血清学试验以及免疫学实验等。这些方法都存在着如试验周期较长，操作繁琐，检测材料受限制等不足。国内李启明等[8]对H5N1亚型禽流感病毒进行了RT-LAMP检测，验证和分析后证明其特异性与常规方法一致，并且其灵敏度可达到10个拷贝。侯佳蕾等[6]根据H5亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计了引物，并建立了一种针对性的检测诊断方法。结果表明，该方法的灵敏度高于一步RT-PCR法。 2.5 口蹄疫病毒的检测 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性，热性，高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽并给经济带来极大威胁。血清学检测不足以确定整群动物是否带毒而PCR方法由于需要专门的仪器。吴绍强等[7]以灭活的亚洲I型口蹄疫细胞培养病毒为材料，设计引物并建立了口蹄疫病毒RT-LAMP检测法，为口蹄疫现场快速检测提供了有效的方法。 2.6 丙型肝炎病毒（HCV）的检测 HCV是一种常见的病毒，传播途径为母婴传播和血液传播。目前最常用的方法是ELLSA法检测抗原抗体或PCR法。但是由病毒的抗原量极少，所以常规免疫学方法常无法检测出病毒。PCR方法操作复杂繁琐，特异性较低。李启明等[8]利用LAMP技术的原理，利用特殊引物进行了LAMP扩增，成功的检测HCV基因，实验结果阳性符合率高达98%。这一成果证实了LAMP技术的优势。 2.7 严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒（SARS-CoV）的检测 SARS带来的阴影提醒人们对此类病毒检测的重要性。目前临床上对其检测的方法主要有2种。一是检测SARS-CoV抗体，虽然此法灵敏度较高，但在发病初期不能检出。二是Real-time PCR，这种方法可在发病早期检测出SARS-CoV，但是其需要熟练操作技术以及高成本仪器，不适于常规筛查。POON等[9]利用改良LAMP法对人群的鼻咽分泌物样本进行了检测。结果显示SARS病人中的SARS-CoV检出率为