精氨酸激酶（AK）的提取与纯化
生物学实验教学中心
目录
１引言 (1)
1.1精氨酸激酶（AK） (1)
1.2亲和层析法 (2)
1.3电泳法 (2)
1.4本实验主要工作 (3)
2.1实验用品 (3)
2.1.1实验材料 (3)
2.1.1实验试剂 (3)
2.1.2仪器设备 (4)
2.2方法 (5)
2.2.1活化菌种 (5)
2.2.2 扩大培养 (5)
2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)
2.2.4 蛋白质提取 (5)
2.2.5蛋白质的检测 (6)
2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)
3 结果与分析 (7)
3.1蛋白质层析图谱 (7)
3.2AK诱导表达电泳图 (8)
4总结 (9)
参考文献 (10)
致谢 (10)
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化
朱景鹏
（指导老师：汪劲松）
（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）
摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化
１引言
1.1精氨酸激酶（AK）
精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。它的作用是催化可逆反应，将ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能健的储能分子——磷酸精氨酸[3]，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。AK在体内催化反应方程式如下：Mg2+ + ADP + Arginine phosphate Mg2+ + ATP + Arginine AK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基
AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
1.2亲和层析法
依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。
当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。
His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni 离子与融合蛋白的6Xhis之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的融合蛋白与其他蛋白区分开来。加样后，用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回收靶蛋白。
1.3电泳法
电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH 被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）,其作用是用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶
（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
1.4本实验主要工作
1.4.1 从大肠杆菌Rosseta中得到精氨酸激酶的粗提液
1.4.2 对精氨酸激酶粗提液通过Ni亲和层析进行进一步纯化
1.4.3 对所得结果通过SDS-PAGE进行检测
2材料与方法
2.1实验用品
2.1.1材料
含有重组有AK基因质粒的表达菌体E. coli Rosetta
2.1.2试剂
LB液体培养基（100 mL）：蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，Nacl 1 g
50 mg/mL 卡那霉素（kanamycin）
IPTG
Binding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0
咪唑（10 mM、250 mM）
12 %的分离胶（5 mL）:
成分体积（mL）
水 1.60
30 %丙烯酰胺 2.00
1.5 M Tris (PH 8.8) 1.30
10 % SDS 0.05
10 % 过硫酸铵0.05
TEMED 0.002
浓缩胶（2 mL）
成分体积（mL）
水 1.40
30 %丙烯酰胺0.33
1.0 M Tris (PH 6.8) 0.25
10 % SDS 0.02
10 % 过硫酸铵0.02
TEMED 0.002
样品缓冲液
考马斯亮蓝R-250
2.1.3仪器设备
● YC-1型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司）；
● CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）；
● TGL-16LA高速冷冻离心机（星科仪器厂有限公司）；
● GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）；
● 超声破壁仪；（上海之信仪器厂有限公司）
● 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）
● 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）
● SDS-PAGE电泳仪
● 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司）
● BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)
● SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）
● 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱
● 漩涡混合器XH-C（江苏省金坛市医疗仪器厂）
● 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）
酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、离心管、恒温水浴锅等。
2.2方法
2.2.1活化菌种
取工程菌种50 μL装有6 mL的LB液体培养基的试管（含有6 μL卡那青霉素，其工作浓度为50 μg/mL）中。于37℃摇床振荡培养8-12小时。
2.2.2 扩大培养
将试管中活化的6 mL菌液接种到300 mL LB培养基，同时加入300 μL卡那青霉素（终浓度50 μg/mL）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3小时。
2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达
实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时,加IPTG 150 μL至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。
2.2.4 蛋白质提取
（1）将上述各管于4℃，5000 r/m离心10 min；
（2）弃上清，加入蒸馏水使沉淀物质重悬，再于4℃，6000 r/m离心10 min；
（3）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加5 mL裂解液使其重悬；
（4）在冰上进行10 min,超声3 s，间隔为2 s的超声波破壁, 反复破壁直到沉淀变得澄清为止；
（5）于4℃，12000 r/m，离心15 min，取上清，得到AK的粗提液；
2.2.5蛋白质的检测
SDS-PAGE电泳检验：
1）安装双垂直板电泳槽；
2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL；
3) 制样：取样品10 μL加样品缓冲液以40 μL混合，100℃加热5 min ，15000×g，4℃离心1 min；
4）上样：用微量注射器加样15-20 μL ；
5）电泳：在浓缩胶上加60 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；
6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；
7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白
Ni柱预处理：
(1)用2 M盐酸胍10 mL与树脂打散混合洗涤，静置10 min；
(2)用蒸馏水洗10 min；Stripping Buffer洗20 min；
(3)用蒸馏水洗10 min；用0.3 M NaOH洗20 min；
(4)用Binding Buffer洗20 min；蒸馏水洗10 min；
(5)用1.5 M NaCl洗20 min；用Binding Buffer洗20 min；蒸馏水洗10 min;
(6)Ni柱再生：→50 mL 0.1 M NiSO4洗蒸馏水洗
(7)6倍柱床体积Binding Buffer（pH=8.0）平衡
注：流速控制在2-3 mL/min。
平衡：用Binding Buffer平衡Ni柱。
上样：插A280滤光片，调A=0值、T=100值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液45 mL上柱，流速约为1.6-1.8 mL/min 洗脱：上样完后，用Binding Buffer(PH=8.0)淋洗。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（40 mM、80 mM、250 mM）洗脱，在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
3 结果与分析
3.1蛋白质层析图谱
图1 AK经Ni柱纯化的层析图谱
由谱图可知：在上样前是用Binding Buffer平衡，由于电脑故障极限数据与穿流前半部分的数据丢失，但不影响穿流液的收集和后面梯度洗脱液的收集。给定的层析图谱中00:00—00:07内曲线峰急剧回落，说明此时穿流液中有数种杂蛋白自然流出；峰回落并基本持平后，分别用40 mM、80 mM、250 mM咪唑洗脱，分别出现了洗脱峰值，说明均有蛋白被洗脱下来，峰面积大小反映了相同体积洗脱收集液中蛋白含量高低。猜想在00:29以后继续用500 mM咪唑洗脱还会出现峰。
3.2 AK诱导表达电泳图
M. marker 1. 250mM 咪唑 2. 80mM 咪唑 3. 40mM 咪唑 4. 穿流
图2 SDS-PAGE电泳图
由图可知：
（1）第4道是穿流液，即蛋白上样后的流出来液体，其理论上应该全部都是杂蛋白，但从实际结果上来看，出现了少量目标蛋白带，同时也有许多杂带，说明目标蛋白大部分结合到了Ni柱上，穿流液中有很多杂蛋白；
(2)第3道是40 mM咪唑洗脱液，目标蛋白带最强，说明大量AK被洗脱下来；
(3)第2道是80 mM咪唑洗脱液，目标蛋白带较强，说明较大量AK被洗脱下来；
(4)第1道是250 mM咪唑洗脱液，其目的是洗去挂在柱子上的所有蛋白质，从SDS-PAGE 上可以看到，目标蛋白带很弱，说明仍有很少的AK被洗脱下来。
（5）目标蛋白的相对分子质量大约在42KD左右，目标条带有叠影现象，表明目标蛋白在提取分离过程中被氧化了。提醒以后的实验中要加抗氧化剂，如PMSF。
4总结
我们以通过IPTG诱导精氨酸激酶基因在E.coli菌株中表达，通过His-tag Ni亲和层析法技术分离纯化得到较纯的活性精氨酸激酶，为精氨酸激酶结构与功能的研究提供基础。诱导条件，层析系统的选择对以后的研究有着重要借鉴意义。
在本实验中，我了解了目标蛋白质的分离纯化程序主要包括：材料的选择、组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；蛋白质初步提纯；选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；目标蛋白的鉴定,SDS-PAGE检测。
同时我通过了本实验掌握了从菌体中粗提目标蛋白质技术，蛋白质Ni离子亲和层析技术，蛋白质的SDS-PAGE电泳分离技术等。
在本实验中，我加深了对蛋白纯化方法与技术的认识，并进一步夯实了理论基础和培养了实验动手能力，更为重要的是通过本实验，我学会了科学的实验思维方法和良好的实验习惯，纠正了以前在实验过程中所犯过的错误，这为我进一步从事学习深造，进行科学研究给予了莫大的信心。
参考文献
[1] 潘继承精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究博士学位论文北京：清华大学F2004(4):1-2
[2] 陆健等蛋白质纯化技术及应用化学工业出版社第一版2005 ：22-24.
[3] 汪家政，范明.蛋白质技术手册.科学出版社.2005：77－110
[4]鲍时翔姚汝华蛋白质分离纯化与层析技术进展华南理工大学学报（自然科学版）1996.12:99-102
[5]芳秋赵权武建国单祥年重组人亲环素A的表达，纯化及活性测定微生物学报38(3)，1998：193-196
[6]金哲洙蔡英姬抗真菌蛋白质的分离纯化中国生物制品学杂志2000.1:30-32
致谢
本次的综合实验是在导师汪劲松教授的指导下完成的。汪老师在我们进行实验的过程中一直在关注着我们的实验最新动向，给与我们悉心的指导，这为我们实验的最终完成给予了莫大的帮助。在此，谨向汪老师表示我深深的敬意和衷心的感谢！
吴元耀师兄和实验室的其他学长学姐在本此实验的进行过程中为我们提供了很多宝贵的指导性意见。在此，向你们表示诚挚的谢意！
实验过程中小组成员的团结合作和细致分工也为我们实验的成功进行奠定了良好的基础！我也向我们有缘能相聚本实验室，共同进行本实验，对小组成员为实验的最后成功所做的努力表示感谢！
精氨酸被专家称为机体内运输和储存氨基酸的重要载体，在肌内代谢中极为重要，在人体内合成能力较低，需要部分从食物中补充，对于中老年人来说，它为你的健康保驾护航，同事它也是维持婴儿生长发育所必不可少的。由于精氨酸的许多新功能逐渐被人们发现，其应用变的越来越广，越来越令人瞩目。 精氨酸独特的生理功能——预防心脑血管疾病 研究发现，一氧化氮在维持血管扩张力的恒定和调节血压的稳定性中起着非常重要的作用。一氧化氮能共与动脉血管中的肌肉细胞接触并使之放松，扩张了动脉血管，使得血压降低，从而改善血流，因此能够有效降低心脑血管疾病的风险。 除此之外，一氧化氮还能预防血液在一些危险的部位发生凝结（如心脏，大脑）。如果血液在心脏或脑部发生凝结，病人就会罹患心脏病或中风。只要人体产生足够的一氧化氮，那么就会大大降低心脑血管疾病的风险，预防中风、心脏病等心脑血管疾病。 100多年前，当硝酸甘油作为缓解心绞痛的特效药物在心脏病患者身上使用时，人们并不明白其作用机理。1986年这一百年谜团终于被美国加州大学洛杉矶分校药理学教授、药学院院长伊格纳罗博士破译，伊格纳罗博士因发现有关于一氧化氮在心血管系统中具有独特的信号分子作用，而于1998年获得诺贝尔医学奖。 伊格纳罗经过三年的研究发现，硝酸甘油本身并不是一种药物，可是当人体摄入之后，它就转变、代谢称为一氧化氮。一氧化氮一旦生成之后，就与动脉中的肌肉接触并使之放松，扩张了动脉，这样就使得血压降低，从而改善血流。除此之外，一氧化氮还能预防血液在一些危险的部位发生凝结，病人就会罹患心脏病或中风。只要人体产生足够的一氧化氮，那么就会大大降低心脑血管疾病的风险，因此，一氧化氮能有效的降低血压，预防中风和心脏病。氨基酸家族中的精氨酸，是人体内生成丰富的一氧化氮的重要来源。 精氨酸是一氧化氮的前体，补充精氨酸能够显著提高体内一氧化氮含量，一氧化氮能够与动脉中的肌肉细胞接触并使之放松，扩张血管，使得血压降低，从而改善血流，因此能够有效降低心脑血管疾病的风险。 精氨酸是自然的产物，是一种来自蛋白质的氨基酸，有很多来源，无论是鸡肉、鱼肉和某些蔬菜都含有精氨酸，但是普通的食物中的精氨酸往往含量较低，产生的一氧化氮数量较少，不具备相关的营养价值。 研究证实，补充富含精氨酸的食物可降低高血压和心脑血管疾病的危害，其生理机能也与精氨酸能够有效促进体内一氧化氮生成有关。高脂肪饮食会导致体内内皮依赖性血管舒张功能降低，导致血压增高，血流降低，血黏度增加。而精氨酸能够有效的促进一氧化氮在体内的生成，能够减轻体内氧化脂质对一氧化氮的降解，从而提高体内的一氧化氮的含量，减轻心脑血管疾病导致的危害。 此外，精氨酸还具有有效的改善中老年男性性功能的作用。一般男性大约从四十到五十岁开始，生殖系统机能开始老化，体内雄激素（睾酮）水平随着年龄的增加而降低，会出现许多类似于妇女更年期的症状，而精氨酸就是最佳的救星！ 精氨酸可以在踢被生成大量的一氧化氮，能使血管扩张、软化、充盈、从而缓解心脏负担！原料：复合氨基酸（L-精氨酸、瓜氨酸等）、糊精、羟甲基纤维钠、轻质碳酸钙、胭脂红 作用：免疫调节。复合氨基酸中的极品，是最珍贵的氨基酸，补充人体所需。 原理：维持人体蛋白质营养的新陈代谢，在人体内合成各种酶、激素、免疫蛋白、血红蛋白等功能蛋白质，维持人体心、肝、脾、肺、肾所有器官组织细胞的正常运转。如果氨基酸的摄入能够保持均衡和充足，人体即可获得强大的自愈力和抵抗力。 瑞年精氨酸片三大国际顶尖技术：肠溶、缓释、螯合
各科常用针剂 YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】
脑血管用药： 1、注射用三磷酸胞苷二钠：用于颅脑外伤后综合症及其遗症的辅助治疗。 2、盐酸川芎嗪：用于闭塞性脑血管疾病，如脑供血不足、脑血栓形成、脑栓塞等。 3、复方樟柳碱注：用于缺血性视神经、视网膜、脉络膜病变。 4、注射用盐酸赖氨酸：治疗颅脑外伤、慢性脑组织缺血、缺氧性疾病的脑保护剂。 5、胞磷胆碱氯化钠：辅酶，用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍。 6、注射用奥扎格雷钠：用于治疗急性血栓性脑梗死和脑梗死所伴随的运动障碍。 7、盐酸罂粟碱：用于治疗脑、心及外周血管痉挛所致的缺血，肾、胆或胃肠道等内脏痉挛。 8、注射用脑蛋白水解物：用于颅脑外伤、脑血管病后遗症伴有记忆减退及注意力集中障碍的症状改善。治疗痴呆及改善颅脑损伤后功能障碍。 9、注射用肌氨肽苷：脑血管意外引起的瘫痪；周围神经疾患引起的肌肉萎缩。 10、盐酸丁咯地尔：①外周血管疾病②慢性脑血管供血不足引起的症状：眩晕、耳鸣、智力减退、记忆力或注意力消退、定向障碍等。 11、注射用吡拉西坦：是用于急慢性脑血管病、脑外伤、各种中毒脑病等多种原因所致的记忆减退及轻、中度脑功能障碍。也用于儿童智能发育迟缓。 12、奥拉西坦注：用于脑损伤及引起的神经功能缺失、记忆与智能障碍等症的治疗。 13、注射用长春西汀（又叫润坦）：改善脑梗塞后遗症、脑出血后遗症、脑动脉硬化症等诱发的各种症状。脑血管扩张药。 14、注射用盐酸川芎嗪（又叫川青）：用于缺血性脑血管疾病。 15、奥扎格雷钠：用于治疗急性血栓性脑梗塞和脑梗塞所伴随的运动障碍。 16、复方麝香注：豁痰开窍、醒脑安神。用于痰热内闭所致的中风昏迷。 17、醒脑静注：清热解毒，凉血活血，开窍醒脑。 18、甲钴胺注（安痛定）：①用于周围神经病②因缺乏B12引起的巨幼红细胞性贫血的治疗。 19、依达拉奉注：用于改善急性脑梗死所致的神经症状、日常生活活动能力和功能障碍。 20、尼莫地平注：预防和治疗动脉瘤性蛛网膜下腔出血后脑管痉挛引起的缺血性神经损伤。 21、注射用灯盏花素（培斯汀）：活血化瘀，通络止痛。用于中风及其遗症，冠心病，心绞痛。 心血管用药： 1、注射用单硝酸异山梨酯：治疗心绞痛,与洋地黄或利尿剂合用治疗慢性心力衰竭。 2、丹参酮ⅡA磺酸钠注射液：用于冠心病、心绞痛、心肌梗死的辅助治疗。 3、注射用硝普钠：①高血压急症②急性心力衰竭。 4、注射用葛根素：冠心病、心绞痛、心肌梗塞，视网膜动、静脉阻塞，突发性耳聋。 5、银杏达莫注射液：适用于预防和治疗冠心病、血栓栓塞性疾病。 6、注射用灯盏花素（培斯汀）：活血化瘀，通络止痛。用于中风及其遗症，冠心病，心绞痛。 7、硝酸甘油注射液：用于冠心病心绞痛的治疗及预防，也可用于降低血压或治疗充血性心力衰竭。 8、环磷腺苷葡胺注射液：用于心力衰竭、心肌炎、病窦综合征、冠心病及心肌病，也可用于心律失常的辅助治疗。
精氨酸 精氨酸在体内起生理作用的主要是左旋精氨酸。正常情况下，体内精氨酸一部分来源于膳食，一部分通过几个器官间的协同作用由鸟氨酸通过瓜氨酸合成，其前体物质是谷氨酸或谷氨酰胺。机体中所有组织均利用精氨酸合成细胞浆蛋白和核蛋白，同时精氨酸也是脒基的唯一提供者，进而合成肌酸。精氨酸是碱性氨基酸，可广泛参与机体组织代谢，与机体免疫功能、蛋白质代谢、创面愈合等密切相关。它还能促进血氨进入尿素循环，防止氨中毒，其代谢中间产物多胺是重要的胃肠粘膜保护剂，能促进粘膜增殖。精氨酸也是合成一氧化氮的唯一底物，可参与免疫和血管张力调节。 精氨酸不仅是机体蛋白质的组成成分，而且还是多种生物活性物质的合成前体，如多胺和NO等，通过刺激部分激素分泌，参与内分泌调节和机体特异性免疫调节等生物学过程，因而L-Arg被科学家誉为“神奇分子”。L-Arg还是内生性一氧化氮(NO)的唯一前体。精氨酸为条件性必需氨基酸，对胎儿期和哺乳期动物来说是一种必需氨基酸，而对成年动物来说是非必需氨基酸，在体内能自身合成，但体内生成速度较慢，有时需要部分从食物中补充。精氨酸的多种生物学功能引起了营养和医学科研工作者的广泛关注，从而成为目前氨基酸研究的热点之一。 精氨酸是幼龄哺乳动物的必需氨基酸，是组织蛋白中最丰富的氮载体。精氨酸是碱性氨基酸，在动物体内有重要的生理生化功能，其不仅是细胞质和核酸蛋白的主要成分，还是将天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、聚胺(腐胺、精脒、精胺)等转换为高能磷酸化合物肌酸磷酸的中间体，是肌酐酸唯一的氨来源；还作为尿素循环的中间体，通过尿素循环解除氨中毒，避免由于氨过量造成的代谢紊乱；在机体的匀质代谢方面也起着重要的作用，可用于多种代谢途径，包括精氨酸酶、一氧化氮合酶、精氨酸/甘氨酸胍基转移酶(AGAT)、精氨酰-tRNA 合成酶等。另外，精氨酸不仅作为蛋白质合成的重要原料，同时也是机体内肌酸、多胺和一氧化氮(NO)等物质的合成前体，在动物体营养代谢与调控过程中发挥着重要作用，是新生哺乳动物的必需氨基酸，也是成年哺乳动物的条件性必需氨基酸。近年来，研究者对精氨酸营养和生理功能的研究日益增多，且不断突破。 一、概述 1、发现
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化 生物学实验教学中心
目录 １引言 (1) 1.1精氨酸激酶（AK） (1) 1.2亲和层析法 (2) 1.3电泳法 (2) 2.1材料 (2) 2.1.1实验材料与试剂 (2) 2.1.2仪器设备 (3) 2.2方法 (3) 2.2.1活化菌种 (3) 2.2.2 扩大培养 (4) 2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (4) 2.2.4 蛋白质提取 (4) 2.2.5蛋白质的检测 (4) 2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (5) 3 结果与分析 (6) 3.1蛋白质层析图谱 (6) 3.2AK诱导表达电泳图 (7) 4总结 (7) 参考文献 (8) 致谢 (8)
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化 陈蕾 （指导老师：汪劲松） （湖北师范学院生命科学学院生物科学0902班湖北黄石435002） 摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。重组有AK 基因的E. coli Rosetta ，在含有 50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。当A600 达到 0.6-0.8 时，用终浓度为0.2 mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3 小时。加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。 关键词：精氨酸激酶分离与纯化 １引言 1.1精氨酸激酶（AK） 精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。AK在体内催化如下反应： Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphate AK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。 虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，
100种临床常用注射剂的用途 1、注射用辅酶A：用于白细胞减少症、原发性血小板减少性紫癜及功能性低热的辅助治疗。 2、氯丙嗪：用于精神分裂症、躁狂症或其他精神病性障碍。及各种原因所致的呕吐或顽固性呃逆。 3、异丙嗪（又叫非那根）：①用于治疗皮肤黏膜的过敏②晕动病③麻醉和术后的辅助治疗 ④防治放射病性或药源性恶心、呕吐。 4、盐酸奈福泮（又叫悦止）：术后止痛、癌症痛、急性外伤痛。局部麻醉、针麻等麻醉辅助用药。 5、三磷酸胞苷二钠：用于颅脑外伤后综合症及其遗症的辅助治疗。 6、盐酸川芎嗪：用于闭塞性脑血管疾病，如脑供血不足、脑血栓形成、脑栓塞等。 7、氢溴酸高乌甲素：用于中度以上疼痛。 8、盐酸甲氧氯普胺（又叫胃复安）：镇吐药 9、尼可刹米（又叫可拉明）：用于中枢性呼吸抑制及各种原因引起的呼吸抑制。 10、利巴韦林（又叫病毒唑）：抗病毒药。 11、地西泮（安定)：①可用于抗癫痫和抗惊厥②静注可用于全麻的诱导和麻醉前给药。 12、重酒石酸间羟胺注射液：①防治椎管内阻滞麻醉时发生的急性低血压②用于出血、药物过敏、手术并发症及脑外伤或脑肿瘤合并休克而发生的低血压③心源性休克或败血症所致的低血压 13、盐酸肾上腺素注射液（又叫付肾）：主要适用于因支气管痉挛所致严重呼吸困难，可迅速缓解药物等引起的过敏性休克，亦可用于延长浸润麻醉用药的作用时间。 14、苯巴比妥钠注射液（又叫鲁米那）：治疗癫痫，也用于其他疾病引起的惊厥及麻醉前给药。
15、黄体酮注射液：用于月经失调，如闭经和功能性子宫出血、黄体功能不足、先兆流产和习惯性流产、经前期紧张综合症的治疗。 16、盐酸苯海拉明：用于急性重症过敏反应、手术后药物引起的恶心呕吐、牙科局麻、其他过敏反应病不宜口服用药者。 17、异烟肼注射液：与其他结核药联合用于各种类型结核病及非结核分支杆菌病的治疗。 18、硫酸阿托品注射液：①各种内脏绞痛②全身麻醉前给药、严重盗汗和流涎症③迷走神经过度兴奋所致的缓慢性心失常④抗休克⑤解救有机磷酸酯类中毒。 19、复方樟柳碱注射液：用于缺血性视神经、视网膜、脉络膜病变。 20、注射用盐酸赖氨酸：治疗颅脑外伤、慢性脑组织缺血、缺氧性疾病的脑保护剂。 21、注射用单硝酸异山梨酯：治疗心绞痛,与洋地黄或利尿剂合用治疗慢性心力衰竭。 22、碳酸氢钠注射液：①治疗代谢性酸中毒②碱化尿液③作为制酸药，治疗胃酸过多引起的症状④静脉滴注对某些药物中毒有非特异性的治疗作用，如巴比妥类、水杨酸类药物及甲醇等中毒。 23、硫酸镁注射液：可作为抗惊厥药。常用于妊娠高血压，治疗先兆子痫和子痫，也用于治疗早产。口服具有导泻作用。 24、维生素C注射液：①治疗坏血病②慢性铁中毒③特发性高铁血红蛋白症的治疗。 25、胞磷胆碱氯化钠（又叫胞二磷）：辅酶。用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍。 26、过氧化氢溶液：消毒防腐药。 27、注射用脂溶性维生素Ⅱ：用以满足成人每日对脂溶性维生素A、维生素D2、维生素E、维生素K1的生理需要。 28、二羟丙茶碱注射液（又叫喘定）：适用于治疗支气管哮喘、喘息型支气管炎、阻塞性肺气肿等以缓解喘息症状。也用于心源性肺水肿引起的哮喘。 29、盐酸布比卡因注射液：用于局部浸润麻醉，外周神经阻滞和椎管内阻滞。
第十二章鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸发酵 L-精氨酸（L-Arginine, L-Arg）是具有胍基的碱性氨基酸，是合成蛋白质和肌酸的重要原料。精氨酸是人体和动物体的半必需氨酸，在医药和食品工业上具有广泛的用途。L-鸟氨酸（L-Ornithine, L-Orn）和L-瓜氨酸（L-Citrulline, L-Cit）是精氨酸生物合成的前体物质。L-精氨酸是生物体尿素循环中的一种重要中间代谢产物，临床上除作为复合氨基酸输液的主要成分之一外，L-精氨酸及其盐类广泛用作氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能促进剂。对病毒性肝炎疗效显著，对肠道溃疡、血栓形成、神经衰弱和男性无精病等症都有治疗效果。它也是配制营养支持用或特殊治疗用要素膳的重要原料。 第一节生物合成途径和代谢调节机制 一、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸的相互转化 图12-l 鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸的结构 从结构（见图12-1）上看，鸟氨酸虽与谷氨酸都是五碳酸，但是鸟氨酸却是一羧基二氨基的氨基酸。如果在鸟氨酸末端氨基的氮上接上氨甲酰基，则生成瓜氨酸。瓜氨酸经过精氨琥珀酸，将瓜氨酸的酮基转换成亚氨基，则成为精氨酸。当然，精氨酸放出尿素，就转变为鸟氨酸。 因此，鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸的生物合成，可认为是从谷氨酸出发，逐步合成鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸，从而组成以精氨酸为最终产物的不分支代谢途径。但是，如果精氨酸发生分解，放出尿素，则生成鸟氨酸。这样在代谢途径上，就使所谓的终产物精氨酸与鸟氨酸相衔接，形成一个循环，即尿素循环或鸟氨酸环（图12-2）。
图12-2 尿素循环 二、生物合成途径和代谢调节机制 从谷氨酸经鸟氨酸、瓜氨酸生物合成L-精氨酸，由八个酶催化的反应组成（见图12-3），第一步和第五步反应因微生物的种类不同而不同。 谷氨 酸N-乙酰谷氨乙酰谷氨酸磷酸 乙酰谷氨酸半醛 N-乙酰鸟氨 鸟氨酸 精氨酰琥 珀 NADPH NADP × 酸 α-酮 瓜氨 门冬氨 × 氨基甲酰磷酸 × × ⑴ ⑶ ⑸ ⑹ 精氨酸 反丁烯二酸 I 型大肠杆菌、枯草杆菌 × 谷氨酸N-乙酰谷氨酸N-乙酰谷氨酸磷酸 N-乙酰谷氨酸半醛 N-乙酰鸟氨酸 精氨酰琥珀酸精氨酸 × × × × ⑴⑵ ⑶ ⑷ 鸟氨酸 瓜氨酸 × ⑸ ⑹ ⑺⑻ × 反馈抑制×阻遏×可能存在的阻遏 II型谷氨酸产生菌、酵母菌 × 图12-3 L-精氨酸生物合成途径及调节机制
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化 报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化 作者姓名徐青龙 班级学号1005/2010114020208 指导教师汪劲松 完成时间2013年10月 生物学实验教学中心
目录 １引言 (1) 1.1精氨酸激酶（AK） (1) 1.2亲和层析法 (2) 1.3电泳法 (2) 1.4本实验主要工作 (3) 2.1实验用品 (3) 2.1.1实验材料 (3) 2.1.1实验试剂 (3) 2.1.2仪器设备 (4) 2.2方法 (5) 2.2.1活化菌种 (5) 2.2.2 扩大培养 (5) 2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5) 2.2.4 蛋白质提取 (5) 2.2.5蛋白质的检测 (6) 2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6) 3 结果与分析 (7) 3.1蛋白质层析图谱 (7) 3.2AK诱导表达电泳图 (8) 4总结 (9) 参考文献 (10) 致谢 (10)
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化 朱景鹏 （指导老师：汪劲松） （湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002） 摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。 关键词：精氨酸激酶分离与纯化 １引言 1.1精氨酸激酶（AK） 精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。它的作用是催化可逆反应，将ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能健的储能分子——磷酸精氨酸[3]，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。AK在体内催化反应方程式如下：Mg2+ + ADP + Arginine phosphate Mg2+ + ATP + Arginine AK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。 虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基
瓜氨酸功效 1.防治前列腺疾病 瓜氨酸对防治前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺肿胀、前列腺肥大、前列腺增生症、前列腺癌作用明显。 2. 提高男性性功能 瓜氨酸能够使人体产生出氮氧化物，而这种氮氧化物对男性的性能力是一种非常重要的物质。与提高性能力药物不同的是，瓜氨酸可以完全吸收到血液中，更容易产生氮氧化物，从而达到使阴茎勃起的功效。而且作为一种纯天然制品，瓜氨酸不仅没有任何副作用，同时还能全面增强男子的身体状况，被誉为“绿色伟哥”，而且美国已经有公司开发出了相关产品。 3.治疗L-精氨酸缺乏引起的相关疾病 最近的研究表明，瓜氨酸在体内转化为人体必需氨基酸L-精氨酸，在维持心血管正常功能的一氧化氮代谢中也发挥着重要作用。L-精氨酸缺乏可导致一系列的心血管疾病，包括高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、高胱氨酸血症、心衰及缺血再灌注损伤等。膳食或循环中L-精氨酸升高时，肝脏、肾脏和其他组织中精氢酸酶活性升高，增加L-精氨酸代谢。由于L-瓜氨酸作为合成L-精氨酸的前体，在许多组织中能转化成L-精氨酸，且在胃肠道和肝脏中不代谢，亦不诱导精氢酸酶活性升高，因此补充L-瓜氨酸能辅助治疗L-精氨酸缺乏引起的相关疾病，及对解决肥胖，糖尿病，代谢性疾病等提供了新的、可行的治疗手段。 4.抗衰老和增强免疫力 研究发现瓜氨酸有较强的抗氧化能力，能够清除羟基，增加NO合成所需的精氨酸，可有效保护DNA及PMN免受氧化反应的侵害，可以作为抗衰老、提高免疫力的保健品，也可作为女性美容化妆品，具有护肤防皱祛斑抗衰老之功效5．提高运动员肌肉力量与耐力 精氨酸对于人体的运动机能有良好的促进作用，但是有文献报道，单纯补充精氨酸对运动员没有明显作用。由于L-瓜氨酸作为合成L-精氨酸的前体，在许多组织中能转化成L-精氨酸，服用瓜氨酸能有效的改善人体的抗疲劳能力，维护健康的心肺功能，提高脑力清晰度，降低压力和克服沮丧情绪，平衡血糖浓度，增
L-精氨酸 中文同义词：L-精氨酸;2-氨基-5-胍基戊酸;L-蛋白氨基酸;胍基戊氨酸;精氨酸;L-2-氨基-胍基戊酸;L-胍基戊氨酸;L-精氨酸碱 英文名称: L(+)-Arginine 英文同义词: L(+)-ARGININE;L-ARGININE;L-ARGININE BASE;L-ARG;L-2-AMINO-5-GUANIDINOVALERIC ACID;ARG;ARGININE, L-;FEMA 3819 分子式 : C6H14N4O2 分子量 : 174.2 相关类别: 氨基酸和衍生物;pharmacetical;chiral;Arginine [Arg, R];Amino Acids;Amino Acids and Derivatives;for Resolution of Acids;Optical Resolution;alpha-Amino Acids;Biochemistry;Synthetic Organic Chemistry;L-Amino Acids;L-型氨基酸;Amino Acids;食品添加剂;食品和饲料添加剂;营养性添加剂;氨基酸及其衍生物;生化试剂;生物化学品;氨基酸;营养强化剂（营养增补;Nitric Oxide L-精氨酸性质 L-精氨酸用途与合成方法
L-精氨酸产品详细描述 L-Arginine(L-1-Amino-4-guanidovaleric acid) 对成人为非必需氨基酸，但体内生成速度教慢，对婴幼儿为必需氨基酸，有一定解毒作用。 天然品大量存在于鱼精蛋白等中，亦为各种蛋白质的基本组成，故存在十分广泛。 分子式：C6H14N4O2 分子量：174.20 性状:白色斜方晶系(二水物)晶体或白色结晶性粉末.熔点244℃(分解).经水重结晶后,于105 ℃失去结晶水.其水溶性呈强碱性,可从空气中吸收二氧化碳.溶于水(15%,21℃),不溶于乙醚,微溶于乙醇. 质量标准： 外观性状：白色结晶粉末
精氨酸酶缺乏症 一、疾病概述 精氨酸酶缺乏症(arginase deficiency)也称精氨酸血症(argininemia)，或高精氨酸血症，属常染色体隐性遗传病，是先天性尿素循环障碍中较少见的类型。1969年由Terheggen等[1]首次报道。精氨酸血症患者的临床表现与其他类型的尿素循环障碍有所不同，多数患儿在婴儿早期智力运动发育正常，随着疾病进展，在婴儿晚期出现进行性智力运动发育倒退、癫痫等神经系统损害。除一般高氨血症所导致的症状外，可有步态异常、痉挛性瘫痪、小脑性共济失调等。 国内外关于精氨酸血症发病率的研究资料较少，据报道其发病率为1/350 000～1/2 000 000不等。国内韩连书等从4 981名临床疑似遗传代谢病患者中检查出了1例精氨酸血症患者[2]；杨艳玲教授团队曾报道7例精氨酸血症患者[3]。精氨酸酶(EC3.5.3.1)有两种同工酶，Ⅰ型存在于肝脏，为精氨酸酶的主要类型；Ⅱ型存在于肝外组织，含量较少。精氨酸血症是由于Ⅰ型精氨酸酶缺乏导致的一种疾病。精氨酸酶缺乏导致精氨酸不能顺利转化为瓜氨酸，血液及尿液中精氨酸浓度增高，尿素生成障碍，引起神经、肝脏、肾损伤等多脏器损害，引起一系列临床表现。 编码Ⅰ型精氦酸酶的基因（ARGl）位于6q23，长11.5 kb，包括8个外显子和7个内含子，编码由322个氨基酸组成的精氨酸酶同工酶Ⅰ蛋白。迄今已报道了至少30种ARG1基因突变。 二、临床特征 精氨酸血症患者临床表现复杂，个体差异较大，包括痉挛、震颤、舞蹈样运动、多动、共济失调、痉挛性四肢瘫痪、抽搐、精神发育迟缓等进行性神经系统损害，以及肝病、周期性呕吐和小头畸形。患儿早期可表现出厌食蛋白倾向及蛋白不耐受，进食高蛋白食物后血氨增高，导致呕吐或嗜睡，易合并营养不良。 进行性神经系统损害是精氨酸血症患者主要的临床特点，病情严重者可于新生儿早期发病，出生后数日出现惊厥，病死率高。患儿于2岁内出现“剪刀”步态、痉挛性双侧瘫、惊厥、严重智力低下、脑电图异常。婴儿期至学龄期发病的患者以智力运动障碍、惊厥、痉挛性瘫痪、共济失调为主要表现，因此易被误诊为脑
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 生物学实验教学中心
目录 引言 (4) 1实验材料、试剂、仪器 (7) 2 实验方法 (9) 2.1配制LB液体培养基 (9) 2.2 活化菌种 (9) 2.3 扩大培养 (9) 2.4 IPTG诱导AK的表达 (9) 2.5蛋白质提取 (9) 2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (10) 2.7 上样和洗脱 (10) 2.8 SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度 (10) 3 结果与分析 (11) 3.1层析谱图 (11) 3.2 SDS-PAGE电泳带型分析 (12) 总结 (13) 参考文献 (14)
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 指导老师： 摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB培养基中培养。当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。加裂解液后用超声破 壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。通过CM-Cellulose阳离子交换层析， SephacrylTM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电 泳纯的精氨酸激酶。 关键词：精氨酸激酶表达与纯化 Expression and Purification of Arginine Kinase Abstract：Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which 2
第一章引言 １．１ 精氨酸激酶 精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物的激酶。它的作用是催化如下可逆反应：将ATP上的磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能键的储能分子――磷酸精氨酸。反应方程式如下： 精氨酸＋ATP? 磷酸精氨酸＋ADP?Mg + H+ AK被发现已经超过70年的历史了, 它属于磷酸原（胍基化合物）激酶这个大家族中的一员。现在已经在许多种无脊椎动物中发现了AK, 例如有鳌节肢动物(chelicerate arthropod) Limulus polyphemus[1], 腹足动物(gastropod) Cellana grata 和Aplysia kurodai [2]，海参Stichopus japonicus[3]，头足类动物Nautilus pompilius[4]，龙虾(lobster) Homarus vulgaris[5]，海葵（sea anemone）Anthopleura japonicus[6]，海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus[7]等无脊椎动物中都已经分离得到了AK。 尽管说基本功能都是催化同样的高能磷酸键转移反应，但是从不同的无脊椎动物体内得到的AK的结构和分子量大小却存在着很大的差异。这些不同的精氨酸激酶结构和大小有以下类别：（1）单亚基，如海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus 的AK[7]，是一种相对分子量约为40 kDa的单亚基的蛋白质。单亚基的AK是目前研究最多的一种AK。本论文中用到的AK就是单亚基，相对分子量约为40 kDa。（2）双亚基，如海参Stichopus japonicus中分离得到的AK就是一种相对分子量约为84 kDa的双亚基蛋白质[3]。（3）四个亚基，如环节动物（annelid）Sabella pavonina中具有相对分子量在150～160 kDa之间的四亚基AK[8]。 来自于某些物种的精氨酸激酶的晶体结构现在已经被解析了出来。早在1998年， Zhou等人已经利用来自于马蹄蟹（horseshoe crab）Limulus polyphemus 的单亚基的AK解出了结合有过渡态类似物的AK的过渡态的晶体结构（分辨率：1.86 ?）[9]。结果显示AK由一个小的全α－螺旋的N端结构域和一个大的C 端结构体（112号－357号残基）组成。C端结构域和谷氨酸合成酶的C端结构域相似，8股反平行β－折叠被7个α－螺旋包绕着（见图1－1）。 - 1 -
精氨酸的研究进展 发表时间：2013-10-24T15:09:30.873Z 来源：《医药前沿》2013年第28期供稿作者：耿晓华[导读] 精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。 耿晓华（山西焦煤西山煤电职工总医院药剂科 030053）【摘要】精氨酸在体内发挥着非常重要的生作用。在动物细胞内，精氨酸是目前发现的功能最多的一种氨基酸，其不仅是合成蛋白质的重要原料，也是机体内一氧化氮（NO）、多胺和肌酸等重要物质的合成前体，近年来，有关精氨酸营养和生理功能的研究取得了许多突破性的进展。它不仅可以作为氮源提供者，改善氮平衡、也包括刺激内分泌腺分泌、拮抗分解代谢。还可以改善机体免疫功能，为淋巴细胞增殖、分化及合成细胞因子所必需，在维护肠黏膜完整性方面发挥重要作用。精氨酸能够通过影响肿瘤的生长，明显地增强巨噬细胞、自然杀伤细胞以及细胞毒T淋巴细胞的活性。研究表明精氨酸具有多种独特的生理作用，已广泛应用于临床营养治疗。【关键词】精氨酸功能营养增补剂抗肿瘤免疫调节【中图分类号】R3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）28-0094-02 概述 精氨酸，学名：2-氨基-5-胍基-戊酸。一种脂肪族的碱性的含有胍基的极性α氨基酸，在生理条件下带正电荷。L-精氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物必需氨基酸和生糖氨基酸。D-精氨酸在自然界中尚未发现。符号：R。 1.1 合成 精氨酸，是由瓜氨酸透个胞质酵素精氨基琥珀酸合成酶（ASS）及精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）合成。这个过程所要求较大的能量，这是因要将每一个分子合成精氨基需要将三磷酸腺苷（ATP）水解成一磷酸腺苷（AMP），即两个三磷酸腺苷当量。瓜氨酸能从以下各种来源生成：从精氨酸经由一氧化氮合酶（NOS）催成；从鸟氨酸经由脯氨酸或谷氨酰胺/谷氨酸的分解代借催成；从非对称性二甲基精氨酸（ADMA）经由二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）催成。经由精氨酸或谷氨酰胺及谷氨酸所生成的途径是双向性的，因此氨基酸的生成会容易受到细胞的种类及生长阶段所影响。在整个身体内看，精氨酸的合成基本是发生在小肠的上皮细胞。上皮细胞会从谷氨酰胺及谷氨酸产生瓜氨酸，再经由肾脏的肾小管细胞协助下抽取出来并转化为精氨酸。所以，若小肠或肾脏受到损害，精氨酸的内生合成会因而减少，这些人的膳食质素因而要相应提高。另外，精氨酸的合成亦会在其他细胞中发生，所合成的份量较少。若在合成的环境中加入诱导型一氧化氮合酶（iNOS），可以明显的提高合成的份量。在一氧化氮合酶催化的过程中所产生的副产品瓜氨酸，可以透过“瓜氨酸／一氧化氮过程”或“精氨酸／瓜氨酸过程”再转化为精氨酸。这个过程可以从多种细胞内，瓜氨酸会某程度上取代精氨酸协助一氧化氮显明出来。这个转化过程在多种不同的细胞内，瓜氨酸取代精氨酸协助一氧化氮的生成显明出来。但是，过程很难被量化，原因是瓜氨酸会与较稳定的一氧化氮化合物（硝酸盐及亚硝酸盐）积聚起来。 1.2 功能 1.2.1 作为前体 精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。精氨酸作为合成一氧化氮（NO）的唯一前体，其能够参与免疫和血管张力调节[1]。非对称性二甲基精氨酸（ADMA）会压抑一氧化氮的化学作用，所以ADMA被认为是血管疾病的标记，就像精氨酸是健康内皮细胞层的象征一样。 1.2.2 营养增补剂 精氨酸是鸟氨酸循环中的一个组成成分具有极其重要的生理功能。多吃精氨酸,可以增加肝脏中精氨酸(arginase)的活性，有助于将血液中的氨转变为尿素而排泄出去。精氨酸也是精子蛋白的主要成分，有促进精子的质量，提高精子运动能量的作用。机体对精氨酸的需要:精氨酸是一种双基氨基酸,对成人来说虽然不是必需氨基酸,但在有些情况如机体发育不成熟或在严重应激条件下，如果缺乏精氨酸,机体便不能维持正氮平衡与正常的生理功能。病人若缺乏精氨酸，会导致血氨过高,甚至昏迷。婴儿基先天性缺乏尿素循环的某些酶,精氨酸对其也是比需的,否则不能维持正常的生长与发育。但一般认为对婴儿不说组氨酸与精氨酸也属必需氨基本。也就是说,婴儿有10种必需氨基酸。缺少精氨酸会导致婴儿生长发育迟缓，而补充适量的精氨酸可以满足动物机体尿素循环对精氨酸的需要，使病情得到缓解[2]，补充精氨酸可增加血浆合成蛋白质的底物浓度，有效减少癌症患者体重的下降[3]。临床上，已将血浆中精氨酸浓度的降低作为机体癌变的一个重要症状。外源性精氨酸可以增加NO的合成速度，有利于保护急性胃黏膜损伤，提高内皮细胞功能障碍高血压患者体内的NO浓度，降低患者的血压[4-5]。在小鼠心脏离体试验中发现，灌喂适量精氨酸可促进NO生成与释放，减少氧自由基的生成，降低过氧亚硝酸阴离子（ONOO －）的合成，从而缓解自由基对心肌细胞的损害[6]。 1.2.3精氨酸的抗肿瘤作用及其作用机制 精氨酸具有与免疫有关的抗肿瘤特性，其可在不同动物模型中防止由乙酸胺、7，12－二甲基苯并蒽和N－甲基－N－亚硝基脲诱导的化学转化，且不阻止异烟肼（抗结核病药）和肼。在没有其他影响因素时，小鼠接种致瘤病毒后，精氨酸能提高潜伏时间、减少肿瘤的尺寸和缩短肿瘤倒退的时间；在几种可转移肿瘤模型中，精氨酸可抑制肿瘤的生长，减少潜伏的时间并增长宿主的生存时间。依靠人类白细胞抗原（HLA）的相溶性、肿瘤相关抗原的表达和肿瘤继代转移的次数，相反，化学转移和几种不同的诱导转移有高度的免疫原性。相关研究表明了精氨酸的抗肿瘤作用和肿瘤免疫原性之间的关系，精氨酸降低肿瘤生长速度并提高了小鼠感染中性和弱性激发免疫应答的神经母细胞瘤的存活时间；在小鼠适度产生免疫的肿瘤中，精氨酸提高了淋巴细胞－肿瘤混合培养基中宿主的反应性，相反，小鼠宿主抗肿瘤反应性在弱免疫应答的肿瘤是不可预测的[7]。相似的研究表明，在宿主肿瘤的相互影响中，供给精氨酸的积极作用是提高了脾细胞对抗原ConA和IL-2的有丝分裂。一些研究表明，小鼠在蛋白质衰竭的情况下，精氨酸的抗肿瘤作用和肿瘤免疫遗传性之间存在联系。在中性免疫激发的肿瘤中，精氨酸降低肿瘤的生长率并提高小鼠的营养状况，但是对少量免疫激发肿瘤的小鼠则无作用。这说明，精氨酸对小鼠产生免疫激发免疫应答的肿瘤非特异性免疫有积极作用，但是，精氨酸不能克服蛋白质营养不良造成的免疫缺陷和少量的免疫应答。精氨酸对肿瘤的生长和转移的积极作用与提高肺泡巨噬细胞的吞噬作用有关，这些研究表明，精氨酸通过自然细胞毒性和依靠细胞毒性T淋巴细胞的无性繁殖的细胞中间免疫影响肿瘤的生长。研究表明，精氨酸能够通过影响肿瘤的生长，明显地增强巨噬细胞、自然杀伤细胞以及细胞毒T 淋巴细胞的活性[8-10]。
盐酸精氨酸注射液说明书 【药品名称】 通用名：盐酸精氨酸注射液 英文名：ArginineHydrochlorideInjection 汉语拼音：YansuanJing’ansuanZhusheye 本品主要成分为盐酸精氨酸，其化学名称为L-2-氨基-5-胍基戊酸盐酸盐。 分子式：C6H14N4O2 ·HCl分子量：210.66 【性状】本品为无色或几乎无色的澄明液体。 【药理毒理】本品为氨基酸类药物。可在人体内参与鸟氨酸循环，促进尿素的形成，使人体内产生的氨，经鸟氨酸循环转变成无毒的尿素，从尿中排除，从而降低血氨浓度。 【药代动力学】本品经口服经肠道吸收较好，绝对生物利用度约为70%，静脉给药后22-30分钟，口服给药90分钟达血药峰值浓度。本品在肝脏代谢，经肾小球滤过后几乎被肾小管完全重吸收，其清除半衰期为1.2-2小时。 【适应症】用于各种肝昏迷忌钠患者。 【用法用量】静脉滴注。一次15-20g，于4小时以上滴完或遵医嘱。 【不良反应】 1．可引起高氯性酸中毒，以及血中尿素、肌酸、肌酐浓度升高。 2．少数患者可出现过敏反应。 3．静滴过快，可引起流涎、面部潮红及呕吐等。 4．有报道肝肾功能不良或糖尿病患者使用本品可引起高钾血症。 5．静脉滴注本品可引起肢体麻木和头痛，恶心、呕吐及局部静脉炎。静脉给予大剂量精氨酸可使外周血管扩张而引起低血压。 【禁忌】 1．对本品中任何成份过敏者禁用。 2．高氯性酸中毒、肾功能不全及无尿患者禁用。
3．爆发性肝衰竭患者，因体内缺乏精氨酸酶不宜使用本品。 【注意事项】 1．本品不含钠离子，适用于不宜用谷氨酸钠的患者。 2．用药期间宜监测血气分析、酸碱平衡和电解质，有酸中毒和高钾血症者不宜使用。 3．用药前请详细检查，如有药液浑浊、变色、封口松动、内有异物及玻璃瓶破损时切勿使用。 【孕妇及哺乳期妇女用药】尚不明确。不推荐孕妇及哺乳期妇女使用本品。 【儿童用药】尚无本品用于儿童肝昏迷治疗的研究资料和报道。 【老年患者用药】尚无老年患者用药的研究数据，可参考其他项下内容或遵医嘱。 【药物相互作用】 1．本品与谷氨酸钠、谷氨酸钾合用，可增加疗效。 2．本品与螺内酯合用可引起高钾血症，特别是合并严重肝脏疾病的患者。 3．本品禁忌与强心甙类联合应用。 4．用于抢救肝昏迷有缺钙者，可与麸氨酸合用。 【药物过量】尚无本品药物过量的系统的研究资料。静脉大剂量给予精氨酸可引起低血压。一旦发生药物过量，应立即停药，给予支持和对症治疗。 【规格】20ml：5g 【贮藏】密闭保存。
1000吨/年L-精氨酸（食品添加剂） 项目建议书 一、项目
1、项目名称：1000吨/年L-精氨酸（食品添加剂）项目。 2、项目规划：由于生产工艺的同一性，可以逐渐形成多品种氨基酸食品添加剂系列的工厂。 3、建设单位：名称待定 二、产品--L-精氨酸（食品添加剂） 英文名称：L-Arginine 中文名称：L -精氨酸 化学分子式：C6H14N4O2 特性：白色斜方晶体(二水物)晶体或白色结晶性粉末。熔点244℃(分解)。经水重结晶后，于105℃失去结晶水。其水溶液呈强碱性，可从空气中吸收二氧化碳。溶于水(15%，21℃)，不溶于，微溶于乙醇。天然品大量存在于鱼精蛋白等中，亦为各种蛋白质的基本组成，故存在十分广泛。除鱼精蛋白外，亦较多存在于乌贼、绿茶、蒜等中，并成为他们特殊的呈味物质。 用途：增味剂；营养强化剂。主要用于水产加工品、绿茶风味增加剂等。 与糖进行加热反应可获得特殊的香味物质。 氨基酸输液及氨基酸制剂的重要成分。 质量标准：FCC ，aji09—日本味之素09版标准
功用：对成人为非必需氨基酸，但体内生成速度较慢，对婴儿为必须氨基酸， [包装]：牛皮纸袋或纸桶包装，每袋(桶)净含量为25kg，还可根据用户需要包装。 [运输]：轻装轻卸以防包装破损，防日晒雨淋，不能与有毒，害物同运。为非危险品。 [贮存]：本品应贮存在阴凉、干燥、清洁、遮光的环境中，严禁与有毒、有害物质混放，以免污染。 三．产品主要用途： 国际上开展对精氨酸的研究已经有50多年的历史。大量的研究结果表明，精氨酸具有增加人类生长激素（Human Growth Hormone HGH）、恢复疲劳、增强肌肉力量、抗衰老、增强性功能以及提高免疫力等多种功能。 精氨酸是人体和动物体中的"半必需"氨基酸，即在人和动物体内合成
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣 班级学号0801/2008114010130 指导教师汪劲松 完成时间2011年5月 生物学实验教学中心
目录 摘要........................................................................ 错误！未定义书签。引言.. (2) 1 实验材料 (2) 2 实验方法 (3) 2.1菌种活化 (3) 2.2扩大培养 (3) 2.3 IPTG诱导AK的表达 (3) 2.4 AK的提取及其纯化 (3) 2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3) 2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4) 3 结果与分析 (4) 3.1 提取物的层析谱图与分析 (5) 3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6) 总结 (6) 参考资料 (7)
藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 余姣 （指导老师：汪劲松） 摘要： 精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。 关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析