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转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建

转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建
转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建

Construction of Red Fluorescence Protein Transgenic Zebrafish JIAN Qing, BAI Jun-jie, YE Xing, XIA Shi-ling, LAO Hai-hua, LUO Jian-ren

(Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fish Breeding & Cultivation, CAFS. Pearl River Fishery Research Institute,

CAFS. Guangzhou 510380,China)

Abstract The cloned myosin light chain 2 promoter was modified by PCR method and was inserted into the vector(pDSRed2) to construct the red fluorescence protein expression vector. The linlinearized expression vector was delivered into one or two cells stage embryo zebrafish by micro-injection. Under fluorescence microscope, red fluorescence had been observed in muscle tissue as early as embryo blood-circling stage, and red fluorescence intends to increase with the growth of the fish. After hatching, almost all the trunk of the red fluorescence transgenic zebrafish was covered with red fluorescence. Keywords: Danio rerio, red fluorescence protein, transgenic, myosin, promoter

转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建

简清*, 白俊杰, 叶星, 夏仕玲, 劳海华, 罗建仁

(中国水产科学研究院珠江水产研究所,中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,广东广

州510380)

摘要: 采用PCR方法,改造肌球蛋白轻链2启动子,使其适合定向插入红色荧光蛋白载体

的多克隆位点,构建成肌肉特异性表达的红色荧光载体。通过显微注射,将线性化的表达

载体注入斑马鱼的受精卵,获得了转红色荧光蛋白基因的斑马鱼。红色荧光蛋白在胚胎期

开始表达,随着鱼体的生长,表达量有增加的趋势, 至仔鱼出膜时,大部分的躯干部被红

色荧光所覆盖。本研究为特定基因的表达研究和获得有特色的转基因观赏鱼奠定了基础。

关键词:斑马鱼;红色荧光蛋白;转基因;肌球蛋白;启动子

斑马鱼(Danio rerio)具有易于养殖、体外受精,胚胎透明等优点,是研究脊椎动物胚胎发育的模型生物[1],也是常见的观赏性鱼类之一。从海葵(Discosoma sp.)分离得到的红色荧光蛋白基因,具有与绿色荧光蛋白基因相同的特性:不需预处理即可被检测,已被证明可作为报告基因用于转基因或核移植的研究[2]。本实验采用PCR方法改造已由本研究室克隆到的斑马鱼肌球蛋白轻链2(mylz2)启动子基因,使其适合于定向插入红色荧光蛋白基因载体,构建了肌肉特异性表达的红色荧光蛋白表达载体,通过显微注射,获得了肌肉特异性高效表达红色荧光蛋白的转基因斑马鱼,初步研究了荧光蛋白在转基因鱼不同时期的表达情况和变化趋势,为下一步特定基因的表达研究和获得有特色的转基因观赏鱼奠定了基础。

*资助项目:广东省科技计划项目(2003C20310)

作者简介: 简清(1973-) 男, 助理研究员, 从事鱼类生物技术研究 E-mail: jianqing2@https://www.doczj.com/doc/ee13206746.html,

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌种与载体 E.coli DH5α由本实验室保存,红色荧光蛋白基因载体(pDsRed2)购自Clontech 公司。质粒mylz2-T(含斑马鱼mylz2启动子基因)由本室构建[3]。

1.1.2酶与化学试剂Wizard PCR Preps DNA Purification System 为Promega公司产品;PCR扩增试剂盒Takara PCR TM Kit Ver

2.1购自Takara公司;引物由上海生工公司合成;限制性内切酶,T4 DNA 连接酶为华美生物工程公司产品;其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 实验动物斑马鱼为AB品系,取自本研究所。

1.1.4主要实验仪器荧光显微镜为AO 120型(带2071M落射式荧光照明系统和1053F Expostar 显微照相系统);立体解剖镜为OPTON产品;基因导入采用国产显微注射仪(中国科医文化厂)[4] 1.2 方法

1.2.1表达载体的构建为了将mylz2启动子定位插入红色荧光蛋白基因载体(pDsRed2)的多克隆位点,设计1对引物(P1 5'ttgaattcttcgccacagaggaatgagc,P25'tatggatcctgtcctgtact tgaggggct )。引物P1引入Eco R I位点,引物P2引入Bam H I位点。采用P1、P2引物,以质粒mylz2-T为模板,对本实验室克隆到的mylz2启动子基因进行PCR改造,反应条件如下:94℃预变性3 min,每循环包括94℃变性1 min,55℃复性1 min,72℃延伸4 min,共30个循环,最后1个循环结束后再72℃延伸7 min。扩增片段经Wizard PCR Preps DNA Purification System纯化。扩增产物经Eco R I和Bam H I限制性内切酶消化后与经相同的限制性内切酶消化的载体pDsRed2连接,转化E.coli DH5α,酶切、电泳法筛选重组转化子。操作方法参照 Sambrook等的《分子克隆实验手册》[5]。

1.2.3斑马鱼的饲养管理实验用斑马鱼饲养于水族箱中,投喂人工饵料,温度恒定于25~26℃。繁殖时雌雄分开暂养,产卵前一天晚上将1尾雌鱼和1尾雄鱼配对于一小水族箱中,用黑布盖好,实验当天早上揭去黑布,让其自然产卵。

1.2.4基因导入与转基因鱼的检测用bglⅡ线性化mylz2-pDsRed2载体,纯化后溶于双蒸水,参照朱新平等[6]的方法,在立体解剖镜下挑选高质量的受精卵注射,注射量为2nL / 受精卵。注射后的受精卵放入25~26℃水体,自然发育,定期在荧光显微镜(使用2074滤光片组合)下观察荧光表达情况。仔鱼出膜后继续恒温培育,定期检查荧光蛋白基因的表达情况。

2 结果

2.1肌肉特异性红色荧光蛋白表达载体的构建

mylz2启动子基因经PCR改造后,两端分别引入Eco R I和Bam H I位点,经这2种内切酶消化后插入pDsRed2载体的多克隆位点,酶切方法筛选出重组子,将其命名为mylz2- pDsRed2。酶切结果见图1。

2.2转基因鱼的表达检测

2.2.1注射用DNA的前处理

表达载体mylz2-pDsRed2经内切酶bgl II消化、纯化处理后,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,得到一大小为6.0 kb的带,纯度较好,估算其浓度0.25 ug/uL,见图1。将此DNA分别用ddH2O稀释为0.25 ug/uL和0.1 ug/uL 2种浓度,用于显微注射。

2.2.2基因导入与红色荧光的检测

在立体解剖镜下挑选1或2细胞的受精卵注射,注射量为2nL / 受精卵。注射共分两组进行,

注射后的受精卵放入25-26℃水体,自然发育,定期在荧光显微镜(使用2074滤光片组合)下观察荧光表达情况。2组实验细节如下表:

注射DNA 浓度(ug/uL) 注射卵数 (个) 注射当日存活卵数 注射存活率 出膜鱼数出膜率 观察到荧光的

胚胎

数 表达率(%) 观察到荧光时间 A 组 0.25 93

47 50.5%32 68.1%9 19.1% 约48h B 组 0.1 50

23 46% 19 82.6% 2 8.7% 约48h 注:注射存活率= 注射的受精卵数

注射当日存活的卵数%100× 出膜率=注射后存活的受精卵数

出膜尾数%100× 荧光蛋白表达率=

注射当日存活的胚胎数观察到荧光的胚胎数%100× 在荧光显微镜下,处于血液循环期的胚胎即可观察到红色荧光。荧光主要出现在躯干部,呈现亮点状和小块片状,见图2(A-C )。红色荧光的强度有随着鱼体的生长而增加的趋势,至仔鱼出膜时,几乎整个躯干部被红色荧光所覆盖,见图2(D-E )。在胚胎期未能观察到红色荧光的转红色荧光蛋白基因实验鱼,在出膜后也无法观察到红色荧光。

M 1 2 23.1 kb -------- 9.6 kb ----------- 6.6 kb ------- --------6.0 kb 4.4 kb ------------ --------4.1 kb ---------------------------- 2.3 kb ---------- 2.0 kb ------- -----------1.9 kb 图1. mylz2- pDsRed2酶切图谱

Fig.1 restriction enzyme analysis of plasmid mylz2- pDsRed2 M. λDNA / Hind Ⅲ 1. mylz2- pDsRed2/EcoRI 、BamH I 2. mylz2- pDsRed2/bgl II

A B C D E 图2.转红色荧光蛋白基因斑马鱼 A 、B 、C :胚胎 D 、E :仔鱼 Fig.2 Red fluorescence transgenic zebrafish A,B,C :.embryo D,E :Fry

3. 讨论

Bensheng Ju等[7]在转绿色荧光蛋白基因斑马鱼实验中发现,高外源DNA浓度(0.5 ug/uL)注射组与低外源DNA浓度(0.1 ug/uL)注射组的存活率相当(分别为58%和57%),前者的荧光蛋白表达高达76%,而后者只有60%;苏建明[8]在绿色荧光蛋白基因在金鱼体内的整合与表达研究中发现,外源DNA拷贝数为105至107之间时,导入外源基因的拷贝数与荧光蛋白的表达率呈正相关,但外源DNA拷贝数为107至108时,则呈现负相关,显示了外源基因的拷贝数与基因的表达不存在简单的线性关系。本实验中,2个不同浓度注射组的注射存活率比较接近(分别为50.5%和46%),显示注射存活率主要取决于显微注射操作对受精卵的机械损伤,与外源基因的浓度关系不大;而高浓度注射组的出膜率(68.1%)明显低于低浓度注射组(82.6%),荧光蛋白表达率(19.1%)则明显高于低浓度注射组(8.7%)。这可能是由于更多外源基因会有更多的整合机会,但整合位置是随机的,当其整合破坏了受精卵发育必需的基因时,受精卵即会发育畸形,甚至死亡,导致较低的出膜率,但有较高的外源蛋白表达率。因此可认为;在一定范围内,导入高浓度的外源基因可得到较高的外源蛋白表达率。

苏建明在其研究中发现,在囊胚期开始检测到绿色荧光,荧光随着胚胎的发育而增强,但后期又开始减弱;荧光胚胎比率在原肠期出现峰值,随后逐渐下降,但在肌肉效应期后,荧光的表达率相对稳定。本实验中,受精卵直到血液循环期才能检测到红色荧光,但荧光强度随着胚胎的发育不断增强,没有观察到减弱现象,也没有出现荧光胚胎大量死亡。这可能是由于所采用的启动子不同的结果。本实验采用的mylz2启动子可能在血液循环期前不活跃,表达的红色荧光蛋白量少,不足以检测到。一般认为,外源基因在受精卵中的整合发生在胚胎的晚期[9],原肠末期之前胎期的核酸酶系统发育不完善,外源基因的复制速度大于降解速度,大量的外源基因积累在胚胎内;原肠末期之后,外源基因的数量逐步减少,最终只有少量整合到基因组[10]。如果外源基因在原肠末期之前表达,会产生过量的外源蛋白,干扰了胚胎的正常发育,可导致高死亡率。本实验中,红色荧光蛋白在血液循环期才开始大量表达,此时胚胎发育已趋于稳定,估计这是没有出现胚胎大量死亡的原因。

参考文献

[1] 桂建芳. 分子发育生物学研究的理想模式—斑马鱼[J]. 生物工程学报,1995, 15(3):30-33.

[2] 龙华,尾里建二郎,若松佑子,等. 红色荧光蛋白(RFP)基因在转基因青鳉中的表达[J].中国水产科学,2002,

9(2):97-99.

[3] 简清,白俊杰,叶星,等.斑马鱼Mylz2启动子的克隆与转绿色荧光蛋白基因鱼的构建[J],中国水产科学, 2004

11(4)

[4] 中国科学院北京动物研究细胞室. 鱼类细胞核移植技术[J].动物学杂志,1975,(2):44-47.

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[6] 朱新平,夏仕玲,张跃,等.转抗冻蛋白基因鲮鱼的初步研究[J].中国水产科学,1997,4(2):79-80.

[7] Ju B S, Chong S W, He J Y, et al. Recapitulation of fast skeletal muscle development in zebrafish by transgenic

expression of GFP under the mylz2 promoter[J]. Developmental Dynamics,2003, 227:14–26.

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(5):409-414

[9] Duncker B P, Davies L , Vk Walken, Transgenic drosophila melanogaster,Transgenic Res,1998,7:1-6

[10] 杨隽,杨东亚,郭志光,等. 全鱼基因在鲤鱼体内整合行为的研究,黑龙江八一农垦大学学报,1997,9(1):

57-59

文献综述-斑马鱼及其应用

斑马鱼及其研究应用 作者:杜颖指导老师:张源淑 摘要:斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一,体外受精、胚胎透明,因此可在显微镜下直接观察发育过程及检测药物引起的内脏组织变化,在生命科学领域中应用前景十分广阔。斑马鱼体型小,适合高通量研究,还具有生长繁殖周期短及其与人类高度相似的基因组等优点,已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选,此外,斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。因为斑马鱼对污染物反应灵敏,现已用于监测环境污染物及污水检测。本文主要从几个方面对斑马鱼的研究进展进行了整理和归纳。 关键字:斑马鱼模式动物科学研究发育感染药物 Zebrafish and Its Application Abstract:Zebrafish as an important model animal emerging, its in vitro fertilization, transparent embryo, internal organs can be directly observed during the development and testing organ change caused by drugs under the microscope, has very broad application prospects in the field of life sciences. zebrafish also has a live, high-throughput, growth and short reproduction cycles and highly similar to the human genome, etc., it is widely used in modeling human diseases, drug screening, and secondly, zebrafish also is applied in toxicology research, developmental biology and genetics, etc.. Because of its sensitivity, it has been used to monitor environmental pollutants and water testing.This paper mainly from several aspects of zebrafish research progress has been collated and summarized Key words:zebrafish Animal models Scientific research Development Infection Drug 斑马鱼(Danio rerio)又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼,产于孟加拉、印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地,是一种常见的热带淡水硬骨鱼。属辐鳍鱼纲( Actinopterygii)鲤科( Cyprinidae)。斑马鱼身体细长,呈纺锤形,成鱼体长约4-6cm,因全身布满深蓝色条纹似斑马样而得名。斑马鱼雌雄鉴别容易,雄鱼体型细长,颜色偏黄,条纹较为显著,纵纹为柠檬色;雌鱼身体肥胖,颜色较淡,纵纹呈蓝色加银灰色,在性成熟后腹部肥大。雌鱼每次可产卵300多枚,鱼卵易收集,其胚胎透明,繁殖能力强且生长发育速度快,对饲养要求低,可高密度饲养,与其他实验动物相比有很大优势,是一种非常受欢迎的实验动物模型。近三十年来,已有约20个斑马鱼品系的基因数据库资料,全球已有超过1500个斑马鱼实验室,而我国也有超过250个实验室利用斑马鱼开展相关研究。英国桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)于2013年完成了斑马鱼的参考基因组,研究人员在此基础上比较了斑马鱼与人类基因组的异同,并进行了系统性的全基因组分析.在此综合近几十年的研究,在胚胎及遗传发育学、基因组学、药物筛选、疾病模型的建立等方向探讨斑马鱼的研究成果及进展。 1.胚胎及遗传生物学方向 斑马鱼的发育分为6个阶段:卵裂期,囊胚期,原肠胚期、分裂期、成形期

荧光素酶常见问题与解答

1) 什么是双荧光素酶报告基因测试系统(DLR) DLR 测试系统灵敏,方便,在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因,萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶 (Renilla reniformis) ,DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2) 有哪些海肾荧光素酶载体 海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子,可用 T7RNA 聚合物在体外合成海肾荧光素酶,有4个不同的载体: pRL-SV40 载体 pRL-SV40 载体含 SV40 增强子及早期启动子区域,可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 pRL-SV40 载体还含有 SV40 的复制起始区,可在表达 SV40 大 T 抗原的细胞中,如 COS-1 , COS-7 细胞中,瞬时及附加体似地复制。 pRL-CMV 载体 pRL-CMV 载体含有 CMV 极早增强子及启动子,可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 pRL-TK 载体 pRL-TK 载体含 HSV 胞嘧啶激酶启动子区域,在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。pRL-null 载体 pRL-null 载体缺真核启动子及增强子,在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3) 用双报告基因有何优点 一般地说,实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达,而另一个报告基因作为内对照,以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化,这些变化减弱实验准确度,其中包括培养细胞的数目及活力的差异,细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中,将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因,海肾荧光素酶作为对照报告基因。

实验绿色荧光蛋白

生物技术实验报告 姓名:张龙龙 学号:2011506066 班级:11级生技02班

前言:绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水 母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成,长2.6kb;GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr,其蛋白性质十分稳定,能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420 nm,宽240 nm,由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二.实验原理 基因工程一般包括四个步骤:一是取得符合人们要求的DNA片段,这种DNA片段被称为“目的基因”;二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA;三是把重组DNA引入某种细胞;四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 本实验根据绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列设计一对引物,用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头,通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,使GFP基因表达 三.实验材料及仪器 1、实验材料:含有GFP的质粒;DNA Marker;DH5α;BL21; 2、仪器:恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。 四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定: 1)实验试剂:LB培养基;溶液Ⅰ;Tris-HCl(pH=8);溶液Ⅱ;溶液Ⅲ; 酚/氯仿抽提液;无水乙醇;电泳缓冲液;加样缓冲液;GoldView核酸 DNA 染色剂;1%的琼脂糖凝胶;XhoⅠ(10U/μl);NdeⅠ(10U/μl);T 4 lisase。 2)实验步骤: 质粒的提取与鉴定

斑马鱼动物模型的应用介绍

斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼(Danio rerio)属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼,原产于南亚,是一种常见的热带观赏鱼,因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小,易于饲养,成体长4-5cm,雄鱼体修长,雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体,可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速,在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂,之后大约每隔15min分裂一次,24h后主要器官原基形成,相当于28d的人类胚胎,幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10(光照:黑暗)产卵时间,成熟鱼每周可产卵一次,一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精,体外发育,胚体透明,易于观察。受精卵直径约1mm,易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展,已有约20个斑马鱼品系,斑马鱼基因数据库-ZFIN (http://zfin/org)里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen(Tu)品系、WIK 品系,斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系,由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因,用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外,还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种:已基亚硝脲(ENU)化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂,在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换,诱导产生的突变率为0.1%-0.2%,涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排,产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体,用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵,整合到基因组中,干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍,但由于突变涉及多个基因,突变的表型是受若干基因调控的结果,不利于基因功能的分析,因此,ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死

内参基因βActin简介

内参基因βA c t i n简介标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

内参基因β-Actin简介 日期:2012-05-03来源:未知作者:周慕云点击:次 β-Actin 内参即是内部参照,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。 β-Actin简介 Actin即“肌动蛋白”,是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守,以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,包括α-skeletal muscle actin,α-cardiac muscle actin,α-smooth muscle actin,和γ-smooth muscle actin; 其余两种广泛分布于各种组织中,包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%,但在N-terminal同源性仅50%-60%,因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分,也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能,分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参,β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)等。因此β-Actin

绿色荧光蛋白GFP

绿色荧光蛋白GFP综述 生命科学学院 2010级李积锋 1241410007 【摘要】绿色荧光蛋白(GFP) 是一种最先来源于水母的蛋白质,现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时小峰可高效发射清晰可见的绿光。它已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记。在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景。 【关键词】水母绿色荧光蛋白生色团变种 1绿色荧光蛋白简介 绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,当受到紫外或蓝光激发时,发射绿色荧光。其独特之处在于:它产生荧光无需底物或辅因子,发色团是其蛋白质一级序列固有的来源于水母的氨基酸残基组成。 水母的绿色荧光蛋白很稳定,无种属限制,已在多种动植物细胞中表达成功并产生荧光。GFP的荧光受外界的影响较小,另外GFP的检测十分方便,而对细胞的伤害极小。由于这些优点,GFP已经成为检测体内基因表达及细胞内蛋白质原位定位的极为重要的报告分子。 2绿色荧光蛋白的表达和成熟 GFP的表达水平受多种因素的影响。在植物细胞中表达GFP时,改变一些原GFP 基因的密码子为该植物使用的偏爱密码子,并消除潜在的剪接位点。目前适用于哺乳动物的表达系统不受影响。GFP还可以顺利的在无细胞的体外翻译系统中表达并自发折叠。 用一些小体积的氨基酸残基取代大体积残基可以提高GFP在高温下正确折叠的速度。这些突变位点分布于成熟蛋白质三维结构的各个部位,几乎不能提供如

何帮助GFP折叠和成熟的线索。另外,分子伴侣的存在也有助于GFP的折叠,反过来,这个发现也使GFP成为检测分子伴侣功能的一个好底物,因为GFP可以提供一个连续的、无破坏性的检测蛋白折叠成功的分析方法。 3绿色荧光蛋白的应用 3.1报告基因和细胞标记 GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与;无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中,都能有效地监测基因转移的效率。但在这方面的应用中,最大的缺点就是没有放大作用,它不能象酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大所以一般都需强启动子以驱动GFP基因在细胞内足量的表达也可用亚细胞分辨率的显微成像系统检测基因产物,靶入的基因被限制于一个细胞器内,GFP的浓度则相对提高了许多倍。 3.2融合标记 应用得最多和最成功的是GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位 和最后归宿既有荧光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳GFP可融合于宿主蛋白的C端或N端,也可插入其内部迄今为止,GFP已成功地靶入了大部分细胞器中,如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。 3.3 其它 GFP分子生色团的坚固外层保护荧光不被熄灭,但同时也降低了GFP分子的荧光对环境的敏感性通过随机重组和基因定向突变得到了多种对环境敏感的GFP,它们可用作环境指示剂如:对PH敏感GFP的可以测定细胞器内的PH值;通过基因工程,可GFP在中插入磷酸化位点以便用磷酸化控制GFP的荧光。另外,最近报道的利用靶入了水母GFP基因的丝蛋白昆虫病毒,感染蚕的幼虫,用改造的基因取代了蚕的正常基因,当蚕吐丝时这种丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。 4应用特点 GFP这一新型报告基因,在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐,其原因就在于它具有以下优点:

荧光素酶报告基因实验自我总结

荧光素酶报告基因实验自我总结 实验原理: 目前由两个主要的应用方向: 第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用,转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合,这些特异性的序列被称为顺式因子,转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验(luciferase Assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。 第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控,通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列,并设计合适的microRNA质粒或干预片段,同时构建靶基因的报告基因质粒,二者同时转染细胞,这是确定microRNA是否能影响(上调或下调)靶基因的首选研究方法。 实验流程: 1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒,如pGL3-basic(转录因子与靶基因)或pMIR-REPORT Luciferase质粒(微小RNA与靶基因)2)将要检测的转录因子表达质粒(或microRNA质粒)与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子(或microRNA)能够激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。 3)加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光素,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 实验目的:研究转录因子和MicRNA对于靶基因调控的首先方法 实验步骤: (1)用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。 (2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。 (3)筛选阳性克隆,测序,扩增克隆并提纯质粒备用。 (4)扩增转录因子质粒(或microRNA质粒),提纯备用,同时准备相应的空载质粒对照。(5)培养293细胞(或其它目的细胞),并接种于12孔板中,生长24小时(80%汇合度)。(6)将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。 (7)用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。 (8)加入酶作用底物,于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。 (9)计算相对荧光强度,并与空载对照比较,判断影响因子是否有效的作用于靶基因。

荧光蛋白基因试验

荧光蛋白基因实验 胡建江,王安博 实验一质粒DNA的提取 目的及意义:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法; 2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 实验原理:溶液I(50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA-Na、25mmol/L pH=8.0Tris-HCl)可以分散细胞,螯合金属离子可以使酶失活,防止DNA的降解;溶液II(0.4mol/L NaOH与2%SDS临用前1:1配用)可以使细胞在溶液中降解时,蛋白质与染色体DNA发生变性;溶液III (5mol/L醋酸钾30ml、5mol/L冰醋酸 5.75ml、5mol/L双蒸水14.25ml)使得酸性条件下质粒DNA复性,留在上清液,而DNA和蛋白质—SDS复合物等发生沉淀。 实验用品: 1.仪器(恒温摇床、高压灭菌锅、超净工作台、10uL+100uL+1000uL 微量移液器各一支、台式高速离心机、制冰机、混合漩涡器。) 2.材料(事先培养好的含目的基因质粒的菌液、1.5ml塑料离心管、EP管架、微量取液器及取液器吸头、三角瓶、量筒、试剂瓶等) 3.试剂(LB培养液:蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、pH=7.5;溶液I/II/III;50mg/ml卡那霉素贮存液工作浓度50ug/ml;100mg/ml 氨苄青霉素贮存液工作浓度100ug/ml;抽提液:饱和酚:氯仿:异戊醇+25:24:1 作用:氯仿可使蛋白质变性,有助于液相与有机相的

分离,饱和酚密度大,可使DNA在上清液中,异戊醇防止抽提液气泡;无水乙醇作用:除去DNA水化层,使DNA沉淀;70%乙醇作用:纯化质粒DNA;含RNA酶的ddH2O 作用:溶解DNA) 实验步骤: 将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中(相应浓度抗生素), 37摄氏度培养过夜 取培养菌液1.5mL置EP管中,10000rpm,2min,弃上清液后,此步 骤重复一次,弃上清液 加入100uL溶液I,漩涡器上充分混匀,在室温下放置10min 加入200uL新配置的溶液II,轻轻翻转2-3次,使之混匀,冰上放置 5min 加入150uL冰冷的溶液III,加盖后温和颠倒数次使混匀,产生白色 絮状物,冰上放置15min 10000rpm 5min,取上清液于另一干净的离心管中 向上清液中加入等体积(约400uL)的抽提液,振荡混匀,10000rpm 10min,将上清液转移至新的离心管中

常见内参基因

β-A c t i n Actin即“肌动蛋白”,是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、 β-Actin 移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守,以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,包括α-skeletalmuscleactin,α-cardiacmuscleactin,α-smoothmuscleactin,和 γ-smoothmuscleactin;其余两种广泛分布于各种组织中,包括β-actin(β-non-muscle)和 γ-non-muscleactin。不同的actin之间同源性大于90%,但在N-terminal同源性仅50%-60%,因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分,也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能,分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参,β-Actin抗体是WesternBlot很好的内参指数。内参即是内部参照(InternalControl),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)等。因此β-Actin抗体、β-Tubulin抗体以及GAPDH抗体成为最常见的三个动物细胞内参抗体。β-Actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富。Beta-actin 由375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右。 β-actin的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照,也常被用于免疫染色观察细胞的微丝结构。在用作Western的参照时,Actin抗体和Tubulin抗体的主要不同之处在于两者所识别蛋白的分子量不同,这样可以选择合适的参照在同一块胶同一张膜上实现同时检测目标蛋白和参照蛋白。 GAPDH GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶,由4个30-40kDa的亚基组成,分子量146kDa。该酶基因为管家(housekeeping)基因,几乎在所有组织中都高水平表达,在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的,且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定,故被广泛用作抽提totalRNA,poly(A)+RNA,Westernblot等实验操作的标准化的内参。 GAPDH结构图

绿色荧光蛋白的应用及发展前景汇总

学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学 号014010110349 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月

目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)

绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用

绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用 杨军廷 201141804054 华大基因 摘要来源于水母 (AequoreaVictoria)的绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP) ,现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。其内源性荧光基团在受到紫外或蓝光激发时可发 现清晰可见的绿光。由于检测方便 ,对生物体基本没有毒性 ,在很多领域已有取代LacZ ,荧光素酶等传统标记方法的趋势 ,在制作转基因动物过程中更是如此。本文综述了GFP在标记目的基因、筛选阳性胚胎等方面的应 用 关键词绿色荧光蛋白;转基因 在研究基因的表达或蛋白质的定位与时序变化时常用荧光物质或报告基因作为标记。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上!此方法难以控制化学剂量和染料附着部位!若该标记蛋白用于活细胞内检测!则难以通过细胞膜。因此,该方法已基本淘汰现在常用的报告基因如荧光素酶(LUX)基因和β-葡萄糖苷酶(GUS)基因也不尽人意。LUX所检测到的荧光产生部位不一定反映荧光素酶基因的特异表达部位;GUS则需要昂贵的反应底物且由于其它因素的干扰。反应颜色的深浅有时不能说明GUS活性的高低或有无.源于水母等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)可吸收蓝光而后发出绿光是生物发光现象中能量传递的受体之一。它克服了上述缺陷,具有灵敏度高、操作简便,不需要添加任何底物或辅助因子,不使用同位素,也不需要测定酶的活性等优点。已成为目前最优良的标记基因之一。 1GFP的生化性质及其发光原理 1.1 GFP的发光特性 GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。尽管450~490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测. 1.2GFP的性质特点 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450~490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 1.3GFP的发光原理

荧光蛋白(整理)

荧光 一、定义 荧光(fluorescence )又作“萤光”,是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光(通常波长在可见光波段);而且一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时,光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道,即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的,所以会恢复基态,当电子由第一激发单线态恢复到基态时,能量会以光的形式释放,所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下,发光波长比吸收波长较长,能量更低。但是,当吸收强度较大时,可能发生双光子吸收现象,导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时,既是共 荧光强度:荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q:量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领,是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定,与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP )

在光谱的绿光区(500nm-525nm)已经发现了多种荧光蛋白,而且来源广泛,包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应,即使最好的荧光蛋白与EGFP相比,也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP 衍生的Emerald(祖母绿),它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变,另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效,但含有快速光漂白成分,可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白: (1)来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光,其发光过程需要冷光蛋白质 Aequorin 的帮助,而且,这个冷光蛋白质可与钙离子(Ca2+)相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小,仅为27~30kDa,而编码GFP的基因序列也很短,为2.6kb 。 (2)性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67 位残基(Ser65-Tyr66-Gly67 )可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰,在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰,在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定,无光漂白现象(Photobleaching ),用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 (3)野生型 野生型GFP(wild type GFP, wtGFP )从一开始就引起了人们极大的兴趣,而且被用作新型的简单报告基因及体内标记,但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如,研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP,并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在,人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。 这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白,它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变,热稳定性和荧光强度得到了提高,GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。 (4)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)现在,应用最为广泛的是红移变体增强型GFP (EGFP)。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动,大约为490nm,这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变,当被蓝光激发时,它发出的荧光要比wtGFP亮30-40 倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长,所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。 (5)不稳定增强型绿色荧光蛋白(dEGFP) 为克服这一问题,人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白(dEGFP)。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase, ODC)基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列,这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然,目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用,但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。 (6)增强型黄色荧光蛋白(EYFP)另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白(EYFP),该变体有四个氨基酸突变。在527nm时,EYFP的发射光从绿色变为黄绿色。EYFP荧光的亮度水平与EGFP相当。EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感,使它的应用受到限制。在EYFP 基础上改进的突变体mCitrine[21] 和mVenus[22]是目前应用

内参基因1

内参基因 内参即是内部参照,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测基因的表达 水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差, 保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样 半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改 变的基因作内参。 在进行基因研究的过程中,实时反转录 PCR也和传统的mRNA定量方法如 Northern b lot技术等一样, 要求使用参照基因以校正转录效率和 cDNA用量, 弥补制备过程中样本 纯度和浓度的差别, 使不同样本之间目的基因的比较成为可能,以期获得真实可靠的结果。大多数分析方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。最普通的内参照是内 源性参照基因,也叫管家基因。 管家基因:又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达,其产物 是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解 酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的 基因。 管家基因表达水平受环境因素影响较小,而是在个体各个生长阶段的大多数、 或几乎全部组织中持续表达,或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响,而不受其他机制调节。管家基因高度保守并且在大多数 情况下持续表达,因此管家基因常被用于分子技术--多位点基因分析。 内参基因通常是各种看家基因,在细胞内组成稳定性表达,有助于保持细胞的 功能。理想的内参基因应该满足以下条件:1, 不存在假基因(Pseudogene),以 避免基因 DNA的扩增; 2,高度或中度表达,排除低表达; 3,稳定表达于不同类型 的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞),而且其表达量是近似的,无显着性差别; 4,表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关;5, 其稳定的表达水平与目标基因 相似;6, 不受任何内源性或外源性因素的影响,如不受任何实验处理措施的影响. 近年来的研究发现:这些常用内参基因均存在缺陷,在不同类型的细胞和组织 细胞增殖和器官发育的不同阶段体外培养各种实验条件等情况下它们的表达量通 常变异较大。正确的选择内参基因, 很大程度上依赖所研究的细胞或组织, 不同的试验 需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而,合适内参基因的选择, 需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。理想的内参基因应在 各种试验条件下,各种类型的组织和细胞中均恒定表达,而且其表达量是近似的,无显着 性差别。另外要求不存在假基因以避免基因组的扩增。

斑马鱼常见疾病

斑马鱼常见疾病 烂鳍病/病尾病(嗜水气单胞菌) 多由饲水不良,水质长期浑浊,受新水刺激过多,或鱼儿互相撕咬导致细菌感染。感染的迹象: 最初,鳍的边缘出现轻微的不透明的外观。然后膜一片片地脱落,暴露出鳍刺,鳍刺开始依次裂开。当裂缝到达身体时,受侵害的鱼通常都会死亡。感染详述: 引起烂鳍病的细菌可能经常出现,特别是嗜水气单胞菌,荧光假单胞菌和鳗弧菌,它们只在恶劣的环境里侵害不健康的鱼。这些细菌能引起一系列的症状,如斑点、区域发炎和溃疡。细菌传染引起的损伤使受侵害的鱼容易受到来自其他病原体如真菌、病毒和寄生虫的侵害。 推荐的治疗方法: A,在100千克的水中放呋喃西林粉0.2克进行浸洗消毒,多次用药后可缓解病情。 B,在100千克水中放痢特灵3~5片,浸洗病鱼30分钟。 C,在100千克水中放土霉素5~8片浸洗消毒,可预防感染此病。 D,用低浓度的高锰酸钾溶液浸洗消毒。 E,用庆大霉素浸洗,在100厘米X50厘米X35厘米的水族箱中放2支。 对于如此多的疾病,除非环境条件很满意,任何化学药物治疗都不是完全有效的。有几种以苯氧基乙醇、聚-氯-苯氧基乙醇或呋喃那斯为基础的专用处理剂,假如治疗不被耽误的话,它们可能有效。杀菌的化学药物如氯化苯甲烃胺(新洁尔灭),也能使用。对于冷水鱼类的治疗,水温至少应该升高到16度。 对付烂尾如果一时找不到鱼药,可到药店去买泻痢停(肤腩睉酮),找一小缸药浴,40CM缸加8片(慢慢搓溶于水),同时充气。若是热带鱼将水温升到30摄氏度,隔天补加一半药片,效果极佳。一般一周内会康复。 烂鳃病 患烂鳃病多由寄生虫寄生或细菌感染引起,故有寄生虫烂鳃病和细菌性烂鳃病两种。 (1)寄生虫烂鳃病:其病原体是指环虫或车轮虫,它们交互感染,鳃部明显浮肿,鳃盖张开困难,严重时,鳃丝局部溃烂,以至鳃软骨外露,鱼体呼吸困难,最终死亡。防治方法:可选用晶体敌百虫0.5-0.8克,放在10千克水中,浸洗病鱼10-15分钟。也可选用晶体敌百虫0.2克、硫酸铜0.2克、亚硫酸铁0.2克,混合放入10千克水中,浸洗病鱼10-15分钟。或选用晶体敌百虫0.2--0.3克溶于水中,泼洒在1吨饲水中,每周用药1-2次,可有效杀死水中的寄生虫。(2)细菌性烂鳃:其病原体是水霉菌,病鱼鳃丝严重失血,鳃丝发白,严重时有絮状菌丝粘附,死亡率极高。防治方法:可选用食盐50克、小苏打50克,混合放在10千克水中,浸洗病鱼15-20分钟。也可选用0.7克孔雀石绿,放在100克水中,浸洗病鱼15-30分钟。 (3)粘孢子虫性烂鳃:其病原体是粘孢子虫,鳃丝会出现许多肉眼可见的灰白色点状或胞囊,由小变大破坏鱼鳃,当胞囊一旦破裂,无数个孢子虫进入饲水,重新侵入健康鱼的鳃部,鳃丝失血导致大批死亡。粘孢子虫引起的烂鳃病比较少

荧光素酶及其报告基因的应用和检测

荧光素酶及其报告基因的应用和检测 一生物发光 生物发光(bioluminescence)是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收,而是一种特殊类型的化学发光,化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是:由细胞合成的化学物质,在一种特殊酶的作用下,使化学能转化为光能。 与荧光的区别在于 荧光:荧光检测需要激发光源,发射光的能量来源于激发光,荧光反应为瞬时反应。 发光:生物发光、化学发光,发光反应无需激发光源,发射光的能量来源于化学反应,发光有一定的持续时间。 二荧光素酶 荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。 自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前,以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白,是一个61kDa的单体酶,无需表达后修饰,直接具有完全酶活。 发光机制 生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550~ 580 nm 的荧光,其化学反应式如下。 这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。 三荧光素酶报告基因 报告基因(report gene)是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因,可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达,

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验,绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定,对多数宿主的生理无影响,是常用的报道基因,便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后,把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中,从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词:绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤,以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体

三、材料与方法: 1.实验材料: 质粒:pEGFP-N1 T载体:pUCm-T 菌种:DH5(克隆菌) PCR引物: F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂: 即用型蓝白T载体(pMD18-T vector cloning kit) 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶:EcoR I(Fermentas) Axygen质粒提取试剂盒 抗生素:氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器: 超净工作台,恒温摇床,高压灭菌锅,恒温培养箱,台式高速离心机,大容量冷冻离心机,PCR仪,紫外分光光度计,水平电泳槽,垂直电泳槽,电泳仪,凝胶成像系统,制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒

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