收稿日期:2009209210;修回日期:2009209227
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(30532690);国家自然科学基金青年项目(30700766)
作者简介:路丽明(19762),女,免疫学博士,副研究员,主要从事免疫调节研究。
通讯作者:周光炎(E 2mail :my @https://www.doczj.com/doc/ee11266710.html, )
应用RNA 干扰阻抑小鼠L929细胞MHC II 类基因表达及功能
的研究
路丽明,丁庆,杨能,周晓荣,周芸,周光炎
(上海交通大学医学院上海市免疫学研究所,上海200025)
摘要:为了探讨RNA 干扰技术对小鼠CIITA (II 类反式激活因子)以及M HC II 类基因表达和功能的影响。我们首先设计并合成4条小干扰RNA (small 2interfering RNA ,siRNA )(siRNA 21、siRNA 22、siRNA 23和siRNA 24)序列,在阳离子脂质体的介导下转染小鼠L929细胞。48h 后,用半定量R T 2PCR 和定量PCR 方法检测CIITA mRNA 的变化;流式细胞仪检测
I 2A b 分子表达的变化。接着构建了CIITA 特异的短发夹状干扰RNA (short hairpin RNA ,shRNA )表达载体,通过在靶细胞
内转录形成具有特异干扰作用的shRNA ,高效、特异的阻断CIITA 基因的表达,形成II 类基因功能缺陷或使其表达降低。进一步混合淋巴细胞反应观察同种异基因CD4+T 细胞对稳定转入RAN 干扰载体的L929细胞的免疫应答强度,结果证实该L929细胞对不同受者CD4+T 细胞的刺激能力分别下降73.90%和76.34%。以上结果为减低同种异体/异种器官细胞性排斥提供了新的思路和手段。
关键词:M HC II 类转录激活因子;siRNA ;I 2A ;M HC II 类基因中图分类号:R392.12
文献标识码:A
文章编号:100122478(2009)0620464206
M HC II 类分子在抗原处理提呈、调控CD4T 细胞激活及特异性应答中发挥重要的作用,II 类分子主要表达在专职抗原提呈细胞,如树突状细胞(DC )、巨噬细胞和B 淋巴细胞。然而,多种刺激
特别是干扰素(IFN 2
γ)可诱导T 淋巴细胞和表皮细胞表达该分子[1]。
现已明确,机体主要通过M HC II 类转录激活因子(M HC class II t ransactivator ,CIITA )来调节M HC II 类基因的表达水平,进而控制T 细胞介导
的免疫应答。即CIITA 是调控M HC II 类基因转
录激活的关键蛋白[2,3]。CIITA 基因敲除小鼠的同种异体心脏移植存活时间延长,我们以前的研究中发现[4,5],通过对小鼠CIITA 基因进行改造,并使得M HC II 类分子的表达明显受阻,最终可抑制受者T 细胞对供者细胞的免疫应答,从而降低同种基因免疫排斥。
在成功构建小鼠CIITA 突变体并明显抑制I 2A 分子表达的基础上,我们基于RNAi 能高效、特异
性抑制细胞内源基因表达的原理[6],探索利用RNA 干扰技术阻抑CIITA 基因的活性进而下调M HC II 类分子的表达,为防治同种异基因免疫排斥提供新的思路和途径。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 干扰专用载体p GCsi 2H1/Neo/GFP/shRNAi system 购自Calbiochem 公司。内切
酶Bgl II ,Hind III ,Eco R I 购自Promega 公司。质粒抽提试剂盒、逆转录试剂盒、限制性内切酶购自Promega 公司,Light Cycler RNA Master S Y BR Green I 试剂盒、T4连接酶购自Roche 公司,胶回收试剂盒购自Q IA GEN 公司,Neromycin 购自Calbiochem 公司。DM EM ,胎牛血清,22M E 和Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒均购自Iin 2
vitrogen 公司;重组鼠IFN 2
γ购自R.D 公司;抗小鼠I 2A b 单抗购自BD 公司;L929细胞为本室保
存,引物由上海生工公司合成。1.2 siRNA 的设计、合成与定量 根据GenBank 小鼠H 22分子反式激活因子CIITA 基因(基因编号NM00757)已知序列,按Elbashir 等的siRNA 设计原则:从转录本(mRNA )的AU G 起始密码开始,寻找“AA ”二连序列,并以其3’端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA 靶位点。将该序列在
GenBank用NCB I BLASTN软件进行同源序列搜索,排除那些和其他编码序列同源的序列。我们选取了4条含19个碱基的siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4);并在实验过程中根据基因设计随机阴性对照(siRNANon)。利用Silencer siRNAConstruction K it按照试剂盒操作指南体外转录法合成siRNA。siRNA序列如下: siRNA1(正义链)5’GGU CU U ACC U GC C GG A GU Udt dt3’,(反义链)5’AAC UCC GGC A GG UAA GAC Cdtdt3’;siRNA2(正义链)5’GGA GGC CUA U GC CAA CAU Udt dt3’,(反义链) 5’AAU GU U GGC AUA GGC CUC Cdtdt3; siRNA3(正义链)5’GCA A GG ACC UCU UCA UA G Adt dt3’,(反义链)5’UCU AU G AA G A GG UCC UU G Cdtdt3;siRNA4(正义链)5’GCG CU G ACC UCC C GU GUA Adt dt3’,(反义链)5’UUA CAC GGG A GG UCA GC G Cdt dt3’siRNANno(正义链)5’U UC UCC GAA C GU GUC AC G Udtdt3’,(反义链)5’ACG U GA CAC GU U C GG A GA Adt dt3’。其19个碱基的寡核苷酸模板序列由Silencer siRNA Const ruction Kit Template Design Tool软件设计,由Invit rogen公司合成。shRNA的设计。
1.3 L929细胞株的培养 台盼蓝拒染法测定活细胞数为99%±3%,调节细胞浓度为1×106/ml,加入DM EM完全培养基(含10%胎牛血清),在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。
1.4 脂质体转染 转染实验共设7组。实验组4组,分别为siRNA1组(转染时加入siRNA1与脂质体复合物)、siRNA2组(转染时加入siRNA2与脂质体复合物)、siRNA3组(转染时加入siRNA3与脂质体复合物)、siRNA4组(转染时加入siR2 NA4与脂质体复合物);对照组3组,分别为对照组(空白对照组,转染时不加siRNA或脂质体)、siRNAnon组(转染时加入随机阴性对照siR2 NAno n与脂质体复合物)。转染前2h,将培养L929细胞重悬于无血清DM EM培养基,调节细胞浓度为1×106/ml,铺于6孔培养板,每孔细胞数为1×106,体积为2ml。采用Lipofectamine 2000转染试剂盒按照试剂盒操作指南进行细胞转染,每孔加入siRNA60p mol,脂质体10μl。转染4h后洗涤细胞并重悬于2ml DM EM完全培养基,在37℃、5%CO2培养箱中继续培养。分别于
转染后48h,收集细胞进行检测。
1.5 p GCsi2H1/Neo/GFP/shRNA2CIIT A干扰表达载体构建
1.5.1 黏合反应 合成编码发夹状结构的正义和反义链DNA Oligo片断,将其溶解至无核酸酶的无菌水中至3mg/ml,取正义和反义链DNA Oligo 各1μl(3mg/ml),加入48μl黏合缓冲液(Anneal Buffer:100mmol/L NaCl和50mmol/L H EPES (p H7.4)。放入PCR仪,94℃4min,85℃4 min,80℃4min,75℃4min,70℃10min,37℃20min,10℃60min,直接用于连接反应。1.5.2 载体线性化 所用载体为环状,需经Bgl II、Hind III连续双酶切。取载体p GCsi2H1/Neo/ GFP1μl(0.5mg/ml),先经Hind III37℃酶切1～2h,再加入Bgl II继续酶切2h,然后65℃或80℃灭活20min,经琼脂糖电泳验证。
1.5.3 连接反应 将线性化的载体回收,取1μl 载体,2μl黏合的DNA Oligos,T4DNA连接酶及缓冲液各1μl,无核酶蒸馏水5μl。10μl体系室温或4℃过夜。
1.5.4 转化 以连接产物转化 E.coli D H5α感受态,在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体,挑选阳性克隆扩增,提取质粒。
1.5.5 酶切和PCR鉴定 质粒经Hind III酶切和PCR鉴定后收集酶切鉴定正确的重组质粒送测序。
1.6 流式细胞仪(FCM)检测I2A表达的变化 于转染后48h,每组收集1×106个细胞,无菌PBS 洗涤2遍,重悬于100μl无血清的DM EM培养基,加入PE标记的I2A单克隆抗体,4℃避光孵育30min,缓冲液洗涤2次,重悬于0.2ml缓冲液,经FACS流式细胞仪检测,采用Cellquest软件分析L929细胞表面分子I2A的表达率。以PE 标记的Ig G2a单抗作为阴性对照。
1.7 细胞转染和筛选 将5×105个L929细胞接种于24孔板,待生长至80%左右汇片,分别取空载体和重组载体p GC12H1/Neo/GFP/shRNA2 CIITA各1μg,按说明用脂质体LipofectAM I2 N ETM2000进行转染,48h后加入G4181000μg/ml,进行稳定筛选约3周,挑取生长良好的抗性克隆进一步扩增,其中转染重组载体p GC12H1/ Neo/GFP/shRNA2CIITA的细胞为实验细胞,简称为shRNA2CIITA,稳定筛选转染空载体p GC12 H1/Neo/GFP的L929细胞为对照细胞,同时观察
绿色荧光,检测转染效率.。
1.8 半定量RT2PCR法测定CIIT A/I2A基因mRNA 水平的变化 针对四种siRNA靶点设计不同引物,CIITA1:Sense p rimer:5’T GG CCC T TC T GG GTC T TA3’Anti2sense p rimer:5’GA G GC T TCT GTC C T G CT T CTA3’扩增产物长度413bp;CIITA2:Sense primer:5’T GG CCC T TC T GG GTC T TA3’Anti2sense primer:5’TCC TC T GC T CCA A T G T GC T3’扩增产物长度363bp;CIITA3:Sense primer:5’GGA C TA CA G AC G T TA CT G C3’Anti2sense primer:5’AA T GT G C TC TA T GAA GA G G3’扩增产物长度408bp;I2A基因Sense p rimer:5’CT G C GG A GG T GA A GA C G3’Anti2sense primer:5’AA G GGA T GA A GG T GA GA T AA G ACA3’扩增产物长度488bp。于转染后48h,每组收集1×106个细胞,按照试剂盒操作抽提细胞总RNA、反转录,PCR扩增目的基因片段。反应体系为50μl。反应条件为94℃5min;94℃30s, 58℃30s,72℃60s,共27个循环。以β2actin为内参照,最终的PCR产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.9 Real2time PCR法测定CIIT A/I2A基因mRNA 水平的变化 提取稳定筛选的对照细胞和shRNA2 CIITA细胞总RNA,参照LightCycler RNA Master S Y BR Green I K it说明书,进行一步法Real2time PCR测定,利用CIITA特异引物,扩增目的片断,应用Light Cycler分析软件分析目的基因表达。在定量PCR检测中,一个基因相对于另一个基因的相对浓度或拷贝数的不同反映在其达到相同荧光强度经历的循环数的差值上,即ΔCT (C T靶基因2CT管家基因),目的基因相对于管家基因的相对表达量为22ΔCT,而实验前后目的基因相对表达量的差异表达为22ΔΔCT。
1.10 统计学处理 用SPSS软件包处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,三组以上的组间差异采用单因素方差分析(ANOVA),两组间差异采用t检验,P<0.05为统计学差异有显著性。
2 结果
2.1 FACS检测IFN2γ刺激前后L929细胞I2A表达 台盼蓝拒染法测定L929活细胞数为99%±3%,在细胞中加入IFN2γ刺激3d后,FACS检测细胞I2A分子(I2A b)表达,结果表明,刺激后I2 A分子从14.66%升高到47.73%(图1)
。
图1 FACS检测IFN2γ刺激前后L929细胞I2A表达
2.2 半定量RT2PCR检测L929细胞CIIT AmRNA 表达 半定量R T2PCR检测结果显示:siRNA21、siRNA22、siRNA23、siRNA24、siRNA2non同时转染经IFN2γ刺激的L929细胞48h后,抽提细胞总RNA,R T2PCR结果发现细胞内CIITA mRNA 表达有不同程度降低。转染siRNA23的细胞中目的基因扩增条带明显变弱,转染siRNA21、siRNA22的细胞CIIT A mRNA干扰结果次之,siRNA24、siRNA2non基本无干扰效果。如图2
所示。
图2 半定量RT2PCR检测转染siR N A L929细胞CIIT A mR N A表达M:50bp marker;1:siRnA21;2:siRNA22;3:siRNA23;
4:siRNA24;5:siRNA2non
2.3 Real2time PCR检测L929细胞CIIT A mRNA 表达水平 采用相对定量方法检测siRNA干扰后细胞中CIITA基因表达变化。结果表明siRNA2 1、siRNA22、siRNA23都可使CIITA mRNA水平表达下降,其中siRNA23干扰效果最明显, siRNA32CIITA细胞中CIITA基因表达量为对照细胞的11.9%,CIITA mRNA水平阻断约89%。siRNA24、siRNA2non没有干扰效果(图3)
2.4 p GC12H1/Neo/GFP2shRNA2CIIT A干扰表达载体的构建和鉴定 p GC12H1/Neo/GFP经Bam H I 和Hind III双酶切线形化后,体外合成的DNA Oligo与酶切的载体p GC12H1/Neo/GFP连接重组,挑选重组子,用PCR鉴定阳性克隆,发现阳
性克隆比阴性克隆条带大约多60bp ,并选取重组克隆进行DNA 测序,结果表明合成的DNA Oligo 序列(64bp 靶序列)插入位置正确,特异性shR 2NA 载体(p GC12H1/Neo/GFP 2shRNA 2CIITA )构建成功,结果未列出
。
图3 real 2time PCR 检测转染siR N A 后L929细胞CIIT A mR N A 表达
2.5 p GC12H1/Neo/GFP 2shRNA 2CIIT A 转染L929
细胞筛选出稳定株 转染p GC12H1/Neo/GFP 2shRNA 2CIITA 重组质粒L929细胞阳性组和对照组新霉素筛选第30天,在100倍倒置相差显微镜下观察结果分别见图4A 、4B
。
图4 显微镜下观察L929细胞稳定转染干扰载体后单个克隆
2.6 FACS 检测I 2A 分子表达 RNAi 载体/空载体转染L929细胞,筛选出稳定株后IFN 2γ刺激三天流式细胞仪结果显示,shRNA 2CIITA 细胞中表达I 2A 分子明显低于对照细胞,表明p GC12H1/Neo/GFP/shRNA 2CIITA 有效阻断CIITA 的表
达,I 2A 蛋白表达被阻断约82%;同时我们发现L929细胞表面的CD80分子的表达量也由47.15%
下降为32.09%,具体机制有待进一步研究证实(图5)。
2.7 干扰CIIT A 基因表达可阻断L929对同种异基
因CD4T 细胞的刺激 台盼蓝拒染实验结果表明,分离得到的小鼠CD4+T 细胞的活力良好,以此作为反应细胞;以经过照射的CIITA 基因被有效干扰的L929和对照细胞作刺激细胞,以ML C 中T 细胞增殖为指标进行功能评估小鼠同种异基因反应强度,自动细胞收集仪收集各种混合培养体
系中的小鼠细胞,液闪仪测定。结果发现:
CI I T A 基因被有效干扰阻断后的L929细胞对于
C3He 和BALB/c 两种不同小鼠品系来源CD4T
淋巴细胞增殖抑制分别达到73.90.%和76.34%(P <0.001)(图6)
。
3 讨论
RNA 干扰(RNA interference ,RNAi )是20
世纪90年代后期发现的一种以RNA 为基础的转录后基因沉默机制,是细胞用以自我保护自身基因
组不受病毒或转座子等其他种类的遗传物质损伤及控制基因表达的关键途径,当外源双链RNA (dsRNA )导入细胞后,生物体通过在体内产生21～23bp 的siRNA 来降解同源的mRNA 序列,从而抵御外来病原微生物的侵袭,维持遗传物质中转座子和可移动元件的稳定性[6～11]。
基于RNAi 高效、特异的抑制细胞内源基因的表达原理,本研究针对小鼠CIITA 基因设计合成了4条siRNA 序列,将4条RNAi 序列和对照分别转染L929细胞,并且通过real 2time PCR 和FACS 方法确认siRNA3能高效、特异地阻断小鼠L929细胞内90%以上CIITA 基因的转录。令人遗
憾的是,化学合成的siRNA虽然可以强烈抑制内源基因的表达,但作用是瞬时的,在我们的实验体系中siRNA3转染L929细胞后干扰作用仅能维持48h,因此后续功能实验受到很大的限制。新近研究显示,给哺乳细胞转染带有干扰基因的载体,经转录的发夹状shRNA不仅可以强烈的抑制内源基因的表达[12],也实现了RNAi长期稳定的抑制基因表达的目的。Gregory等[13]将可以在体内编码短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的基因装入质粒或病毒载体中,这些shRNA环状结构在体内可以被哺乳细胞中Dicer同源物处理为特异的siRNA,针对特异序列的同源mRNA,显示与体外合成siRNA相似的诱导RNAi的潜力。
因此,我们合成了与siRNA3一致的DNA序列,通过分子生物学方法将双链DNA序列克隆到p GC12H1/Neo/GFP/shRNA载体中,成为p GC12 H1/Neo/GFP/shRNA2CIITA载体,应用转染技术将干扰载体p GC12H1/Neo/GFP/shRNA2CIITA 和对照载体p GC12H1/Neo/GFP/shRNA转染L929细胞并经G418筛选4周后,得到单克隆细胞,经FACS分析发现,p GC12H1/Neo/GFP/ shRNA2CIITA可以长期抑制小鼠CIITA基因表达,L929细胞中I2A蛋白的表达量与对照细胞相比明显下降80%以上。同时发现该细胞表面CD80分子表达也降低,机制未明,相关研究正在进行中。
以上表明所构建的干扰载体能长时间明显干扰CIITA和I2A蛋白表达,由于CIITA在II分子的转录和表达关键性作用,而M HC II分子为淋巴细胞活化提供重要的第一信号,同时干扰后也降低了L929细胞(小鼠成纤维细胞株)表面共刺激分子的表达,我们也证实CIITA分子被有效干扰阻断后明显降低同种异体混合淋巴细胞反应的强度。在接下来的工作中,我们将会研究CIITA基因沉默后为何会导致细胞表面共刺激分子表达水平的降低,进一步探讨CIITA和第二信号分子的内在联系,为下一步其在移植免疫耐受防治应用中奠定基础。参考文献
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Study on the suppressive effect of RNA interference on the expression and f unctions of MH C class II transactivator(CIITA)and MH C class II genes of L929cells
L U Li2ming,L U Qing2ding,YAN G Neng,ZHOU Xiao2rong,ZHOU Yun,CHOU Kuang2yan(S han g2 hai I nstit ute of I m m unolog y,S han g hai J i aotong U ni versit y,M edical College,S han g hai200025,Chi2 na)
Abstract:To explore the alternative ways of suppression on the expression of I2A molecules by interfering of M HC class II transactivator(CIITA),4pieces of the small interfering RNA(siRNA),designated as siRNA21,siRNA22,siRNA23and siR2 NA24,were synthesized,characterized by cloning and sequencing,and then transfected into mouse L929cells by using lipo2 fectamine.The expression of CIITA mRNA was detected by semi2quantitative R T2PCR and quantitative PCR and that of I2Ab molecule was assayed by flow cytometry48hours after transfection.In addition,the short hairpin RNA(shRNA)plasmid p GCsi2H1/Neo/GFPshRNA32CIITA was constructed and also transfected into L929cells.The experimental results revealed that the L929cells transfected with the plasmid p GCsi2H1/Neo/GFPshRNA2CIITA only expressed I2A molecules at low level and the suppression could maintain for a long time.However,it failed to stimulate the proliferation of allogeneic CD4+T cells as demonstrated in the mixed lymphocyte reaction.These result may provide new idea and means to reduce the occurrence of al2 lograft rejection.
K ey w ords:M HC class II transactivator(CIITA);siRNA;I2A;M HC II