大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
小鼠间充质干细胞 一、细胞复苏和接种 1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。 2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。 4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。 5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。 6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。 7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。 8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。 9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。 10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 二、细胞换液和培养 注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。 1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。 2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。 3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。 三、消化细胞 1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，
用前按1：1混合。 将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。 2．具体操作如下： （1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。 （2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。 （3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。 （5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。 （6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。 （7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。 四、细胞传代 1．消化细胞（详见第三步）。 2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。 3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增 断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜
造血干细胞移植的护理常规 1、移植前的护理 1.1、供者准备选用HLA相合的同细胞作为最适合供者，移植前两周对供者进行循环采血。 1.2、无菌层流室的准备：室内一切物品需经清洁、消毒、灭菌处理，室内不同空间采样，行空气细菌检测合格后病人方可进入。 1.3、病人准备： 1.3.1、心理护理：对病人及家属详细讲解骨髓移植的方法，过程和相关知识，使其有充分的思想准备和经济准备，鼓励病人建立战胜疾病的信心。 1.3.2、进行全面的身体检查。 1.3.3、无菌护理：进行口、眼、耳、肠道的无菌准备，行药浴，更换无菌衣裤后进入无菌室。 1.3.4移植前一天行中心静脉插管。 1.3.5预处理：是指全身射线照射和使用免疫抑制剂。其目的是杀灭受者的免疫活性细胞，使之失去排斥外来细胞的能力，从而允许供者的骨髓植入而使造血功能重建，同时还可消灭体内的异常细胞起到一定的治疗作用。执行预处理方案时需密切观察病情变化，鼓励病人多饮水，每天入水量4000ml以上，防止尿酸性肾病的发生。 2、术中护理 2.1、正确采集骨髓或外周造血干细胞，并保证足够的细胞数。 2.2、骨髓液回输：在无菌层流室6小时输完，每袋骨髓液至最后5ml时应留在袋中弃去，以防脂肪颗粒进入血液循环引起肺栓塞，外周血干细胞不需要过滤。 2.3、病情观察：监测生命体征的变化，并注意观察病人有无胸闷，气促等情况，配合医生做好相应处理。 3、移植后护理 3.1、心理护理：护士应多与病人交谈，调节病人情绪，传递家属信息，以解除病人的恐惧心理和孤独感，充分调节病人的积极性。 3.2、并发症护理： 3.2.1、感染；是最常见的并发症，对骨髓移植病人必须实行全环境保护：a严格执行无菌环境的清洁及消毒隔离制度b严格落实病人的各项无菌护理c 加强扩胸运动，防止肺部感染ｄ严密观察生命体征及病情变化。
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5?2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
小鼠骨髓间充质干细胞 小鼠骨髓间充质干细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠骨髓间充质干细胞产品简介： 产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞 组织来源：正常小鼠骨髓 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠骨髓间充质干细胞简介： 小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。 本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
干细胞培养基的选择 研究背景： 小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。问题应该出现在培养基配方上。陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。 解决方案： 百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。 选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014） 实施步骤： 1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材； 2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液； 3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好； 4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。 结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。目前已经传至20代。对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。 案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。
D609诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经元 样细胞分化1 赵洪令，孙春辉，陈箐，赵静，张尚立，苗俊英 山东大学生命科学学院发育研究所，济南（250100） E-mail: miaojy@https://www.doczj.com/doc/e711207635.html, 摘要：研究D609能否诱导小鼠骨髓间充质干细胞定向分化为神经元样细胞。参考Pittenger 的方法提取小鼠骨髓间充质干细胞；倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经纤维丝蛋白（NF）的表达；利用荧光探针（DCHF）并结合激光扫描共聚焦显微术检测分化细胞内活性氧(ROS)水平。结果表明D609能诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞，并表达神经元特异性蛋白NSE、NF。分化过程中ROS水平升高，FGF-2能通过降低细胞内的ROS水平提高细胞存活率。 关键词：D609；骨髓间充质干细胞；神经元分化 1.前言 骨髓间充质干细胞具有很强的自我增殖能力和分化潜能，能在特定的体内外环境条件下分化为神经细胞[1]。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）是多种细胞中普遍存在的一种磷脂酶，其结构、功能、亚细胞分布具有物种、细胞特异性。本课题组在研究中已经发现PC-PLC参与调节血管内皮细胞、肺癌细胞以及神经元的增殖、分化和凋亡等多种信号通路[2]。同时发现PC-PLC的特异性抑制剂D609[3]能诱导部分人脐带静脉血管内皮细胞和大鼠骨髓间充质干细胞（rat Bone Mesenchymal Stem Cells，rBMSCs）定向分化成神经元样细胞[4]。小鼠骨髓间充质干细胞（mouse Bone Mesenchymal Stem Cells ,mBMSCs）是一种重要的动物实验模式细胞，D609能否诱导小鼠mBMSCs分化成神经元样细胞？目前尚未搞清。 研究表明，非毒性水平的ROS能作为信号分子，参与细胞增殖、分化和凋亡的信号转导，从而调控这些重要细胞活动[5]。我们先前的实验结果表明,ROS参与rBMSCs向神经元分化的过程。另外，碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）能维持分化的细胞存活[6]。为了探讨D609诱导mBMSCs向神经元分化的分子机制，我们检测了mBMSCs分化前后ROS水平的变化以及FGF-2对ROS水平的影响。 2. 材料与方法 2.1 材料 昆明小鼠（山东大学实验动物中心）；DMEM（low glucose）培养液（美国GIBCOBRL公司）；胰酶（上海生工）；D609 (Cat. No. T-8543；美国Sigma公司)；NSE及NF抗体（美国Sigma公司）；MTT（美国Amresco公司） 2.2 方法 2.2.1 mBMSC的提取、培养 选用6～8周龄健康雄性昆明小鼠，乙醚麻醉后淹死，无菌条件下分离股骨和胫骨，用注射器吸取4mL MSC培养液冲出骨髓，吹打成单细胞悬液，种于直径60mm的塑料培养皿 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20050422013）的资助。
全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特 性 [ 10-11-01 14:00:00 ] 编辑：studa20 作者：丰炳峰，董晨，关 凤军 【摘要】目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充 质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利 用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜 抗原。结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。FCM 检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论贴壁培养法能有效分离 纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生 物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。 【关键词】间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养 Abstract:Objective To establish a simple and effective method of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biological characteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry (FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM- F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%, respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.
造血干细胞移植患者的饮食护理 发表时间：2016-01-27T15:02:30.397Z 来源：《解放军预防医学杂志》2015年第7期供稿作者：张小花[导读] 徐州医学院附属淮安医院有效的饮食护理干预可有效预防患者营养不良，使移植顺利完成，提高疗效改善生存质量。 徐州医学院附属淮安医院江苏淮安 223002 【摘要】目的探讨饮食护理对造血干细胞移植病人营养状况的影响。方法将2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人31例随机分为观察组16例和对照组15例。观察组在常规护理干预下进行饮食护理干预，对照组进行常规护理干预，观察两组患者造血功能恢复时间、体重增加情况，以评价患者的营养状况。结果有效的饮食护理干预，可以提高造血干细胞移植患者的营养状况，减少患者的住院天数，使患者造血功能尽快恢复，减轻患者的经济负担。结论有效的饮食护理干预可有效预防患者营养不良，使移植顺利完成，提高疗效改善生存质量。 【关键词】造血干细胞移植; 饮食护理 中图分类号 R473.5 文献标识码 B 目前随着社会的发展血液系统肿瘤发生率逐年增加，随着人们意识水平、经济水平及医学水平的提高，造血干细胞移植在我国广泛开展，造血干细胞移植患者越来越多，造血干细胞移植患者的营养状况对患者的造血重建，免疫功能恢复及移植后生存质量有重要意义。多数造血干细胞移植患者及家属只注重临床药物治疗而轻视饮食护理。据有关报道[1]患者在良好的饮食方式和营养状况下，较能承受肿瘤及其治疗对身体所产生的种种压力，同时接受化疗效果也会更好，相对来说移植成功率会提高，移植效果就会更好，因此做好造血干细胞移植患者的饮食护理，对移植的成功及移植后患者控制体重，术后恢复造血功能至关重要。我科对2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人进行饮食护理干预，并通过移植后患者体重及术后恢复造血功能期间血红蛋白计数评价其营养状况，现报道如下1资料与方法 1.1一般资料。2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人31例，年龄6-59岁，其中自体造血干细胞移植5例，异基因造血干细胞移植26例，随机分给观察组16例和对照组15例。 1.2方法。观察组每天与患者主动沟通了解患者饮食习惯，食欲情况，医嘱饮食要求，对患者整体评价后制定饮食计划，与家属沟通食物品种，烹饪方法。对照组实施常规护理干预及健康宣教，观察两组患者体重及术后恢复造血功能期间血红蛋白计数评价其营养状况。2结果 对31例造血干细胞移植患者进行有效的饮食护理干预可以提高造血干细胞移植患者的营养状况，保证移植的成功率。3讨论 3.1影响进食的因素：（1）特殊的病室环境，移植期间患者独居无菌层流净化仓，没有亲人的陪伴，以及对造血干细胞移植术的担心。（2）造血干细胞移植术前患者经过超剂量的放化疗预处理，对患者胃肠功能造成伤害，患者产生呕吐症状，食欲下降，进食明显减少。（3）因患者预处理期间体质虚弱，卧床休息，活动量减少，肠蠕动减慢，饥饿感下降。（4）急性移植物抗宿主病消化道反应影响消化功能，降低食欲。 3.2宣教饮食护理的重要性 移植前，加强与患者及家属的沟通，稳定患者的情绪，建立良好的护患关系，向患者及家属宣教充足的营养是造血干细胞移植成功的前提，破除饮食与食物致病的封建迷信的传统思想习惯，对这样的患者及家属要赖心的宣教，以保证患者能获取更全面的营养。 3.3饮食的消毒方法 为保证患者食物的无菌，患者的食物必须经过微波炉高火加热7分钟，告知患者家属选用微波炉专用的筷子、勺子、饭盒或器皿，所有食物必须装在饭盒中递给护理人员，如为馒头、包子、饺子等水分少的食物，放在蒸霸中隔水加热，水果应该洗干净去皮，剁成小块，煮成水果汤，进仓后护理人员再次高火加热，煮鸡蛋应该剥壳捣碎后递给护理人员，防止微波炉加热时发生爆炸，食物不要装的过满，防止经过微波炉长时间的高温加热而溢出，耽误病人的进食时间，也避免家属对护理人员的误解。患者预处理期间进食会减少，剩下的的食物禁止再次递给护理人员，必须重新再做食物。患者喝的水必须是二次烧开的水，避免进食或进水带给患者细菌。保证患者的食物及水的无菌。 3.4造血干细胞移植前饮食护理 正确指导家人配合做好饮食护理，注意饮食卫生，水果、蔬菜要洗干净，变质的食物勿食用，勿食生、冷、油炸、刺激性食物。食物必须新鲜，家人自己烹饪，勿食加工食物及零食，不可重复食用，避免消化道感染。饮食原则以清淡、易消化、高蛋白、高热量、为主，定时、定量，少量多餐，注意品种多样化及色彩的搭配，增加患者的食欲，经常食用瘦肉、蛋类、牛奶、鱼类（没有鱼刺），多食新鲜水果及蔬菜，不易消化的食物、产气食物勿吃如：糯米面加工的食物，红薯，洋葱、大蒜、大蒜黄、韭菜、韭菜黄、，没有发酵的面食。预处理期间由于超剂量放化疗，患者会有呕吐症状，告知患者呕吐后仍需坚持进食，呕吐后进食可中和胃酸，促进肠蠕动，减轻对胃黏膜的刺激，帮助患者建立合理的饮食结构。进食与化疗时间间隔大于2小时[2]可以减轻恶心呕吐。这时候应少量多餐，两餐之间可以吃些不易引起恶心的辅助食物，饮食宜清淡，勿油腻，调料品种不宜过多，少量多餐，做好患者及家属心里沟通，鼓励患者进食，指导患者保持情绪乐观，介绍造血干细胞移植成功的病例，使患者树立战胜疾病的信心，让患者听轻音乐，集中治疗和护理，为患者提供舒适的进餐环境。如果患者进食量仍然很少及时与患者的床位医生沟通，通过静脉输液补充维生素及氨基酸，防止加重患者的营养不良，以免影响治疗效果。化疗后4-8天易发生口腔溃疡，其发生率为83.7%[3]，口腔溃疡影响进食，因此要做好口腔护理，做口腔护理时要用手电筒及压舌板仔细检查口腔情况，动作轻缓，避免人为损伤引起出血，指导患者每日晨起、饭前、饭后、睡前，用预防细菌和真菌感染的漱口液交替漱口，每次漱口用舌头上下、左右、里外、前后，反复搅拌，每种漱口液每次含漱时间大于3分钟。发生口腔溃疡时宜进温流食、半流食。口腔溃疡疼痛影响进食时，可用2%利多卡因漱口。预处理期间患者的血小板会降低，指导家人烹饪食物勿过干、过硬、带骨、带刺、宜流质或半流质。预处理期间患者的血红蛋白也会下降，指导家人给予患者多食补血的食物及水果如：菠菜、芹菜、红豆、红枣、花生、黑米、紫米、枸杞、龙眼、黑芝麻、南瓜、石榴、橘子、猕猴桃等，患者食欲下降的时候可以将这些食物烹饪成粥或者汤类。指导患者多食粗纤维的食物及水果，多饮水，保持大便通畅，预防便秘。