项目名称：发育过程中形态发生素梯度形成和信号
转导的调控机制
首席科学家：林鑫华中国科学院动物研究所起止年限：2011.1至2015.8
依托部门：中国科学院
二、预期目标
1、项目总体目标
本项目针对形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制这一发育生物学研究领域的关键问题，整合在形态发生素研究领域已做出优秀成绩的研究单位和科学家，以果蝇、斑马鱼、小鼠等模式动物和细胞系为研究体系，利用遗传学、发育生物学、细胞生物学和生物化学等实验技术，系统地研究形态发生素的分泌、梯度形成和信号转导的调控，发现形态发生素与其它重要发育信号之间相互作用及机制，完善形态发生素信号转导与调控的分子网络，阐明形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制在胚胎发育和组织器官形成中的重要作用，进一步探讨形态发生素在多种人类重要疾病（如先天性缺陷、肿瘤）中的作用机制。以上研究结果将揭示形态发生素梯度形成和信号转导这一重要发育生物学问题的新机制，获得一系列具有国际领先和拥有自主知识产权的研究成果，打造一支达到国际先进水平的发育生物学研究团队，使我国在此领域的研究处于世界领先行列。同时本项目的实施也将有助于阐明相关人类疾病的发病机制，为疾病诊断和药物开发提供理论基础和科学依据，为人类健康做出重要贡献。
2、五年预期目标
在基础理论研究方面：揭示形态发生素梯度形成和信号转导的新机制；发现并鉴定参与形态发生素相关信号通路的新基因；解释这些新基因在发育过程中和人类疾病中的功能和作用机制；发现形态发生素信号与其它重要发育信号间相互关系及其在人类疾病发生和发展过程中的作用；完善形态发生素信号转导与调控的分子网络；阐明形态发生素梯度形成和信号转导在胚胎发育和组织器官形成中的重要作用；探讨形态发生素在多种人类重大疾病（如先天性缺陷、肿瘤）中的作用机制。
在应用基础研究方面：Wnt、Hh、BMP、JNK、Hippo等信号通路与多种人类疾病密切相关，本项目将鉴定出这些信号通路中的未知成员，为相关疾病的诊断和治疗提供新的检测方法、治疗方案和药物靶点。
在平台建设方面：建立一个完整而系统的形态发生素研究体系和技术平台,包括用于研究的人力资源、实验材料、实验方法和技术手段等。该平台的建立将为研究团队高效率、高水平完成形态发生素及相关发育生物学科研任务提供良好
的基础条件，增强我国在这些研究领域的国际竞争力。
在人才培养方面：培养硕士及博士研究生100名，博士后15-20名，国家杰出青年等高级人才2-3名。
成果考核指标：在国际一流杂志（IF >10）发表论文12-16篇，在有影响力的杂志（IF >5）上发表论文40-50篇。申请5-10项发明专利。
三、研究方案
1. 学术思路
形态发生素作为形态构建的组织者，对多种发育过程均起到至关重要的作用。了解形态发生素的作用机制是深入理解图式形成和器官发生的关键。对形态发生素的研究不仅为组织工程和器官修复提供实验依据和理论基础，同时为出生缺陷、癌症等重大疾病的预防、诊断及治疗开辟新的途径。
本项目将对形态发生素的分布及其信号转导机制开展系统性研究，利用多种模式动物（果蝇、斑马鱼、小鼠等）的研究优势，力求从遗传学、生物化学、细胞生物学及分子生物学等不同角度出发，回答形态发生素梯度形成及信号转导的关键问题。我们将利用果蝇模式动物完善的遗传学研究系统，首先分析形态发生素梯度形成和信号转导的分子机制；其次研究形态发生素与JNK及Hippo信号通路间的相互作用，深入理解各种信号通路如何协同调控胚胎发育和图式形成；最后，我们利用斑马鱼研究形态发生素在脊椎动物胚胎发育中的作用，并用斑马鱼和小鼠的心血管系统为模型研究形态发生素信号通路对器官发生的作用。
总之，本项目的实施将解决形态发生素梯度形成及信号转导的一系列关键问题；揭示发育过程中形态发生素的梯度形成及信号转导的调控机制。这些结果不仅会对形态发生素梯度形成的基础理论做出重要贡献，而且有助于阐明相关重大疾病的发生机制，并为相关疾病的诊治奠定理论基础。
2. 技术途径
本项目充分利用果蝇、斑马鱼等模式动物的优势，整合国内优秀团队，利用当前最先进的研究手段和技术，对发育过程中形态发生素的表达、分泌、梯度形成和信号转导，以及与其它重要信号通路间的相互作用进行研究，揭示形态发生素与其它重要信号间的互动机制，构建完整的信号转导网络，并阐明其在胚胎发育和人类疾病中的重要作用。
围绕项目研究内容和目的，本课题将在分子、细胞和整体动物水平上开展研究。在研究手段上将突出系统性、动态性，同时将注重发展并使用新方法。
在分子水平的研究中，除了常规的研究方法外，将开展多标记、定量和实时的方法对基因转录、蛋白质翻译、蛋白质修饰以及蛋白质相互作用进行动态研究，
如实时定量PCR、荧光素酶定量分析、蛋白质修饰位点确定、修饰位点突变、报告基因活性分析、免疫共沉淀实验等。
在细胞水平的研究中，将突出活细胞研究技术，如活细胞荧光免疫观察、活细胞内标记蛋白质的动态多维观察、活细胞囊泡运输观察等。通过结合常规的固定细胞研究技术和活细胞研究的方法，更好地认识细胞内信号转导分子和通路在调控细胞活动中的作用。
在分子和细胞水平的机制性研究基础上，我们还将在整体动物模型上进行基因的功能分析。利用果蝇、斑马鱼和小鼠等模型对形态发生素信号及其它相关发育信号的功能开展体内生理条件下的研究，如采用果蝇嵌合体突变技术、RNAi 干涉技术、过量表达技术、可阻遏细胞标记技术（MARCM system）以及斑马鱼Morpholino干涉技术、转基因鱼荧光活体观察技术、小鼠基因敲除技术等。
本项目针对细胞生长调控的几个关键要点和过程设置了相应的四个研究课题，包括 (1) Wnt梯度形成和信号转导的调控机制；(2) Hh梯度形成和信号转导的调控机制；(3) 形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用；(4) 形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制。
总体技术途径如下图：
3、创新点与特色
科学问题： 形态发生素信号通路在正常发育和疾病发生过程中都有重要的作用，是发育生物学领域一个极为重要的研究方向。虽然经过多年的努力，我们已经对其信号通路的主要成员和基本作用机制有了一定的了解，但对于其浓度梯度形成、信号转导和不同信号间相互作用等诸多问题还知之甚少。本项目针对形态发生素信号通路中几个极为重要且尚待研究的科学问题，力图通过利用不同模式生物的研究优势，采用现有多种稳定有效的研究方法，并应用新的技术和研究手段来解决这些重要的科学问题。
研究内容：本项目抓住形态发生素信号通路的几个关键要点，同时从多个重要的信号通路Wnt 、Hh 、TGF-β、JNK 和Hippo 出发，利用果蝇全基因组RNAi 文库、果蝇全基因组过表达文库和蛋白质组学等多种手段，鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，研究这些基因在形态发生素梯度形成和信号转导中的功能和机制，揭示不同信号通路之间的相互作用，进而探究形态发生素信号在正常发育和
总体技术途径示意图
疾病发生过程中功能和作用机制，形成一个由表及里、相互关联的研究体系。
研究系统：本项目针对形态发生素梯度形成和信号通路调控机制这一发育生物学关键问题，从分子、细胞和整体动物多个层次，利用果蝇、斑马鱼、小鼠等模型并结合哺乳动物细胞，有利于更好地鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，分析基因在信号通路中的新功能，发现信号通路调控的新机制。
研究方法：本项目综合运用遗传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学、蛋白质组学和生物信息学等方面的研究思想和技术方法，系统地研究形态发生素梯度形成和信号通路调控机制。充分利用不同模式生物的优势，结合果蝇嵌合体分析技术、过量表达分析技术、斑马鱼morpholino干涉技术和小鼠组织特异性敲除技术对形态发生素信号通路进行系统性研究。针对基因功能和作用机制的研究，我们结合细胞活体染色观察囊泡运输、蛋白质亚细胞定位、荧光素酶定量分析、免疫共沉淀、酵母双杂交和基因定点突变等微观分析手段对形态发生素分子及其信号进行直观的、动态的、定量的分析。
研究队伍：本项目由形态发生素研究领域资深专家林鑫华博士领衔, 并汇集了在形态发生素及胚胎发育研究领域已做出优秀成绩的中青年科学家，他们在各自研究领域都有很好的研究基础和特色的科研成果。项目整体分为4个研究课题，每个课题由7-8名研究方向一致的研究人员组成，能相互合作集中解决本课题内的关键科学问题。4个课题之间又可以紧密联系、相互促进。例如在课题一Wnt 信号通路中发现的新分子、新机制可以用于课题二Hh信号通路的研究。课题一和课题二的研究成果则可以作为课题三研究的基础，将有利于阐明形态发生素信号通路与其它发育信号通路之间的关系。由于形态发生素信号通路从果蝇到哺乳动物高度保守，所以前三个课题的基础研究成果可以应用到课题四在脊椎动物模型中进行功能分析和机制研究。研究队伍的所有成员都能够相互借鉴，互助合作，形成长期而良好的科研合作平台。
4、可行性分析
本项目抓住形态发生素信号通路的几个关键要点，同时从多个重要的信号通路Wnt、Hh、TGF-β、JNK和Hippo出发，通过多种筛选手段鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，研究这些基因在形态发生素梯度形成和信号转导中的功能和机制，揭示不同信号通路之间的相互作用，进而探究形态发生素信号在正常发育和疾病发生过程中的功能和作用机制，形成了一个由表及里、相互关联的研究体
系。目前利用果蝇全基因组RNAi干涉文库和果蝇全基因组过表达文库系统进行的遗传筛选工作已经获得了多个参与形态发生素信号调控的新基因，初步实验结果显示这些新基因很可能有新的功能和新的作用机制，我们正力图将这些基因融合进现有的信号通路，构建一个完善的形态发生素信号调控网络图谱。现有的实验结果已经证明我们的研究体系和研究手段切实可行。
本研究团队已经承担多项科研任务，其中包括科技部“973”项目、中国科学院创新工程项目、国家自然科学基金项目等，具有很强的科研实力，能够承担国家重大科研任务。研究组前期的研究工作已经在形态发生素研究领域做出了突出成绩，成果发表在Cell、Nature、Science、Developmental cell、Nature Cell Biol、Development 等国际一流学术期刊上。同时各个研究组目前已经形成各具特色的研究团队，并且研究组间相互协作形成了一支技术过硬、结构合理的的整体队伍。
本项目课题负责人和主要学术骨干所在的研究组大多依托国家级重点实验室和省部级重点实验室。其中包括有生物膜与膜生物工程国家重点实验室、中国科学院分子细胞生物学重点实验室, 中国科学院系统生物学重点实验室、中国科学院干细胞重点实验室（筹）、卫生部视觉科学研究重点实验室、上海市信号转导和疾病重点实验室和浙江省眼视光学重点实验室。各重点实验室及研究中心经过多年的积累和发展，营造了良好的科研环境、配备了较完备的大型专业仪器设备，建立了完善的实验技术和研究系统，为本项目的顺利开展奠定了基础。此外我们还建设了多个模式生物实验平台，包括果蝇平台、斑马鱼平台、小鼠平台、果蝇显微注射平台、斑马鱼显微注射平台和小鼠胚胎显微注射平台，能够进行大规模转基因动物的构建和大规模遗传筛选。课题组所在单位主要为中国科学院动物研究所、中国科学院上海生命科学院、南京大学、同济大学、南开大学等具有悠久历史的研究单位，在发育生物学、细胞生物学、遗传学、分子生物学、蛋白质组学、生物信息学和方面都有良好的基础。各研究组之间可以相互借鉴、优势互补，确保本项目的顺利实施。
5、课题设置及各课题间相互关系
本项目围绕“发育过程中形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制”这一关键科学问题，系统地研究形态发生素的梯度形成和信号转导、形态发生素和其它信号通路的相互作用以及在脊椎动物胚胎发育中的作用。项目分为四个课题：课题一，Wnt梯度形成和信号转导的调控机制；课题二，Hh梯度形成和信号转导
的调控机制；课题三，形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用；课题四，形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制。
从研究的科学问题来看, 前两个课题将详细阐明两个关键形态发生素Wnt 和Hh的浓度梯度形成和信号传导的分子机制。该课题的开展不仅使我们进一步完善对Wnt和Hh信号通路中各成员作用机制的认识，而且有助于我们鉴定这些信号通路中的新成员。课题三将研究JNK和Hippo信号通路与形态发生素信号通路之间的相互作用。课题一和课题二发现的信号通路新成员和新机制将有助于我们加深理解这些信号通路之间的相互关系，全面认识形态发生素及其相关信号通路控制组织图式形成和器官发育的客观规律，促进项目中课题三和课题四相关研究的实施。另一方面，充分掌握JNK和Hippo信号通路与Wnt和Hh信号通路的关系，也为我们全面理解Wnt和Hh的整个信号网络提供了重要信息。前三个课题的目标是揭示形态发生素的浓度梯度形成、信号转导以及各发育信号之间的相互作用；课题四是以斑马鱼和小鼠为模式动物，揭示形态发生素信号通路在脊椎动物胚胎发育和器官发生中的重要作用，因此我们可以将课题一、二和三鉴定出的新成员在课题四的脊椎动物发育系统中进行功能分析。
从实验材料和技术手段共享方面来看，我们已经获得果蝇全基因组RNAi干涉文库和果蝇全基因组过表达文库，并利用这两个全基因组文库筛选到了多个参与Wnt和Hh信号通路的新基因。下一步我们将利用这两个果蝇文库，筛选JNK和Hippo信号通路的新基因。同时我们还利用蛋白质质谱、基因芯片等方法找到多个参与Wnt和TGF-β信号通路的新基因，我们将共享这些信息，研究这些基因是否参与其它信号通路。综合利用以上多种实验材料和技术手段，我们可以在全基因组水平上鉴定Wnt、Hh、TGF-β、JNK和Hippo信号通路的新基因。同时我们还将完全共享现有的果蝇品系、cDNA文库等重要的实验材料，为研究各个信号通路间相互作用提供基础保障。
本项目由形态发生素研究领域资深专家林鑫华博士主持，同时汇集了国内目前形态发生素研究方面最优秀的中青年科技人才。本项目包含的四个课题各自独立又紧密相关，形成一个研究形态发生素作用机制和功能的完整体系。本项目的实施不仅将阐明形态发生素浓度梯度形成和信号转导的分子机制，并且将揭示它们在发育过程中的重要功能。
小鼠、斑马鱼等模式动物
课题一，Wnt 梯度形成和信号转导的调控机制
研究目标：
本课题以Wnt/Wg 信号通路为研究对象，通过遗传学、细胞生物学和生物化学等手段相结合的方法，研究Wnt/Wg 蛋白从分泌、运输、分布、受体结合到信号传递等各个环节的调控机制，寻找Wnt/Wg 信号通路中未知的调节因子，并揭示它们的调控机制以及在发育过程中的重要作用，从而全面地了解Wnt/Wg 信号通路的分子网络及调控机制。 研究内容：
利用果蝇全基因组RNAi 文库，转基因过表达文库及蛋白质组学，筛选并鉴定Wnt/Wg 信号通路的新基因；研究Wnt/Wg 的分泌和扩散及与受体结合的分子机制；探讨细胞质中各种调节因子如何调控β-Catenin/Armadillo 的稳定性；分析核内β-Catenin/Armadillo 与TCF/Pangolin 复合物如何通过其它调节因子的协同作
课题之间的相互关系
用调控下游基因的转录；研究Wnt/Wg信号通路中的新成员及新机制在脊椎动物中的保守性。
经费比例：32%
承担单位：中国科学院动物研究所、中国科学院上海生命科学研究院、温州医学院
课题负责人：林鑫华
学术骨干：宋海云、江晓勇、金龙金、杨勇飞、叶菊秀
课题二，Hh梯度形成和信号转导的调控机制
研究目标：
本课题结合遗传学、细胞生物学、生物化学及分子生物学多种手段，以果蝇为研究系统，研究形态发生素Hh梯度形成和信号转导的调控机制。寻找参与Hh信号通路的新基因；揭示Hh浓度梯度形成和信号转导的新机制；阐明Hh在机体发育过程中的作用机制。
研究内容：
利用果蝇全基因组RNAi文库，转基因过表达文库及蛋白质组学，筛选并鉴定参与Hh信号通路调控的新基因；研究Disp蛋白如何调控Hh蛋白分泌；分析Dlp和Ihog影响Hh分布的调控机制；以信号通路的关键分子Smo为靶点，研究其作用机理，分析形态发生素Hh刺激下的信号通路成员的动态变化；研究Ci分子稳定性和活性的调节；研究Hh信号通路中的新成员及新机制在脊椎动物中的保守性。
经费比例：25%
承担单位：中国科学院上海生命科学研究院、南京大学、中国科学院动物研究所课题负责人：赵允
学术骨干：张青、吴一卉、石大伟、吴文青
课题三，形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用
研究目标：
本研究拟利用模式生物果蝇的遗传学优势，从分子、细胞、组织及整体水平，
探讨形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路间的相互作用；寻找参与JNK、Hippo信号通路的新基因；揭示JNK、Hippo信号转导的新机制；构建完整的信号转导网络；阐明其调控胚胎发育和器官发生的重要作用。
研究内容：
分析JNK信号通路与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp信号通路之间的相互作用，及对发育的调控机制；探索Hippo信号通路与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp信号通路之间的相互作用，及对发育的调控机制；研究JNK信号通路与Hippo信号通路间的相互作用，及对发育的调控机制；筛选JNK和Hippo信号通路中的新成员，分析其与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp通路中各成员的交互关系，构建完整信号转导网络。
经费比例：18%
承担单位：同济大学、南开大学
课题负责人：薛雷
学术骨干：吴世安、赵素然、张欣文、王兰芳
课题四，形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制
研究目标：
研究形态发生素在脊椎动物胚胎发育和器官发生中的功能和作用机制；了解形态发生素信号通路及靶基因在细胞增殖、分化和凋亡等细胞命运中的作用；揭示形态发生素在胚胎发育和器官发生中的重要作用；探讨形态发生素信号通路与其它信号通路的相互联系，共同调控脊椎动物胚胎发育、血液和心脏发育的分子机制。
研究内容：
应用模式动物斑马鱼阐明形态发生素Nodal信号通路在胚胎发育中的功能；鉴定Smad2直接调控的靶基因，并进一步探讨Smad2通过其靶基因调控胚胎发育的分子机制；分离鉴定Smad2相互作用蛋白，从而了解Smad2的活性与功能的调控机制及在发育中的意义；应用斑马鱼模式动物揭示BMP和FGF在血液和心血管发育中的作用机制；揭示BMP、Wnt、Hh 和FGF等信号通路之间相互
关联对造血干细胞维持、形态发生以及细胞命运的调控作用；应用小鼠模式动物阐明形态发生素信号通路Wnt、BMP和FGF信号与Akt 和Hippo信号通路之间的相互关系，以及在心脏发育中的调控机制。
经费比例：25%
承担单位：南京大学、中国科学院动物研究所
课题负责人：杨中州
学术骨干：刘峰、王强、常在、马东媛
四、年度计划
1 PPAR信号通路：过氧化物酶体增殖物激活受体( PPARs) 是与维甲酸、类固醇 和甲状腺激素受体相关的配体激活转录因子超家族核激素受体成员。它们作为脂 肪传感器调节脂肪代谢酶的转录。PPARs由PPARα、PPARβ和PPARγ 3种亚型组成。PPARα主要在脂肪酸代谢水平高的组织，如：肝、棕色脂肪、心、肾和骨骼肌表达。他通过调控靶基因的表达而调节机体许多生理功能包括能量代谢、生 长发育等。另外，他还通过调节脂质代谢的生物感受器而调节细胞生长、分化与 凋亡。PPARa同时也是一种磷酸化蛋白，他受多种磷酸化酶的调节包括丝裂原激活蛋白激酶( ERK-和p38．M APK) ，蛋白激酶A和C( PKA，PKC) ，AM PK和糖原合成酶一3( G SK3) 等调控。调控PPARa生长信号的酶报道有M APK、PKA和G SK3。PPARβ广泛表达于各种组织，而PPAR γ主要局限表达在血和棕色脂肪，其他组织如骨骼肌和心肌有少量表达。PPAR-γ在诸如炎症、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和糖代谢调节，以及肿瘤和肥胖等方面均有着举足轻重的作用， 而其众多生物学效应则是通过启动或参与的复杂信号通路予以实现。鉴于目前人 们对PPAR—γ信号通路尚不甚清，PPARs通常是通过与9-cis维甲酸受体( RXR)结合实现其转录活性的。 2 MAPK信号通路:mapk简介:丝裂原激活蛋白激酶（mitogen—activated protein kinase，MAPK）是广泛存在于动植物细胞中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。作用主要是将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞的生物化学反应（增殖、分化、凋亡、应激等）。 MAPKs家族的亚族 :ERKs（extracellular signal regulated kinase)：包括ERK1、ERK2。生长因子、细胞因子或激素激活此通路，介导细胞增殖、分化。 JNKs(c-Jun N-terminal kinase)包括JNK1、JNK2、JNK3。此亚族成员能使 Jun转录因子N末端的两个氨基酸磷酸化而失活，因此称为Jun N末端激酶(JNKs)。物理、化学的因素引起的细胞外环境变化以及致炎细胞因子调节此通路。P38 MAPKs：丝氨酸/络氨酸激酶，包括p38 α、p38β、p38γ、p38δ。p38 MAP K参与多种细胞内信息传递过程 ,能对多种细胞外刺激发生反应,可磷酸化其它细胞质蛋白,并能从胞浆移位至细胞核而调节转录因子的活性来改变基因的表达水平 ,从而介导细胞生长、发育、分化及死亡的全过程。 ERK5:是一种非典型的MAPK通路，也叫大MAPK通路，只有一个成员。它可被各种刺激因素激活。不仅可以通过磷酸化作用使底物活化，并且通过C端的物理性结合作用激活底物。 3 ERBB信号途径:ErbB 蛋白属于跨膜酪氨酸激酶的 EGF 受体家族成员。ErbB 的命名来源于在禽红白血病 B( v-Erb-B) 发现的 EGF 受体的突变体,因而 EGF 受体 亦称为“ ErbB1”。人源 ErbB2 称为HER2, 特指人的 EGF 受体。ErbB 家族的
细胞信号转导途径研究方法 一、蛋白质表达水平和细胞内定位研究 1、信号蛋白分子表达水平及分子量检测: Western blot analysis. 蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白)，将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后,将NC膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带)，再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。 基本流程： 检测示意图：
2、免疫荧光技术 Immunofluorescence （IF） 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。 二、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1、免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）
Co-IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在agarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行Western Blot 和质谱分析。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用。 2、GST pull-down assay GST pull-down assay是将谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白（标记蛋白或者饵蛋白，GST, His6, Flag, biotin …）作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein或者prey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。
信号转导 061M5007H 学期：2015-2016学年秋| 课程属性：| 任课教师：谢旗等 教学目的、要求 本课程为细胞生物学专业研究生的专业基础课，同时也可作为相关专业研究生的选修课。细胞信号转导是细胞生物学学科进展最快的研究领域之一，信号转导的概念已经开始深入到生命科学的各个领域。本课程内容涵盖动植物受体、G蛋白、环核苷酸第二信使、质膜磷脂代谢产物胞内信使、酶活性受体、蛋白质可逆磷酸化、泛素蛋白化及其对基因表达的调控、信号转导途径的多样性、网络化和专一性等方面的研究现状和进展。 预修课程 生物化学、分子生物学 教材 生命科学学院 主要内容 第一章绪论（3学时，教师：谢旗）细胞信号转导的研究对象和研究意义，细胞信号的主要种类，细胞化学信号分子与信号传递途径的特征。真核生物的蛋白激酶，蛋白磷酸酶，蛋白质可逆磷酸化对信号转导的调节方式，蛋白质可逆磷酸化与基因表达调控，蛋白质可逆磷酸化在细胞信号中的意义。蛋白质稳定性与信号转导。第二章植物免疫的表观遗传调控（3学时，教师：郭惠珊）表观遗传调控包含RNA干扰、DNA修饰、组蛋白翻译后修饰和染色质重塑等各种过程互相交叠，共同调控基因组表观修饰的动态平衡；除了影响生长和发育，表观遗传调控的另一重要功能是抗病免疫作用。本讲将着重介绍植物表观遗传途径及其抗病免疫信号的调控作用。第三章MicroRNA介导的信号（3学时，教师：郭惠珊）microRNA 广泛存在于生物体内，是生物体保守机制RNA沉默过程产生并具有序列特异性调控功能的一类非编码小分子RNA。本课程主要讲授植物microRNA的产生、加工、特性及其调控作用的基本生物学过程；以及植物miRNAs和其他小分子RNA参与植物生长素信号途径和其他植物生理性状的调控作用。第四章钙离子通道及信号转导（3学时，教师：陈宇航）钙离子是生命活动的必需元素，基本分布和内稳，代谢平衡和疾病；钙离子发挥重要生物学功能，简述历史发现，作为第二信使的化学基础，功能调控的基本模式，以钙结合蛋白为例子展开介绍钙离子发挥功能调控的分子结构基础等；介绍钙离子信号转导系统的组成，
总字数：19,361 图：5 表：0 第七章细胞信号转导异常与疾病 第一节细胞信号转导系统概述 一、受体介导的细胞信号转导通路 二、细胞信号转导通路调节靶蛋白活性的主要方式 第二节信号转导异常发生的环节和机制 一、细胞外信号发放异常 二、受体或受体后信号转导异常 第三节与信号转导异常有关的疾病举例 一、胰岛素抵抗性糖尿病 二、肿瘤 三、心肌肥厚和心衰
第七章细胞信号转导异常与疾病 细胞信号转导系统(signal transduction system或cell signaling system)由能接收信号的特定受体、受体后的信号转导通路以及其作用的靶蛋白所组成。细胞信号转导系统具有调节细胞增殖、分化、代谢、适应、防御和凋亡等作用，它们的异常与疾病，如肿瘤、心血管病、糖尿病、某些神经精神性疾病以及多种遗传病的发生发展密切相关。受体和细胞信号转导分子异常既可以作为疾病的直接原因，引起特定疾病的发生；亦可在疾病的过程中发挥作用，促进疾病的发展。细胞信号转导异常可以局限于单一成分（如特定受体）或某一环节，亦可同时或先后累及多个环节甚至多条信号转导途径，造成调节信号转导的网络失衡。对信号转导系统与疾病关系的研究不仅有助于阐明疾病的发生发展机制，还能为新药设计和发展新的治疗方法提供思路和作用靶点。 第一节细胞信号转导系统概述 信号转导过程包括细胞对信号的接受，细胞内信号转导通路的激活和信号在细胞内的传递。激活的信号转导通路对其靶蛋白的表达或活性/功能的调节，如导致如离子通道的开闭、蛋白质可逆磷酸化反应以及基因表达改变等，导致一系列生物效应。 一、受体介导的细胞信号转导通路 细胞的信号包括化学信号和物理信号，物理信号包括射线、紫外线、光信号、电信号、机械信号(摩擦力、压力、牵张力以及血液在血管中流动所产生的切应力等)以及细胞的冷热刺激等。已证明物理信号能激活细胞内的信号转导通路，但是与化学信号相比，目前多数物理信号是如何被细胞接受和启动细胞内信号转导的尚不清楚。 化学信号又被称为配体(ligand)，它们包括：①可溶性的化学分子如激素、神经递质和神经肽、细胞生长因子和细胞因子、局部化学介质如前列腺素、细胞
第十五章细胞信号转导 复习测试 （一）名词解释 1. 受体 2. 激素 3. 信号分子 4. G蛋白 5. 细胞因子 6. 自分泌信号传递 7. 蛋白激酶 8. 钙调蛋白 9. G蛋白偶联型受体 10. 向上调节 11. 细胞信号转导途径 12. 第二信使 （二）选择题 A型题： 1. 关于激素描述错误的是： A. 由内分泌腺/细胞合成并分泌 B. 经血液循环转运 C. 与相应的受体共价结合 D. 作用的强弱与其浓度相关 E. 可在靶细胞膜表面或细胞内发挥作用 2. 下列哪种激素属于多肽及蛋白质类： A. 糖皮质激素 B. 胰岛素 C. 肾上腺素 D. 前列腺素 E. 甲状腺激素 3. 生长因子的特点不包括： A. 是一类信号分子 B. 由特殊分化的内分泌腺所分泌 C. 作用于特定的靶细胞 D. 主要以旁分泌和自分泌方式发挥作用 E. 其化学本质为蛋白质或多肽 4. 根据经典的定义，细胞因子与激素的主要区别是： A. 是一类信号分子 B. 作用于特定的靶细胞 C. 由普通细胞合成并分泌 D. 可调节靶细胞的生长、分化 E. 以内分泌、旁分泌和自分泌方式发挥作用 5. 神经递质、激素、生长因子和细胞因子可通过下列哪一条共同途径传递信号：
A. 形成动作电位 B. 使离子通道开放 C. 与受体结合 D. 通过胞饮进入细胞 E. 自由进出细胞 6. 受体的化学本质是： A. 多糖 B. 长链不饱和脂肪酸 C. 生物碱 D. 蛋白质 E. 类固醇 7. 受体的特异性取决于： A. 活性中心的构象 B. 配体结合域的构象 C. 细胞膜的流动性 D. 信号转导功能域的构象 E. G蛋白的构象 8. 关于受体的作用特点，下列哪项是错误的： A. 特异性较高 B. 是可逆的 C. 其解离常数越大，产生的生物效应越大 D. 是可饱和的 E. 结合后受体可发生变构 9. 下列哪项与受体的性质不符： A. 各类激素有其特异性的受体 B. 各类生长因子有其特异性的受体 C. 神经递质有其特异性的受体 D. 受体的本质是蛋白质 E. 受体只存在于细胞膜上 10. 下列哪种受体是催化型受体： A. 胰岛素受体 B. 甲状腺激素受体 C. 糖皮质激素受体 受体 D. 肾上腺素能受体 E. 活性维生素D 3 11. 酪氨酸蛋白激酶的作用是： A. 使蛋白质结合上酪氨酸 B. 使含有酪氨酸的蛋白质激活 C. 使蛋白质中的酪氨酸激活 D. 使效应蛋白中的酪氨酸残基磷酸化 E. 使蛋白质中的酪氨酸分解 12. 下列哪种激素的受体属于胞内转录因子型： A. 肾上腺素 B. 甲状腺激素 C. 胰岛素 D. 促甲状腺素 E. 胰高血糖素
细胞信号转导练习题 选择题：正确答案可能不止一个 1. NO直接作用于(B) A.腺苷酸环化酶 B.鸟苷酸环化酶 C.钙离子门控通道D．PKC 2.以下哪一类细胞可释放NO( B) A.心肌细胞 B.血管内皮细胞 C.血管平滑肌细胞 3.硝酸甘油作为治疗心绞痛的药物是因为它( C) A.具有镇痛作用 B.抗乙酰胆碱 C.能在体内转换为NO 4.胞内受体(A B) A.是一类基因调控蛋白 B.可结合到转录增强子上 C.是一类蛋白激酶 D.是一类第二信使 5.受体酪氨酸激酶RPTK( A B C D) A.为单次跨膜蛋白 B.接受配体后发生二聚化 C.能自磷酸化胞内段 D.可激活Ras 6. Sos属于(B) A.接头蛋白（adaptor protein） B.Ras的鸟苷酸交换因子（GEF） C.Ras的GTP酶活化蛋白（GAP）D：胞内受体 7.以下哪些不属于G蛋白(C)
A.Ras B.微管蛋白β亚基 C.视蛋白 D. Rho 8. PKC以非活性形式分布于细胞溶质中，当细胞之中的哪一种离子浓度升高时，PKC转位到质膜内表面(B) A.镁离子 B.钙离子 C.钾离子 D.钠离子 9.Ca2+载体——离子霉素（ionomycin）能够模拟哪一种第二信使的作用(A) A.IP3 B.IP2 C.DAG D.cAMP 10.在磷脂酰肌醇信号通路中，质膜上的磷脂酶C（PLC-β）水解4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2），产生哪两个两个第二信使(A B) A.1，4，5-三磷酸肌醇（IP3） B.DAG C.4，5-二磷酸肌醇（IP2） 11.在磷脂酰肌醇信号通路中，G蛋白的直接效应酶是(B) A.腺苷酸环化酶 B.磷脂酶C-β C.蛋白激酶C D. 鸟苷酸环化酶 12.蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）由两个催化亚基和两个调节亚基组成，cAMP能够与酶的哪一部分结合？(B) A.催化亚基 B.调节亚基 13.在cAMP信号途径中，环腺苷酸磷酸二酯酶（PDE）的作用是 (C) A.催化ATP生成cAMP B.催化ADP生成cAMP C.降解cAMP生成5’-AMP 14.在cAMP信号途径中，G蛋白的直接效应酶是(B)
生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７ 综述 文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３３６－０３ 蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用 李敏，周慧，崔银秋 吉林大学生命科学学院生物大分子实验室，吉林长春１３００２１ ［摘要］蛋白质组学的新技术为我们研究细胞内的信号转导过程提供了更广泛和崭新的思路，它克服了传统技术的局限 性，实现了对蛋白的高通量分析。简要综述了蛋白质组学技术在信号转导过程中信号分子的确定、定量，磷酸化等翻译后修 饰的识别，以及蛋白质之间相互作用研究等方面的应用。 ［关键词］蛋白质组学；信号转导 ［中图分类号］Ｑ２５FＱ５０３［文献标识码］Ａ ＡｐｐｌｙｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｉｃＭｅｔｈｏｄｓｔｏＣｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ ＬＩＭｉｎ，ＺＨＯＵＨｕｉ，ＣＵＩＹｉｎ－ｑｉｕ ＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅＬａｂ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｉｍｐｒｏｖｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔｈａｔｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｐｒｏｖｉｄｅｕｓｍｕｃｈｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎｄｎｅｗｉｎ－ ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔｈａｓｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｒｅａｌｉｚｅｄｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｍｏｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｌｅｔｔｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｙｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｄｅｆｉｎｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｒｅ－ ｓｅａｒｃｈｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓFｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ２０世纪９０年代以来，对细胞内信号转导途径的研究逐渐成为国内外生物学界广泛关注的热点。由于信号的传递在细胞的增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因而逐渐成为解决许多重要理论及实践问题的基本思路和有力武器。近年来有关细胞信号转导研究的方法层出不穷。传统地，人们主要利用ＲＮＡ干扰技术、抗体免疫沉淀、３２Ｐ标记结合蛋白质印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法来检测和鉴定信号传递过程中差异表达的信号分子及关键蛋白的磷酸化。这些方法和技术能够做小量的分析，但无法进行大规模的研究。随着双向电泳（ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）和质谱技术的不断完善与发展，蛋白质组学方法越来越多地被用于研究胞内信号转导过程。它弥补了传统方法的不足之处，实现了高通量大规模的研究模式。近年来，蛋白质组学方法应用于信号转导的研究，主要在对蛋白表达谱的检测和定量、翻译后修饰的识别，以及蛋白质之间相互作用图谱的绘制等方面。蛋白质组学方法为我们完整地绘制细胞内信号转导网络图提供了更为可靠的依据。以下就近年来该领域的一些新技术及应用做一简要综述。 １信号蛋白的寻找和确定 细胞受到外界的刺激后，首先吸引许多锚定蛋白、衔接蛋白的结合，引起蛋白的相互作用，并随之引发胞内的一系列信号蛋白的改变（如级联磷酸化事件的发生），最终信号传递到核基因，表达或阻抑表达一些特征蛋白，或者作用于某些特定的细胞器，引发其他生物学效应。由此可见，要了解一种信号途径的具体过程，首先要对该过程的特征信号分子及下游所表达的蛋白进行确定。目前，二维电泳结合质谱技术（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ或ＥＳＩ－ＭＳ）已经成为蛋白质组学的首选工具，来获得不同状态下的细胞全蛋白质组。许多研究通过选择性抑制或激活信号通路并筛选２－ＤＥ的效应分子成功地鉴定了信号转导过程中的靶标。本文作者所在研究室［１］利用２－ＤＥ结合ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，对处于不同生理条件下的ＮＩＨ３Ｔ３细胞的全细胞裂解液进行双向电泳分离及软件分析。在我们筛选的ａＦＧＦ拮抗剂小肽存在的条件下，鉴定出３种表达量下调、１种表达量上升的蛋白，其中鸟苷酸结合蛋白α－１１亚单位和１Ｃ型核因子分别参与胞内ａＦＧＦ信号传导以及转录调控。近来人们又开发出许多以２－ＤＥ为基础的改进方法，包括从样本制备、分离到染色等各方面，来对蛋白进行更好的分离分析，如亚细胞分离、差异凝胶电泳（ＤＩＧＥ）技术等［２］。 ２－ＤＥ的优势是能够更直观地提供信号蛋白的相对分子质量、等电点、相对表达丰度等信息，但它在分离一些ｐＩ过大或过小、疏水性强的低丰度蛋白时有很大的困难。最近研究较多的多维蛋白质鉴定技术（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈ－ｎｉｑｕｅ，ＭｕｄＰＩＴ）［３］弥补了上述缺陷。ＭｕｄＰＩＴ能够更有效地检测疏水蛋白，且在分析来自胞内细胞器的蛋白时具有更高的效率。最常用的是二维液相色谱（２Ｄ－ＬＣ），它首先对蛋白复合物进行酶 ［收稿日期］２００６－０８－３０ ［基金项目］吉林省科技发展计划项目（２００４０４１１－３） ［作者简介］李敏（１９８２－），女，硕士研究生 ［通讯作者］崔银秋，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｃｕｉｙｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ３３６
植物生长发育的各个阶段, 包括胚胎发生、种子萌发、营养生长、果实成熟、叶片衰老等都受到多种植物激素信号的控制。人们对植物激素的生物合成途径、生理作用已有大量阐述，在生产上的应用也已取得很大进展，但对其信号转导途径的认识并不是很全面。今天小编和大家聊一聊，9大类植物激素信号转导途径。 1.生长素 与生长素信号转导相关的三类蛋白组分是:生长素受体相关SCF复合体(SKP1, Cullin and F-box complex)、发挥御制功能的生长素蛋白(Aux/IAA)和生长素响应因子(ARF)。早期响应基因有Aux/IAA基因家族、GH1、GH3、GH2/4、SAUR基因家族、ACS、GST。生长素信号转导通路主要有4条: TIR1/AFBAux/IAA/TPL-ARFs途径、T MK1-IAA32/34-ARFs途径、TMK1/ABP1-ROP2/6-PINs或RICs 途径和SKP2AE2FC/DPB途径。 2.细胞分裂素
细胞分裂素信号转导途径是基于双元信号系统（TCS），通过磷酸基团在主要组分之间的连续传递而实现。双元信号系统主要包含3类蛋白成员及4次磷酸化事件: (ⅰ)位于内质网膜或细胞膜的组氨酸受体激酶(histidine kinases, HKs)感知细胞分裂素后发生组氨酸的自磷酸化；(ⅱ)将组氨酸残基的磷酸基团转移至自身接受区的天冬氨酸残基上；(ⅲ)受体天冬氨酸残基上的磷酸基团转移至细胞质的组氨酸磷酸化转移蛋白(His-containing phosphotransfer protein, HPs)的组氨酸残基上；(ⅳ)磷酸化的组氨酸转移蛋白进入细胞核并将磷酸基团转移至A类或B类响应调节因子(response regulators, ARR s)。在拟南芥中已知的细胞分裂素受体有AHK2、AHK3和AHK4 3个，AHP有6个(AHP1?6)，A类和B类ARR分別有10个和1 2个，它们是细胞分裂素信号转导通路的主要组成部分。
第九章细胞信号转导 细胞通讯：一个信号产生细胞发出的信息通过介质（又称配体）传递到另一个靶细胞并与其相应的受体相互作用，然后通过信号转导产生靶细胞内一系列的生理生化变化，最终表现为靶细胞整体的生物学效应。 信号传导：是指信号分子从合成的细胞中释放出来，然后进行传递。信号传导强调信号的产生、分泌与传送。 信号转导：是指信号的识别、转移与转换，包括配体与受体的结合、第二信使的产生及其后的级联反应等。信号转导强调信号的接收与接收后信号转换的方式与结果。 受体：是一类能够结合细胞外特异性信号分子并启动细胞反应的蛋白质。 第二信使：细胞外信号分子不能进入细胞，它作用于细胞表面受体，经信号转导，在细胞内产生非蛋白类小分子，这种细胞内信号分子称为第二信使。 分子开关：细胞信号传递级联中，具有关闭和开启信号传递功能的分子。 信号通路：细胞接受外界信号，通过一整套特定机制，将胞外信号转化为胞内信号，最终调节特定基因表达，引起细胞的应答反应，这种反应系列称为细胞信号通路。 G蛋白偶联受体：指配体-受体复合物与靶细胞的作用是要通过与G蛋白的偶联，在细胞内产生第二信使，从而将细胞外信号跨膜传递到胞内影响细胞行为的受体。 cAMP信号通路：细胞外信号与细胞相应受体结合，导致细胞内第二信使cAMP 水平的变化而引起细胞反应的信号通路。 （磷脂酰肌醇信号通路）双信使系统：胞外信号分子与细胞表面G蛋白偶联受体结合，激活膜上的磷脂激酶C，使质膜上的PIP2分解成IP3和DAG两个第二信使，将胞外信号转导为胞内信号，两个第二信使分别激活两种不同的信号通路，即IP3-Ca2+和DAG-PKC途径，实现对胞外信号的应答，因此将这种信号通路称为“双信使系统”。 钙调蛋白：真核细胞中普遍存在的Ca2+应答蛋白。 Ras蛋白：Ras基因的产物，分布于质膜胞质侧，结合GTP时为活化状态，结合GDP时失活状态，因此Ras蛋白属于GTP结合蛋白，具有GTP酶活性，具有分子开关的作用。
生长素的作用机理 生长素是发现最早的一类植物激素也是植物五大类激素中的一种．它参与着植物体内很多的生理作用如细胞的伸长生长、形成层的细胞分裂、维管组织的分化、叶片和花的脱落、顶端优势、向性、生根和同化物的运输等。所以研究生长素的作用机理对认识植物生长发育的许多生理过程有着不可估量的意义。 目前对激素作用的机理有各种解释，可以归纳为二：一是认为激素作用于核酸代谢，可能是在DNA转录水平上。它使某些基因活化，形成一些新的mRNA、新的蛋白质（主要是酶），进而影响细胞内的新陈代谢，引起生长发育的变化。另一则认为激素作用于细胞膜，即质膜首先受激素的影响，发生一系列膜结构与功能的变化，使许多依附在一定的细胞器或质膜上的酶或酶原发生相应的变化，或者失活或者活化。酶系统的变化使新陈代谢和整个细胞的生长发育也随之发生变化。此外，还有人认为激素对核和质膜都有影响；或认为激素的效应先从质膜再经过细胞质，最后传到核中。 虽然对激素作用机理有不同的解释，但是，无论哪一种解释都认为，激素必须首先与细胞内某种物质特异地结合，才能产生有效的调节作用。这种物质就是激素的受体。生长素作用于细胞时，首先与受体结合。经过一系列过程，引起细胞壁介质酸化和影响蛋白质合成，最终导致细胞的变化。 1.生长素受体结合蛋白（ABP1） ABP包括位于内质网膜上的ABP-I、可能位于液泡膜上的ABP-∏、位于质膜上ABP -III 以及生长素运输抑制剂 N1-naphthylp- hthalamic acid(NPA)和2，3，5一三碘苯甲酸(TIBA)的结合蛋白4类。 内质网上的ABP1合成后运输到细胞质膜上发挥生长素受体作用。生长素与细胞质膜上的ABP1结合后，钝化的坞蛋白转变为活性状态，并进一步激活质子泵将膜内H+泵到膜外，引起质膜的超极化，胞壁松弛，于是引起细胞的生长反应。内质网上的ABP1可能只是起贮藏库的作用。由于发育或其他信号引起的质膜上ABP1量的改变是通过内质网上的ABP1输出增加或减少调节的。由此可见，ABP1的分布和数量可以调节IAA功能的行使。 研究还发现，各种植物的ABP基因结构相似，编码的前体蛋白都具有主要的功能性结构序列。在氨基末端有一疏水信号序列，利于ABP在内质网膜间的穿透和转移，起信号转导作用；在羧基末端的KDEL四肽结构则使得ABP定位于内质网中的特定区域。研究认为，ABP1是一个同型二聚体糖蛋白，其亚基由163个氨基酸残基组成。如玉米的ABP1由3个组氨酸残基和1个谷氨酸残基组成1个结合部位，内含1个金属阳离子，这个部位极其疏水。在第2和第5位的半胱氨酸残基间还有1个二硫键，当生长素结合到这个部位时，羧酸酯与金属离子结合，而芳香环则与第151位的色氨酸残基等疏水性氨基酸残基结合。对ABP1羧基末端高度保守的氨基酸残基作定点突变时，发现第177位的半胱氨酸残基、第175位的天冬氨酸残基和第176位的谷氨酸残基是ABP1折叠和在质膜上起作用的重要残基，ABP1构象变化引发质膜信号传递。 2.信号转导 生长素信号传导分为两条主要途径：(1)质膜上的生长素结合蛋白(ASP)可能起接收细胞外生长素信号的作用，并将细胞外信号向细胞内传导．从而诱导细胞伸长。2)细胞中存在的细胞液／细胞核可溶性结合蛋白(SABP)与生长素结合，在转录和翻译水平上影响基因表达。生长素要引发细胞内的生化反应和特定基因表
植物Ca2+信号的研究进展 摘要 为了适应环境,调节自身代谢和生长, 在植物的生长发育过程中,需要对各种外界环境刺激以及植物内部生理信息做出反应,因此,植物产生了自己的信号系统。Ca2+作为一种信号分子，它几乎参与了生命体所有的生理生化活动，在植物细胞的信号系统中也起着举足轻重的作用。钙是植物生长发育必需的大量元素之一，在细胞水平上, 钙在细胞分裂、极性形成、生长、分化、凋亡等过程中均有重要的调节功能, 能维持细胞壁, 细胞膜及膜结合蛋白的稳定性并参与调节和控制植物的许多生理生化反应, 是植物代谢的重要调节者。针对国内外对植物Ca2+信号的研究情况,综述了Ca2+信号的产生、Ca2+信号参与的各种植物生理过程、Ca2+信号的检测以及其研究的最新进展。 关键词：植物; Ca2+信号; 检测; 研究进展
钙元素广泛存在于自然界和各种生物体内, 而游离态的Ca2+更是在生命活动中扮演着举足轻重的角色, 它几乎参与了生命体所有的生理生化活动。作为一种信号分子, Ca2+在受精、胚胎发育、基因表达、细胞分化、组织形成、代谢调控等过程中都有参与, 可以说, Ca2+信号无处不在[1]。1967年, Ridg-wang和Ashley通过向藤壶肌纤维中微注射水母发光蛋白, 第一次测定静息态胞内钙离子浓度[Ca2+]以来, 对于Ca2+信号的研究即风生水起。虽然植物Ca2+信号的研究起步较动物细胞晚, 但依然取得了一些成果。对植物Ca2+信号的研究, 不但能揭示生命的奥秘, 同时能帮助我们更加清楚地了解各种生命活动。为此, 针对国内外对植物Ca2+信号的研究情况, 笔者对Ca2+信号的生理功能、信号的产生、Ca2+信号参与的各种植物生理过程、以及其研究的最新进展进行了综述。 1.Ca2+的功能 Heilbrunn在1937～1952年发表的著作中, 提出了Ca2+在生物系统中复杂和多功能性的观点。认为利用Ca2+是所有活细胞的基本特征。在他提出的“细胞刺激理论”中认为:当细胞受到各种刺激时, 细胞内原来浓度很低的Ca2+水平明显增高。Heilbrunn提出Ca2+的一些细胞效应有:(1)促进细胞黏合和胞间通讯;(2)影响酶活性, 如ATP酶酯酶等;(3)调节细胞分裂;(4)控制细胞的代谢活动;(5)调节细胞溶质中溶胶-凝胶状态转变;(6)高浓度Ca2+可能造成细胞死亡, 溶质中Ca2+浓度如果太高, 会与细胞内的磷酸根产生沉淀, 而磷酸根是细胞能量及物质代谢所必须的;(7)调节细胞膜的透性。钙在维持细胞膜方面有着重要作用, 电镜观察表明, 缺钙导致细胞膜解体, 加钙又恢复常态。可见钙有稳定细胞膜结构, 防止细胞膜损伤的作用。有机酸是植物代谢的中间产物, 钙能和有机酸结合成为可溶性的钙盐结晶, 其中最为普遍的就是草酸钙。据报道, 在外源Ca2+诱导下, 细胞内可形成草酸钙结晶移去外源Ca2+, 结晶会消失。草酸钙的形成有以下生理作用:(1)消除有机酸在植物体内的过多积累。(2)草酸钙的形成过程是可逆的,植物体内钙离子过多形成草酸钙, 消除过量钙对植物的伤害, 当钙离子浓度不能满足植物需要时,草酸钙释放出Ca2+以满足植物的需要。 2.植物Ca2+信号的产生和终止 高度区域化的植物细胞内结构中, 在质膜液泡膜内质网膜上都存在着跨膜的钙离子电化学梯度, 细胞质和细胞核内游离钙离子也呈现不均匀分布, 这些梯度分布在静止状态是相对稳定的, 在受到刺激时会发生变化。钙离子梯度是钙信号产生的基础，即植物细胞Ca2+空间分布的不均衡性是产生Ca2+信号的生物基础。植物细胞中, 静息态的胞内Ca2+浓度([Ca2+] i)为100～200nM, 而细胞外(细胞壁)和细胞内(内质网、液泡、线粒体、高尔基体、细胞核)钙离子库中钙离子浓度却是胞内的数十倍, 达到了1～10mM[2,3]。当细胞受到信号刺激时, Ca2+从钙离子库中释放, 使胞内Ca2+浓度瞬间升高,激活Ca2+依赖蛋白和激酶CPKs引起细胞代谢以及基因表达的改变。当Ca2+重新进入细胞内钙离子库或流出细胞进入胞外钙离子库时, 信号得以终止。钙离子浓度的调节是通过各种钙离子通道, 钙离子泵和钙离子转运来实现的[4]。 3.植物Ca2+信号的多样性 Ca2+信号几乎参与了各种植物生理过程, 包括花粉管生长、细胞分裂、受精等;同时, Ca2+信号还参与植物的抗逆反应和对光线的感知。由此可见, Ca2+
细胞受体类型、特点 及重要的细胞信号转导途径 学院：动物科学技术学院 专业：动物遗传育种与繁殖 姓名：李波
学号：2015050509
目录 1、细胞受体类型及特点 (4) 1.1离子通道型受体 (4) 1.2 G蛋白耦联型受体 (4) 1.3 酶耦联型受体 (5) 2、重要的细胞信号转导途径 (5) 2.1细胞内受体介导的信号传递 (5) 2.2 G蛋白偶联受体介导的信号转导 (6) 2.2.1激活离子通道的G蛋白偶联受体所介导的信号通路 (7) 2.2.2激活或抑制腺苷酸环化酶的G蛋白偶联受体 (7) 2.2.3 激活磷脂酶C、以lP3和DAG作为双信使 G蛋白偶联受体介导的信号通 路 (8) 2.2 酶联受体介导的信号转导 (9) 2.2.1 受体酪氨酸激酶及RTK-Ras蛋白信号通路 (10) 2.2.2 P13K-PKB(Akt)信号通路 (10) 2.2.3 TGF-p—Smad信号通 (11) 2.2.4 JAK—STAT信号通路 (12)
1、细胞受体类型及特点 受体(receptor)是一种能够识别和选择性结合某种配体(信号分子)的大分子物质，多为糖蛋白，一般至少包括两个功能区域，与配体结合的区域和产生效应的区域，当受体与配体结合后，构象改变而产生活性，启动一系列过程，最终表现为生物学效应。受体与配体问的作用具有3个主要特征：①特异性；②饱和性；③高度的亲和力。 根据靶细胞上受体存在的部位，可将受体分为细胞内受体(intracellular receptor)和细胞表面受体(cell surface receptor)。细胞内受体介导亲脂性信号分子的信息传递，如胞内的甾体类激素受体。细胞表面受体介导亲水性信号分子的信息传递，膜表面受体主要有三类：①离子通道型受体(ion—channel—linked receptor)；②G蛋白耦联型受体(G—protein —linked receptor)；③酶耦联的受体(enzyme—linked recep—tor)。第一类存在于可兴奋细胞。后两类存在于大多数细胞，在信号转导的早期表现为激酶级联事件，即为一系列蛋白质的逐级磷酸化，借此使信号逐级传送和放大。 1.1离子通道型受体 离子通道型受体是一类自身为离子通道的受体，即配体门通道(1igand—gated channel)，主要存在于神经、肌肉等可兴奋细胞，其信号分子为神经递质。神经递质通过与受体的结合而改变通道蛋白的构象，导致离子通道的开启或关闭，改变质膜的离子通透性，在瞬间将胞外化学信号转换为电信号，继而改变突触后细胞的兴奋性。如：乙酰胆碱受体以三种构象存在，两分子乙酰胆碱的结合可以使之处于通道开放构象，但该受体处于通道开放构象状态的时限仍十分短暂，在几十毫微秒内又回到关闭状态。然后乙酰胆碱与之解离，受体则恢复到初始状态，做好重新接受配体的准备。离子通道型受体分为阳离子通道，如乙酰胆碱、谷氨酸和五羟色胺的受体，和阴离子通道。 1.2 G蛋白耦联型受体 三聚体GTP结合调节蛋白(trimeric GTP—binding regulatory protein)简称G蛋白，位于质膜胞质侧，由a、p、-／三个亚基组成，a和7亚基通过共价结合的脂肪酸链尾结合在膜上，G蛋白在信号转导过程中起着分子开关的作用，当a亚基与GDP结合时处于关闭状态，与GTP结合时处于开启状态，“亚基具有GTP酶活性，能催化所结合的ATP 水解，恢复无活性的三聚体状态，其GTP酶的活性能被RGS(regulator of G protein signaling)增强。RGS也属于GAP(GTPase activating protein)。 G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白(图10—6)，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白耦联。通过与G蛋白耦联，调节相关酶活性，在细胞内
第十一章细胞的信号转导 一、名词解释 1、细胞通讯 2、受体 3、第一信使 4、第二信使 5、G 蛋白 6、蛋白激酶A 二、填空题 1、细胞膜表面受体主要有三类即、、和。 2、在细胞的信号转导中，第二信使主要有、、、和。 3、硝酸甘油之所以能治疗心绞痛是因为它在体内能转化为，引起血管，从而减轻的负荷和的需氧量。 三、选择题 1、能与胞外信号特异识别和结合，介导胞内信使生成，引起细胞产生效应的是( )。 A、载体蛋白 B、通道蛋白 C、受体 D、配体 2、下列不属于第二信使的是（）。 A、cAMP B、cGMP C、DG D、CO 3、下列关于信号分子的描述中，不正确的一项是（）。 A、本身不参与催化反应 B、本身不具有酶的活性 C、能够传递信息 D、可作为酶作用的底物 4、生长因子是细胞内的（）。 A、结构物质 B、能源物质 C、信息分子 D、酶 5、肾上腺素可诱导一些酶将储藏在肝细胞和肌细胞中的糖原水解，第一个被激活的酶是（）。 A、蛋白激酶A B、糖原合成酶 C、糖原磷酸化酶 D、腺苷酸环化酶 6、（）不是细胞表面受体。 A、离子通道 B、酶连受体 C、G蛋白偶联受体 D、核受体 7、动物细胞中cAMP的主要生物学功能是活化（）。 A、蛋白激酶C B、蛋白激酶A C、蛋白激酶K D、Ca2+激酶 8、在G蛋白中，α亚基的活性状态是（）。 A、与GTP结合，与βγ分离 B、与GTP结合，与βγ聚合 C、与GDP结合，与βγ分离 D、与GDP结合，与βγ聚合
9、下面关于受体酪氨酸激酶的说法哪一个是错误的 A、是一种生长因子类受体 B、受体蛋白只有一次跨膜 C、与配体结合后两个受体相互靠近，相互激活 D、具有SH2结构域 10、在与配体结合后直接行使酶功能的受体是 A、生长因子受体 B、配体闸门离子通道 C、G蛋白偶联受体 D、细胞核受体 11、硝酸甘油治疗心脏病的原理在于 A、激活腺苷酸环化酶，生成cAMP B、激活细胞膜上的GC，生成cGMP C、分解生成NO，生成cGMP D、激活PLC，生成DAG 12、霍乱杆菌引起急性腹泻是由于 A、G蛋白持续激活 B、G蛋白不能被激活 C、受体封闭 D、蛋白激酶PKC功能异常 13下面由cAMP激活的酶是 A、PTK B、PKA C、PKC D、PKG 14下列物质是第二信使的是 A、G蛋白 B、NO C、GTP D、PKC 15下面关于钙调蛋白（CaM）的说法错误的是 A、是Ca2+信号系统中起重要作用 B、必须与Ca2+结合才能发挥作用 C、能使蛋白磷酸化 D、CaM激酶是它的靶酶之一16间接激活或抑制细胞膜表面结合的酶或离子通道的受体是 A、生长因子受体 B、配体闸门离子通道 C、G蛋白偶联受体 D、细胞核受体 17重症肌无力是由于 A、G蛋白功能下降
生长素的作用机理 学院：农业资源与环境专业：10农资学号：2010310501 姓名：夏选发生长素(auxin)是最早被发现的植物激素，它的发现史可追溯到1872年波兰园艺学家西斯勒克(Ciesielski)对根尖的伸长与向地弯曲的研究。他发现，置于水平方向的根因重力影响而弯曲生长，根对重力的感应部分在根尖，而弯曲主要发生在伸长区。他认为可能有一种从根尖向基部传导的剌激性物质使根的伸长区在上下两侧发生不均匀的生长。它能调控细胞伸长、细胞分裂与分化、顶端优势、向性生长、根原基的发生、胚的形成和维管分化等。很多研究表明, 生长素是茎伸长生长所必需的, 生长素的亏缺(deficiency)会导致茎伸长受阻。外源生长素处理能促进茎切段的伸长, 促进亏缺生长素的整体植株茎伸长。作为植物的一种重要的内源激素，生长素参与植物生长和发育的诸多过程，如根和茎的发育和生长、器官的衰老、维管束组织的形成和分化发育，以及植物的向地和向光反应等。 研究生长素的作用机制对深入认识植物生长发育的许多生理过程有重要意义。早在上个世纪30年代有关生长素作用机制的研究就已经开始，到60年代末、70年代初形成两派学说，即基因表达学说和酸生长学说。之后，随着生物化学和生物学技术的发展，两种学说都有了新的发展，但同时其所存在的不足之处也日益暴露。近年来，由于分子生物学和遗传工程实验手段的广泛应用，在分子水平上的生长素作用机制研究日益深入，尤其是生长素信号转导途径的研究已经成为当前的热点。 1.生长素的作用机理 生长素, 如IAA作用于细胞核上, 作为基因的脱阻抑剂, 首先是被阻抑的基因活化。随之, 在已活化的基因控制下, 通过调节酶蛋白的种类和数量来表现其继发的生理作用[ 2 ]。生长素的生物试验表明，用生长素处理时，细胞壁变软，因而增加了其可塑性。可塑性是指细胞壁不可逆转的伸展张力。生长试验证明，在生长素的影响下，细胞壁可塑性的变化与生长素所促进的生长增加幅度是很相似的。因此可以认为，生长的增加确实是通过细胞壁可塑性的变化而实现的。这些生长试验，必须以活的器官或组织为材料，并在呼吸作用能够顺利进行的条件才能完成。这就表明，生长素诱导生长是在原生质内进行的。试验证明，在生长素的影响下，原生质的粘度下降、流动性增加、呼吸作用增强，对水和溶质的透性也提高，从而导致更多的营养物质和水分进入细胞，为细胞增大体积提供了必要的物质条件。 1.1酸生长理论
第十五章 细胞信号转导 教材精要与重点解析 一、 信息物质的定义与分类 细胞间信息物质：凡由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质，又称为第一信使 细胞内信息分子：细胞内传递细胞调控信号的化学物质 第二信使：Ca ++ 、cAMP 、cGMP 、DAG 、IP 3、Cer 、花生四烯酸及其代谢产物等小分子化合物 第三信使：负责细胞核内外信息传递的物质，又称为DNA 结合蛋白 二、 受体的定义、分类、作用特点及调节 受体：细胞膜上或细胞内能识别生物活性分子并与之结合的成分，能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应。本质是蛋白质，个别是糖脂 配体：能与受体呈特异性结合的生物活性分子，细胞间信息物质就是最常见的配体 膜受体 ? 环状受体：配体依赖性离子通道 ? G 蛋白偶联受体（GPCRs ）：又称七个跨膜螺旋受体 ? 信息转导：激素→受体→G 蛋白→酶（腺苷酸环化酶AC 或磷脂酶C ）→第二信使→ 蛋白激酶→ 酶或功能蛋白→生物学效应 ? G 蛋白：鸟苷酸结合蛋白，和GTP 或GDP 结合的位于细胞膜胞液面的外周蛋白，由三个亚基组成。 活化型为α亚基与GTP 结合并导致βγ二聚体脱落时 ? 单个跨膜α螺旋受体：三型 ? 酪氨酸蛋白激酶受体型
?非酪氨酸蛋白激酶受体型 ?转化生长因子β（TGFβ）受体 ?具有鸟苷酸环化酶（GC）活性的受体 ?膜受体：配体包括心钠素和鸟苷蛋白 ?可溶性受体：配体为NO和CO 胞内受体： ?多为反式作用因子 ?配体为类固醇激素、甲状腺素和维甲酸 ?四个结构区域：高度可变区、DNA结合区、铰链区、激素结合区 表15-3 膜受体与胞内受体的比较 受体作用的特点 ①高度专一性②高度亲和力③可饱和性④可逆性⑤特定的作用模式 受体活性的调节机制有： ①磷酸化与去磷酸化②膜磷脂代谢的影响③酶促水解作用④G蛋白调节 三、膜受体介导的信息转导 cAMP-蛋白激酶途径 ?激素调节物质代谢的主要途径 ?PKA是四聚体组成的别构酶，共有四个cAMP结合位点 ?配体为：胰高血糖素、肾上腺素和促肾上腺皮质激素 ?作用机制：受体＋配体→腺苷酸环化酶AC激活→cAMP浓度升高→激活PKA（蛋白激酶A）→使 许多蛋白质的特定的组氨酸残基或苏氨酸残基磷酸化，调节细胞内代谢 Ca++-依赖性蛋白激酶途径 ?以靶细胞内Ca++-浓度变化为特征，激活PKC（蛋白激酶C） ?PKC有12种同工酶 ?配体为：促甲状腺素释放激素、去甲肾上腺素和抗利尿激素 ?作用机制：受体＋配体→激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）→DAG＋IP3→激活PKC（蛋白 激酶C）→引起一系列靶蛋白的组氨酸残基或苏氨酸残基磷酸化，调节细胞内代谢 cGMP-蛋白激酶系统 ?配体是：心钠素（ANP）、NO、CO ?PKG是单体酶，分子中有一个cGMP结合位点 ?作用机制：受体＋配体→激活鸟苷酸环化酶→cGMP浓度升高→激活PKG（蛋白激酶G）→特定蛋 白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，产生生物学效应 酪氨酸蛋白激酶体系 ?没有第二信使的参与，但都涉及TPK（酪氨酸蛋白激酶）的激活 ?质膜上的受体型TPK，如胰岛素受体、表皮生长因子受体及某些原癌基因（erb-B、kit、fms等）编码的受体，属催化型受体。产生受体型TPK-Ras-MAPK途径