文章编号：１００１．０５８０（２００７｝０３．０３３１．０３中图分类号：Ｒ１１４文献标志码：Ａ
总黄曲霉毒素ＥＬＩＳＡ定量检测试剂盒研制＊
计融，柳桢，江涛，郑佳，李敏
【实验研究】
摘要：目的研究并建立敏感、特异和快速的针对食品中总黄曲霉毒素的ＥＬＩＳＡ检测方法，形成具有我国自主知识产权的快速定量检测试剂盒。方法在生产抗总黄曲霉毒素单克隆抗体基础上，利用间接竞争ＥＬＩＳＡ方法，研制出食品中总黄曲霉毒素快速检测试剂盒，并对试剂盒的各项技术参数进行测定。结果该试剂盒对黄曲霉毒素Ｂ＋Ｇ标准品的最低检出浓度为０．２６ｎｇ／ｍｌ，标准曲线的线性范围为０．２６～２０．００ｎｇ／ｒｒａ，线性方程Ｙ＝一０．４４６３ｘ＋０．３５３２（Ｒ２＝０．９９１５）；对黄曲霉毒素Ｂ＋Ｇ５０％的抑制浓度为２．０８ｎｇ／ｍｌ；试剂盒的条内变异系数为４．１８％，条间变异系数为５．２１％，抗体亲和力常数为１．５２×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ；对玉米３个加标水平的平均回收率分别为９８．６３％，９４．５６％和１１２．０５％；对花生的３个加标水平的平均回收率分别为８８．６６％，８７．５０％和８５．６０％。试剂盒３７℃可放置９６ｈ以上；试剂盒对黄曲霉毒素Ｂ】、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２的交叉反应率分别为１００％，５７．５％，１０４％和１９％，与其他真菌毒素无交叉反应。结论研制出的ＥＬＩＳ试剂盒能定量检测食品中总黄曲霉毒素。
关键词：总黄曲霉毒素；单克隆抗体；试剂盒
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＥＬＩＳＡ—ｋｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒＡｆｌａｔｏｘｉｎｓＪＩＲｏｎｇ，ＬＩＵＺｈｅｎ。ＪＩＮＧＴａｏ，ｅｔａ１．ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉ—ｔｕｔｅｆｏｒＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｏｏｄＳａｆｅｔｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｒａｐｉｄｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔＯ—ｔａｌａｆｌａｔｏｘｉｎｓ．ＴｏｄｅｖｅｌｏｐｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎＥＬＩＳＡ—ｋｉｔｔｈａｔｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇｃｏｕｎｔｒｙｐａｔｅｎｔ．Ｍｅｔｈ优ｌｓＡｒａｐｉｄ．ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＥＬＩＳＡ—ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄ（ＥＬＩＳＡ—ｋｉｔ）ｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｏｎｔｈｅｂａｓｅｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＡｆｌａｔｏｘｉａｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＦｏｒＡｆｌａ．ｔｏｘｉｎ（Ｂ＋Ｇ），ｔｈｅｌｉｍｉｔｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＥＬＩＳＡ—ｋｉｔｗａｓ０．２６ｎｇ／ｍｌ，ｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｗａｓ０．２６～２０．００ｎｇ／ｍ１．ｔｈｅｌｉｎｅａｒｅｑｕａｔｉｏｎｗａｓＹ＝一０．４４６３ｘ＋０．３５３２（Ｒ２＝０．９９１５）．Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５０％ｆｏｒＡｒｉａ—ｔｏｘｉｎ（Ｂ＋Ｇ）ＷａＳ２．０８ｎｇ／ｍ１．Ｔｈｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎｗａｓ４．１８％ｗｉｔｈｉｎｔｈｅｓｔｒｉｐｓ，ａｎｄ５．２１％ａｍｏｎｇｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ０．３０ｐｇ／ｋｇ，２．１０ｏｇ／ｋｇａｎｄ１０．４０％ｗａｓ９８．６３％，９４．５６％ａｎｄ１１２．０５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｏｒｐｅａｎｕｔｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ０．５０ｐｇ／ｋｇ，２．００弘ｇ／ｋｇａｎｄ４．００ｐｇ／ｋｇｗａｓ８８．６６％，８７．５０％ａｎｄ８５．６０％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｔｈｅｋｉｔｃｏｕｌｄｂｅｓｔｏｒｅｄａｔ
３７℃ｏｖｅｒ９６ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅ
ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｏｎｉ＇ａｔｅｗｉｔｈａｆｔａｔｏｘｉｎＢｌ，１５，Ｇｉ，Ｇ２ｗａｓｌｏｏ％５７．５％，１０４％，１９％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｎｏｃ煅ｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｏｔｈｅｒ
ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅＥＬＩＳＡ—Ｋｉｔｆｏｒｔｏｔａｌａｆｌａｔｏｘｉｎｓｉｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｏｔａｌａｆｌａｔｏｘｉｎａ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ；ＥＬＩＳＡ—Ｋｉｔ
黄曲霉毒素（Ａｆｌａｔｏｘｉｎ）是黄曲霉（ＸｓｐｅＥｉＵｕｓｆｌａｖｕｓ）和寄生曲霉（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）等产生的一组结构类似的次生代谢产物。据Ｇａｂａｌ等［１］报道，有４０％的黄曲霉菌株培养物可同时测出黄曲霉毒素Ｂｌ，Ｂ２，Ｇｌ’Ｇ２（ＡＦＢｌ、ＡＦｌ５、ＡＦＧｌ、ＡＦＧ２）。同时黄曲霉毒素的毒性具有协同作用，因此，９０％以上的国家都制定了食品中总黄曲霉毒素的限量标准。目前总黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层层析法、色谱法。我国执行的食品中总黄睦霉毒素Ｂｌ＋Ｂ２＋Ｇ１＋Ｇ２的国家标准测定方法是薄层色谱法和微柱筛选法。均为目测半定量法，最低检出浓度为５／Ｌｇ／ｋｇ【２】。这些方法因受本身的限制，精确度低、敏感性差；样品前处理过程复杂费时；或需要价格昂贵的仪器。检测成本高，难以推广应用，影响了粮油食品中黄曲霉毒素的有效监测。酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）是在免疫学和细胞工程学基础上发展的一种微量检测技术，特别适合于对黄曲霉毒素污染监控中大量样本的筛检。本研究以Ｂ细胞杂交瘤技术以能分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株为基础，建立了检测玉米、花生中总黄曲霉毒素的ＥＬＩＳＡ检测。方法，并初步研制出具有我国自主知识产权的ＥＬＩＳＡ试剂盒。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１主要仪器Ｃ０２培养箱（美国Ｑｕｅｕｅ公司）；洁净工作
＊基金项目：国家“十五”科技重大专项（２００１ＢＡ８０４Ａ２０）作者单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京１０００２１作者简介：计融（１９６２一），男，北京人，硕士，研究员，主要从事食品卫生研究。台（北京半导体设备一厂）；生物倒置显微镜（日本欧林巴斯光学株式会社）；酶标分析仪（瑞士ＳＵＮＲＩＳ公司）；电子分析天平（瑞士Ｍｅｔｔｌｅｒ公司）；低温高速离心机（德国Ｈｅｒｍｌｅ公司）；电泳仪（美国ＢＩＯ—ＲＡＤ公司）等。
１．１．２试剂ＡＦＢ，一ＢＳＡ、黄曲霍毒素（Ｂ＋Ｇ）（ＡｆｌａｔｏｘｉｎＢ＋Ｇ）、黄曲霉毒素Ｂ１（ＡｆｌａｔｏｘｉｎＢｌ’ＡＦＢｌ）黄曲霉毒素Ｂ２（ＡｆｌａｔｏｘｉｎＢ２，ＡＦｌ５）、黄曲霉毒素Ｇ１（ＡｆｌａｔｏｘｉｎＧｌ，ＡＦＧｌ）、黄曲霉毒素Ｇ２（ＡｆｌａｔｏｘｉｎＧ２，ＡＦＧ２）、Ｔ一２毒素（Ｔ一２ｔｏｘｉｎ）、赭曲霉毒素Ａ（ＯｃｈｒａｔｏｘｉｎＡ）、展青霉素（Ｐａｔｕｌｉｎ）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Ｄｅｏｘｙｎｉｖｓｈｎｏｌ，ＤＯＮ）、玉米赤霉烯酮（Ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ，ＺＥＮ）、匙孔喊血蓝素（ＫＬＨ）、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、伏马菌素Ｂ１、抗体亚类测定试剂盒（ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＧｌ，ＩｇＧ２。，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３）（美国Ｓｉｇｍａ公司）；ＲＰＭｌｌ６４０培养基、选择性培养基、福氏佐剂（完全、不完全）、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、聚乙二醇（ＰＥＧ，ＭＷ５０００）、青霉素，链霉素（美围Ｇｉｂｃ０公司）；辣根过氧化物酶羊抗鼠ＩｇＧ（北京中山试剂公司）；３０％Ｈ２０２（优级纯，北京化工厂）。
１．１．３溶液系统ＥＬＩＳＡ使用液参考文献［３］制备。１．１．４细胞系与实验动物小鼠骨髓瘤细胞系Ｓｐ２／０由本室传代，并经８一氮杂鸟嘌呤处理。雌性ＢＡＬＢ／ｅ小鼠，体重１８－－２０ｇ（军事医学科学院实验动物研究所动物繁育场）。１．１．５抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞株本研究室自制。
１．２方法
１．２．１单克隆抗体生产将抗总黄曲霉毒素杂交瘤细胞注入ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔。获得含抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的
万方数据
腹水，并将所得腹水采用饱和硫酸铵盐析法进行纯化【４］。１．２．２抗体特性鉴定抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用抗体亚类鉴定试剂盒；抗体的纯度及分子量用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）测定；ＩｇＧ含量采用二喹呆甲酸（ＢＣＡ）蛋白测定试剂盒进行测定；抗体滴度测定采用间接非竞争ＥＬＩＳＡ方法：以ＡＦＢ，一ＢＳＡ为包被抗原，从１：１００００倍开始将抗体进行倍比稀释，以Ｓｐ２／Ｏ细胞培养上清为阴性对照，以（Ａｉｎ，ｔ—Ａ空白）／（Ａ对照一Ａ空白）／＞２．１的最大稀释倍数为滴定终点；抗体的特异性和抗体的灵敏度用间接竞争抑制性ＥＬＩＳＡ法进行测定，参试毒素为黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ＤＯＮ）、赭曲霉素Ａ（ＯＡ）、伏马菌素Ｂ１、Ｔ一２毒素和载体蛋白ＢＳＡ。?
１．３试剂盒各项技术参数研究
１．３．１方法的检出限（灵敏度）用间接非竞争ＥＬＩＳＡ法作抗体滴度测定，找出合适的抗体工作浓度。再用间接竞争ＥＬＩＳＡ法作棋盘滴定，找出合适的包被浓度与毒素的竞争浓度，最后作标准曲线，确定线性范围及检出限。
１．３．２方法的回收率试验根据试剂盒的检测范围确定加标浓度，在不含黄曲霉毒素的玉米和花生样品中分别进行高、低２个浓度的加标回收试验，每个加标水平做５个重复的平行样。样品的提取方法为：样品粉碎后使其９０％通过２５０～５００ｐｔｍ网筛。称取５９加到１００ｍｌ具塞三角烧瓶中，加入０．５ｇＮａＣｌ及２５ＩＩｌｌ甲醇水溶液（７０：３０，ｖ／ｖ），剧烈震荡３０ｍｉｎ后过滤。滤液用纯水稀释１０倍进行检测。样品中黄曲霉毒素浓度（弘ｇ／Ｋｇ）＝ＣＤＸ／Ｗ。式中：Ｃ一酶标板上测的黄曲霉毒素浓度（Ｉｌｇ／ｍ１），根据标准曲线求得；Ｄ一样品提取液的体积（ｍ１）；Ｘ一稀释倍数；Ｗ一样品重量（ｇ）。
１．３．２试剂盒稳定性试验对试剂盒稳定性采用３７℃加速破坏实验进行研究，将试剂盒分别放置于４℃和３７℃，每隔２４ｈ进行ＥＬＩＳＡ测定，测定阴性对照（不加毒素Ｅｊ０）和阳性（即５０％的抑制毒素浓度Ｂ）的吸光度（Ａ）值，计算两者的比值（Ｂ／Ｂｏ）。当Ｂｏ＜０．６个吸光度（Ａ）值，或Ｂ／Ｂ０＜Ａ０．７时，即可判定ＥＬＩＳＡ试剂盒已失效。在３７℃放置２４ｈ相当于在４℃放置４５ｄ。从试剂盒的生产日期到失效日期的时间可确定为ＥＬＩＳＡ试剂盒的稳定周期，即保质期。
１．３．３方法的专一性（特异性）用交叉反应率表示（见抗体特性鉴定）。
１．３．４方法的重复性方法的重复性亦即实验室内的变异程度，分别作加标量为２ｐｇ／ｋｇ和４肛ｇ／ｋｇ的各５个平行样的回收率，计算其平均回收率和变异系数。
１．３．４方法的再现性方法的再现性亦即实验室间的变异程度，３个实验室分别作加标量为２和４飕／ｋｇ的各５个重复的回收率，计算３个实验室间的变异系数。
２结果
２．１单克隆抗体特性鉴定杂交瘤细胞株产生的腹水抗体经纯化后，抗体滴度约为１：２．５６×１０７，抗体的工作浓度为１：１．６×１０６。抗体检测黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇｌ、Ｇ２标准毒素的灵敏度分别为０．２５，０．５，０．１５和１ｎｇ／ｍｌ。该抗体的亚类为Ｉ葚，ＧＩ，抗体的亲和力常数为１．５２×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ。抗体的相对分子量约为１５０ＫＤ纯化后ＩｇＧ浓度为１０ｇ／Ｌ。抗体与黄曲霉毒素Ｂ】、Ｂ２、Ｇｌ、Ｇ２的交叉反应分别为１００％，５７．５％，１０４％和１９％；与Ｔ一２毒素、赭曲霉毒素Ａ、展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素Ｂ１等其他真菌毒．素和牛血清白蛋白的交叉反应均＜０．１％。
２．２试剂盒技术参数经过棋盘滴定，抗体的最适工作浓度为１：１．６×１０６，ＡＦＢｌ一ＢＳＡ的最适包被浓度为０．０６２５ｐｇ／ｍｌ。选择黄曲霉毒素（Ｂ＋Ｇ）标准品（０，０．０２６，０．０５２，０．１３，０．２６，０．５２，１．３，２．６，５．２，１３，２６，５２，１３０，２６０Ｉｌｇ／ｍ１）共１４个浓度制作标准竞争校正曲线，线性方程Ｙ＝一０．４４６３ｘ＋０．３５３２（Ｒ２＝０．９９１５），最低检出浓度是０．２６ｒｉｇ／ｍｌ，标准曲线的线性范围为０．２６～２０．００ｒｉｇ／ｍｌ，５０％的抑制浓度为２．０８ｒｉｇ／ｍｌ。试剂盒的条内变异系数为４．１８％，条间变异系数为５．２１％。２．３回收率测定对玉米做黄曲霉毒素（Ｂ＋Ｇ）０．３０，２．１０和ｌＯ．４０肛ｇ／ｋ９３个加标浓度的回收率实验。其中０．３肛／ｋｇ加标回收率的范围为１１２．０５％～８８．０４％，平均回收率９８．６３％；２．１弘ｇ／ｋｇ加标回收率的范围为８．１３％～８６．５８％，平均回收率９４．５６％，１０．４”ｇ／ｋｇ加标回收率的范围为１１７．２４％～１０９．０４％。平均回收率１１２．０５％。对花生做黄曲霉毒素（Ｂ＋Ｇ）０．５０，２．００和４．００ｐｇ／ｋｇ３个加标浓度的回收率实验。其中０．５ｄｋｇ加标回收率的范围为１０３．７５％～７７．３８％，平均回收率８８．６６％；２．０弘ｇ／ｋｇ加标回收率的范围为１０３．８６％～７５．６７％，平均回收率８７．５０％；４．０熘／ｋｇ加标回收率的范围为９７．９６％～７５．７６％，平均回收率８５．６０％。２．４试剂盒稳定性试验经３７℃稳定试验，试剂盒在３７℃下存放９６ｈ，超过９６ｈ后其吸光度值开始下降并Ａ＜０．６。２．５方法的重复性和再现性经ＥＬＩＳＡ测定其２个加标水平（２．０～４．０ｐｇ／ｋｇ）实验室内变异系数分别是４．１％和６．３％；实验室间平均变异系数分别为７．９％和８．３％。
２．６方法的专一性将试剂盒所用抗体与Ｔ一２毒素、赭曲霉毒素Ａ、展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素Ｂ１等其他真菌毒素和牛血清白蛋白进行交叉反应试验，其交叉反应率均＜０．１％，说明该试剂盒有很好的专一性。２．７试剂盒与｝玎？ＬＣ方法验证分别使用本研究研制的试剂盒和高效液相色谱（｝玎？ＬＣ）方法对玉米、花生盲样同时进行检测，并将２种方法的检测结果进行Ｔ检验，Ｐ＞Ｏ．０５，说明２种方法对样品的’检测结果差异无统计学意义。
３讨论
黄曲霉毒素对人和动物均产生严重的危害，是各国对粮食和饲料重点监控的指标。由于黄曲霉菌株培养物可同时产生ＡＦＢｌ、Ａ踢、ＡＦＧｌ和崛，而且黄曲霉毒素的毒性具有
协同作用，因此，检测食品中总黄曲霉毒素的污染水平具有重要意义。本研究在制备出针对黄曲霉毒素Ｂｌ，Ｂ２、Ｇｌ、Ｇ２均有较好的交叉反应并且有较好的灵敏度和特异性的单克隆抗体基础上，研制具有我国自主知识产权的总黄曲霉毒素ＥＬＩＳＡ检测试剂盒。该试剂盒最低检出浓度为０．２６肚ｇ／ｋｇ，对样品的最低检出量为１．５ｐｇ／ｋｇ，与国外同类试剂盒灵敏度相似。试剂盒所用单克隆抗体与其他参试真菌毒素均无交叉反应，具有较高的特异性。对玉米３个加标水平的平均回收率为９８．６３％，９４．５６％和１１２．０５％，对花生的３个加标水平的平均回收率为８８．６６％，８７．５０％和８５．６０％，符合技术要求（７０％～１２０％）。经实验室间验证，此试剂盒再现性和重复性均较好，变异系数（Ｃｖ）均＜２０％。以上技术参数均达到试剂盒的技术要求。而且具有简便、灵敏、快速，特异性好并可同时检测大量样品等优点。值得推广应用。本研究成功地制备出针对黄曲霉毒素（Ｂ＋Ｇ）具有高亲合力、高特异性的单克隆抗体，建立了总黄曲霉毒素的ＥＬＩＳＡ检测方法并研制出具有我
万方数据
中国公共卫生２００７年３月第２３卷第３期ＣｈｉｎＪＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＭａｒ２００７Ｖ０１．２３Ｎｏ．３３３３
国自主知识产权的总黄曲霉毒素ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，对开展全国性黄曲霉毒素污染调查及制定粮食中总黄曲霉毒素推荐限量标准建议值具有科学价值和应用意义。
参考文献
［１ＪＧａｂａｌＭＡ，ＨｅｇａｚｉＳＡ，ＨａｓｓａｎｉｎＮ．ＡｆｌａｔｏｘｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＡｆｌａｖｕｓｉｓｏｌａｔｅｓ［Ｊ］．ＶｅｔＨｕｍＴｏｘｉｃｏｌ，１９９４，３４：５１９～５２１．［２］中华人民共和国国家标标食品卫生检验方法［Ｊ］．２００４，１８９—１９４．
［３］江涛，李凤琴，王环宇，等．赭曲霉毒素Ａ免疫学检测方法的研究［Ｊ］．中国公共卫生，２００４，２０（５）：５５６—５５８．
［４］董志伟，王琰．抗体工程［Ｍ］．２版．北京：北京医科大学出版社，２００２：１８５—１８７．
收稿日期：２００６—０６．１３（文涛编辑赵淑艳校对）
文章编号：ｌｂ０１．０５８０（２００７｝０３．０３３３．０１中图分类号：Ｒ１５１．１文献标志码：Ｂ
海参中硒微波消解原子荧光光谱法测定
李春一，冯淑芹
硒是人体所必须的微量元素之一，在海产品中含量较高，
尤其是在海参中。本文采用微波消解处理样品，氢化物发生
原子荧光法测定海参中的硒，避免了由于常压敞开湿法消解
样品造成的元素损失，试剂用量少，减少了试剂引入的沾污，
提高了灵敏度、操作简单、快速。结果可靠。现报道如下。
材料与方法（１）仪器与试剂：ＡＦＳ一２３０型双道原子荧
光光度计、硒特制空心阴极灯（北京海光仪器公司）。ＭＤＳ一
２００３Ｆ型空压密闭微波快速消解系统（上海新仪微波化学科
技有限公司）。氩气（９９．９％）、硝酸、盐酸、氢氧化钾均为优级
纯，硼氢化钾（进口分装）、铁氢化钾（分析纯）、硒标准溶液（国
家标准物质研究中心）；ＧＢＷ（Ｅ）０８０２１５（１００．ｇ／ｍ１），使用时
稀释成１肛ｇ／“的标准使用液。（２）方法：按食品卫生检验方
法理化部分［ＧＢ／”００９．９３—２００３）［１】。（３）仪器条件：光电倍
增管负高压２９０Ｖ，空心阴极灯灯电流７０ｍＡ；原子化器高度
８ｍｍ；原子化器温度２００℃；载气流量４００ｍｌ／ｍｉｎ；屏蔽气流
量１０００ｍｌ／ｍｉｎ；测量方式：标准曲线法；读数方式：峰面积；
延迟时间：１．０ｓ；读数时间：１０Ｓ。（４）样品处理：将干海参粉
碎后，准确称取样品０．５ｇ，加５．０ｍｌ硝酸，置预处理炉预消解
１２０℃１０ｒａｉｎ，依消解炉操作规程，设定初始压力０．５，１．０，
１．５ＸＶ［Ｖａ，共８ｒａｉｎ冷却后开罐。消化液无色透明，取消解内
罐，置预处理炉内赶尽余酸，再加入１．０ｍｌ盐酸，消化５ｍｉｎ，
最后用３．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸转移并定容至５０ｍ１容量瓶中备用。
同时作空白及回收实验。
结果与讨论（１）消化方式的选择：湿法消化所用试剂为
盐酸、硝酸、高氯酸，消化时间为６０ｒａｉｎ，结果为１．５５弘ｇ／ｇ，回
收率９４．２％。微波消解所用试剂为盐酸、硝酸，消化时间为
１６ｒａｉｎ，结果为１．６３，ｇ／ｇ，回收率９９．３％。实验结果显示，微
波消解法具有试剂用量小，消化时间短，灵敏度高等优点。
（２》仪器参数选择：负高压增大，仪器灵敏度也增高，但负高压
过高，结果的重现性差；灯电流越大，激发强度越大，灵敏度越
高，但灯电流过大会降低灯的使用寿命。本文选择负高压
２９０Ｖ、灯电流７０ｍＡ。（３）介质和酸度：市售硫酸中大多含有
硒，硝酸会使硒的荧光值下降，盐酸可以完全将硒（Ⅵ）还原成
硒（Ⅳ）。并且碱金属不会干扰实验，故本法选用盐酸作为介【检验技术】
质。氢化物反应要求有适宜的酸度，盐酸浓度为１．５～５．０
ｍｏｌ／Ｌ，硒的灵敏度不受影响，酸度低于１．５ｍｏｌ／Ｌ时，结果偏
低。本试验选用３．０ｍｏｌ／Ｌ的盐酸作为介质。（４）硼氢化钾
浓度的选择：分别配制６．０，８．０，１０．０，１２．０，１５．０ｇ／Ｌ硼氢化
钾溶液，在选定的条件进行试验（样中硒标的加入量均为５
ｎｇ／ｍ１），荧光强度为３５９．２８，４４８．９６，４１７．５１，３９０．７８，２７４．２６
（减空白的荧光强度）。从结果可见，硼氢化钾浓度为６～１２
ｍｏｌ／Ｌ时，信号强度基本差别不大，而当硼氢化钾浓度为１５
ｍｏｌ／Ｌ时，荧光强度下降。这是由于高浓度的硼氢化钾不稳
定，易产生大量的氢气。因此，本法选用８．０ｍｏｌ／Ｌ硼氢化钾
溶液。（５）铁氰化钾浓度的选择：铁氰化钾可消除干扰元素的
影响，提高灵敏度，加入量越多，荧光强度越大。但考虑到仪器
的灵敏度和稳定性，选择１０％的铁氰化钾。（６）共存元素的
影响：本法对常见的几种元素的干扰情况分别进行试验，采用
盐酸作为介质，碱土金属Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｍ９２＋、Ａ１３＋等离子不干扰
测定，而加入１０％铁氢化钾，主要是消除ｃｕ２＋（１００ｍｇ／Ｌ）、
Ａｇ＋（０．１ｍｇ／Ｌ）、Ｉ一（１００ｍｇ／Ｌ）、Ｎｉ２＋（４００ｍｇ／Ｌ）等离子的干
扰。（７）标准曲线：用硒标准溶液分别配制成含０．０，１．０，
５．０，１０．０，２０．０，３０．０，４０．０，８０．０ｎｇ／ｍｌ的标准系列。回归方
程为：Ｉｆ＝８７．１℃＋５．０５６，相关系数ｒ＝０．９９９９，检出限为
０．０１４（ｎｇ／ｍ１）。试验表明，在选定的条件下，硒标准溶液在１
～８０ｎｇ／ｍｌ的范围内均呈线形关系，该曲线线形良好。（８）精
密度试验：分别称取６份样品，重复６次测定，结果为１．６３，
１．７７，１．５６，１．６１，１．６５，１．６４弘ｇ／ｇ，均值为１．６３肛ｇ／ｇ，标准偏
差为０．０７，相对标准偏差为４．３％。采用加标法做回收试验。
加入量为２，５，１０ｐｇ／ｇ，结果为３．５９，６．８０，１１．５０ｐｇ／ｇ。回收
率为９７．７％～１０３．８％，平均值在９９．３％。
小结由以上实验结果得出，运用微波消解、氢化物发
生原子荧光光谱法对海参中硒进行消化测定，试剂用量小，基
体干扰少，操作方便快速，灵敏度高，结果满意，值得推广应用。
参考文献
［１］食品卫生检验方法理化部分［ｓ］．ＧＢ／Ｔ５００９．９３—２００３
收稿日期：２００６．０６—２１（宋艳萍编辑‘赵淑艳校对）
作者单位：辽宁省阜新市疾病预防控制中心，１２３０００
作者简介：李春一（１９７１一），女，主管检验师，本科，主要从事食品理化检验工作。
万方数据
ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断。 人血管内皮细胞生长因子（VEGF）定量检测试剂盒（ELISA） 使用说明书 【试剂盒名称】 人血管内皮细胞生长因子（VEGF）定量检测试剂盒（ELISA） 【试剂盒用途】 定量检测人子血清、血浆及相关液体样本中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的含量。【检测原理】 本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被人血管内皮细胞生长因子（VEGF））多克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人血管内皮细胞生长因子（VEGF））浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中人血管内皮细胞生长因子（VEGF））含量。 【试剂盒组成】 1 酶标包被板12孔×8条7 底物夜A6mL 2 标准品：1600pg/ml0.6mL 8 底物夜B6mL 3 20倍浓缩洗涤液20mL9 终止液6mL 4 标准品稀释液6mL10 说明书1份 5 样本稀释液6mL 11 封板膜1张 6 酶标试剂6mL12 密封袋1个 备注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：1600、800、400、200、100、50pg/ml 【需要而未提供的试剂和器材】 1、37℃恒温箱 2、标准规格酶标仪 3、精密移液器及一次性吸头 4、蒸馏水 5、一次性试管 6、吸水纸 【操作步骤】 1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。 2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。 3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、
elisa试剂盒 Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM 抗体ELISA检测。 目录 1elisa试剂盒简介 2优点 3回收率 4发展 5使用方法 6制备方法 7影响 8检测原理 9操作步骤 10试剂器材 elisa试剂盒简介 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。 2优点 一、高效、灵敏、特异的抗体； 二、稳定的重复性和可靠性； 三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体； 四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型； 五、节省实验经费。
人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法） 1 试剂信息 试剂厂家：北京万泰生物药业股份有限公司 2 样本要求 2.1 本试剂使用样品为人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。 2.2 不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物，重度溶血的样品。 2.3 样品中应无微生物，可在2-8℃储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。 2.4 使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。 3 检测步骤 3.1 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 3.2 编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1型、2型各1孔、空白对照1孔。 3.3 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100μL。 3.4 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.5 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 3.6 加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。 3.7 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.8 洗板：操作同步骤5。 3.9 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37±1℃避光显色30±1分钟。 3.10 测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。 4 参考值 临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照A均值+0.12. 5 检验结果的解释 5.1 阴性对照孔A值≦0.10，阳性对照A值≧0.80，否则试验无效。 5.2 若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复试验。
5.3 阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阴性。 5.4 阳性判定：样品A值≧临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阳性。（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者应按《全国艾滋病检测技术规范》送HIV确证实验室进行确证实验。）
仅供科研使用，不得用于临床检验。 人白细胞介素6（IL-6）定量检测试剂盒（ELISA）说明书 【产品名称】 通用名称：人白细胞介素6（IL-6）定量检测试剂盒（ELISA） 英文名称：Human Interleukin-6（IL-6）ELISA KIT 【包装规格】 48人份/盒，96人份/盒 【预期用途】 仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中人白细胞介素6（IL-6）的浓度。 【检验原理】 本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗人白细胞介素6（IL-6）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人白细胞介素6（IL-6）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗人白细胞介素6（IL-6）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物A 和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人白细胞介素6（IL-6）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人白细胞介素6（IL-6）的浓度。 【主要组成成分】 主要成分
校准品浓度依次为：320、160、80、40、20、0 pg/ml。校准品已经通过测试，结果表明HBs抗原阴性，HIV1、HIV2和HCV抗体阴性，由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质，本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。 需要但未提供的材料及耗材 1、酶标仪 2、精密移液器及一次性吸头 3、蒸馏水 4、洗瓶或者自动洗板机 5、37℃水浴锅或恒温箱 6、500ml量筒 7、无粉一次性乳胶手套 8、质控品（可从蓝图生物科技产品研发系统中选择） 【储存条件及有效期】 1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。 2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。 3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。
人CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）ELISA检测试剂 盒说明书 本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆 樊克生物专业供应： 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）含量。 试验原理： CX3CR1试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知CX3CR1浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板 内进行检测。先将CX3CR1和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合 的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中CX3CR1的浓度呈比例关系。 试剂盒内容及其配制 试剂盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制 96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型 塑料膜板盖1块半块即用型 标准品：80ng/ml 1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀 稀 空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型 标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型 生物素标记的抗CX3CR1抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型 亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型 洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀 释 底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 标本稀释液1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）即用型 自备材料 1．蒸馏水。 2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。 3．振荡器及磁力搅拌器等。 安全性 1．避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体 在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。 因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下： 1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。 2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。 3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。 4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。 5．加入酶底物，温育显色测定 本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其
人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试 剂盒 人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒 产品规格：96T/48T。 供应商：上海乔羽生物有限公司 上海乔羽有限公司，有elisa试剂盒，抗体，培养基 人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒其主要特点如下 专一性强：抗原与抗体的免疫反应是专一反应，而免疫酶技术以免疫反应为基础，所检测的对象是抗原（或抗体），使用的抗体除标记了酶以外，与普通抗体的免疫反应特性并无多大差别。 灵敏度高：由于抗体联结上了酶，因此，借助于酶与底物的显色反应，显示抗原与抗体的结合，大大提高了检测的灵敏性，使检测水平接近放射免疫测定法。 人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。 1.标准品复溶：试剂盒提供6管标准品，每管已标定浓度，并且冻干。实验前在每个标准品管中加入0.5mL 样本稀释液，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动助其溶解，使其恢复为每个标准品管身标注的浓度。 2.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。 人(5-HIAA)ELISA试剂盒说明书，5羟基吲哚乙酸ELISA检测试剂盒试剂的准备： 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 ELISA试剂盒的优势： 全面——混合8 种不同的常见抗原，对自身免疫性疾病进行全面筛查。
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
1、elisa试剂盒简介 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。 2 优点 一、高效、灵敏、特异的抗体； 二、稳定的重复性和可靠性； 三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体； 四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型； 五、节省实验经费。 3 回收率 elisa试剂盒回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越少，回收率越高，如果作标液1PPM，就是1毫克/升，而作出标准数据为0.99毫克/升，就是说你的回收率是99%，这个与真实成分有密切的关系，说明方法的准确度。比如水中总无机氯含量测定，样品水中含有无机氯20mg/L，取100mL 被测水样品，加入0.1mL浓度为10mg/mL的含无机氯标准样品，测定时忽略体积变化，如果测定出样品中无机氯为2.98mg/L，则认为回收率为99%。 4 发展 临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。 5 使用方法 （1）血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。 （2）血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 （3）细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。 （4）组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清
人白细胞介素ELISA 检测试剂盒 人IL-17 ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、缓冲液中细胞上清液及各种体液中的IL-17 。本试剂盒可以检测天然和重组的IL-17 。本试剂盒专用于科研、而非用于临床诊断。 试验原理： 人IL-17 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知IL-17 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将IL-17 和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中IL-17 的浓度呈比例关系。 自备材料 1．蒸馏水。 2．加样器：5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。 3．振荡器及磁力搅拌器等。 安全性 1．此试剂盒的人血制品中的HbsAg、和抗HIV为阴性，但没有实验室可完全保证此血制品不会传染肝炎、AIDS或其它传染病，依据当地的安全条例处理本试剂盒里的成份及血清和血浆等样品。 2．避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。 3．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。 4．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。 操作注意事项 1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。 2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。 5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。 避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。 样品收集、处理及保存方法 1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血 液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 3、细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法. ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。 主要有以下几种类型:（直接法也称一步法） 1 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固
人P16ELISA试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中人P16的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人P16水平。用纯化的人P16抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入P16，再与HRP标记的P16抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的P16呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人P16浓度。 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备
仅供科研使用，不得用于临床检验。 大鼠CD36分子（CD36 ）酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒）说明书 黄石市艾恩斯生物科技有限公司 【产品名称】 通用名称：大鼠CD36分子（CD36 ）酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒） 英文名称：Rat Cluster of differentiation 36（CD36 ）ELISA KIT 【包装规格】 48人份/盒，96人份/盒 【预期用途】 仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中大鼠CD36分子（CD36 ）的浓度。【检验原理】 本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗大鼠CD36分子（CD36 ）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入大鼠CD36分子（CD36 ）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗大鼠CD36分子（CD36 ）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物A 和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中大鼠CD36分子（CD36 ）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中大鼠CD36分子（CD36 ）的浓度。 【主要组成成分】 主要成分
校准品检测范围：0.218-14ng/ml。校准品已经通过测试，结果表明HBs抗原阴性，HIV1、HIV2和HCV抗体阴性，由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质，本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。 需要但未提供的材料及耗材 1、酶标仪 2、精密移液器及一次性吸头 3、蒸馏水 4、洗瓶或者自动洗板机 5、37℃水浴锅或恒温箱 6、500ml量筒 7、无粉一次性乳胶手套 【储存条件及有效期】 1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。 2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。 3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。 【适用仪器】 半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。 【样本要求】 样本类型和采集 以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。 1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。 2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。 3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
克伦特罗(Clenbuterol)ELISA检测试剂盒说明书 一、概要 克伦特罗（Clenbuterol）属于β-兴奋剂，因为该药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。人食用了饲喂克伦特罗作为添加剂的动物所产生的畜产品后，残留的克伦特罗可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康造成极大危害。因此世界许多国家现已被明令禁止在饲料中添加克伦特罗来增加动物的瘦肉率。HPLC或GC-MS一直用作检测β兴奋剂的方法，但是其前处理步骤费用昂贵；而使用酶联免疫检测试剂盒方法则可以经济、快速地检测尿，肌肉，肝脏及饲料中的CLE。 本试剂盒是应用ELISA技术研发而成的检测产品，操作时间短于45min，能最大限度地减少操作误差和工作强度。 二、试验原理 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被克伦特罗抗原，样本残留的克伦特罗和微孔条上预包被的抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物克伦特罗负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中克伦特罗的含量。 三、适用范围 可定性、定量检测动物组织、饲料、尿液等样本中克伦特罗的残留量。 四、交叉反应率 克伦特罗………………………………………………100%特普他林……………………………………………小于1%非诺特罗……………………………………………小于1%马布特罗……………………………………………小于1% 西马特罗…………………………………………小于1%溴布特罗……………………………………………小于1% 塞曼特罗……………………………………………小于1% 五、使用单位需自备的设备及试剂 设备： ┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm ┅┅振荡器 ┅┅涡旋仪 ┅┅离心机 ┅┅天平：感量0.01g ┅┅刻度移液管：10ml ┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、50ml ┅┅微量移液器：单道20μl～200μl、200μl～1000μl 多道250μl 试剂： ┅┅甲醇(分析纯) ┅┅氢氧化钠(分析纯) ┅┅浓盐酸 ----去离子水 六、提供的材料与试剂 1、96孔酶标板×1块 2、标准品×6瓶：(1ml/瓶） 0ppb, 0.05ppb, 0.15ppb,0.45ppb, 1.35ppb,4.05ppb 3、高浓度标准品：100ppb （1ml/瓶） 4、克伦特罗酶标物…………………………………………7ml 5、克伦特罗抗试剂…………………………………………9ml 6、底物液A液………………………………………7ml 7、底物液B液………………………………………7ml 8、终止液…………………………………………7ml 9、浓缩洗涤液(10×) ……………………………………40ml 10、克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)…………………………40ml 七、溶液的配制 配液1: 样品稀释液 用去离子水将克伦特罗浓缩样品稀释液(2×)按1:1体 积比进行稀释，即：1份克伦特罗浓缩样品稀释液 (2×)+1份去离子水；用于提取样本的稀释，样品稀释 液在4℃环境可保存一个月。 配液2: 洗涤工作液 用去离子水将浓缩洗涤液(10×)按1:9体积比进行稀 释，即：1份浓缩洗涤液(10×)+9份去离子水；用于酶 标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。配液3: 1M 氢氧化钠溶液 称取 4.0g 氢氧化钠加去离子水混匀溶解定容至 100ml。 配液4: 0.1M 盐酸溶液 量取0.83ml浓盐酸加去离子水混匀定容至100ml 配液5：25%甲醇溶液 将25ml无水甲醇加入到75ml去离子水中并充分混匀配液6：组织样本提取液 80ml 25%甲醇溶液加20ml 0.1M 盐酸 八、样本前处理步骤 样本处理前须知： （a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 （b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。 （c）未处理的样本需冷冻保存。 （d）处理后的样本可在2-8℃避光保存24h。
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。 ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。 该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。 一、直接ELISA 原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。 优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。 缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。 二、间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。 优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。 缺点：交叉反应几率升高。 三、双抗夹心法ELISA 原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。 双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
elisa试剂盒的价格及规格品牌 elisa试剂盒首选爱尚实验室,规格齐全,价格合理,完善的售后服务, ELISA试剂盒在国内有许多种叫法：例如：ELISA检测试剂盒、ELISA Kit、酶联免疫试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、酶免试剂盒等，比较常见的叫法是ELISA检测试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒等ELISA试剂盒自从60-70年代问世以来，得到全世界科研工作者的认可及推崇，在欧美及中国获得很大的推广，尤其是国内生化领域的长足发展。Elisa生物试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒适用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM 抗体ELISA检测。 原理 免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。 HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM 抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性 特点 一、高效、灵敏、特异的抗体； 二、稳定的重复性和可靠性； 三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体； 四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型； 五、节省实验经费。 elisa试剂盒回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越少，回收率越高，如果作标液1PPM，就是1毫克/升，而作出标准数据为0.99毫克/升，就是说你的回收率是99%，这个与真实成分有密切的关系，说明方法的准确度。比如水中总无机氯含量测定，样品水中含有无机氯20mg/L，取100mL被测水样品，加入0.1mL浓度为10mg/mL的含无机
ELISA方法的基本原理和操作步骤 基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体