第24卷 第5期 中 国 预 防 兽 医 学 报 V ol.24,N o.5 2002年9月 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Sep.2002
抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C7重轻链可变区基因的克隆及序列分析
曹盛丰,王 欣,孙 涛,陆 苹,魏 然,王国丰
(上海交通大学农学院生物技术研究所,上海 201101)
摘要:应用分子生物学技术,从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1C7中提取总RNA,经反转录,PCR扩增及克隆,分别得到V H基因及V L基因。序列测定结果表明:1C7的V H基因为368bp,V L基因为323bp。用NC BI G enBank分析表明,V H和V L均符合小鼠抗体可变区特征,为功能性重排的抗体可变区基因。根据K abat分类体系,1C7的V H基因中的VH基因片段隶属于抗体重链第7183家族,其V L基因中的V L基因片段隶属于抗体K轻链20家族,V H基因由VH76-1BG-DF L16.1-J H4重排而形成,V L基因由V K bw20-J K2重排而形成。1C7的V H和V L基因的克隆为抗F M DV scFv的构建与表达奠定了基础。
关键词:口蹄疫病毒; 单克隆抗体; 可变区; 基因克隆; 序列分析
中图分类号:Q785; S852+3 文献标识码:A 文章编号:1008-0589(2002)05-0341-05
Cloning and Sequencing of the V aribale R egion’s G ene Fragments of the Anti-FMDV Monoclonal Antibody1C7
C AO Sheng-feng,W ANG X in,S UE N T ao,LU Ping WEI Ran,W ANG G uo-feng
(Biotechnology Instiute,School of Agriculture,Shanghai Jiaotong University,Shanghai201101,China) Abstract:The V H and V L genes were am plified from a hybridoma cell line1C7producing m ouse McAb against foot-and-m outh disease virus by RT-PCR.The results of sequence determination showed that PCR products of V H region consisted of368bp encoding about122amino acid resides,and PCR products of V L region contained323bp encoding about107amino acid resides.The sequences of V H and V L genes were hom olog ous with those of m ouse antibody variable region published in NC BI G enbank.According to K abat classified method,mAb1C7V H and V L gene segments belong to the m ouse Ig heavy chain subgroup VH7183and K chain subgroup V K20respectively.1C7V H was constructed by the rearrangement of VH76-1BG-DF L16.1-J H4and1C7V L by the rearrangement of V K bw20-J K2.The success of cloning of the gene fragments of mAb1C7’s variable regions laid a benefit basis for the construction and expression of anti-F M DV single-chain Fv.
K ey w ords:F oot-and-m outh disease virus; M onoclonal antibody; Variable region; G ene cloning; Sequence analysis
口蹄疫(F oot-and-m outh disease,FMD)是由小核糖核酸病毒科(Picornavirdae)口蹄疫病毒属(Aph2 thovirus)的口蹄疫病毒(FMDV)引起的侵染偶蹄动物的烈性传染病[1],尤其是对牛、羊、猪的生产力及畜产品的影响危害极大。由于本病具有传播途径多、传播速度快、流行范围广、传染力强、感染率高、病原变异大、危害程度烈的特点,易形成全球性的大规模流行,因此国际兽疫局(OIE)将其列为A类烈性传染病之首并受到人们的普遍关注。世界各国,尤其是FMD流行的国家和地区为了防制该病,对引起FMD 的FMDV的结构及功能[2],FMDV基因及遗传性特[3],FMDV免疫原性及变异[4],FMDV的诊断及
基金项目:上海交通大学基础研究资助项目
作者简介:曹盛丰(1954～),男,浙江镇海人,教授,博士生,主要从事基因工程抗体的研究.
收稿日期:2001-12-17监控[5],FMDV疫苗研制及应用[6]等作了大量的研究,取得了极大的进展。由于目前尚无很好的诊断方法以区分FMDV注苗动物和感染动物,早在1992年原欧共体所有国家已统一停止使用传统的FMDV 疫苗。因此,利用抗FMDV抗体对易感动物进行被动免疫成为有效防制FMD暴发的重要手段,B细胞杂交瘤技术的建立为研制针对FMDV的mAb提供了有效的技术支撑[7,8]。然而,由于杂交瘤细胞的制备步骤繁琐。筛选费时,且培养杂交瘤细胞需要复杂而昂贵的细胞生长培养液,这给单克隆抗体技术在FMDV防治领域广泛的应用带来了一定的限制。随着DNA重组技术和PCR技术的诞生。从90年代起,形成了以基因工程方法构建重组菌并以此为生物反应器研制基因工程抗体的生物高新技术,它为大批量生产价廉的抗体提供了一条新思路[9]。基因工程抗体的构建其关键之一是抗体可变区基因的获得[10]。本试验采用抗体基因工程技术,从分泌抗O
型FMDV 的杂交瘤细胞中提取RNA ,通过PCR 扩增抗体V L 和V H ,经克隆及测序分析V L 和V H 基因,旨在为构建抗FMDV 单链抗体(scFv )奠定基础。1 材料和方法
111 细胞、质粒及菌株 小鼠抗O 型FMDV 杂交瘤
细胞株1C7由本所建株及提供,质粒pMD18-T Vecter
为T aK aPa 公司产品,细菌E.Coli TG 1菌株由本实验室保存。
112 主要试剂 T rizol 试剂为G ibco 公司产品,M -M LV 反转录酶、rRNasin Ribonuclease Inhibitor 、限制性
内切酶Pst Ⅰ、BstE Ⅱ、Sac Ⅱ和Xho Ⅰ为Promega 公司
产品,T aq DNA 聚合酶、Hexadeoxyribonucleotide mixture [pd (N )6]、Ligation S olution Ⅰ为T aK aRa 公司产品,质粒抽提试剂盒为华舜生物工程有限公司产品
。113 PCR 扩增引物 设计扩增小鼠IgG 类抗体1C7
的V H 和V L 基因的引物序列如下:
114 总RNA 提取 取对数生长期的1C7细胞,用T rizol 试剂按异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取细胞
总RNA 。
115 cDNA 第一链的合成 取5μl 总RNA ,总反应体积50μl 。其中含5μl M -M LV 5X 反转录buffer ,2.5μl 10mm ol/L dNTPs ,2μlH exadeoxyribonucleotide mix 2ture[pd (N )6],400U M -M LV 反转录酶,80U rRNasin Ri 2bonuclease Inhibitor ,用含有0.1%DEPC ddH 2O 补充至
50μl 。混匀,置37℃水浴反应1小时,存-20℃,备用。
116 V H 和V L 基因的扩增 总反应体积为50μl 。分别取合成的cDNA 1μl ,相应加入V H F or ,V H Back 引物
各0.6μl 或V L F or ,V L Back 引物各0.6μl 。然后再分别加入5μl10Xbu ffer ,4μl 2.5mm ol/L dNTPs ,3μl 25mm ol/L
MgCl 2,2.5UT aq DNA 聚合酶,用ddH 2O 补至50μl 。反应条件:预变性94℃4分钟,以94℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,作30个循环,最
后72℃再延伸10分钟。PCR 扩增产物在0.9%A 2garose 凝胶电泳进行鉴定。
117 V H 和V L 基因的克隆 经电泳鉴定的PCR 产
物用PCR 产物纯化试剂盒纯化。取纯化的V H 和V L
基因DNA 各2μl ,pMD18-T Vector 1μl ,Ligation S olution
I 5μl ,ddH 2O 2μl ,置16℃做连接反应1小时。以连接产物转化处于感受态的 E.coli TG 1,经蓝白筛选获得克隆的V H 和V L 基因。质粒抽提试剂盒提取质粒DNA 。0.9%Agarose 凝胶电泳鉴定插入的重组子。118 克隆片段的酶切鉴定 将插入的重组子分别
用BstE 、ⅡPst Ⅰ和Xho Ⅰ、Sac Ⅰ进行双酶切,0.9%A 2
garose 凝胶电泳鉴定克隆的插入片段。119 克隆的V H 和V L 基因序列测定及分析 序列测定反应试剂为:ABI PRIS M BigDye T M T erminator Cy 2cle Sequencing Ready Reaction K it with Am pliT aq DNA P olymerase ,FS (PERKI N E LMER )。测序所用引物:F Primer (M13-47):CG CC A GGG TT TT CCC AG T C A CG AC 。测序仪为:ABI PRIS M T M 377X L DNA Se 2quencer 。分别对V H 和V L 基因片段测序。然后按K abat 等[11]的方法对V H 和V L 基因片段进行序列分
析。2 结 果
211 1C7的V H 和V L 基因的扩增及鉴定 以合成
的cDNA 为模板,用设计的V H 和V L 引物经PCR 分
别扩增V H 基因及
V L 基因。各取PCR 产物2μl ,以
0.9%Agarose 凝胶电泳,显示在370bp 位置和320bp 位置可见清晰的特异性扩增V H 条带及V L 条带(图1)。
图1 M cAb1C7可变区基因的PCR 扩增图谱
1:VH 基因片段 2:V L 基因片段 3:PCR marker
Fig.1E lectrophoretic map of VH and V L PCR am plification products Lane1 G ene fragment of light-chain variable region ;Lane2 G ene fragment of heavy -chain variable region ;Lane3 PCR marker
212 1C7的V H 和V L 基因在pMD18-T Vector 质粒的
克隆与鉴定 以pMD18-T -V H 及pMD18-T -V L 表示插
入了1C7V H 或1C7V L 片段的两种重组质粒。分别将1C7pMD18-T -V H 及1C7pMD18-T -V L 的连接产物,转化处于感受态的 E.coli TG 1,得到数十个白色转化
2
43 中 国 预 防 兽 医 学 报 2002年
菌落。分别从中随机挑取白色菌落,提取质粒DNA ,得到重组质粒1C7pMD18-T -V H 及1C7pMD18-T -V L 。前者经BstE Ⅱ和Pst Ⅰ双酶切后,得到350bp 左右的V H 片段(图2),后者经Sac Ⅰt Xho Ⅰ双酶切后得到300bp 左右的V L 片段(图3),表明1C7的V H 基因及V L 基因在质粒中克隆成功
。
图2 含有重链可变区基因载体的酶切图谱
Fig.2Restriction enzyme map of pM D18-T -VH
1.DNA marker (λDNA/Hind Ⅲ+EcoR I )
2.BstE Ⅱ酶切1C7pM D18-T -VH
3.Pst Ⅰ酶切1C7pM D18-T
-VH 4.BstE Ⅱ-Pst Ⅰ双酶切1C7pM D18-T -VH 5.PCR
marker
图3 含有经链可变区基因载体的酶切图谱
Fig.3Restriction enzyme map of pM D18-T -V L
1.DNA marker (λDNA/Hind Ⅲ+EcoR I )
2.Sac Ⅰ酶切1C7pM D18-T -V L
3.Xho Ⅰ酶切1C7pM D18-T -V L
4.Sac Ⅰ-Xho Ⅰ双酶切1C7pM D18-T -V L
5.PCR marker
213 1C7的V H 和V L 核苷酸序列的测定及分析
用ABI PRIS M BigDye T M T erminator Cycle Sequencing Ready Reaction K it ,分别对1C7的V H 和V L 基因的核苷酸序列进行了测定,结果见图4和图5。结果表明,由PCR 扩增,经克隆所得的V H 基因由368bp 组
成,V L 基因由323bp 组成。经与NC BI G enBank 作
Blast 对V H 基因及V L 基因进行同源性分析表明,所得到的V H 和V L
基因符合小鼠抗体可变区框架结构。
图4 重链可变区基因序列及推导的氨基酸序列
Fig.4The DNA sequence and deduced am ino acid sequence of the V H
gene
图5 轻链可变区基因序列及推导的氨基酸序列
Fig.5The DNA sequence and deduced am ino acid sequence of the
V L
gene
图6 1C7V H 胚系基因分析
Fig.6Analysis of 1C7V H germ -line gene
3
43第5期 曹盛丰,等.抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C7重轻链可变区基因的克隆及序列分析
214 构成1C7V H 和V L 基因的胚系基因分析 由图61C7VH 胚系基因比较分析结果可见,1C7VH 胚系
基因片段与VH76-1BG [12]
仅在252位由A 变成G,1C7V H 的DH 胚系基因片段为DF L16.1,1C7VH 的J H 胚系基因片段为J H4
。
图7 1C7V L 胚系基因分析
Fig.7Analysis of 1C7V L germ -line gene
由图71C7V L 胚系基因比较分析结果见可,1C7V L 胚系基因片段与Schable 等报道的V K bw20胚
系基因片段
[13]
仅在151位由G 变成A 。1C7V L 的
JL 胚系基因片段为J K 2。3 讨 论
随着Ig 基因结构与功能研究的不断深入,已经知道Ig 基因由三组不连锁的基因群控制,分别为重
链基因,K 轻链基因和λ轻链基因。在未分化的胚系B 淋巴细胞和其他有核体细胞的染色体中,编码IgV 区和C 区各部分的基因节段是相互分离的。重
链V 区基因由V 、D 、J 三组基因节段组成,边链V 区基因由V 、J 二组基因节段构成,在B 细胞分化发育过程中,通过一部分基因节段相互连接,基因重排,形成功能性V 区基因,由于重链VD J 和轻链V J 基因段组合性连接的多样性,构成了Ig 的多样性。利用基因工程从分泌mAb 的杂交瘤细胞中分离和克隆IgV 区基因是构建基因工程抗体的途径之一,其关键
是抗体可变区基因的获得,抗体基因的正确拼接及有生物活性的抗体分子的表达。其中抗体可变区基因的获得是至关重要的第一步,它必须解决V H 和V L 基因PCR 扩增引物正确设计的问题。我们应用
随机引物寡聚核苷酸逆转录合成抗体第一链cDNA ,它能够保持编码区及5’端序列的完整性。依据Or 2
landi 等[14]对复杂多变的抗体基因序列进行计算机
分析得出的在各种抗体V 区FR15’端和J 区3’端的核苷酸序列有极高同源性的特征,针对V 区FR15’端和J 区3’端最保守序列设计了扩增V H 和V L 的PCR 引物。应用设计合成的引物V H F or ,V H Back 及V L F or ,V L Back 分别以1C7cDNA 第一链为模板进行PCR 扩增,分离克隆了目的基因V H 和V L ,对重组质
粒1C7pMD18-T -V H 用BstE Ⅱ和Pst Ⅰ双酶切后,在电泳胶上见到目的条带V H ,对重组质粒1C7pMD18-T -V L 用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切能切出目的条带V L 。说
明所设计的这一套引物适用mAb 1C7V H 和V L 基因的克隆。尽管难以证实所用引物序列与mAb 1C7V H 和V L 的FR15’端和J 区3’端序列完全匹配,但
即使有少数几个碱基不严格配对,由此造成的突变也不会影响克隆到的V H 和V L 基因表达的抗体片段结合抗原的活性[15]。本试验克隆的V H 和V L 经测序表明,V H 基因由368bp 组成,V L 基因由323bp 组
成,计算机分析结果表明克隆的V H 和V L 基因均符合小鼠抗体可变区特征,为功能性重排的抗体可变区基因。将1C7V H 基因核苷酸序列与已经在NC BI G enBank 登录的Accession Number 为AF169873的H3F8Ig V H mRNA 356bp 核苷酸序列从位点16到位
点352共337个核苷酸序列进行比较,其同源性达96%。将1C7V L 基因核苷酸序列与Fitzsim ons 等报
道[16]的Ig V K mRNA 321bp 核苷酸序列从位点10到位点312共303个核苷酸序列进行比较,其同源性达99%。依据K ofler 等定义的VH 基因家族标准[17],1C7VH 基因片段隶属于小鼠抗体重链7138家族,按照Strohal 等定义的V L 基因家族标准[18],1C7V L 基因片段隶属于小鼠抗体K 轻链20家族。
胚系基因分析结果表明,1C7V H 由VH76-1BG -DF L16.1-J H4功能性重排而形成,1C7V L 由V K bw20-J K 2功能性重排而形成。这就进一步证明本试验成
功克隆了mAb 1C7的V H 基因及V L 基因,也为通过基因重组技术构建抗FMDV scFv 奠定了良好的基础。与McAb 比较基因工程抗体的生产具有操作简便,表达量大,成本低廉的特点[19],用克隆的V 区基因可产生与抗原特异性结合的抗体片段[20],利用基因突变技术改变抗体的某些结构可提高抗体的亲和力,延长其半衰期[21]。可以预测,作为被动免疫抗体的抗FMDV scFv 的构建和应用将有助于我国对FMD 的防制。
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在实验技术上得到中国科学院上海细胞生物学研究所葛锡锐教授及陈良博士的帮助,在此一并致谢。
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第5期 曹盛丰,等.抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C7重轻链可变区基因的克隆及序列分析
https://www.doczj.com/doc/e79449751.html, 乙肝病毒特性与致病机理研究进展 王晓冬，王峰，吕月蒙，李强，张国峰，孙涛，贾亚雄 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州（730070） E-mail ：wangxiaodong505@https://www.doczj.com/doc/e79449751.html, 摘要：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上HBV 感染的患者将会发展为慢性肝炎(Chronic Hepatitis, CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)，甚至肝细胞性1fl 癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC )，常被形象的称之为“慢性肝病三步曲”。新近有多项研究表明活化的T 细胞反应可能在HBV 感染的慢性化和肝细胞损伤过程中起重要作用。CD4+Th 细胞可分为Thl 和Th2细胞，分别介导两种不同的免疫学效应。Thl 细胞主要分泌IL-2, IFN- X 和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子，参与细胞免疫应答;Th2细胞主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等细胞因子，参与体液免疫应答;Thl/Th2的平衡决定了免疫应答的有效性和安全性。Thl 与Th2之间存在相互制约或促进左右，细胞因子组成一个复杂的分子网络，参与调节炎症反应以及器官功能的自我稳定。 关键词：细胞因子，乙型肝炎病毒，细胞毒性T 淋巴细胞 1.引言 乙型病毒性肝炎（hepatitis B, HB ）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV ）引起的。HBV 的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且还与肝硬化（liver cirrhosis, LC ）和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生、发展密切相关。20﹪的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV 慢性感染的人罹患HCC 的危险性是正常人的100倍。HBV 感染呈世界性分布，其中西欧、北美、澳大利亚为低流行区，乙性肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg ）携带率在2﹪以下；东欧、日本、南美、北美和地中海国家为中流行区；中国、东南亚与南非为高流行区（HBsAg 携带率10﹪左右）。全世界共有约3.5亿人为HBsAg 慢性携带者，其中3/4在亚洲。HBV 感染导致全球每年50～120万人死亡，其中死于HCC 的约占32万。我国是HBV 感染的高发区，约60﹪的人群感染过HBV ，10﹪的人群为携带者，多达1.2亿。现有乙型肝炎患者约为1200万，年发病率为158/10万[1-4]。随着HBV 疫苗在1982年的问世，HBV 感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了一定的进展。但是，乙型肝炎的现状仍然不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大，面临发展为肝硬化和肝癌的危险，不幸的是，到目前为止，还没有针对HBV 的特效药物。因此，乙型肝炎的治疗至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的治疗途径是医学研究的重大课题。 2.HBV 的生物学特性 2.1 HBV 的生物学分类 1986年国际病毒革命委员会正式将人类HBV 划归为一个新的病毒科——嗜肝DNA 病毒科（Hepadnaviridae ）的成员。该科病毒成员除了人HBV 外还有：（1）东方土拨鼠肝炎病毒（GHV ），1978年在美国新泽西州和马里兰州等地的野生土拨鼠发现该病毒。东方土拨鼠肝炎和肝癌的发病率较高；（2）地松鼠肝炎病毒（GHV ），是1980年在美国南加州的地松鼠中发现的；（3）鸭乙型肝炎病毒（DHBV ），1981年在我国江苏省启东县肝癌高发区分
单克隆抗体原理 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性 单克隆抗体制备过程 杂交瘤细胞的制备 1)．提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。 2)．应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性 3)．对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，并进行克隆化培养，得到稳定的杂交瘤细胞，再进行大规模培养获得单克隆抗体。 单克隆抗体的提纯 工业发酵主要类别,乙醇发酵、食品发酵、微生物发酵 发酵工程的一般过程可分为三个步骤：第一，准备阶段；第二，发酵阶 段；第三，产品的分离提取阶段。 为什么说基因工程发酵工程和酶工程之间存在着交叉渗透现象？ 1. 比如想获得某种可以治疗疾病的蛋白酶——这种酶的制备、纯化等过程就属于酶工程。 2. 这种蛋白酶是某生物的某基因的产物，把这个基因克隆构建到载体上——这就属于基因工程。 3. 把基因整合到细胞里面表达，得到这种酶——这就属于细胞工程。 4. 把细胞放到发酵罐中大规模生产——这就属于发酵工程。 利用固定化生物催化剂的优点有很多： ①酶成份可以重复利用； ②适合于连续操作； ③产品中不会掺杂入酶； ④可以更加精确地控制催化过程； ⑤酶的稳定性得到改善或提高； ⑥可发展成多酶反应系统；
人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆 吕勇刚1,窦科峰1,吴昱彤2,赵爱志1,刘 杰4,陈 刚5,陶开山1,药立波3 (1.第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安 710033;2.唐都医院信息科,陕西西安 710038; 3.基础部生物化学教研室; 4.基础部药理学教研室,陕西西安 710032; 5.西安交通大学第一医院血液科,陕西西安 710061) 摘要:目的 扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因,将其克隆到T 载体来构建T 载体文库。方法 收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例,TRIzol 法提取总RNA 、纯化mRNA ,行RT 2PCR 扩增,制备T 载体,用于PCR 产物的克隆。结果 总RNA 纯度高,完整性好,mRNA 获得率为1%。经RT 2PCR ,V H 、V λ、V κ的每一条5’端引物均与其相应的3’端引物成功地扩增出了可变区基因片段,轻、重链T 载体库分别为1.7×108和3.5×108。结论 所采用的引物能够 100%扩增目的片段,T 载体过渡能显著提高克隆效率,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。 关键词:聚合酶链式反应;乳腺癌;抗体基因;T 载体 中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:167128259(2004)0620558204 Amplif ication of all human V genes of breast carcinoma from peripheral lymphadens L üY onggang ,Dou Kefeng ,Wu Yutong ,Zhao Aizhi ,Liu Jie ,Chen G ang ,Tao Kaishan ,Yao Libo (Department of Hepatobiliary Surgery ,Xijing Hospital ,Fourth Military Medical University ,Xi πan 710033,China ) ABSTRACT :Objective To amplif y all human V genes of breast carcinoma by R T 2PC R.The p roducts of PC R were cloned int o T 2vect or t o const ruct clone library.Methods Perip heral lymp hadens of 30p atients wit h breast carcinoma were collected ,f rom w hich t otal RNA was ext racted by TRIzol Reagent ,and m RNA was p urified wit h Oligotex m RNA kit.Then cDNA was derived t hrough reverse t ranscrip tion.PC R p roducts were amplified and cloned int o T 2vect or t o const ruct clone libraries. Re sults Total RNA was ext racted p urely and intactly ,so was m RNA w hich accounts f or 1%of t he f or mer.By R T 2PC R ,every p air of p rimers amplified t he V gene efficiently.Rep ert oires of V H and VL were 3.5×108 and 1.7×108 resp ectively.Conclusion The set of p rimers adop ted are able t o recognize 100%of f unctional V genes wit h high efficiency.T 2vect or will f acilitate t he digestion ,w hich lays a f oundation f or const ruction and selection of p hage library. KE Y WOR DS :p olymerase chain reaction ;breast carcinoma ;antibody gene ;T 2vect or 收稿日期:2004204214 修回日期:2004205211基金项目:国家自然科学基金资助(No.30371399)通讯作者:药立波,T el :83374547211;E 2mail :bioyao @https://www.doczj.com/doc/e79449751.html, 作者简介:吕勇刚(19742),男(汉族),医师,在读博士. 噬菌体抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展,能够绕开免疫途径,直接制备全人源化的抗体片段。它将选择能力和扩增能力偶联起来,较好地模拟了体内B 细胞产生特异性抗体的过程。传统的单克隆杂交瘤技术与之相比,已经显得“迟缓和笨拙”,有被逐渐取代的趋势1。PCR 技术的发展,使得人们可以用一组引物扩增全套抗体的可变区基因,是抗体库技术出现的先决条件之一2。我们采用一组高效引物,以乳腺癌患者的外周淋巴结为原料,扩增抗体的全套可变区基因,并将其首先克隆入T 载 体,构建各自的T 载体文库,有助于提高PCR 产物的酶切和高效克隆,为抗体库的构建打下基础,并在方法学上进行了探讨。1 材料与方法 1.1 酶和化学试剂 TRIzol 提取液购自Invitrogen 公司;DEPC 为Sigma 产品;r Taq DNA 聚合酶、dN TP 购自大连宝生物制品公司;mRNA 纯化试剂盒 为Q IA GEN 产品;反转录试剂盒为Promega 产品;DNA 凝胶纯化试剂盒、大提质粒试剂盒购自上海华 舜生物工程有限公司。 1.2 组织总RNA 的提取 术中剥离乳腺癌患者外 周淋巴结30例(标本均经病理证实),迅速冻于液氮, 第25卷第6期2004年12月西安交通大学学报(医学版) J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Sciences )V ol.25N o.6Dec.2004
单克隆抗体导学案2.2.2 班级姓名 问题生成阶段 【温故知新】 免免 结分泌的，能和抗原 1．抗体的化学本质是，是由合。诱导融合细胞2.动物细胞融合：不同DNA的两种细胞 筛选杂交细胞 3.动物细胞培养：分散的单个细胞制成原代培养 培养 【新知预学】 1．传统抗体的获得 (1)方法：①向动物体内反复注射某种，使动物产生；②从
动物 中分离所需抗体。 (2)特点：、纯度低、。 2．单克隆抗体的制备原理 细胞特点 能产生，但不能B淋巴细胞 能，但不能骨髓瘤细胞 既能融合细胞，又能 单克隆抗体的制备过程3. (1)制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的，然后从小鼠 获得相应的B淋巴细胞。 1 (2)细胞融合：融合的方法常用聚乙二醇、、电激等，这时得到的融合细胞除了杂交瘤细胞，还有相互融合的细胞和相互融合的细 胞。 (3)筛选：用特定的培养基筛选出杂交瘤细胞。这时候的杂交瘤细胞既能 同时又能。 (4)克隆化培养和抗体检测：从杂交瘤细胞群中选出能产生的特异性杂交瘤细胞。 相关资料：先在多孔培养皿上培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是由单个杂交瘤
细胞克隆来的，所以产生的抗体一定是化学性质单一、特异性强的单克隆抗体。 (5)培养杂交瘤细胞获得单克隆抗体：将杂交瘤细胞在条件下做大规模培养或注射到小鼠内增殖，从 ______或小鼠的 ______ 中提取单克隆抗体。 4．由上述抗体的产生过程我们可将单克隆抗体的定义归纳为：由 大量繁殖所产生的、的抗体。 5．单克隆抗体的应用 (1)优点：、、并可能大量制备。 (2)应用 ①作为诊断试剂，具有准确、、简易、的优点。 ②用于和。 问题解决阶段 【合作探究】单克隆抗体的制备 B淋巴细胞？如何得到已免疫的1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？2.如何诱导效应 融合过程中会出现几种类型的细胞？3. 怎样淘汰我们不需要的细胞？上述过程得到的细胞哪种是我们需要的？其特 点是什么？4. 淘汰后的细胞所产抗体是单一的吗？如何检测？5. 如何获得大量“单克隆抗体”？6. 2 注意：制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法及目的
黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定 王字玲 邓健蓓 韩 骅 陈梅红 苏成芝 (第四军医大学生物化学与分子生物学教研室 西安710033) 摘 要 目的:克隆黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因.方法:从培养的可分泌人黑色素瘤特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞HB8760提取总RNA,反转录成c DNA,用合成的一对寡核苷酸引物从中扩增了抗体可变区基因,并克隆入pU C19,挑选出阳性克隆后进行了核苷酸序列分析.结果:所克隆基因分别长360bp和330bp,编码120个和110个氨基酸,含三个CDR区和四个FR区,并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸.计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性.结论:所克隆基因可编码小鼠抗体可变区. 关键词 黑色素瘤 单克隆抗体 基因 克隆 核苷酸序列 中图号 Q78 Am p lificati on,clon ing and sequencing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a sp ecific m onoclonal an tibody W ang Z iling,D eng J ianbei,H an H ua,Chen M eihong,S u Cheng z h i D ep artm en t of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logy,Fou rth M ilitary M edical U n iversity, X i’an710033 Abstract Objective:C lon ing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a specific monoclonal an ti-body.M ethods:To tal RNA w as iso lated from a cu ltu red hyb ridom a cell line HB8760w h ich secretes hum an m elanom a specific monoclonal an tibody,and fo llow ed by reverse tran scri p ti on in to c DNA.T hen PCR w as u sed to amp lify the i m m unoglobu lin variab le regi on genes of the an tibody.T he PCR p roduct w as cloned in to pU C19p las m id and sequenced.Results:T he cloned genes con sist of360bp and330bp respectively and en2 code120and110am ino acids.T here are th ree CDR s,fou r FR s and the charicteristic cystein residues w ith in the genes.T he genes are homo logues to the mou se Ig genes pub lished in E M BL gene bank1995.Conclu2 sion s:T he data indicate that the cloned genes encode the variab le regi on of the mou se an tibody. Keywords m elanom a an tibody gene nucleo tide sequence 单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑.单克隆抗体在生物学基础研究和疾病的诊断、治疗和预防等方面显示出重要的作用和应用前景. L evy等[1]建立了一株人黑色素瘤特异性单克隆抗体XMMM E2001(商品名HB8760).该抗体可特异结合携有黑色素瘤相关抗原的肿瘤细胞,而不与对照的成淋巴细胞系或缺乏黑色素瘤相关抗原的瘤细胞结合[1],这对黑色素瘤的诊断及治疗有重要意义.但由于该抗体为鼠源性,在临床应用中存在诸多问题,而基因工程抗体则有免疫原性低,不被细胞受体结合,在体内成象定位检查时本底低,图象清晰,能进入实体瘤周围微循环,在治疗实体 王字玲,女,29岁,博士生瘤时比完整抗体分子效能高等优点[2],我们从HB8760中克隆了这一抗体的轻、重链可变区基因,并测定了其核苷酸序列,为其进一步应用打下基础. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞系 小鼠杂交瘤细胞系HB8760为本校免疫学教研室保存并培养,该细胞可分泌抗人黑色素瘤特异性小鼠IgG2a. 1.1.2 克隆载体及菌种 为本室保存.所用试剂除特殊提到外均为德国Boeh ringer M annhei m公司和华美公司产品. 1.2 方法
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。 载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是 pBR322。 基因库的建造 含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。 cDNA库的建造 是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。 特异基因的筛选 常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。 核酸序列测定 DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
2020年4月16日磨课教案 第二单元动物细胞工程 2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体 一、学习目标 1．知识目标： ⑴掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。 ⑵简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。 ⑶了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说其应用实例。 2．能力目标： 让学生尝试设计单克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。 3．情感、态度和价值观目标： 通过向学生介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。 二、教学重点难点单克隆抗体的制备过程。 三、流程 1、小结植物细胞工程涉及的技术，让学生回顾有关植物体细胞杂交技术的基本知识 2、探究一：动物细胞的融合 教师提出思考问题，布置学生进行讨论探究，四人一组，探讨交流。 多媒体展示探究思考题。 1）、植物体细胞杂交和动物细胞融合的区别 2）、植物体细胞杂交和动物细胞融合的主要区别是什么？ 3）、为什么可以使用灭活的病毒促进动物细胞融合？ 4）、不灭活的病毒能作为诱导剂吗？ 3、探究二：单克隆抗体制备的原理 多媒体展示探究问题。 1）、传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？
2）、B淋巴细胞有什么特点？ 3）、若要想获得大量的单一抗体，如何做呢？ 4）、在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，那么，怎样解决这一问题的呢？ 5)、小结以下内容： ◆利用____________________产生特异性抗体的功能。 ◆利用____________________无限增殖的特性 ◆利用____________________技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。 ◆利用____________________技术大量培养杂交瘤细胞 4、探究三：单克隆抗体制备的过程 教师通过多媒体展示单克隆抗体的制备过程，同时提出问题，教师展示讨论问题，学生分组讨论。 1）、如何获得B淋巴细胞？ 2）、如果把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式（类型）？ 3）、选择杂交瘤细胞的两步筛选的目的各是什么？ 4）、如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？（教师讲解为主） 5、探究四：单克隆抗体的应用 教师引导学生阅读课本进行回答，多媒体展示问题 1）、单克隆抗体的应用有哪些？ 2）、生物导弹的组成及优点 四、二次备课
病毒的致病机理 从分子生物学水平分析，病毒致病特征与其他微生物的差异很大；但从整个机体或群体上研究，发现病毒感染的流行病学和发病机理与细菌感染有很多相似之处。 病毒侵入机体是否引起发病，取决于病毒的毒力和宿主的抵抗力（包括特异性和非特异性免疫因素），而且二者的相互作用受到外界各种因素的影响。 第一节病毒感染 病毒感染：指病毒侵入体内并在靶器官细胞中增殖，与机体发生相互作用的过程。 病毒性疾病：指感染后常因病毒种类、宿主状态不同而发生轻重不一的具有临床表现的疾病。有时虽发生病毒感染，但并不形成损伤或疾病。 一、病毒侵入机体的途径 二、病毒感染的类型 1、按有无临床症状，分为： （1）隐性感染 病毒进入机体后不引起临床症状的感染，对组织和细胞的损伤不明显。 相关因素：病毒的性质、病毒的毒力弱、机体防御能力强 隐性感染虽不出现临床症状，但病毒仍可在体内增殖并向外界播散病毒，成为重要的传染源。 （2）显性感染 某些病毒(如新城疫病毒、犬细小病毒等)进入机体，可在宿主细胞内大量增殖，造成组织和细胞损伤，机体出现明显的临床症状。 2、依病毒在机体内滞留时间的长短，分为： （1）急性感染
病毒侵入机体后，在细胞内增殖，经数日以至数周的潜伏期后突然发病。 在潜伏期内，病毒增殖到一定水平，造成靶细胞损伤，甚至死亡，从而导致组织器官的损伤和功能障碍，出现临床症状。宿主动员非特异性和特异性免疫因素清除病毒。特点是潜伏期短、发病急、病程数日至数周；病后常获得特异性免疫（因此，特异性抗体可作为受过感染的证据） （2）持续性感染 病毒可长期持续存在于感染动物体内数月、数年，甚至数十年，一般不显示临床症状；或存在于体外培养的细胞中而不显示细胞病变。 持续性病毒感染有病毒和机体两方面的因素：机体免疫功能低下，无力完全清除病毒；病毒在免疫因子不能到达的部位生长；有些病毒可产生缺损型干扰颗粒（DIP）；某些病毒基因可整合道宿主细胞的基因组中；某些病毒无免疫原性(如朊病毒)，不产生免疫应答；某些病毒对免疫细胞亲嗜，使免疫功能发生障碍或消失。 持续性感染有下述4种类型： ①潜伏感染 经急性或隐性感染后，病毒基因组存在于一定组织或细胞内，但并不能产生感染性的病毒子。 在某些条件下病毒可被激活而急性发作，病毒仅在临床出现间歇性急性发作时才被检出。在非发作期，用一般常规方法不能分离出病毒。 ②慢性感染 经显性或隐性感染后，病毒并未完全清除，可继续感染少部分细胞，也能使细胞死亡，但释放出的病毒只感染另一小部分细胞，因此不表现病症；病毒可持续存在于血液或组织中并不断排出体外，病程长达数月至数十年。 ③慢发感染 病毒感染后潜伏期很长可达数月、数年甚至数十年之久。平时机体无症状，也分离不出病毒。一旦发病出现慢性进行性疾病，最终常为致死性感染。 ④急性感染的迟发并发症 可在急性感染后1年或数年，发生致死性的疾病。如：犬瘟热→脑炎、猫全白细胞减少症→小脑综合征 兽医临床常见的具有持续性感染特性的病毒 疾病名称病毒分类持续感染方式持续部位 口蹄疫小RNA病毒科 口蹄疫病毒属 短期循环动物咽部 猪水疱病小RNA病毒科 肠道病毒属 短期循环 抵抗力强的病毒 动物咽部 牛瘟、犬瘟热、新城疫副粘病毒科短期循环动物咽部蓝舌病呼肠孤病毒科中间宿主，持续感染，先天性造血系统
病毒的致病机制 （一）病毒对细胞的致病作用。主要包括病毒及其衍生物对细胞的直接损伤和机体免疫病理反应。 1.溶细胞作用：病毒在宿主细胞内增殖成熟后，短时间内释放大量子代病毒造 成细胞破坏而死亡。主要机制包括阻断细胞大分子合成（由病毒编码的早期蛋白，通过各种途径抑制、阻断细胞核酸或蛋白质合成），损伤细胞器（包括细胞核、内质网、线粒体等，常使细胞出现浑浊、肿胀、圆缩等改变），改变溶酶体结构和通透性（可导致细胞自溶），引起细胞膜抗原改变（造成细胞融合或引起免疫性细胞损伤），产生毒性蛋白伤害细胞。 2.稳定状态感染：指有的病毒在宿主细胞内增殖过程中，对细胞代谢、溶酶体 膜影响不大，并且以出芽方式释放病毒，过程缓慢、病变较轻，段时间不会引起细胞溶解和死亡。但细胞稳定状态感染常造成细胞膜成分改变和细胞膜受体的破坏，经病毒长期增殖、多次释放后，细胞最终仍会因能量和营养物质消耗殆尽而亡。 3.细胞凋亡：某些病毒感染细胞后（如腺病毒、HPV和HIV等），病毒可直接 或由病毒编码的蛋白因子的间接作用，诱发细胞凋亡。 4.病毒基因组的整合：病毒遗传物质核酸可全部或部分整合入细胞DNA中， 造成宿主细胞基因组的损伤。有的病毒整合的DNA片段可造成染色体整合处基因的失活和附近基因的激活等现象。有的整合病毒基因可表达出对细胞有特殊作用的蛋白质造成一定的影响。 5.细胞的增生和转化：少数病毒感染细胞后不会抑制宿主细胞DNA的合成， 反而促进细胞DNA的合成，并使细胞形态发生变化，失去细胞间接触性抑制而成堆生长。部分细胞可转化为肿瘤细胞。
6.包涵体的形成：细胞被感染后，在胞浆或细胞核出现光镜下可见的斑块状结 构。这些包涵体由病毒颗粒或未装配的病毒成分组成或是病毒增殖留下的细胞反应痕迹。包涵体可破坏细胞的正常结构和功能，有时引起细胞死亡。（二）病毒对机体的致病作用 1.病毒对组织器官的亲嗜性和组织器官的损伤：病毒性感染具有宿主种属特异 性和组织嗜性，而这种特性由细胞膜上的病毒受体的特异性决定。病毒的细胞、组织和器官亲嗜性造成了病毒对特异组织器官的损伤，形成临床上不同系统疾病。 2.免疫病理损伤：病毒抗原以及感染细胞后产生的自身抗原会导致机体的变态 反应和炎症反应。 ①.体液免疫病理作用：许多病毒能诱发细胞表面出现新抗原，当特异性抗 体与这些抗原结合后，在补体参与下引起细胞破坏。有的病毒抗原与相应抗体结合形成免疫复合物，可长期存在于血液中，当这种免疫复合物沉积在某些器官组织的膜表面时，激活补体引起III型变态反应，造成局部损伤和炎症。 ②.细胞免疫病理作用：细胞免疫在其发挥抗病毒感染同时，特异性细胞毒 性T细胞液对病毒感染细胞造成损伤。病毒蛋白因与宿主细胞蛋白之间存在共同抗原性而导致自身免疫应答（即自体免疫疾病）。 3.病毒对免疫系统的致病作用： ①.病毒感染引起免疫抑制：许多病毒感染可引起机体免疫应答降低或暂时 性免疫抑制。这种免疫抑制使病毒性疾病加重、持续，并可能使疾病进程复杂化。原因可能为病毒直接侵犯免疫细胞。
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.doczj.com/doc/e79449751.html,
基因克隆技术攻略：让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾 一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来，让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益，因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题，经过较长时间的总结和实践，我的题组现在的基因克隆都是一次到位的，基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒，不过我对科研非常热爱，我喜欢买实验用的各种酶啊，好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱，所以我看起来穿的及其普通，可是我的实验花费有点奢华，呵呵，可能像我这样的人不多吧，哈哈，反正无所谓开心就好。下面言归正传 （1）是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶，这极大的丰富了我们的选择，所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同，最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧，其实不然，Takara几乎每年9月都有一次促销活动，在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶，这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用，而且长期五折，我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的，我一般不批量买了，在NEB买的一般都是不常用的酶，比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。 （2）PCR引物的设计这一点我不想多说，虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等，大家设计的时候要参考各种原则，我认为不然，因为做过实验的战友都清楚，有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的，比如我要扩增一个完整的基因的ORF框，那么它的起始密码子，终止密码子部分都要克隆出来的，不能多也不能少一个碱基，即使起始部位或者终止部位的AT含量很高，高到你难以忍受，那怎么办呢，基本我们没有选择，如果实在是没办法的条件下，只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位，我不知道说清楚没有，如果引物序列OK，可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的，那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。（3）PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同，我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题，我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增，所以其实我的条件并不是最佳的，但当时把基因扩出来了我也没有在意，直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签，这样的PCR引物长度差异很大，一支引物100多bp，一支引物只有30bp，于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功，各种温度都试过了也不成。于是我静下心来，把PCR的实验条件进行了全方位优化，在PCR 反应体系中，把引物调整到各种浓度的，把模板调整到各种浓度的，有的加Mg2+，有的加BSA，还使用梯度PCR的条件，试了各种扩增温度的，结果让我很开心，最后我的基因被扩增出来了，而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧！在这次试验中我找到了最佳的PCR条件，这是三年前的事了，这个条件让我在三年中屡试不爽，几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单，50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平，混匀，离心一下，进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存，吸取少量稀释十倍后用于PCR反应，这个浓度是最佳的。所以PCR 体系中引物并不是越多越好，同样的模板的量也很关键，一般我都在10ng-100ng之间，太少或太多都会抑制PCR反应。当然，不同的基因其退火温度差异较大，建议第一次做直接做梯度PCR，设置的温度范围宽些，总会有扩出来的。反正把反应体系加好，把温度控制好应该就万事大吉了，如果这样仍然扩不出来，那就直接调整DNA模版的量吧，其他的因素应该不是原因（当然得保证引物，以及酶的质量得前提下）。 （4）PCR产物的酶切，这是最简单的一步，一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要，毕竟保护性碱基只有几个。
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。 22楼 一、工具酶： 基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。 工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。 从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。 核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA 的入侵：当自身的基因组在复制完成下轮DNA 复制尚未开始前就被甲基化酶修饰(使某特定序列 甲基化), 避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶的功能就是通过特异性序列的识别后进行DNA 的切割，来限制外源性DNA 侵入自身的细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。 根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：I、II、III类： 第I 类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000 个核苷酸对处切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 第II 类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP 提供能量。 第III 类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边24-26 个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。