小麦赤霉病及呕吐毒素的检测探讨
王鹏李彦标王淑武悦赵春慧
巴彦淖尔市农牧业科学研究院内蒙古自治区015000
摘要：随着时代的不断发展，人们越来越重视食品健康安全问题。小麦作为食品的基础性材料，其种植与生长问题一直受到广泛关注。小麦赤霉病是长期以来影响小麦食用安全的病症，本文主要对小麦赤霉病以及呕吐毒素的检测方法进行分析研究。
关键词：小麦赤霉病；呕吐毒素；检测
一、小麦赤霉病
小麦赤霉病是小麦生长过程中感染了以禾谷类镰刀菌为主的霉菌引起的世界性小麦病害之一[1]。这种病害对小麦的生长产生比较大的影响，不仅会严重影响小麦产量，而且还有可能会导致小麦病粒之中含有呕吐毒素，使用含有呕吐毒素的小麦会引发呕吐、腹泻等症状，严重影响人类以及动物的身体健康。小麦赤霉病主要表现在粉红色的霉状物，小麦籽粒会越来越干瘪，然后加工成小麦粉的出粉率也大大降低，最重要的是这种毒害会使得小麦产生有毒的代谢物，其中最具有毒性成分的就是呕吐霉素。呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是一种真菌类毒素，广泛存在于小麦、玉米等谷类作物之中，人体如果摄入过多很有可能会激发呕吐、发烧、厌食等中毒症状，严重的情况下可能会对人体免疫系统造成侵害，严重威胁人体健康。
粮食安全问题一直是人们广泛关注的重点问题，但是由于气候等多方面的原因，很多谷物类作物在种植以及收获的时候会因为各种原因受到真菌毒素的感染与影响。有统计结果表明，每年大约有25%左右的农作物会受到真菌的影响而造成污染，失去价值。根据国家食品安全相关规定，小麦、玉米等谷物类作物中的真菌毒素被控制在1000μg / kg[2]。也正因此，小麦等谷物类作物的毒素卫生指标也成为了食品粮食检查的重要工作之一。目前常用的真菌毒素检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、以及酶联免疫法等等。本文选用高效液相法展开对小麦赤霉病与呕吐毒素的检测研究，可以精确地对样品中的呕吐毒素进行定性定量分析。
二、小麦赤霉病及呕吐毒素的检测方法
（一）试验材料
小麦样品（品种采用永良4号，巴麦13号）、高效液相法华谱S3000。
（二）试验原理
高效液相色谱检测储液器中的流动相被高压泵打入检测系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，经反复多次“吸附-解吸”分配，各组分形成较大的移动速度的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样本浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式输出检测结果。
（三）呕吐毒素检测
检测选取的小麦样品应该是最新收割的新鲜小麦，为了保证检测结果的客观性，需要将所选取的样品进行多次检测分组，本次实验将样品分成6份进行检验。另外筛选出一份不含有赤霉病的小麦进行检测分析，最后将所有的检测进行对比，使用高效液相色谱法的免疫亲和柱法对DON含量进行检测。
检测过程主要分为以下几个步骤：
第一，提取实验样品，将样品研磨，硬质的粮食用高速万能粉碎机磨细并通
过试验筛（1.2 mm 孔径），不要磨成粉末，称取25 g（精确到 0.01 g）磨碎
的试样于 100 m L 容量瓶中加入 5 g 聚乙二醇，用水定容至刻度，混匀，转移
至均质杯中，高速搅拌 2 min。定量滤纸过滤后以玻璃纤维过滤至滤液澄清，收
集滤液于干净的容器中打开氮气阀，打开净化器上的载气开关阀，然后检查是否
漏气，保证气密性良好。
第二，将 2 m L 滤液以 1 滴 /2 s 的速度缓慢通过免疫亲和柱；用 20 m L
水冲洗柱子，流速 1 滴 /s，弃去流出液，加入 1.0 m L 甲醇（色谱级）洗脱，
流速自然重力，直至 2～3 m L 空气通过柱体，收集全部洗脱液。
第三，设置高效液相色谱仪参数包括如下：色谱柱C18 柱：5 μm 150 mm
×4.6 mm；流动相：甲醇 + 水（20+80）；流速：0.8 m L/min；进样量：50 μ
L；检测波长：218 nm。
第四，根据高效液相色谱仪获得的样品峰保留时间情况，进行检验结果的观
察，随后根据峰面积进行最终的定量检测。
（四）结果与分析
样品试验检测结果如下表所示
检验组和对照组DON检测结果
序号组别赤霉病含量/% DON含量/μg/kg
1 0.8 175.1
2 检 1.2 272.7
3 验 1.9 390.2
4 组 3.1 2252.2
5 4.2 3567.2
6 8.9 5466.1
7 1.0 387.1
8 2.0 768.2
9 3.0 1051.2
10 对 4.0 2356.8
11 照 5.0 3000.1
12 组 6.0 3398.2
13 7.0
4226.1
14 8.0 4567.2
从上述检测结果之中，我们能够观察到：当赤霉病的含量在3%以下的时候，
两个组的DON检测结果相差更大，但是当赤霉病的含量在3%以上的时候，两个
组的检测结果基本上是保持着一定的梯度的。综合上述的实验分析结果，了解到
当能够将赤霉病含量控制在3%以下的时候，就能够保证小麦作物的检测结果是
符合国家粮食安全相关规定的，而且这种情况下的检测结果也更加具有可靠性。
根据上述实验结果，了解到一个更为准确的粮食安全含量标准，因此从食品
安全把关的角度进行考虑，需要做好相应的检测准备工作。或者可以直接在粮食
收购的过程中，直接根据当地的粮食存储情况以及赤霉病病粒含量来进行更为细
化的处理。对赤霉病超过限量的小麦，可以采用分阶段处理的形式，将所收购的
小麦进行分层检测处理，检测结果达到要求之后直接对其进行入库，而检测结果
未达标的则要对其进行另外场地的存储以及处理，这也是为了保证粮仓内的小麦
呕吐素含量指标，保证食品的实用安全。除了收购以及存储的把关处理之外，最
好还需要定期对仓库内的小麦进行取样检测工作。定期的检测能够对仓库内小麦
呕吐素的含量进行把关，防止后续的小麦入库过程中出现赤霉病粒含量越来越多
的情况。虽然每次存储前的小麦都会进行检测，但是多次存储之后很难保证仓库
内小麦的赤霉病含量保持一个稳定不变的状态，因此定期对仓库内小麦的赤霉病
含量进行检测是非常有必要的。
三、结论
综上所述，通过检测赤霉病含量的形式判断小麦中呕吐素的含量是否超标是
一种简单、快捷的检测方式，不仅能够快速做好检测与处理工作，而且检测成本
也比较低，不需要花费很长的时间就能够得到检测结果。本文主要分析小麦赤霉
病的概念及原理，并对呕吐毒素的检测方法进行分析研究。粮食安全问题一直是
我国国民关注的重点问题，粮食收购中想要更好地保证小麦的安全性标准，还需
要对其进行检测分工，正确区分并去除小麦中的赤霉病粒，提高粮食作物的食品
安全。
参考文献
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仓储科技通讯,2019,35(3):43-45.
[3]夏培培.小麦分选过程中赤霉病粒与呕吐毒素含量关系探讨[J].现代面粉工
业,2018,32(2):24-26.
呕吐毒素标准操作规程 1、目的 为了规范亲和柱净化样本中呕吐毒素的操作流程，特制订本操作规程。 2、范围 本标准适用于粮食、饲料、食品中呕吐毒素的检测。 3、检出限和定量限 项目 岛津安捷伦 样本检出限 （μg/kg） 样本定量限 （μg/kg） 样本检出限 （μg/kg） 样本定量 限（μg/kg） DON 12.96 36.72 151 503 4、职责 部门名称部门职责 质量管理部1、负责本制度的实施。 2、负责本制度的监督执行。 5、程序 5.1 原理 测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过呕吐毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱呕吐毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。 5.2 溶液配制 5.2.1 PBS缓冲液：称取8.0g 氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化 钾，用990mL蒸馏水或去离子水溶解，用浓盐酸调节pH至7.0，再用蒸馏水或去离子水定容至1L。上述PBS缓冲液用于样品的提取、稀释，以及亲和柱的清洗。 5.2.2 呕吐毒素标准工作液：先用色谱级甲醇将高标稀释到5ppm，再用水将其稀释到 1ppm，此时标品的溶剂为20%甲醇，然后再用20%甲醇将标准品梯度稀释到500ppb、200ppb、100ppb、50ppb。 5.3 样品前处理
5.3.1 玉米、小麦、面粉、配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本 ----将样品粉碎，称取25g样品，加入5g聚乙二醇，加入125mL蒸馏水； ----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液； ----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液； ----取2.5mL上样液过免疫亲和柱净化。 稀释倍数：2 5.3.2 麸皮、豆皮、玉米胚芽粕、米糠等吸水性较强的样本 ----称取10g样品，加入100mL蒸馏水； ----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液； ----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液； ----取5mL上样液过免疫亲和柱净化。 稀释倍数：2 5.3.3 酒类 ----取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品，使用前先搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品25g，用PBS缓冲液定容至100mL； ----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液； ----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液； ----取2mL上样液过免疫亲和柱净化。 稀释倍数：2 5.3.4 酱油、醋、酱及酱制品 ----取样品25g，用PBS缓冲液定容至100mL； ----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
细菌内毒素检查法标准操作规程 1 目的 建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。规范细菌内毒素检验操作，确保检验数据的准确性。 2 范围 适用于细菌内毒素的检验操作。 3 职责 3.1 质量控制部检验人员对具体操作负责； 3.2 质量保证部负责监督本规程的执行。 4 定义 无 5 内容 5.1 概述与原理 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 基本原理：鲎试剂是鲎血液细胞提取物的冻干品，主要包含4种成分，分别是C 因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原。细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化其中的C因子，使鲎试剂发生一系列的酶联反应，最终形成凝胶或使凝固酶活化某些外加的显色集团（显色法）的原理，来检测细菌内毒素的量。 细菌内毒素的活性单位有两种表达方式，即EU和IU。美国、中国和日本扥国家使用EU，欧洲地区使用IU。在活性量值上，1EU=1IU，计算是可以互换。 5.2 仪器与用具 5.2.1 电子天平、电热干燥箱、时钟、水浴锅、温度计、试管架、漩涡器、剪刀、无菌封口膜、无热原吸头、试管、砂轮、移液枪，75%乙醇、木棉等。 5.2.2 细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品按级别分为国际标准品、国家标准品和工作标准品。其中，国际标准品是由WHO制备，在世界范围内进行效价的协作标定，主要用于世界各国标定各自国家的标准品之用，细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。在细菌内毒素检查试验中，应使用细菌内毒素国家标准或细菌内毒素工作标准品。 5.2.3 细菌内毒素检查用水：内毒素含量小于0.015EU/mL（凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。 5.2.4 鲎试剂：一批新的鲎试剂在首次使用时要先进行灵敏度复核，结果符合药典规定后，方可用于后续试验。制备或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂试验。
食品中呕吐毒素的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201702） 1范围 本方法规定了食品中呕吐毒素的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于谷物加工品及谷物碾磨加工品中呕吐毒素的快速测定。 2原理 样品中呕吐毒素与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和与检测卡中检测线（T线）上呕吐毒素-BSA偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C 线）颜色深浅比较，对样品中呕吐毒素进行定性判定。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1试剂 3.1.1提取液：水或胶体金免疫层析检测卡专用提取液。 3.1.2甲醇。 3.2参考物质 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。 表1呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量 注：或等同可溯源物质。 3.3标准溶液配制 准确称取适量呕吐毒素参考物质（精确至0.0001g），用甲醇溶解，配成0.10mg/mL的标准储备液，-20℃保存，有效期3个月。 3.4材料 3.4.1呕吐毒素胶体金免疫层析检测卡。 3.4.2中速定性滤纸。 3.4.3滤膜：0.45μm水相滤膜。 4仪器及设备 4.1天平：感量分别为0.01g和0.0001g。 4.2粉碎机。 4.3样品筛：0.9mm。
4.4漩涡混合器：1500rpm/min。 4.5移液器：100μL，200μL，1.0mL。 4.6恒温装置：37.0℃±2.0℃。 4.7环境条件：温度15-30℃，湿度≤80%。 5分析步骤 5.1试样制备 样品粉碎：将待测样品粉碎，过0.9mm样品筛，充分混合均匀，备用。 5.2试样提取 准确称取粉碎混匀样品5.0g于离心管中，加入25.0mL水或专用提取液（3.1.1），漩涡混合器（4.4）提取5min，静置1min，中速定性滤纸（3.4.2）过滤，滤液用0.45μm水相滤膜（3.4.3）过滤，将滤液稀释至检测卡（3.4.1）检测范围内，混匀，即得待测液。 5.3测定步骤 吸取150μL上述待测液加入到检测卡中，恒温装置内反应6min后进行结果判定。 5.4质控实验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1空白试验 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2加标质控试验 准确称取空白试样5.0g或适量（精确至0.01g）置于离心管中，加入适量呕吐毒素标准溶液，使呕吐毒素浓度为1.0mg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 6结果判定要求 根据控制线（C线）和检测线（T线）颜色变化进行结果判定，采用目测法对结果进行判定，比色法和消线法判定原则如下： 6.1比色法 6.1.1无效 控制线（C线）不显色，无论检测卡（T线）是否显色，表示操作不正确或检测卡已失效。 6.1.2阳性结果 控制线（C线）显色，检测线（T线）显色明显浅于控制线（C线），判为阳性。 6.1.3阴性结果 控制线（C线）显色，检测线（T线）比控制线（C线）显色深或检测线（T线）与控制线（C线）显色基本一致，判为阴性。
******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素
******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法 中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布 一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应 的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。 用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。 二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。 三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。 四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定 （1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。 （2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作 标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量
加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干 支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管 口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。 五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。
呕吐毒素毒性以及检测 呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，化学名为3?, 7?, 15一三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属单端孢霉烯族化合物。由于它可以引起猪的呕吐而得名，对人体有一定危害作用，欧盟分类标准为三级致癌物。 呕吐毒素是什么？ 呕吐毒素主体成分为DON（deoxynivalenol, 脱氧雪腐镰刀菌烯醇），属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等的菌株都可产生该毒素。单端孢霉烯族毒素共有150 多种，是一类强有力免疫抑制剂，所引起典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。呕吐毒素（DON）是其中最重要一种毒素，主要来自镰刀菌属（Fusarium），尤其是禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）和黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）。由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素（vomitoxin，VT）。 呕吐毒素的污染分布 有调查显示，中国饲料和原料霉菌毒素污染超标的比例为60%~70%，其中呕吐毒素的超标比例接近70%，在被检的玉米、麸皮和DDGS样品中呕吐毒素的检出率均高达90%以上，分别为92.9%、92.3%和100%。豆粕的检出率较低为54.5%。麸皮和豆粕中呕吐毒素未见超标，其平均含量分别为0.44mg/kg 和0.05mg/kg，属于轻度污染。玉米中呕吐毒素的超标率为57.1%，毒素平均含量为1.01mg/kg，其最高含量为2.13mg/kg，属于中度污染。DDGS中呕吐毒素的超标率为88.2%，毒素平均含量为1.36mg/kg，最低含量为0.85mg/kg，最高含量为1.72mg/kg，属于中度污染。玉米和DDGS中呕吐毒素的平均含量极显著高于麸皮和豆粕（P<0.01），DDGS中呕吐毒素的平均含量显著高于玉米（P<0.05），麸皮中呕吐毒素的平均含量极显著高于豆粕（P<0.01）。被检配合饲料中呕吐毒素的检出率为97.4%，仔猪料、中猪料、妊娠母猪料和哺乳母猪料的检出率高达100%。其中，乳猪料呕吐毒素未见超标，其平均含量为0.28mg/kg，显著低于其他种类全价料（P<0.05），属于轻度污染。仔猪料、中猪料、大猪料、妊娠母猪料和哺乳母猪料均有不同程度的超标，超标率分别为14.3%、14.3%、22.2%、10.0%和23.1%，其最高含量分别为2.31、1.14、1.44、1.45mg/kg和1.52mg/kg，属于中度污染。 呕吐毒素的毒性 DON具有很强的细胞毒性，它对于原核细胞、真核细胞、植物细胞、肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用。Prelusky等发现，猪喂给呕吐毒素，能提高脑中5-羟色胺（serotonin）和5-羟引哚乙酸（5-Hydroxyindoleaceticacid）的浓度，对脑神经产生麻痹作用。而且，即使是低剂量的DON就能引起猪脑中5-羟引哚乙酸水平的提高。Rizzo等发现不同浓度DON对于大鼠红细胞的溶血作用，其溶血作用有一个阈值，低于此浓度红细胞不会发生溶血反应。DON可能通过3种不同的方式对原核细胞产生毒性作用： （1）通过渗透磷脂双层，作用于亚细胞水平； （2）通过与细胞膜相互作用； （3）通过自由基介导的脂质过氧化作用。DON可能以一种以上的方式同时发挥作用。 呕吐毒素的检测方法 三方圆呕吐毒素酶联免疫试剂盒：呕吐毒素酶联免疫试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被呕吐毒素抗原，样本中的呕吐毒素和微孔条上预包被的抗原竞争抗呕吐毒素抗体（抗
黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案 一、黄曲霉毒素介绍 黄曲霉毒素(aflatoxin，简称为AF)是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素。它可通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全，对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重，该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒素比较耐热，加热至230℃才能被完全破坏，因此一般烹饪加工也不易消除。 二、黄曲霉毒素对人体的危害 1、引起急、慢性中毒： 黄曲霉毒素是剧毒物质，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素属肝脏毒，除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝脏蛋白质的合成，黄曲霉毒索引起人类的急性中毒事件，国内外均有许多报导，最典型的是印度的霉变玉米事件，该事件直接导致了数十人丧生，数百人患上不同类型的肝脏疾病。 2、致癌性： 黄曲霉毒素有极强的致癌性，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍，是目前公认的致癌性最强的物质之一。另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素含量在30~50ug/kg时为低毒，50~100ug/kg时为中毒，100~1000ug/kg时为高毒，1000ug/kg以上为极毒。鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性，我国对其在食品中的含量作了严格规定，其中，乳制品中黄曲霉毒素最高允许量为5ug/kg（即5ppb）。 三、黄曲霉毒素的种类 黄曲霉毒素主要有4种：即B1、B2、G1、G2，其中B1被认为是主要的有毒物质，有2种这些毒素的代谢产物M1和M2。其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品，动物 饲料，中药等产品中；黄曲霉毒素M 1是动物摄入黄曲霉毒素B 1 后在体内经羟基 化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、 肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。黄曲霉毒素M 1 的毒性和致癌 性与黄曲霉毒素B 1 的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食
附件2 食品中呕吐毒素的快速检测胶体金免疫层析法 1 范围 本方法规定了胶体金免疫层析法测定食品中呕吐毒素的快速检测方法。 本方法的适用范围为谷物加工品及谷物碾磨加工品中呕吐毒素的快速检测。 2 原理 试样中呕吐毒素与胶体金标记的特异性抗体发生结合后，抑制了层析过程中抗体与硝酸纤维素膜检测线上呕吐毒素-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色发生变化，根据检测线颜色变化进行结果判定。 3试剂及耗材 除非另有规定，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682中三级水。 3.1 试剂 3.1.1 提取液：水或胶体金免疫层析检测装置专用提取液。 3.1.2 甲醇：分析纯 3.2 参考物质 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。 表1 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量 注：或等同可溯源物质。 3.3 标准溶液配制 准确称取适量的呕吐毒素参考物质（精确至0.0001g），用甲醇溶解，配成0.1mg/mL 的标准储备液，-20 ℃保存，有效期3个月。 3.4 材料 3.4.1 呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置。 3.4.2 中速定性滤纸。 3.4.3 离心管。
3.4.4 滤膜：0.45 μm 水相滤膜。 4 仪器及设备 4.1 天平：感量0.01～0.0001 g。 4.2 粉碎机。 4.3 样品筛：0.9 mm。 4.4 漩涡混合器：1500 rpm/min。 4.5 移液器：100 μL，200 μL，1.0 mL。 4.6 恒温装置：（37.0±2.0）℃。 4.7 设备或方法使用环境条件：温度15 ℃～30 ℃，湿度≤80%。 5 分析步骤 5.1 扦样和分样，按GB 5491 执行。 5.2 试样制备 5.2.1 样品粉碎：将被测样品（5.1）粉碎，过0.9 mm样品筛，充分混合均匀，备用。 5.2.2 质控样品制备：选取经标准方法确认不含呕吐毒素的样品，称取2份平行样，其中一份作为阴性质控样品，另一份添加标准溶液使其样品中呕吐毒素含量为1.0 mg/kg，作为阳性质控样品。 5.2.3 样品溶液制备 准确称取粉碎混匀样品 5.0 g于离心管中，加入25.0 mL 水或专用提取液（3.1.1），漩涡混合器（4.4）提取5 min，静置1 min，中速定性滤纸（3.4.2）过滤，滤液用0.45 μm水相滤膜（3.4.4）过滤，备用； 5.3 测定 5.3.1 将滤液（5.2.3）稀释至呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置（3.4.1）检测范围内，漩涡混合器（4.4）混匀，备用。 5.3.2 取150 μL待测溶液加入呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置内，恒温装置内反应6 min，结果判定。 6 结果判定 根据检测线（T 线）和控制线（C 线）颜色变化进行结果判定，采用目测法对结果进行判定，比色法和消线法判定原则如下： 6.1 比色法 6.1.1 无效 控制线（C 线）不显色，无论检测卡（T 线）是否显色，表示操作不正确或检测装置已失效。 6.1.2 阳性结果 控制线（C 线）显色，检测线（T 线）显色明显浅于控制线（C 线），判为阳性。 —2—
ROMER 国际贸易北京有限公司 编号：COKAQ4000_N O V 09 呕吐毒素是B 型单端孢霉烯族化合物，由镰刀菌产生，特别是Fusarium graminearum. 这种霉菌毒素主要产生在谷物中，例如小麦，大麦，燕麦，黑麦和玉米中。呕吐毒素具有非常高的毒性，1ppm 以上对猪有潜在的危害。由受呕吐毒素污染的小麦做成的宠物食品具有急性毒性。呕吐毒素是一种免疫抑制剂，可以引起肾的疾病。当人类食用了受呕吐毒素污染的谷物后也同样会产生呕吐症状。 美国食品药品监督管理局(FDA)对呕吐毒素限量的法案规定如下： （1）人类食用的成品小麦产品：1ppm ； （2）猪和其他动物饲料中原料的谷物及谷类副产品：5ppm ； 猪饲料：1ppm ； 其他动物饲料：2ppm ； （3）食用牛、4个月以上的饲育牛及肉鸡的饲料原料中的谷物及谷类副产品：10ppm ；食用牛、4个月以上的饲育牛及肉鸡的饲料：5ppm 。 AgraQuant ? 呕吐毒素检测试剂盒应用固相直接竞争酶联免疫吸附原理，用去离子水或蒸馏水从研磨样品中提取呕吐毒素。样品提取液或呕吐毒素标准品与酶-呕吐毒素偶合物混匀后加入到抗体包被的微孔中，样品中的呕吐毒素或呕吐毒素标准品与酶-呕吐毒素偶合物中的呕吐毒素竞争结合微孔中的特异抗体。经过洗板去除未参加抗原-抗体反应的的呕吐毒素，当酶的底物被加入到微孔中，颜色变为蓝色，且颜色深浅与样品中或标准品中呕吐毒素含量成反比。加入反应终止液终止反应后，反应液颜色应由蓝色转为黄色。在450nm(OD450)滤镜及630 nm 示差滤镜下使用酶标仪对微孔板进行吸光度值测量。利用标准品的吸光度值对标准品浓度制作标准曲线，将样品的吸光度值与标准品的吸光度值进行比较以进行结果的判读。AgraQuant ? 呕吐毒素检测试剂盒操作方法0.25/5 ppm Deoxynivalenol （Vomixin ）呕吐毒素 Assay Principles 检测原理
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
呕吐毒素荧光定量快速检测卡性能评估测试 摘要：对上海飞测生物科技有限公司研发生产的呕吐毒素荧光定量快速检测卡在粮食谷物饲料中的检测性能进行了评估。该产品的检出限为25μg/kg，最低定量限为82μg/kg，线性范围为100-5000μg/kg，线性范围内的添加回收率为83.51%~113.84%，同一个样本的检测3次的CV<14.75%，与其他真菌毒素的交叉反应率均小于5%，与其代谢物的交叉反应率在20%以内。该产品具有操作简便、灵敏准确、快速定量、重现性好等优点，非常适合用于对粮食谷物饲料中呕吐毒素的进行快速定量测定。 关键词：呕吐毒素快速定量检测；荧光定量免疫层析；呕吐毒素；粮食谷物饲料 呕吐毒素主体成分为DON（deoxynivalenol,脱氧雪腐镰刀菌烯醇），属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等菌株都可产生该毒素。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，所引起典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。呕吐毒素（DON）是其中最重要一种毒素，主要来自镰刀菌属（Fusarium），尤其是禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）和黄色镰刀菌（Fusariumculmorum）。由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素（vomitoxin，VT）。 该毒素最早于1970年在日本香川县的一次赤霉病大麦中毒的病毒中发现，1972年，由日本的Morooka等首次从赤霉病大麦中分离，Yoshizawa等阐明了这种新的真菌毒素的结构，并将其命名为4-deoxynivalenol（DON）。1973年Vesonder等在美国从被镰刀菌污染的玉米中分离出了同样的化学物质，因为该种物质可以引起猪产生呕吐症状，故命名为呕吐毒素，并相继发现可以在赤霉病大麦、被镰刀菌污染的玉米中分离出该物质。呕吐毒素是食品中常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，通常在欧洲及北美发现的3种毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇。由于它们具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，因此，对人类及动物的健康构成了威胁，特别是对免疫功能具有明显的影响。根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。当人摄入了被DON 污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。由于中国传统饮食习惯中粮谷比例大大高于西方，使得呕吐毒素的危害更为突出。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物。欧盟要求呕吐毒素要小于1.0mg/kg；中国谷物饲料中要求呕吐毒素的含量低于低于1 .0mg/kg，饲料中低于5 mg/kg。 目前，国标法测定呕吐毒素需要大型的仪器设备，价格昂贵，操作过程复杂、时间较长，且无法在现场和基础小型实验室使用。除此之外，也有采用呕吐毒素酶联免疫试剂盒或胶体金快速快速检测卡用于大量样品的筛查，操作简便，检测快速，成本也较低，但准确性和重复性较差，容易造成假阳性或者假阴性。因此，急需一种既简便快速，又能准确定量的检测方法，荧光定量免疫层析正好可以满足这种需求。本文通过对多种粮食谷物饲料样品的实测，验证了上海飞测生物开发的呕吐毒素荧光定量快速检测卡的技术性能。 1实验材料和方法
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
藻毒素检测方法 原理： 样品中的微囊藻毒素与微囊藻毒素酶标记物竞争结合数量有限的抗体结点。 测试孔中包被有抗免IgG，用于捕获加入的免抗微囊藻毒素抗体，微囊藻毒素酶标记物和样品中的微囊藻毒素竞争结合数量有限的抗体结点，抗体与测试板中包被抗免IgG结合。 注意：颜色与微囊藻毒素的含量成反比。 较深的颜色=较低的浓度 较浅的颜色=较高的浓度 所需仪器： 仪器型号规格生产厂商大致价格数量 酶标仪及连带电 脑Bio-rad 680型30000-40000 1台 洗板机Bio-rad 1575 32000 1台移液器Acura（范围：20~200μl）1881 1支八通道精密移液 器Acura（范围：20~200μl）4993 1支 一次性移液器吸 头 （50μl、100μl）恒温培养箱37℃ 分析实验室专用 纯水机超纯水或去离子水(符合分析实验室用水国家标准GB6682一级水) 试剂盒 美国Beacon微囊藻毒素 定量检测试剂盒 3600 所需其它实验材料： PE手套、封口膜（保鲜膜）、振荡器（96孔板振荡器） 步骤： 1．将所有试剂及样品置于室温下。
2．从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。3．稀释100倍浓缩清洗液为1倍清洗液，例：取5ml 100倍清洗液到500ml洗瓶中并加入495ml蒸馏水。 4．吸取50μl酶标记物到微孔板的每个孔中。 5．吸取50μl标准，阴性对照，样品到对应微孔中，必须保证每种溶液使用干净的吸头吸取，避免交叉污染。 6．加入50μl抗体溶液到每个小孔中。 7．快速震荡使孔中的溶液混合，并敷上薄膜，或者微孔板可以放在振荡器上震荡孵育，从而达到在孵育期间持续震荡的效果。 8．37℃孵育30分钟。 9．孵育完后，去掉封口膜将微孔中的溶液倒入水槽中，用1倍清洗液清洗完全充满微孔，震荡后倒掉，重复四次，总共五次洗板。在吸水纸上拍打，尽可能将水拍干。10．每个微孔中加入100μl底物溶液。 11．盖上小孔并37℃孵育30分钟。 12．按照加底物的顺序每孔中加入100μl停止液。停止液为1 N盐酸，需小心操作。13．450nm下读板，如果酶标仪有双波长，可同时测605或650nm双波长。 14．如果酶标仪可以处理数据，可用半对数线性或4参数曲线拟合，如果为手动计算，则可按照以下部分进行。
细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题 摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。 一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤 对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。 1、细菌内毒素限值的确定 一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。 研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。 样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。 内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。 大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考